CN1715407A - 一种提高玉米对矮花叶病抗性的方法及其专用干扰rna - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高玉米对矮花叶病抗性的方法及其专用干扰RNA。该干扰RNA是正义链具有序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列，反义链具有序列表中SEQ ID №：2的双链RNA序列。其编码基因具有下述双链核苷酸序列：正义链具有序列表中SEQ ID№：3的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQ ID №：4的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明对培育高抗矮花叶病转基因玉米中具有重要的理论及实践意义。

Description

一种提高玉米对矮花叶病抗性的方法及其专用干扰RNA

技术领域

本发明涉及一种提高玉米对矮花叶病抗性的方法及其专用干扰RNA。

背景技术

玉米矮花叶病(maize dwarf mosaic，MDM)是一种在世界范围内广泛传播的玉米病毒病，对玉米的生产造成严重影响。我国于1968年在河南省新乡和安阳地区首次发现该病，后来该病逐步扩展蔓延，遍及黑龙江、辽宁、内蒙古、北京、天津、河北、河南、山东、山西、陕西、四川、甘肃、新疆、上海、浙江、广西和海南等省及台湾地区，其中以华北和西北地区受灾较为严重。1998年，山西省矮花叶病的发病面积高达670余万亩，大田发病率为20-30％，制种田高达70-100％，使制种田减产40-50％，总产损失5亿公斤，绝收地块屡见不鲜。玉米矮花叶病现已成为阻碍玉米生产的一大病害。

我国的玉米矮花叶病主要由甘蔗花叶病毒(SCMV)引起。甘蔗花叶病毒在田间主要由蚜虫以非持久性方式传播。通过化学药剂治蚜防病的效果欠佳，种植抗病品种是控制该病毒病的最佳途径，而抗病育种面临的最达障碍是天然抗性基因资源严重不足并且难以分离，同时还存在育种周期长、抗性基因遗传不稳定等问题。

植物病毒主要依赖于寄主的复制转录体系完成自身的繁殖和侵染。干扰病毒的复制和转录，就能达到延迟和减轻病毒病害的目的。自Beachy研究小组(Beachy R N.Coatprotein mediated resistance against virus infection.Ann.Rev.Phytopathol.1990，28：451-474)首次证实表达烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白的转基因植物对TMV产生抗性以来，利用病毒来源的基因获得抗病转基因植物成为植物抗病毒基因工程的重要途径。

玉米抗矮花叶病基因工程主要利用甘蔗花叶病毒或玉米矮花叶病毒(MDMV)的外壳蛋白基因培育转基因植株，转基因植株表现为发病延迟、发病程度减轻。但因抗病程度不高，尚难用于生产。

植物体内正常基因的转录产物因无互补序列不会形成双链RNA，因此植物体内出现了双链RNA就会激发RNAi(RNA interference，RNA干扰)机制。RNA干扰技术是在双链RNA(ds RNA)分子的介导下特异性降解靶基因的生物技术，能使基因表达沉默，达到拮抗靶基因和实现生物(基因)治疗目的。将双链RNA降解成长度为21-25nt的小干扰RNA片段(siRNA，small interfering RNA)，这些小片段会进一步介导与其同源的单链RNA降解。RNAi效率高，是植物保持自身基因稳定的一种防御机制，已被用于反向遗传学和功能基因组学的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高玉米对矮花叶病抗性的方法及其专用干扰RNA。

本发明所提供的提高玉米对矮花叶病抗性的干扰RNA，是正义链具有序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列，反义链具有序列表中SEQ ID №：2的双链RNA序列。

将上述双链RNA序列命名为SCMV iRNA，其反义链与SCMV mRNA的1-900位置序列互补。序列表中SEQ ID №：1由1044个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中SEQ ID №：2由900个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端。

上述提高玉米对矮花叶病抗性的干扰RNA的编码基因也属于本发明的保护范围。它可具有下述双链核苷酸序列：正义链(不做模板的DNA链)具有序列表中SEQ ID №：3的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链(做模板的DNA链)具有序列表中SEQ ID №：4的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

序列表中SEQ ID №：3由1944个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中SEQ ID №：4由1944个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端。

含有提高玉米对矮花叶病抗性的干扰RNA编码基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌以及扩增提高玉米对矮花叶病抗性的干扰RNA编码基因中任一片段的引物也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种提高玉米对矮花叶病抗性的方法。

本发明所提供的提高玉米对矮花叶病抗性的方法，是将上述提高玉米对矮花叶病抗性的干扰RNA的编码基因导入玉米外植体，得到矮花叶病抗性提高的玉米。

所述提高玉米对矮花叶病抗性的干扰RNA的编码基因通过含有所述提高玉米对矮花叶病抗性的干扰RNA的编码基因的RNAi植物表达载体导入玉米外植体；用于构建所述RNAi植物表达载体的出发载体可为任意一种可在玉米中表达外源基因的植物表达载体，如pCAMBIA1300(购自CAMBIA公司)、pCAMBIA1301(购自CAMBIA公司)、pCAMBIA3301(购自CAMBIA公司)、pBI121(购自Clontech公司)、pBin19(购自Clontech公司)、pART27(Gleave，A.P.(1992)A versatile binary vector systemwith a T-DNA organisational structure conducive to ef^cient integration ofcloned DNA into the plant genome.Plant Mol.Biol.20，1203-1207)等，其中，pCAMBIA3301为优选的出发载体。

以pCAMBIA3301为出发载体，构建的RNAi植物表达载体为p3301SCMVirNIb。

携带有提高玉米对矮花叶病抗性的干扰RNA编码基因的植物表达载体可通过使用农杆菌介导法、基因枪法、电击法、花粉管导入法或脂质体融合法等方法转化玉米的外植体，优选为农杆菌介导法；所述农杆菌可为任意一种根癌农杆菌或发根农杆菌，优选为根癌农杆菌LBA4404。

所述外植体可为玉米的幼胚、愈伤组织、原生质体、幼苗基部叶片、花药、花粉粒或子房，优选为幼胚。

所述玉米的品种可以是多种多样的，如综3、综31、齐31、黄早四、先早17、P138或郑87-1等。

本发明应用RNAi技术，将甘蔗花叶病毒(SCMV)复制酶基因的正义基因和反义基因相连，构建了一个RNAi基因，利用植物表达载体将该RNAi基因导入玉米。在玉米体内，该RNAi基因转录出的RNA能通过序列互补形成发夹状的双链RNA结构，激发植株体内的RNAi机制，降解入侵病毒与其同源的RNA。本发明的RNAi基因转入玉米后，转基因玉米对矮花叶病具有高抗性。

本发明具有以下优点：

1)现有的玉米抗矮花叶病基因工程是利用植物表达载体将目标病毒的某个基因的全部核苷酸序列的cDNA导入玉米，以此获取抗病转基因植株。此法所得到的转基因玉米的抗病株率较低，且抗性只是延迟发病或者减轻发病程度，抗病水平不高，难以用于生产。利用本发明的方法获得的转基因玉米抗病株率高，可达90％，且抗性能达高抗甚至免疫水平，较易在生产上应用。

2)本发明的RNAi基因的转录产物会形成一种序列自我互补的双链结构，该结构会激发植株体内的RNAi机制，把该双链结构降解成小片段，因此转基因的mRNA不存在或存在量很少，也不会翻译成蛋白质，避免了常规抗病毒转基因方式可能引起病毒与转基因发生遗传重组或异源包装产生新病毒的风险。

本发明对培育高抗矮花叶病转基因玉米中具有重要的理论及实践意义。

说明书附图

图1为所构建的甘蔗花叶病毒复制酶基因的RNAi植物表达载体的PstI和SacI单酶切鉴定结果

图2为所构建的甘蔗花叶病毒复制酶基因的RNAi植物表达载体的SacI和MunI双酶切鉴定结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物由上海博亚公司合成。

实施例1、抗矮花叶病性提高的转基因玉米的获得

一、甘蔗花叶病毒外壳蛋白的RNAi载体的构建

1、RT-PCR扩增甘蔗花叶病毒复制酶的全长cDNA基因

根据甘蔗花叶病毒复制酶基因的核苷酸序列(GenBanK号：AJ001691)设计反转录PCR扩增其cDNA的引物，引物序列如下：

引物1：(上游引物)5′-GAGCGTTGAAGAACAATGTG-3′；

引物2：(下游引物)5′-CGTTGTTCCAGATCCACTTC-3′

采用RT-PCR法扩增甘蔗花叶病毒复制酶的全长cDNA基因，具体方法包括以下步骤：

1)反转录合成其第一链cDNA：提取感染矮花叶病玉米植株叶片的总RNA，10μL反应体系为：叶片总RNA 2μL，10mM dNTP 1μL，Oligo(dT) 1μL，ddH₂O 6μL。65℃水浴5min，冰浴2min。再向管内加入以下组分：10×RT缓冲液(Promega)2μL，25mMMgCl₂4μL，0.1M DTT 2μL，RNasin 1μL，Superscript II RT酶1μL，混匀后，按如下条件进行反应：先42℃ 50min，再70℃ 15min，冰浴5min后，加入RNase 1μL，37℃，20min。

2)PCR扩增甘蔗花叶病毒复制酶的全长cDNA基因

以步骤1)反转录合成的第一链cDNA为模板，在引物1和引物2的引导下，PCR扩增甘蔗花叶病毒复制酶的全长cDNA基因，50μL反应体系为：步骤1)的反转录产物2μL，ddH₂O 39.6μL，10×PCR缓冲液(TaKaRa)5μL，10mM dNTP 1μL，10μM引物1 1μL，10μM引物21μL，Taq plus酶(TaKaRa)(5U/μL)0.4μL。PCR反应条件为：先94℃ 5min；再94℃ 1min，56℃ 1min，72℃延伸2min，共35个循环；最后72℃ 7min。反应结束后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用柱式回收试剂盒(上海生工)回收1.6kb的扩增产物，将其溶于20μL去离子水中。将回收的PCR扩增产物与pGEM-T Easy载体连接，10μL连接反应体系为：PCR产物2μL，2×Rapid连接缓冲液(TaKaRa)5μL，pGEM-T Easy载体(Promega)(50ng/μL)1μL，T₄ DNA连接酶(3U/μL)1μL，ddH₂O 1μL，4℃连接12-24小时。反应结束后，将连接产物加入到200μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行转化，转化条件为：先冰浴30min，再42℃热击90sec，然后冰浴5min，最后加入800μL LB液体培养基，37℃轻摇培养1h。培养结束后，3500rpm离心5min，弃去800μL上清液，将剩余物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板上，37℃避光培养16小时。挑取长出的单菌落，接种于LB液体培养基中扩大培养，然后提质粒进行酶切鉴定，将阳性克隆送基康公司进行核苷酸序列测定，测序结果表明获得了序列正确的甘蔗花叶病毒复制酶的全长cDNA基因序列，将含有甘蔗花叶病毒复制酶的全长cDNA基因序列的重组载体命名为pGEM-T Easy/SCMV。

二、甘蔗花叶病毒外壳蛋白的RNAi载体的构建

1、用限制性内切酶EcoRI将pGEM-T Easy/SCMV中的甘蔗花叶病毒复制酶基因的全长序列切下，插入到载体pUC19的EcoRI的酶切位点中构建重组载体，将其命名为pUC19/SCMV。pUC19的多克隆位点处有XbaI酶切位点，甘蔗花叶病毒复制酶基因上有XhoI酶切位点，用限制性内切酶XbaI和XhoI双酶切重组载体pUC19/SCMV，对甘蔗花叶病毒复制酶基因在重组载体pUC19/SCMV中的插入方向进行鉴定，鉴定结果表明甘蔗花叶病毒复制酶基因以反向方式插入到pUC19中，插入方向正确。

2、用限制性内切酶SacI和MunI双酶切(MunI为部分酶切)重组载体pUC19/SCMV，回收甘蔗花叶病毒复制酶基因5’端长度分别为1044bp和896bp的两个DNA片段，分别具有序列表中SEQ ID №：5和SEQ ID №：6限定的核苷酸序列。

3、将正义链分别为896bp和1044bp两个长度的DNA片段同时与经限制性内切酶SacI酶切的植物表达载体pCAMBIA3301获得的片段(命名为p3301Ubi)连接，构建重组植物表达载体。连接体系及连接条件为：回收的长度为1044bp片段2μL，896bp片段2μL，p3301Ubi片段1μL，10×缓冲液2μL，T₄连接酶(TaKaRa)1μL，ddH₂O 12μL，16℃连接12小时。反应结束后，将连接产物加入到200μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行转化，转化条件为：先冰浴30min，再42℃热击90sec，然后冰浴5min，最后加入800μL LB液体培养基，37℃轻摇培养1h。培养结束后，3500rpm离心5min，弃去500μL上清液，将剩余物涂布于含100mg/L卡那霉素的LB平板上，37℃避光培养16小时。挑取长出的单菌落，接种于LB液体培养基中扩大培养，然后提质粒进行酶切鉴定。分别用PstI和SacI进行的单酶切鉴定结果如图1所示(泳道2、3为PstI单酶切产物，泳道5、6为SacI单酶切产物)，SacI和MunI的双酶切鉴定结果如图2所示(泳道1、2为SacI和MunI双酶切产物)，酶切鉴定结果表明长度为1044bp的正义链和长度为896bp的反义链在MunI切口处连接，然后插入了植物表达载体p3301Ubi的SacI切口处，形成了含甘蔗花叶病毒复制酶基因干扰RNA的编码基因的RNAi植物表达载体，命名为p3301SCMVirNIb。

三、将甘蔗花叶病毒复制酶基因的RNAi植物表达载体导入玉米

T₀表示由玉米愈伤组织得到的植株，T₁表示T₀代自交产生的种子及由它所生长的植株，T₂表示T₁代自交产生的种子及由它所生长的植株。

用农杆菌介导法将步骤二构建的RNAi植物表达载体p3301SCMVirNIb导入玉米，具体方法包括以下步骤：

1、用冻融直接转化法将RNAi植物表达载体p3301SCMVirNIb导入农杆菌LBA4404，具体步骤如下：

1)制备农杆菌LBA4404感受态细胞

取28℃振荡培养至OD₆₀₀为0.5的农秆菌LBA4404的菌液于5000rpm离心5min后弃上清，然后加入10mL 0.15M的NaCl溶液悬浮细胞，再5000rpm离心5min后弃上清，用1mL预冷的20mM CaCl₂悬浮细胞，冰浴后分装，液氮中速冻1分钟，置-70℃保存备用；

2)通过冻融直接转化法将甘蔗花叶病毒复制酶基因的RNAi植物表达载体p3301SCMVirNIb导入农秆菌LBA4404

取200μL步骤1)制备的农秆菌LBA4404的感受态细胞，加入1μg步骤二构建的甘蔗花叶病毒复制酶基因的RNAi植物表达载体p3301SCMVirNIb，液氮中速冻1min，37℃水浴5min，然后加入1mL YEB培养基，28℃慢速振荡培养4h后于1000rpm离心30sec，弃上清，加入0.1mL YEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有100μg/mL卡那霉素(Kan)和125μg/mL链霉素(Sm)的YEB平板上，28℃培养48h后，挑取平板上长出的单菌落，接种于YEB液体培养基(含有100μg/mL卡那霉素和125μg/mL Sm)中，28℃振荡培养过夜。用特异性引物NIbU：5′-GCTCACGGAGTGTATTCAGG-3′和NIbD：5′-GGTGCTGCTGTAAAAGTCCG-3′对菌液进行PCR鉴定，得到重组农秆菌，命名为LBA4404/p3301SCMVirNIb。

3)通过农秆菌介导法将RNAi植物表达载体p3301SCMVirNIb转入玉米D-inf液配方(1L)：N6大量(20×)50mL，B5微量(100×)10mL，Dicamba3.3mg，Fe盐(200×)5mL，RTV(100×)10mL，酪蛋白水解物0.5g，L-脯氨酸0.7g，蔗糖68.5g，葡萄糖36g，肌醇0.1g，pH5.2。

D-AS培养基配方(1L)：N6大量(20×)50mL，B5微量(100×)10mL，Dicamba3.3mg，Fe盐(200×)5mL，RTV(100×)10mL，酪蛋白水解物0.5g，L-脯氨酸0.7g，AgNO₃ 10mg，乙酰丁香酮3.3mg，蔗糖20g，葡萄糖10g，肌醇0.1g，琼脂粉8g，pH5.8。

D培养基配方(1L)：N6大量(20×)50mL，B5微量(100×)10mL，Dicamba3.3mg，Fe盐(200×)5mL，RTV(100×)10mL，酪蛋白水解物0.5g，L-脯氨酸0.7g，蔗糖20g，葡萄糖10g，肌醇0.1g，琼脂粉8g，pH5.8。

玉米综3人工授粉10-13天后，取幼穗剥去苞叶，在70％酒精中浸泡30秒后剥幼胚，将其浸入用D-inf液悬浮的重组农秆菌LBA4404/p3301SCMVirNIb菌液，放置5min以上，取出用灭菌滤纸吸干，放到D-AS培养基上，25℃暗培养3天。然后将幼胚放到含有除草剂(10mgPPT/L)的D培养基上筛选培养，2周继代一次，共继代4次，筛选出抗性愈伤组织。把抗性愈伤放到诱导培养基(将D培养基中的麦草畏(Dicamba)减为1mg/L，再添加6-BA 5mg/L)上培养10d，诱导生成胚状体。将胚状体放到分化培养基(不加Dicamba的D培养基)上光照培养，胚状体分化成苗。小苗转到1/2MS培养基上培养，长出较粗的根后，取出幼苗，自来水冲净培养基，移栽于混有营养土和蛭石(营养土和蛭石的混合比例为1∶3)的小花盆中练苗，待长出2-3片新叶时，将其移入温室(或大田)，结果共得到26株生长正常的再生苗。

4)转基因玉米植株的分子检测

用SDS法提取转RNAi植物表达载体p3301SCMVirNIb的玉米基因组DNA约100ng，用引物NIbU和NIbD进行PCR检测，以构建的RNAi载体为模板，利用引物NIbU和NIbD的PCR扩增产物为阳性对照，以同品种非转基因玉米植株的基因组DNA为模板；利用引物NIbU和NIbD的PCR扩增产物为阴性对照。PCR反应条件为：先94℃ 5min；再94℃ 45sec，56℃ 45sec，72℃ 45sec，共30个循环；最后72℃ 8min。反应结束后，将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果26株中有14株可扩增出560bp的特异性条带，为阳性转基因植株，阴性对照未扩增出该特异性条带。

将经PCR检测为阳性的植株定为转基因植株。对这些转基因植株的T₁代和T₂代植株分别在温室和田间人工接种甘蔗花叶病毒，同时以同品种非转基因玉米作对照，观测发病症状，并作间接ELISA分析，测定病毒浓度。

其中，甘蔗花叶病毒的接种方法为：将感染了甘蔗花叶病毒的玉米叶片于液氮中研磨至粉末状，加10倍体积(W/V)的提取缓冲液(0.01M PB，pH7.0，配方为Na₂HPO₄.12H₂O，43.7g，NaH₂PO₄.H₂O 12.2g，蒸馏水定容至11)，摇动混匀后3000rpm离心5min取上清。待玉米长出2叶一心时，在心叶下一叶正面撒上600目金刚砂，棉球蘸病毒汁液单向摩擦两次，1周后再重复接种病毒一次，共接种3次。

用间接ELISA检测病毒浓度的操作步骤如下：

(1)取0.2克叶片，液氮研磨，加10mL包被缓冲液(0.05M的碳酸盐缓冲液，pH9.6)，低速离心(2500rpm/min)，取上清；

(2)酶标板中每孔加200μL步骤(1)提取的上清液，设2个重复。上样后加盖，4℃包被12-24小时；

(3)甩干，用200μL洗涤液(0.02M的PBST，pH7.4，配方为：取pH8.0的高压灭菌的100mmol的Tris-HCl100mL，1.5mol的NaCl 100mL，0.5mL Tween-20，定容至1L)洗涤3次，每次3min；

(4)每孔加200μL封闭液(0.1gBSA溶于10mlPBST溶液中，PBST配方为：NaCl8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 2.9g，KH₂PO₄ 0.2g，NaN₃ 0.2g，定容至1L后，加0.5mLTween-20)，37℃反应1h；倾去孔内封闭液，同样方法冲洗3次；

(5)每孔加150μL的兔抗血清(由中国科学院遗传研究所制备)(PBST稀释，或用健康叶汁液稀释100倍)，37℃反应2h；倾去孔内封闭液，同样方法冲洗3次；

(6)每孔加150μL样品稀释液稀释2500倍的辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG(SAR-IgG-HRP，购自Promega)，37℃反应2h；

(7)PBST冲洗3次，蒸馏水冲洗2次，除净孔内水分；

(8)每孔加邻苯二胺(OPD)底物溶液(含0.04g联苯二氨，20mL底物缓冲液(5.1g柠檬酸，18.43g NaHPO₄，加1L水溶解后加0.5mL Tween-20)和8μL H₂O₂)150μL，室温或37℃显色5-10min；

(9)加入50μL 2M的H₂SO₄终止反应；

(10)在酶标分光光度计上测490nm波长下的OD值(测定时每个样品均设2次重复)。

对冬季种于温室的步骤3)获得的转基因玉米的T₁代株行，重复3次(每次间隔3天)接种甘蔗花叶病毒。10天后进行观测，感病株上部叶片出现明显的褪绿点线，有的褪绿面积比较大，条纹连片，甚至叶片变黄，并逐渐显现一定程度的矮化，抗病株则表现正常，抗病与感病株差异明显，易于区分。在14个株行中，转基因玉米有11个株行的感病株率低于40％，而非转基因对照行的感病株率高于85％。提取植株的基因组DNA，在引物NIbU和NIbD的引导下进行PCR扩增甘蔗花叶病毒的复制酶基因，抗病株目的基因的PCR阳性株率为92％，非转基因对照株均呈阴性，表明抗病性与转基因高度相关。

根据T₁代植株抗病性鉴定，结合PCR检测结果，在田间继续种植T₂代株系。在人工接种病毒的条件下，有3个株系的抗病株率高于85％，而非转基因对照行100％感病。用上述相同反应条件和引物作PCR检测抗病株，均扩出了甘蔗花叶病毒的复制酶基因的目标带，而非转基因对照株均呈阴性。ELISA检测结果表明，转基因抗病株的OD值与未接病的健康植株无明显差异，明显低于接病的非转基因对照株，与症状观测结果一致。

在成熟期测量了3个T₂代株系的株高，并以相邻的非转基因行作对照。结果表明，非转基因对照的平均株高不足转基因植株平均株高的90％，减低了20cm左右。t检验结果表明，3个转基因株系与相邻对照的株高差异均达极显著水平。非转基因对照株叶色明显变黄，叶面积变小，后期叶片早衰，穗子变小，穗粒数减少。表明用本发明的方法得到的转基因玉米对相关病毒的抗性程度高，较易得到稳定的抗病株系。

                                      序列表

<160>6

<210>1

<211>1044

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

agcguugaag aacaauguga gguuacagag acauggcuca cggaguguau ucaggauaau      60

uuacagguug uugcaaaaug uccaggccaa cuugucacca agcacguugu caaaggccca     120

ugcccacacu uucagcuaua ccugucaaca caugaugaag cuaaagcaua cuuugcacca     180

uuacucggga aauacgacaa gagcagauua aacagagcag cuuuuaucaa agacauuuca     240

aaauaugcaa aaccaaucua cauuggagaa aucaauuacg augucuuuga aaaggcuaua     300

caacguguaa uuaaaauucu uagagacgug ggaaugcagc aaugcacgua uguaacggac     360

gaggaugaaa uauuccaguc acuuaaccuc aacgcugcag uuggcgccuu auacacagga     420

aagaagaaag auuauuucaa ggauuuuuca aaugaggaca aaucagaaau uaucaugaga     480

uccugugagc guuuauacaa cggacaccuu ggcgugugga augguucacu caaagcugaa     540

auaaggccua uagagaaaac aauguuaaau aagacucgga cuuuuacagc agcaccauua     600

gaaacuuuac uugguggcaa ggucuguguu gaugauuuca acaaccaauu cuacucgcac     660

cacuuagaag guccuuggac aguuggaaua acaaaguuuu auggugggug gaaccguuug     720

uuggaaaaau ugccagaugg uuggauauac ugcgacgccg auggaucaca guucgacagc     780

ucuuugacac cauaucucau caacgccgua uuacacauuc gauuacaauu cauggaagaa     840

uggaacuuag gagaacaaau guugcgaaac uuguacacug aaaucgugua cacaccaauu     900

gcaacaccag auggaucugu aaucaagaaa uuuaaaggaa auaacagcgg gcagccguca     960

acaguuguag acaacacacu cauggugaua uuagcauuua auuaugcaau guuaucaagu    1020

gguguuaaag aggaagaaau agcc                                           1044

<210>2

<211>900

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

aauuggugug uacacgauuu caguguacaa guuucgcaac auuuguucuc cuaaguucca      60

uucuuccaug aauuguaauc gaauguguaa uacggcguug augagauaug gugucaaaga     120

gcugucgaac ugugauccau cggcgucgca guauauccaa ccaucuggca auuuuuccaa     180

caaacgguuc cacccaccau aaaacuuugu uauuccaacu guccaaggac cuucuaagug     240

gugcgaguag aauugguugu ugaaaucauc aacacagacc uugccaccaa guaaaguuuc     300

uaauggugcu gcuguaaaag uccgagucuu auuuaacauu guuuucucua uaggccuuau     360

uucagcuuug agugaaccau uccacacgcc aagguguccg uuguauaaac gcucacagga     420

ucucaugaua auuucugauu uguccucauu ugaaaaaucc uugaaauaau cuuucuucuu     480

uccuguguau aaggcgccaa cugcagcguu gagguuaagu gacuggaaua uuucauccuc     540

guccguuaca uacgugcauu gcugcauucc cacgucucua agaauuuuaa uuacacguug     600

uauagccuuu ucaaagacau cguaauugau uucuccaaug uagauugguu uugcauauuu     660

ugaaaugucu uugauaaaag cugcucuguu uaaucugcuc uugucguauu ucccgaguaa     720

uggugcaaag uaugcuuuag cuucaucaug uguugacagg uauagcugaa agugugggca     780

ugggccuuug acaacgugcu uggugacaag uuggccugga cauuuugcaa caaccuguaa     840

auuauccuga auacacuccg ugagccaugu cucuguaacc ucacauuguu cuucaacgcu     900

<210>3

<211>1944

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

agcgttgaag aacaatgtga ggttacagag acatggctca cggagtgtat tcaggataat      60

ttacaggttg ttgcaaaatg tccaggccaa cttgtcacca agcacgttgt caaaggccca     120

tgcccacact ttcagctata cctgtcaaca catgatgaag ctaaagcata ctttgcacca     180

ttactcggga aatacgacaa gagcagatta aacagagcag cttttatcaa agacatttca     240

aaatatgcaa aaccaatcta cattggagaa atcaattacg atgtctttga aaaggctata     300

caacgtgtaa ttaaaattct tagagacgtg ggaatgcagc aatgcacgta tgtaacggac     360

gaggatgaaa tattccagtc acttaacctc aacgctgcag ttggcgcctt atacacagga     420

aagaagaaag attatttcaa ggatttttca aatgaggaca aatcagaaat tatcatgaga     480

tcctgtgagc gtttatacaa cggacacctt ggcgtgtgga atggttcact caaagctgaa     540

ataaggccta tagagaaaac aatgttaaat aagactcgga cttttacagc agcaccatta     600

gaaactttac ttggtggcaa ggtctgtgtt gatgatttca acaaccaatt ctactcgcac     660

cacttagaag gtccttggac agttggaata acaaagtttt atggtgggtg gaaccgtttg     720

ttggaaaaat tgccagatgg ttggatatac tgcgacgccg atggatcaca gttcgacagc     780

tctttgacac catatctcat caacgccgta ttacacattc gattacaatt catggaagaa     840

tggaacttag gagaacaaat gttgcgaaac ttgtacactg aaatcgtgta cacaccaatt     900

gcaacaccag atggatctgt aatcaagaaa tttaaaggaa ataacagcgg gcagccgtca     960

acagttgtag acaacacact catggtgata ttagcattta attatgcaat gttatcaagt    1020

ggtgttaaag aggaagaaat agccaattgg tgtgtacacg atttcagtgt acaagtttcg    1080

caacatttgt tctcctaagt tccattcttc catgaattgt aatcgaatgt gtaatacggc    1140

gttgatgaga tatggtgtca aagagctgtc gaactgtgat ccatcggcgt cgcagtatat    1200

ccaaccatct ggcaattttt ccaacaaacg gttccaccca ccataaaact ttgttattcc    1260

aactgtccaa ggaccttcta agtggtgcga gtagaattgg ttgttgaaat catcaacaca    1320

gaccttgcca ccaagtaaag tttctaatgg tgctgctgta aaagtccgag tcttatttaa    1380

cattgttttc tctataggcc ttatttcagc tttgagtgaa ccattccaca cgccaaggtg    1440

tccgttgtat aaacgctcac aggatctcat gataatttct gatttgtcct catttgaaaa    1500

atccttgaaa taatctttct tctttcctgt gtataaggcg ccaactgcag cgttgaggtt    1560

aagtgactgg aatatttcat cctcgtccgt tacatacgtg cattgctgca ttcccacgtc    1620

tctaagaatt ttaattacac gttgtatagc cttttcaaag acatcgtaat tgatttctcc    1680

aatgtagatt ggttttgcat attttgaaat gtctttgata aaagctgctc tgtttaatct    1740

gctcttgtcg tatttcccga gtaatggtgc aaagtatgct ttagcttcat catgtgttga    1800

caggtatagc tgaaagtgtg ggcatgggcc tttgacaacg tgcttggtga caagttggcc    1860

tggacatttt gcaacaacct gtaaattatc ctgaatacac tccgtgagcc atgtctctgt    1920

aacctcacat tgttcttcaa cgct                                           1944

<210>4

<211>1944

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

tcgcaacttc ttgttacact ccaatgtctc tgtaccgagt gcctcacata agtcctatta      60

aatgtccaac aacgttttac aggtccggtt gaacagtggt tcgtgcaaca gtttccgggt     120

acgggtgtga aagtcgatat ggacagttgt gtactacttc gatttcgtat gaaacgtggt     180

aatgagccct ttatgctgtt ctcgtctaat ttgtctcgtc gaaaatagtt tctgtaaagt     240

tttatacgtt ttggttagat gtaacctctt tagttaatgc tacagaaact tttccgatat     300

gttgcacatt aattttaaga atctctgcac ccttacgtcg ttacgtgcat acattgcctg     360

ctcctacttt ataaggtcag tgaattggag ttgcgacgtc aaccgcggaa tatgtgtcct     420

ttcttctttc taataaagtt cctaaaaagt ttactcctgt ttagtcttta atagtactct     480

aggacactcg caaatatgtt gcctgtggaa ccgcacacct taccaagtga gtttcgactt     540

tattccggat atctcttttg ttacaattta ttctgagcct gaaaatgtcg tcgtggtaat     600

ctttgaaatg aaccaccgtt ccagacacaa ctactaaagt tgttggttaa gatgagcgtg     660

gtgaatcttc caggaacctg tcaaccttat tgtttcaaaa taccacccac cttggcaaac     720

aaccttttta acggtctacc aacctatatg acgctgcggc tacctagtgt caagctgtcg     780

agaaactgtg gtatagagta gttgcggcat aatgtgtaag ctaatgttaa gtaccttctt     840

accttgaatc ctcttgttta caacgctttg aacatgtgac tttagcacat gtgtggttaa     900

cgttgtggtc tacctagaca ttagttcttt aaatttcctt tattgtcgcc cgtcggcagt     960

tgtcaacatc tgttgtgtga gtaccactat aatcgtaaat taatacgtta caatagttca    1020

ccacaatttc tccttcttta tcggttaacc acacatgtgc taaagtcaca tgttcaaagc    1080

gttgtaaaca agaggattca aggtaagaag gtacttaaca ttagcttaca cattatgccg    1140

caactactct ataccacagt ttctcgacag cttgacacta ggtagccgca gcgtcatata    1200

ggttggtaga ccgttaaaaa ggttgtttgc caaggtgggt ggtattttga aacaataagg    1260

ttgacaggtt cctggaagat tcaccacgct catcttaacc aacaacttta gtagttgtgt    1320

ctggaacggt ggttcatttc aaagattacc acgacgacat tttcaggctc agaataaatt    1380

gtaacaaaag agatatccgg aataaagtcg aaactcactt ggtaaggtgt gcggttccac    1440

aggcaacata tttgcgagtg tcctagagta ctattaaaga ctaaacagga gtaaactttt    1500

taggaacttt attagaaaga agaaaggaca catattccgc ggttgacgtc gcaactccaa    1560

ttcactgacc ttataaagta ggagcaggca atgtatgcac gtaacgacgt aagggtgcag    1620

agattcttaa aattaatgtg caacatatcg gaaaagtttc tgtagcatta actaaagagg    1680

ttacatctaa ccaaaacgta taaaacttta cagaaactat tttcgacgag acaaattaga    1740

cgagaacagc ataaagggct cattaccacg tttcatacga aatcgaagta gtacacaact    1800

gtccatatcg actttcacac ccgtacccgg aaactgttgc acgaaccact gttcaaccgg    1860

acctgtaaaa cgttgttgga catttaatag gacttatgtg aggcactcgg tacagagaca    1920

ttggagtgta acaagaagtt gcga                                           1944

<210>5

<211>1044

<212>DNA

<213>玉米属玉米(Zea mays L.)

<400>5

agcgttgaag aacaatgtga ggttacagag acatggctca cggagtgtat tcaggataat      60

ttacaggttg ttgcaaaatg tccaggccaa cttgtcacca agcacgttgt caaaggccca     120

tgcccacact ttcagctata cctgtcaaca catgatgaag ctaaagcata ctttgcacca     180

ttactcggga aatacgacaa gagcagatta aacagagcag cttttatcaa agacatttca     240

aaatatgcaa aaccaatcta cattggagaa atcaattacg atgtctttga aaaggctata     300

caacgtgtaa ttaaaattct tagagacgtg ggaatgcagc aatgcacgta tgtaacggac     360

gaggatgaaa tattccagtc acttaacctc aacgctgcag ttggcgcctt atacacagga     420

aagaagaaag attatttcaa ggatttttca aatgaggaca aatcagaaat tatcatgaga     480

tcctgtgagc gtttatacaa cggacacctt ggcgtgtgga atggttcact caaagctgaa     540

ataaggccta tagagaaaac aatgttaaat aagactcgga cttttacagc agcaccatta     600

gaaactttac ttggtggcaa ggtctgtgtt gatgatttca acaaccaatt ctactcgcac     660

cacttagaag gtccttggac agttggaata acaaagtttt atggtgggtg gaaccgtttg     720

ttggaaaaat tgccagatgg ttggatatac tgcgacgccg atggatcaca gttcgacagc     780

tctttgacac catatctcat caacgccgta ttacacattc gattacaatt catggaagaa     840

tggaacttag gagaacaaat gttgcgaaac ttgtacactg aaatcgtgta cacaccaatt     900

gcaacaccag atggatctgt aatcaagaaa tttaaaggaa ataacagcgg gcagccgtca     960

acagttgtag acaacacact catggtgata ttagcattta attatgcaat gttatcaagt    1020

ggtgttaaag aggaagaaat agcc                                           1044

<210>6

<211>896

<212>DNA

<213>玉米属玉米(Zea mays L.)

<400>6

agcgttgaag aacaatgtga ggttacagag acatggctca cggagtgtat tcaggataat      60

ttacaggttg ttgcaaaatg tccaggccaa cttgtcacca agcacgttgt caaaggccca     120

tgcccacact ttcagctata cctgtcaaca catgatgaag ctaaagcata ctttgcacca     180

ttactcggga aatacgacaa gagcagatta aacagagcag cttttatcaa agacatttca     240

aaatatgcaa aaccaatcta cattggagaa atcaattacg atgtctttga aaaggctata     300

caacgtgtaa ttaaaattct tagagacgtg ggaatgcagc aatgcacgta tgtaacggac     360

gaggatgaaa tattccagtc acttaacctc aacgctgcag ttggcgcctt atacacagga     420

aagaagaaag attatttcaa ggatttttca aatgaggaca aatcagaaat tatcatgaga     480

tcctgtgagc gtttatacaa cggacacctt ggcgtgtgga atggttcact caaagctgaa     540

ataaggccta tagagaaaac aatgttaaat aagactcgga cttttacagc agcaccatta     600

gaaactttac ttggtggcaa ggtctgtgtt gatgatttca acaaccaatt ctactcgcac     660

cacttagaag gtccttggac agttggaata acaaagtttt atggtgggtg gaaccgtttg     720

ttggaaaaat tgccagatgg ttggatatac tgcgacgccg atggatcaca gttcgacagc     780

tctttgacac catatctcat caacgccgta ttacacattc gattacaatt catggaagaa     840

tggaacttag gagaacaaat gttgcgaaac ttgtacactg aaatcgtgta cacacc         896

Claims (10)

1、提高玉米对矮花叶病抗性的干扰RNA，是正义链具有序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列，反义链具有序列表中SEQ ID №：2的双链RNA序列。

2、权利要求1所述的提高玉米对矮花叶病抗性的干扰RNA的编码基因。

3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述提高玉米对矮花叶病抗性的干扰RNA的编码基因是下述双链核苷酸序列：正义链具有序列表中SEQ ID №：3的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQ ID №：4的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

4、含有权利要求2或3所述编码基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。

5、一种提高玉米对矮花叶病抗性的方法，是将权利要求2或3所述的提高玉米对矮花叶病抗性的干扰RNA的编码基因导入玉米外植体，得到矮花叶病抗性提高的玉米。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述提高玉米对矮花叶病抗性的干扰RNA的编码基因通过含有所述提高玉米对矮花叶病抗性的干扰RNA的编码基因的RNAi植物表达载体导入玉米外植体；用于构建所述RNAi植物表达载体的出发载体为pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1301、pCAMBIA3301、pART27或pBin19。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：用于构建所述RNAi植物表达载体的出发载体为pCAMBIA3301。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述RNAi植物表达载体为p3301SCMVirNIb。

9、根据权利要求5或6或7或8所述的方法，其特征在于：将所述提高玉米对矮花叶病抗性的干扰RNA编码基因导入玉米外植体的方法为农杆菌介导法、基因枪法、电击法、花粉管导入法或脂质体融合法；所述农杆菌为根癌农杆菌LBA4404。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述玉米的品种为综3、综31、齐31、黄早四、先早17、P138或郑87-1。

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