CN101061226A - Rtbv植物启动子及其处理 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)分离和表征新的核苷酸序列，所述的核苷酸序列在植物中显示出启动子活性。本发明进一步涉及通过将全长以及缺失型的RTBV启动子序列与细菌报告基因GUS融合来分析RTBV启动子的功能结构域。本发明也涉及在不同的发育阶段的转基因水稻和烟草植物的多种组织中研究报告基因的表达。本发明还描述了RTBV启动子及其缺失型，其以组成性或组织特异性的方式作用来驱动异源核酸序列在单子叶和双子叶植物、细胞和组织中表达。

Description

RTBV植物启动子及其处理
技术领域
本发明涉及从水稻东格鲁杆状病毒(rice tungro bacilliformvirus，RTBV)分离新的核苷酸序列，所述的核苷酸序列在转基因植物中显示出启动子活性。其进一步涉及RTBV启动子中的功能结构域的表征，其中所述的启动子序列以组成性或组织特异性方式作用来驱动异源核酸序列在单子叶和双子叶植物、细胞和组织中表达。
背景技术
水稻认为是世界上最重要的粮食作物，因为它是多数人的食物热量的主要来源。为了将来给不断增长的食用稻米的人口继续提供足够的热量并提高基于稻米的食物的质量，必需改良水稻以便通过开发杂种优势来增加产量，抵抗不利条件例如虫害、病害、干旱、水涝、盐害和高温，以及整合更多的营养。对于多数这些改良，必须在水稻中引入和表达来自其它生物体的基因(通常称为转基因)。
从农艺学观点来看，为了产生优良的水稻变种，必须将多种赋予理想特性的基因引入相同的转基因背景中。然而，完成基因累进增加(gene pyramiding)并不容易。
为了确保转基因的稳定表达，必需将它们融合至称为启动子的特定的DNA元件，所述的元件作为从基因产生mRNA的控制单元发挥作用，这是基因表达的最重要阶段。这些序列在本质上，从它们起始转录加工并可调节转录的速率的方面来讲是调节性的。相对少量的启动子已经普遍用于在植物中表达转基因。此外，能在单子叶和双子叶植物两者中驱动高水平的组成型表达的启动子的数量甚至更少。而且，仅有少数可驱动组织或器官特异性表达的启动子。因此当前的科学难题在于鉴定新的调控元件以在获得理想的时间-空间上的mRNA表达模式方面引入更大多样性。研究已经表明在相同植物中使用相同的启动子来驱动两种截然不同的异源基因的表达可能会导致基因沉默。然而，该问题可通过对每种异源基因使用不同的启动子来解决。因而，需要鉴定能在多种植物中显示组织和/或发育特异性表达，并且能用于转基因表达的新启动子。本申请案提供了有关新启动子的信息，所述的新启动子是从水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)中鉴定并表征，从在印度WestBengal的田地里种植的受病毒感染的水稻中分离并修饰。
花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV 35S)及其衍生物是用于该目的的最普遍使用的启动子。CaMV 35S在双子叶植物中有活性，但在单子叶植物中其相对强度基本上比在双子叶植物中低。其它双子叶植物启动子也已经用于单子叶植物转化，但对于单子叶植物活性趋向于降低(Wilmink等，1995)。已经鉴定数种启动子用于在单子叶植物中驱动高水平的转基因表达，例如水稻Act1启动子(McElroy等，1991)、水稻rbcS启动子(Kyozuka等，1993)、玉米Ubi1启动子(Toki等，1992；Cornejo等，1993)和水稻细胞色素C基因启动子OsCc1(Jang等，2002)。当然在这些启动子中，只有CaMV 35S(Terada和Shimamoto，1990)、水稻Act1、玉米Ubi1和水稻OsCc1在本质上是组成型的。在水稻中只确定了少数组织特异性启动子。例如，水稻种子储存蛋白谷蛋白(Gt1)启动子已经用于在水稻种子中表达转基因(Ye等，2000)以及水稻Glu-B1启动子已经用于大豆铁蛋白基因的胚乳特异性表达(Goto等，1999)。在水稻中表征的一些其它启动子包括已经显示为创伤诱导性的马铃薯pin2启动子(Xu等，1993)、在厌氧条件下在根部激烈诱导的玉米Adh1启动子(Kyozuka等，1991)以及叶肉特异性的玉米pep和rbcS启动子(Matsuoka等，1994)。
Beachy、Roger N和Bhattacharyya、Maitrayee已经鉴定并表征了来自RTBV的启动子，其分离自菲律宾(美国专利：5,824,857)。该启动子的用途涉及在转基因植物中驱动维管特异性表达。然而，本研究涉及鉴定并表征来自RTBV的启动子片段(分离自West Bengal，India)，所述的启动子片段与先前表征的RTBV启动子无明显同源性。该全长克隆的DNA序列已经存储于EMBL序列数据库中并且已经赋予了下列登记号：AJ314596，但早先未说明该DNA序列的功能。本发明涉及鉴定来自RTBV的新的启动子(分离自West Bengal)以及它们在植物的转基因表达中的用途。
发明目标
本发明的主要目标是提供从水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)分离的启动子，所述的启动子具有如在序列列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
本发明的另一目标是提供缺失型的RTBV启动子，所述的启动子具有如序列表中所示的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15。
本发明的另一个目标是提供嵌合的植物转化载体，所述的载体包含可操作地连接至目标异源核苷酸序列的RTBV启动子(全长，FL)或其缺失型UD1、UD2、UD3、UD4、UD5和UD6(上游缺失型，UD)以及DD1、DD2、DD3、DD4、DD5、DD6、DD7和DD8(下游缺失型，DD)。
此外本发明的另一个目的是提供嵌合的植物转化载体，其中所述的异源核苷酸序列编码能赋予植物改良的农艺学性状或者抗病害或虫害的抗性的多肽，所述的异源基因可操作地连接至上述RTBV启动子及其前述的衍生物上。
此外本发明的另一目标是提供植物细胞、组织、器官和植物(单子叶植物或双子叶植物)，所述的植物细胞、组织、器官和植物用融合至异源核酸序列的多种RTBV启动子序列(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQID NO：15)转化。
依然，本发明的另一个目标是提供在RTBV(FL)或上游缺失型(UD1、UD2、UD3、UD4、UD5、UD6)或者下游缺失型(DD1、DD2、DD3、DD4、DD5、DD6、DD7和DD8)启动子序列的调控下表达一种或多种目标异源核苷酸序列的方法。
依然，本发明的另一个目标是提供产生转基因单子叶植物或双子叶植物的方法，所述的植物在RTBV(FL)或上游缺失型(UD1、UD2、UD3、UD4、UD5、UD6)或者下游缺失型(DD1、DD2、DD3、DD4、DD5、DD6、DD7和DD8)启动子序列的控制下表达异源核酸序列。
发明内容
本发明涉及从水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)分离新的核苷酸序列，所述的核苷酸序列在植物中显示出启动子活性。在此提供的核酸序列(从RTBV中分离)引导可操作地连接的核苷酸序列在单子叶植物和双子叶植物的细胞、组织和器官中的表达。
本发明提供了含有如SEQ ID NO：1(序列表)所示的核苷酸序列的RTBV启动子(FL，876bp)。而且，本发明提供了缺失型的RTBV启动子，即UD1(818bp，SEQ ID NO：2)；UD2(789bp，SEQ ID NO：3)；UD3(754bp，SEQ ID NO：4)；UD4(718bp，SEQ ID NO：5)；UD5(681bp，SEQ ID NO：6)；UD6(671bp，SEQ ID NO：7)；DD1(862bp，SEQ IDNO：8)；DD2(793bp，SEQ ID NO：9)；DD3(691bp，SEQ ID NO：10)；DD4(581bp，SEQ ID NO：11)；DD5(426bp，SEQ ID NO：12)；DD6(325bp，SEQ ID NO：13)；DD7(289bp，SEQ ID NO：14)和DD8(254bp，SEQ ID NO：15)。
本发明进一步涉及通过将全长和缺失型的RTBV序列与细菌报告基因GUS融合来分析如SEQ ID NO：1所示的RTBV启动子的功能结构域，并涉及在不同的发育阶段的转基因水稻和烟草植物的多种组织中研究报告基因的表达。在优选的实施方案中，鉴定了来自RTBV的启动子序列(表示为FL，长度为876bp，如SEQ ID NO：1中显示)、FL上游缺失型启动子例如如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7中分别显示的UD1、UD2、UD3、UD4、UD5以及UD6。此外，还鉴定了FL的下游缺失型启动子例如如在SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15中分别显示的DD1、DD2、DD3、DD4、DD5、DD6、DD7和DD8。这些序列用于驱动细菌报道基因GUS基因在水稻和烟草植物、细胞、组织和器官中的表达。
本发明也涉及RTBV启动子及其缺失型启动子，其以组成型或组织特异性方式作用以驱动异源核酸序列在单子叶植物和双子叶植物、细胞以及组织中的表达。
本发明的另一方面是提供RTBV全长启动子(FL)及其上游以及下游缺失型启动子，所述的启动子在水稻中可预测性地以组织特异性方式(FL、UD1、UD2、UD 3、UD4、UD5、DD 3和DD4)或组成性地表达(DD7和DD8)。
本发明的另一方面涉及构建嵌合的植物转化载体，所述的载体包含融合至目标异源核酸序列的FL、上游和下游缺失型启动子序列。
本发明进一步提供通过将嵌合的植物转化载体介导入植物细胞中来产生转基因植物(单子叶植物或双子叶植物)的方法，其中所述嵌合的植物转化载体包含融合至异源结构基因的RTBV启动子序列(FL或上游或者下游缺失型)。
本发明还提供了用于在所述RTBV启动子序列(FL或上游或者下游缺失型)的调控下在转基因植物中表达异源核酸序列的方法，其中所述异源核苷酸序列执行能赋予植物改良的农艺学性状或对病害或虫害抗性的功能。
本发明也提供了用于在所述RTBV启动子序列(FL或上游或者下游缺失型，启动子突变体)的调控下在转基因植物中表达异源基因的方法，其中所述的植物是单子叶植物例如水稻、小麦或玉米。
本发明还提供了用于在所述RTBV启动子序列(FL或上游或者下游缺失型突变体)的调控下在转基因植物中表达异源核酸序列的方法，其中所述植物是双子叶植物例如烟草、棉花或番茄。
本发明还提供了植物、细胞或组织，所述的植物、细胞或组织包含RTBV启动子和在RTBV(FL)或上游缺失型(UD1、UD2、UD3、UD4、UD5和UD6)或者下游缺失型(DD1、DD2、DD3、DD4、DD5、DD6、DD7和DD8)启动子序列控制下的异源核酸序列。
附图说明
图1：具有SEQ ID NO：1的全长RTBV启动子序列，其显示了用于PCR扩增的正向引物(FP)或反向引物(RP)的位置。
图2：PCR产生RTBV启动子缺失型片段的示意图。
图3：无启动子的载体pCAMBIA1381z的T-DNA区的示意图。
图4：具有多种构建体的显示GUS活性的转基因水稻组织的切片。
具体实施方式
本发明的优选实施方案涉及从水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)中分离并表征启动子，所述的启动子能指导可操作地连接的核酸序列在单子叶植物和双子叶植物细胞、组织以及器官中的表达，所述启动子具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
本发明的另一个实施方案涉及提供缺失型RTBV启动子(UD1、UD2、UD3、UD4、UD4、UD5、UD6、DD1、DD2、DD3、DD4、DD5、DD6、DD7和DD8)，所述启动子含有SEQ ID NO：1的至少59-876bp(UD1)，如SEQ ID NO：2所示。
如下给出多种缺失型RBTV启动子的名称和序列ID：如SEQ ID NO：3所示的UD2(SEQ ID NO：1的88-876bp)；如SEQ ID NO：4所示的UD3(SEQID NO：1的123-876bp)；如SEQ ID NO：5所示的UD4(SEQ ID NO：1的159-876bp)；如SEQ ID NO：6所示的UD5(SEQ ID NO：1的196-876bp)；如SEQ ID NO：7所示的UD6(SEQ ID NO：1的206-876bp)；如SEQ ID NO：8所示的DD1(SEQ ID NO：1的1-862bp)；如SEQ ID NO：9所示的DD2(SEQ ID NO：1的1-793bp)；如SEQ ID NO：10所示的DD3(SEQID NO：1的1-691bp)；如SEQ ID NO：11所示的DD4(SEQ ID NO：1的1-581bp)；如SEQ ID NO：12所示的DD 5(SEQ ID NO：1的1-426bp)；如SEQ ID NO：13所示的DD6(SEQ ID NO：1的1-325bp)；如SEQ ID NO：14所示的SEQ ID NO：1的DD7(1-289bp)；如SEQ ID NO：15所示的SEQID NO：1的DD8(1-254bp)。
本发明的另一个实施方案涉及提供FL及其上游以及下游缺失型，其在水稻中可预测性地以组织特异性方式(UD1、UD2、UD3、UD4、UD5、DD3和DD4)或组成性地表达(DD7和DD8)。
本发明的另一个实施方案涉及提供嵌合的植物转化载体，所述的载体包含可操作地连接至目标异源核酸序列的RTBV启动子(FL、UD1、UD2、UD3、UD4、UD5、UD6、DD1、DD2、DD3、DD4、DD5、DD6、DD7和DD8)。
另外本发明的另一优选实施方案涉及产生嵌合的植物转化载体，所述的载体包含可操作地连接至异源基因的所述RTBV启动子(FL、UD1、UD2、UD3、UD4、UD5、UD6、DD1、DD2、DD3、DD4、DD5、DD6、DD7和DD8)，所述的异源基因编码能够赋予植物改良农艺学性状或对病害或虫害抗性的多肽。
依然本发明的另一个的实施方案涉及在单子叶植物和双子叶植物中提供转基因植物细胞、组织和器官。
另外，本发明的另一个实施方案涉及提供转基因植物，其中所述的植物来自禾本科如水稻、小麦和玉米。
另外本发明的另一实施方案涉及提供转基因植物，其中所述的植物是双子叶植物如烟草、棉花和番茄。
另外本发明的另一实施方案涉及提供表达一种或多种目标异源核酸序列的方法，所述的核酸序列包括RTBV(FL、UD1、UD2、UD3、UD4、UD5、UD6、DD1、DD2、DD3、DD4、DD5、DD6、DD7和DD8)启动子，其中所述方法包括以下步骤：
(a)产生嵌合质粒DNA构建体(植物转化载体)，所述的构建体包含示于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的启动子序列，所述的序列可操作地连接至目标异源核酸序列上。
(b)将来自步骤(a)的质粒导入至合适的宿主细胞中。
(c)用步骤(b)的细胞转化植物细胞或组织来产生表达所述异源核酸序列的转基因植物。
另外本发明的另一个实施方案涉及表达的方法，其中所述异源核酸序列编码能赋予植物改良的农艺学性状的多肽。
依然，本发明的另一个实施方案涉及提供表达的方法，其中所述的异源核酸序列编码能赋予植物改良的农艺学性状或对病害或虫害抗性的多肽，其中所述的转基因植物是单子叶植物。
另外本发明的另一个实施方案涉及表达的方法，其中所述的异源核酸序列编码能赋予植物改良的农艺学性状或对病害或虫害抗性的多肽，其中所述的转基因植物来自禾本科，例如水稻。
另外本发明的另一个实施方案涉及表达的方法，其中所述的异源核酸序列编码能赋予植物改良的农艺学性状或对病害或虫害抗性的多肽，其中所述的转基因植物是双子叶植物，如烟草。
如实施例1所述纯化RTBV(West Bengal分离株)的DNA。表征上述DNA的片段的启动子活性。在上述启动子片段上进行多种上游和下游缺失用于分析启动子活性并且在实施例2中给出了细节。
RTBV启动子的完整序列示于图1。在正向引物的情况下引物在5′碱基上部标出，在反向引物的情况下引物在3′碱基上部标出。获得的RTBV FL启动子的多种缺失型在图2中用图示表示。正向引物表示为FP1-FP7，反向引物表示为RP1-RP9。矩形框描述了RTBV基因组的～900bp的片段。箭头表示大概的引物位置而连接它们的水平线表示期望的PCR片段(见图2)。
通过采用寡核苷酸引物FP1(SEQ ID NO：16)和RP1(SEQ ID NO：23)扩增FL RTBV启动子序列(876bp，SEQ ID NO：1)。FL片段用于产生5′和3′启动子缺失型片段。5′缺失型片段是UD1、UD2、UD3、UD4、UD5和UD6。3′缺失型片段是DD1、DD2、DD3、DD4、DD5、DD6、DD7和DD8。用引物FP2(SEQ ID NO：17)和RP1(SEQ ID NO：23)扩增UD1片段(818bp，SEQ ID NO：2)。用引物FP3(SEQ ID NO：18)和RP1扩增UD2片段(789bp，SEQ ID NO：3)。用引物FP4(SEQ IDNO：19)和RP1扩增UD3片段(754bp，SEQ ID NO：4)。用引物FP5(SEQ ID NO：20)和RP1扩增UD4片段(718bp，SEQ ID NO：5)。用引物FP6(SEQ ID NO：21)和RP1扩增UD5片段(681bp，SEQ ID NO：6)。用引物FP7(SEQ ID NO：22)和RP1扩增UD6片段(671bp，SEQ ID NO：7)。
通过采用引物FP1(SEQ ID NO：16)和RP2(SEQ ID NO：24)扩增DD1缺失型片段(862bp，SEQ ID NO：8)。用引物FP1和RP3(SEQ ID NO：25)扩增DD2缺失型片段(793bp，SEQ ID NO：9)。用引物FP1和RP4(SEQ ID NO：26)扩增DD3缺失型片段(691bp，SEQ ID NO：10)。用引物FP1和RP5(SEQ ID NO：27)扩增缺失型片段DD4(581bp，SEQ ID NO：11)。用引物FP1和RP6(SEQ ID NO：28)扩增缺失型片段DD5(426bp，SEQ ID NO：12)。用引物FP1和RP7(SEQ ID NO：29)扩增缺失型片段DD6(325bp，SEQ ID NO：13)。用引物FP1和RP8(SEQ ID NO：30)扩增缺失型片段DD7(289bp，SEQ ID NO：14)。用引物FP1和RP9(SEQ ID NO：31)扩增缺失型片段DD8(254bp，SEQ ID NO：15)。多种缺失型片段、它们的大小、用来产生这些片段引物的引物及它们的SEQ ID号的详细资料在表1中提供。
将多种DNA片段克隆进无启动子的植物转化载体骨架例如pCAMBIA1381z中以驱动带有内含子的GUS基因的表达。在植物转化载体pCAMBIA1381z的左边界和右边界之间的T-DNA区的示意图示于图3。无启动子的载体pCAMBIA1381z与潮霉素抗性标记基因一起用于克隆进水稻中，或者与抗卡那霉素抗性标记基因一起用于克隆进烟草中。获得了多种具有pCAMBIA1381z骨架的嵌合的植物转化载体，每种载体具有不同的DNA片段，即GUS(内含子)基因上游的FL、UD1、UD2、UD3、UD4、UD5、UD6、DD1、DD2、DD3、DD4、DD5、DD6、DD7和DD8。如实施例3中给出的，将这些载体构建体导入农杆菌菌株EHA105中。该农杆菌菌株用于转化植物例如烟草和水稻。水稻的转化如实施例4中给出的进行。烟草的转化如实施例5中给出的进行。随后用实施例6中给出的标准方法分析该转化植物的GUS活性。
研究了如SEQ ID NO：1所示的876个碱基对的全长(FL)启动子，以及如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6中分别显示的上游缺失型突变体UD1、UD2、UD3、UD4和UD5在水稻中的启动子活性的表达模式。如分别在SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的下游缺失型突变体DD3、DD4、DD5、DD6、DD7和DD8得以鉴定并用于分析细菌报道基因GUS基因在水稻中的表达。手工切取的转化的水稻组织的GUS活性在图4中显示，蓝色通常揭示启动子活性。
将如SEQ ID NO：1所示的FL启动子、如分别示于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的上游缺失型启动子片段UD1、UD2、UD3、UD4和UD5，以及如SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的下游缺失型突变体DD5、DD6、DD7和DD8用于转化烟草植物和组织以驱动细菌报道基因GUS基因的表达。分析转化的烟草组织的GUS活性来研究在多种组织中的表达。
在水稻中，FL(SEQ ID NO：1)启动子片段在苗和根(萌发后(dpg)7天，表皮和根尖除外)的所有细胞中均显示出强的报告基因活性的组成型表达。该表达随着组织的年龄逐渐减少，在萌发后30天维管组织例如韧皮部和维管束鞘中很强地保持。萌发后100天该表达变弱至可以忽略。对于构建体UD1、UD2、UD3、UD4、UD5、DD3和DD4可见类似的表达模式。然而，在两种它的下游缺失型构建体即DD7和DD8中观察到第二种表达模式。在这两种结构中，启动子活性在植物的整个生存期中是组成型的，表皮和根尖除外(在其中没有表达)。另一组下游缺失型构建体DD5和DD6显示出第三种表达模式，其中在植物的任何发育阶段不存在肉眼可检测的GUS活性。RTBV启动子的FL及其多种缺失型片段在水稻幼苗和成熟的叶外植体中的表达模式在图4中显示。
在水稻中，在花序中，对于FL、UD1、UD2、UD3、UD4、UD5、DD3和DD4，内稃和外稃仅在输导组织中展示出GUS活性，然而，在DD7和DD8中在叶脉间(inter-veinal)组织中该活性也是可检测的。在所有的这些构建体中，雄蕊的花丝和结缔组织显示出启动子活性但是花粉囊裂片和花粉未显示启动子活性。在雌蕊中，该启动子活性限于羽状柱头和二裂花柱上，但不存在于子房中。
在水稻的第二代转基因植物(T1)的幼叶组织中的GUS活性评估显示RTBV启动子在表达水平上比得上很好建立了的玉米Ubi1以及CaMV 35S启动子，该值相当于每小时每毫克蛋白质～25,000nmol的4-MU(4-甲基伞形酮)。
还发现RTBV启动子在异源体系例如烟草中是有活性的，但不像RTBV启动子转基因水稻，FL、UD1、UD2、UD3、UD4、DD5、DD6、DD7和DD8的表达限于茎、叶和根甚至幼小组织中的维管系统中，即成熟的FL水稻转基因植物的模式。然而，在DD7和DD8中，仅子叶组成型地表达GUS活性，然后当植物成熟时该表达局限于维管组织。与水稻不同，在UD5中任何组织中都未发现表达。在FL、UD或DD中，在花中未观察到明显不同的表达谱，该表达局限于萼片和花瓣中的维管组织。对于任何构建体雄蕊或雌蕊中未观察到启动子活性。
在转基因水稻中，早先报道了来自菲律宾的全长RTBV启动子的韧皮部特异性活性(Bhattacharyya-Pakrasi等，1993；Yin和Beachy，1995；Yin等，1997)，但是确定的该启动子序列来自与当前研究(WestBengal，印度)不同的隔离种群(菲律宾)。后来，依据包含278个下游启动子序列(dps)的核苷酸，据报导与先前在缺少dps的情况下观察到的比较，相同的RTBV启动子在更广范的细胞中显示出活性(Klti等，1999)。该启动子活性主要在幼小组织中检测到，所述的启动子活性随着植物年龄的增长而逐渐消失。
在本研究中，3′缺失型(DD7和DD8)描述了在水稻的整个生活期在所有组织中组成型地表达异源基因的启动子序列。先前未报导RTBV启动子水稻转基因植物的这种活性。在所有先前报导的RTBV启动子中，全长启动子的活性随着植物的年龄而减少并且在老年时变得非常低，变得局限于维管组织。相反，在这里报导的一些启动子构建体(DD7和DD8)甚至在成熟的植物中仍保持活性。在FL、UD1、UD2、UD3、UD4、UD5、DD3和DD4中，表达模式与Klti等(1999)描述的相似。另外，本启动子的组织特异性也以另一种方式不同于先前报导的RTBV启动子；两种构建体(对应DD5和DD6)在该植物的整个生活期未显示出表达。结果表明某些与细胞反式作用因子结合的正调控和负调控元件的存在决定了所述启动子的强度和组织特异性。因而，认为在这里描述的启动子的活性将在水稻中在以可预测的组织特异性方式表达(FL、UD1、UD2、UD3、UD4、UD5、DD3和DD4)或组成型地表达(DD7和DD8)转基因中非常有用。然而，在烟草植物中该表达是组织限制性的，该活性局限于维管组织。这些不同的表达模式表明，在不同的植物系统中不同的蛋白质与相同的嵌合DNA序列(RTBV启动子)相互作用。表达模式总结于表2中。
实施例
给出的实施例仅仅是说明本发明中所要求的用途、处理和产品，并且本发明自身的实践不限制于或不受描述的实施例限制。
实施例1
DNA提取和启动子的鉴定
从Bidhan Chandra Krishi Viswavidyalaya，Kalyani，WestBengal，India的试验农场收集病毒感染的材料。根据Jones等的方法(1991)用粗病毒制剂分离RTBV DNA。随后用多种限制性内切酶完全消化病毒DNA并用标准方法克隆进pUC19中。将嵌套缺失和引物步移法结合用于产生全长RTBV克隆的全序列，其为BamHI克隆(Nath等，2002)。所述全长克隆的DNA序列存放于EMBL序列数据库中并赋予下列登记号：AJ314596。
实施例2
启动子分析
RTBV全长启动子(SEQ ID NO：1)的完整序列在图1中显示，并且用于通过PCR产生多种启动子变体的引物编号已经在5′末端(正向引物)或3′末端(反向引物)的上部标出。
所有引物即RTBV(FL)和RTBV缺失型(UD和DD)序列的全序列也通过Patent-In Software在序列表中提供。用于全长(876bp)构建体的合成的引物组的序列如下：
FP1(SEQ ID NO：16)5′-CG GAATTCTGTCCTGCACCACCTCAATG-3′
RP1(SEQ ID NO：23)5′-AA CTGCAGTCAATATTTGAGAAAGTAAGATCCCTC-3′。
对于3′缺失型DD1(862bp)构建体，正向引物FP1是相同的，但反向引物序列如下：
RP2(SEQ ID NO：24)5′-AA CTGCAGTAAGATCCCTCTTCAGAACATATGT-3′。
对于3′缺失型DD2(793bp)构建体，正向引物FP1是相同的，但反向引物序列如下：
RP3(SEQ ID NO：25)5′-AA CTGCAGAACATCGCTCTGATACCAGATG-3′。
对于3′缺失型DD3(691bp)构建体，正向引物FP1是相同的，但反向引物序列如下：
RP4(SEQ ID NO：26)5′-AA CTGCAGCGTGATGAGGAAGAGCTACTTG-3′。
对于3′缺失型DD4(581bp)构建体，正向引物FP1是相同的，但反向引物序列如下：
RP5(SEQ ID NO：27)5′-AA CTGCAGCTTGTTCCCTTGGCATCAC-3′。
对于3′缺失型DD5(426bp)构建体，正向引物FP1是相同的，但反向引物序列如下
RP6(SEQ ID NO：28)5′-AA CTGCAGCAGCGGATAAGTTCTTGATG-3′。
对于3′缺失型DD6(325bp)构建体，正向引物FP1是相同的，但反向引物序列如下：
RP7(SEQ ID NO：29)5′-AA CTGCAGCAGCTAATCCTTCTTTGAAGAGG-3′。
对于3′缺失型DD7(289bp)构建体，正向引物FP1是相同的，但反向引物序列如下：
RP8(SEQ ID NO：30)5′-AA CTGCAGCTCTTCTCTTGCTCTTGTGGAAG-3′。
对于3′缺失型DD8(254bp)构建体，正向引物FP1是相同的，但反向引物序列如下：
RP9(SEQ ID NO：31)5′-AA CTGCAGCTCTGGGTGTGTGGATTTCG-3′。
对于5′缺失型UD1(818bp)构建体，反向引物RP1是相同的但正向引物序列如下：
FP2(SEQ ID NO：17)5′-CG GAATTCTGATCCAAAGATAAAGGAACAAAG-3′。
对于5′缺失型UD2(789bp)构建体，反向引物RP1是相同的，但正向引物序列如下：
FP3(SEQ ID NO：18)5′-CG GAATTCAAGCATCAATAAAAGAAGACTGAAG-3′。
对于5′缺失型UD3(754bp)构建体，反向引物RP1是相同的，但正向引物序列如下：
FP4(SEQ ID NO：19)5′-CG GAATTCGGAATCCACTTTAAATTATTGTACCTC-3′。
对于5′缺失型UD4(718bp)构建体，反向引物RP1是相同的，但正向引物序列如下：
FP5(SEQ ID NO：20)5′-CG GAATTCTGTAAGAGTGTGTAAAATCTAGCCTACC-3′。
对于5′缺失型UD5(681bp)构建体，反向引物RP1是相同的但正向引物序列如下：
FP6(SEQ ID NO：21)5′-CG GAATTCCTATATAAGGAGAAGTAGTCTGCATG-3′。
对于5′缺失型UD6(671bp)构建体，反向引物RP1是相同的但正向引物序列如下：
FP7(SEQ ID NO：22)5′-CG GAATTCGGAGAAGTAGTCTGCATGTAATAGGC-3′。
在所有引物序列中，EcoRI和PstI酶切位点用下划线标出。RTBV全长启动子的全序列在图1中显示。用于产生不同启动子变体的引物编号已经在5′端(正向引物)或3′端(反向引物)的上部标出。将来自克隆的RTBV DNA的DNA用作模板，用高保真Taq DNA聚合酶(RocheApplied Science，Germany)在以下条件下来扩增启动子片段：在94℃下进行初始变性5分钟，随后进行10个循环的94℃热变性30秒、58℃退火30秒和72℃的延伸1分钟，接着进行25个循环的94℃热变性30秒、58℃退火30秒和72℃的延伸1分钟以及每个循环的每次延伸另外增加5秒的延伸时间，最后延伸7分钟。所述的PCR片段通过PCR纯化试剂盒(Qiagen，Germany)纯化，用限制性内切酶EcoRI和PstI消化过夜，随后克隆至经EcoRI和PstI消化的无启动子的植物转化载体pCAMBIA1381z内，所述的转化载体具有GUS报告基因(具有过氧化氢酶内含子)和潮霉素抗性作为选择标记。因为潮霉素抗性不能有效地用于在烟草中选择转化体，将来自所述无启动子的载体pCAMBIA1381z的潮霉素抗性基因用限制性内切酶XhoI切除，并将来自pCAMBIA2300的指定的卡那霉素抗性基因的XhoI片段导入至所述的载体内。所述无启动子的载体的T-DNA区显示于图3中。
洗脱不同的缺失型启动子并用新构建的载体骨架连接产生一系列用于烟草转化的RTBV启动子缺失型构建体，卡那霉素用作选择标记。PCR产生RTBV启动子缺失型片段的图示显示于图2中。
实施例3
双载体/构建体转化进农杆菌中
将这些嵌合的植物转化载体通过冰冻-解冻的方法(An等，1988)导入农杆菌菌株EHA105中。将大约1μg的质粒DNA与感受态农杆菌细胞混合，并且随后将其在液氮中冷冻，然后在37℃下孵育5分钟。将1ml的Luria Bertani(LB)肉汤培养基加入至这些转化的细胞中并将内容物在28℃下孵育4-5个小时。随后将细菌悬液沉淀并且涂布于含有合适抗生素的LB琼脂板上。将该板保持在28℃下两天并且通过标准方法分析单个菌落存在正确的构建体。
实施例4
在水稻中转化
让源于来自水稻变种PB1的愈伤组织的，在28℃下，在愈伤诱导培养基CIM[含有2mg/l的2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)的N6B5培养基(Chu，1978；Gamborg等，1968)并用0.8％的琼脂固化]上于黑暗中继代一个半月的盾片(Scutellar)根据Wang等(1997)的方法接受农杆菌介导的转化。用液体N6B5培养基中的并且终细胞密度为2×108个细胞/ml的农杆菌细胞的悬液感染水稻愈伤组织20分钟，所述的培养基含有100μM乙酰丁香酮和2mg/l的2，4-D。随后在28℃下于黑暗中将该愈伤组织置于共同培养基(具有100μM乙酰丁香酮的CIM)上两天半。用抑菌剂150mg/l的奥格门汀洗涤并将愈伤组织在黑暗中置于选择培养基(含有30mg/l潮霉素和150mg/l的奥格门汀的CIM)上一个月至一个半月，在转移至预再生培养基(含有0.5mg/l苯甲酸嘌呤[BAP]、10uM脱落酸、30mg/l潮霉素和150mg/l奥格门汀的N6B5培养基)一周以前，将乳色的假定转化了的愈伤组织进一步保持在选择平板上5-6天，孵育在黑暗中进行3天并在光照下进行4天。然后将该愈伤组织转移至再生培养基(含有1mg/l BAP、30mg/l潮霉素和150mg/l奥格门汀的N6B5培养基)直到出现小苗。随后将这些小苗转移至含有再生培养基的培养管中。为了确保良好发育的根系(硬化)，将推定的转基因植物转移至液体MS(Murashige和Scoog，1962)培养基中，最后种植于含有1∶1比率的soilrite和土壤的罐中并转移至温室直到成熟。
实施例5
烟草中的转化
将叶盘(leaf disc)法用于烟草转化(Savda和Binns，2000)。从3-4周大的烟草植物上部的2-3片叶上切取大约1cm2大小的叶盘，所述的烟草植物在无菌条件下种植于MS培养基上的果酱瓶中，并将该叶盘用作用于农杆菌介导的转化的外植体。将这些叶盘在农杆菌悬液中共同培养20分钟，所述的细菌悬液含有在液体MS培养基中的OD600为～0.6的启动子构建体。然后将所述叶盘在无菌的3MM Whatman纸片上吸干并在28℃下的散射光中置于经0.8％的琼脂固化的MS培养基上两天半，所述的MS培养基含有0.1mg/l的萘乙酸(NAA)和1mg/lBAP。用抑菌剂500mg/l的cephotaxime彻底地洗涤所述叶盘，并且将所述叶盘在光照下置于选择培养基(0.8％的琼脂固化的MS培养基，含有0.1mg/l的NAA和1mg/l的BAP、500mg/l的cephotaxime和50mg/l的卡那霉素)中一个月至一个半月。切取推定的转基因枝芽并置于经0.8％的琼脂固化的MS培养基中以便生根，所述的培养基含有50mg/l的卡那霉素。切取生根的植株并将具有至少一个节的一部分茎进一步置于生根培养基上进行第二轮选择。随后将再一次生根的那些植株转移至温室中的罐中直到其成熟。
实施例6
转化株的分析
通过用基因或启动子特异性引物实施PCR来检验推定的转基因植物是否存在T-DNA区。然后使用Dellaporta等(1983)的方法分离基因组DNA。为了检测报告基因在不同组织中的活性，将叶片/根的手工切片在37℃下的X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-葡萄糖苷酸)溶液中染色过夜，随后在1∶3的丙酮∶乙醇中脱色直到叶绿素完全去除，并且将其在复式显微镜下摄像(图4)。如Jefferson(1987)描述的将约100mg的叶组织用于GUS荧光测定分析。
本发明优势
1.鉴定了在单子叶植物和双子叶植物中都有活性的启动子。
2.鉴定了用于在水稻中组成型表达的强的启动子。
3.鉴定了显示组织特异性表达的启动子。
4.鉴定了启动子，所述的启动子在获得基因累进增加时驱动基因表达以便避免当相同的启动子驱动两种不同基因时的基因默化。
参考文献
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5,824,857    十月，1998       Beachy等         800/287
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表1
  序列名称   序列号   长度(bp)
  FI   SEQ ID NO：1   876
  UD1   SEQ ID NO：2   818
  UD2   SEQ ID NO：3   789
  UD3   SEQ ID NO：4   754
  UD4   SEQ ID NO：5   718
  UD5   SEQ ID NO：6   681
  UD6   SEQ ID NO：7   671
  DD1   SEQ ID NO：8   862
  DD2   SEQ ID NO：9   793
  DD3   SEQ ID NO：10   691
  DD4   SEQ ID NO：11   581
  DD5   SEQ ID NO：12   426
  DD6   SEQ ID NO：13   325
  DD7   SEQ ID NO：14   289
  DD8   SEQ ID NO：15   254
  FP1   SEQ ID NO：16   28
  FP2   SEQ ID NO：17   32
  FP3   SEQ ID NO：18   33
  FP4   SEQ ID NO：19   36
  FP5   SEQ ID NO：20   36
  FP6   SEQ ID NO：21   34
  FP7   SEQ ID NO：22   34
  RP1   SEQ ID NO：23   35
  RP2   SEQ ID NO：24   33
  RP3   SEQ ID NO：25   30
  RP4   SEQ ID NO：26   30
  RP5   SEQ ID NO：27   27
  RP6   SEQ ID NO：28   28
  RP7   SEQ ID NO：29   31
  RP8   SEQ ID NO：30   31
  RP9   SEQ ID NO：31   28
表2.在水稻和烟草转基因植物中的营养组织中观察到的RTBV启动子构建体的表达模式。
  结构体   表达模式
  水稻   烟草
  FL   FL TYPE   FL TYPE
  UD1   FL TYPE   FL TYPE
  UD2   FL TYPE   FL TYPE
  UD3   FL TYPE   FL TYPE
  UD4   FL TYPE   FL TYPE
  UD5   FL TYPE   无表达
  DD3   FL TYPE   -
  DD4   FL TYPE   -
  DD5   无表达   FL TYPE
  DD6   无表达   FL TYPE
  DD7   组成性   FL TYPE+
  DD8   组成性   FL TYPE+
FL TYPE IN RICE：在幼年组成型表达和在成年维管特异性表达
FL TYPE IN TOBACCO：仅维管特异性表达
FL TYPE+IN TOBACCO：仅子叶显示组成型表达，但其余营养组织的显示维管特异性表达
“-”：表示植物没有用特异性构建体转化
                         序列表
所有结构体的序列连同它们的大小，所述结构体分别名为全长(FL)、上游缺失体(UD1-6)或者下游缺失体(DD1-8)
tgtcctgcaccacctcaatggaagaagaatatgcccacaggctggaggcataaagagatgatccaaagataaaggaacaa
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tgaagagggatcttactttctcaaatattga 671个碱基的UD6，SEQ ID No.7
tgtcctgcaccacctcaatggaagaagaatatgcccacaggctggaggcataaagagatgatccaaagataaaggaacaa
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gtgtgatgccaagggaacaagtaccatgaataccctaataagtgctagagggaagataagaactaacgaaataaggaaca
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aagggaaattttgatacaaacttatacatacatttacatatgttctgaagagggatcttact 862个碱基的DD1，SEQ IDNo.8
tgtcctgcaccacctcaatggaagaagaatatgcccacaggctggaggcataaagagatgatccaaagataaaggaacaa
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ccacacacccagagtagcacacacttccacaagagcaagagaagagctgatcttctcacctcctcttcaaagaaggatta
gctgcaatggctcaggtcagtgagtagtcgtctttaaggttcctctaggaacctctgtgtcatatgtattgtatcatgtt
tgtatcatcaagaacttatccgctgcatgaataaagctctatattgttgtttacactccttagataagatatgaagccat
acccgtttcttaaatcaatagttctaagataattctagcatgaaaaagggggctaaagggggaagaagtaccgtcagggc
gtgtgatgccaagggaacaagtaccatgaataccctaataagtgctagagggaagataagaactaacgaaataaggaaca
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tgaaacagtgactaggccgaggaattgcgaaaagatagggggggtgcctacatctggtatcagagcgatgttc 793个碱基的DD2，SEQ ID No.9
tgtcctgcaccacctcaatggaagaagaatatgcccacaggctggaggcataaagagatgatccaaagataaaggaacaa
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ccacacacccagagtagcacacacttccacaagagcaagagaagagctgatcttctcacctcctcttcaaagaaggatta
gctgcaatggctcaggtcagtgagtagtcgtctttaaggttcctctaggaacctctgtgtcatatgtattgtatcatgtt
tgtatcatcaagaacttatccgctgcatgaataaagctctatattgttgtttacactccttagataagatatgaagccat
acccgtttcttaaatcaatagttctaagataattctagcatgaaaaagggggctaaagggggaagaagtaccgtcagggc
gtgtgatgccaagggaacaagtaccatgaataccctaataagtgctagagggaagataagaactaacgaaataaggaaca
tttggtagctggtttcttattatcattatcaagtagctcttcctcatcacg 691个碱基的DD3，SEQ ID No.10
tgtcctgcaccacctcaatggaagaagaatatgcccacaggctggaggcataaagagatgatccaaagataaaggaacaa
agcagcaaagcatcaataaaagaagactgaagacataaagggggaatccactttaaattattgtacctctacaattattg
taagagtgtgtaaaatctagcctacccctgaacactcctatataaggagaagtagtctgcatgtaataggcattcgaaat
ccacacacccagagtagcacacacttccacaagagcaagagaagagctgatcttctcacctcctcttcaaagaaggatta
gctgcaatggctcaggtcagtgagtagtcgtctttaaggttcctctaggaacctctgtgtcatatgtattgtatcatgtt
tgtatcatcaagaacttatccgctgcatgaataaagctctatattgttgtttacactccttagataagatatgaagccat
acccgtttcttaaatcaatagttctaagataattctagcatgaaaaagggggctaaagggggaagaagtaccgtcagggc
gtgtgatgccaagggaacaag 581个碱基的DD4，SEQ ID No.11
tgtcctgcaccacctcaatggaagaagaatatgcccacaggctggaggcataaagagatgatccaaagataaaggaacaa
agcagcaaagcatcaataaaagaagactgaagacataaagggggaatccactttaaattattgtacctctacaattattg
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ccacacacccagagtagcacacacttccacaagagcaagagaagagctgatcttctcacctcctcttcaaagaaggatta
gctgcaatggctcaggtcagtgagtagtcgtctttaaggttcctctaggaacctctgtgtcatatgtattgtatcatgtt
tgtatcatcaagaacttatccgctgc 426个碱基的DD5，SEQ ID No.12
tgtcctgcaccacctcaatggaagaagaatatgcccacaggctggaggcataaagagatgatccaaagataaaggaacaa
agcagcaaagcatcaataaaagaagactgaagacataaagggggaatccactttaaattattgtacctctacaattattg
taagagtgtgtaaaatctagcctacccctgaacactcctatataaggagaagtagtctgcatgtaataggcattcgaaat
ccacacacccagagtagcacacacttccacaagagcaagagaagagctgatcttctcacctcctcttcaaagaaggatta
gctgc 325个碱基的DD6，SEQ ID No.13
tgtcctgcaccacctcaatggaagaagaatatgcccacaggctggaggcataaagagatgatccaaagataaaggaacaa
agcagcaaagcatcaataaaagaagactgaagacataaagggggaatccactttaaattattgtacctctacaattattg
taagagtgtgtaaaatctagcctacccctgaacactcctatataaggagaagtagtctgcatgtaataggcattcgaaat
ccacacacccagagtagcacacacttccacaagagcaagagaagagctg 289个碱基的DD7，SEQ ID No.14
tgtcctgcaccacctcaatggaagaagaatatgcccacaggctggaggcataaagagatgatccaaagataaaggaacaa
agcagcaaagcatcaataaaagaagactgaagacataaagggggaatccactttaaattattgtacctctacaattattg
taagagtgtgtaaaatctagcctacccctgaacactcctatataaggagaagtagtctgcatgtaataggcattcgaaat
ccacacacccagag  254个碱基的DD8，SEQ ID No.15

Claims (22)

1.来自水稻东格鲁杆状病毒的分离的启动子(RTBV启动子)，所述的启动子由如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的片段组成。
2.根据权利要求1所述的分离的启动子，其中所述的启动子至少包含SEQ ID NO：1的碱基1-254。
3.基于根据权利要求1的启动子的分离的启动子，其中所述的启动子选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15。
4.嵌合质粒DNA构建体，其中，根据权利要求1所述的启动子可操作地连接至目标异源核酸序列上。
5.嵌合质粒DNA构建体，其中，根据权利要求3所述的启动子可操作地连接至目标异源核酸序列上。
6.根据权利要求4所述的嵌合质粒DNA构建体，其中所述的异源核酸序列编码能赋予植物改良的农艺学性状的多肽。
7.根据权利要求5所述的嵌合质粒DNA构建体，其中所述的异源核酸序列编码能赋予植物改良的农艺学性状的多肽。
8.根据权利要求4所述的嵌合质粒DNA构建体，其中所述的质粒是植物转化载体。
9.根据权利要求5所述的嵌合质粒DNA构建体，其中所述的质粒是植物转化载体。
10.重组细胞，所述的重组细胞包含根据权利要求4所述的嵌合质粒DNA构建体。
11.重组细胞，所述的重组细胞包含根据权利要求5所述的嵌合质粒DNA构建体。
12.根据权利要求10所述的重组细胞，其中所述的细胞选自大肠杆菌或农杆菌。
13.根据权利要求11所述的重组细胞，其中所述的细胞选自大肠杆菌或农杆菌。
14.转化的植物或细胞，所述的植物或细胞包含可操作地连接至如权利要求1中所述的启动子的异源核酸序列。
15.转化的植物或细胞，所述的植物或细胞包含可操作地连接至如权利要求3中所述的启动子的异源核酸序列。
16.源于根据权利要求14或15的转基因植物的子代。
17.源于根据权利要求14或15的转基因植物的种子。
18.根据权利要求14或15所述的转基因植物，其中，所述的植物是单子叶植物或双子叶植物。
19.根据权利要求14或15所述的转基因植物，其中所述的单子叶植物种类选自水稻、玉米、小麦、大麦和高粱。
20.根据权利要求14或15所述的转基因植物，其中所述的双子叶植物种类选自烟草、番茄、豌豆、大豆、油菜、鹰嘴豆、棉花和木豆。
21.用于在植物中表达异源核酸的方法，所述的异源核酸可操作地连接至RTBV启动子上，其中所述的方法包括以下步骤：
a)构建根据权利要求9的嵌合质粒DNA构建体；
b)将步骤a)的构建体导入农杆菌菌株中产生重组的农杆菌菌株；
c)从植物获得合适的外植体用于植物转化；
d)将步骤c)的外植体与步骤b)的重组农杆菌菌株共培养以产生转化的植物细胞；
e)选择步骤d)的转化的植物细胞；
f)从步骤e)的转化植物细胞获得幼苗；
g)从步骤f)的幼苗获得生根的小苗；
h)培育步骤g)的生根的小苗产生转化的植株。
22.根据权利要求21所述的表达方法，其中所述的RTBV启动子选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15。
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