CN111363787A

CN111363787A - 一种检测双链rna的方法及其试剂盒与应用

Info

Publication number: CN111363787A
Application number: CN202010289477.1A
Authority: CN
Inventors: 王乐乐; 刘刚; 许丽; 闻艳丽; 杨镇州; 杨雪; 李兰英
Original assignee: Shanghai Institute of Measurement and Testing Technology
Current assignee: Shanghai Institute of Measurement and Testing Technology
Priority date: 2020-04-14
Filing date: 2020-04-14
Publication date: 2020-07-03
Anticipated expiration: 2040-04-14
Also published as: CN111363787B

Abstract

本发明提供一种检测双链RNA的方法及其试剂盒与应用。所述方法包括如下步骤：待测样品中的双链RNA、taqman探针与RNA间隔探针杂交得到杂交产物，利用双链特异性核酸酶进行切割，所述taqman探针从所述杂交产物上脱落并发出荧光，而后继续杂交并切割，分析荧光信号，得到所述双链RNA的检测结果。所述方法操作简单，利用DSN酶的切割特性，切割杂交所得到的DNA/RNA双链，被切割之后的taqman探针从双链上脱落并发出荧光，所述RNA间隔探针能够促进RNA二级结构的展开，提高taqman探针与dsRNA的杂交效率，实现定量检测，检测范围广，能够检测1pM～50nM范围内的dsDNA。

Description

一种检测双链RNA的方法及其试剂盒与应用

技术领域

本发明属于核酸检测领域，涉及一种检测双链RNA的方法及其试剂盒与应用，尤其涉及一种检测RNAi转基因作物中的双链RNA的方法及其试剂盒与应用。

背景技术

DSN(Duplex-specific nuclease，双链特异性核酸酶)是一种从堪察加螃蟹(Paralithodes camtschaticus)肝胰腺中提取的一种热稳定核酸酶，能够选择性降解双链DNA和DNA-RNA杂交体中的DNA，对ssDNA或RNA几乎没有活性。由于DSN的独特的性质，在设计合成的DNA探针形成DNA-RNA杂交时，DSN非常适合于RNA的检测。近年来，荧光法、电化学法和比色法中广泛使用DSN检测RNA，且具有很高的灵敏度。

RNA干扰(RNAi)是指外源性的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子引起的序列特异性降解靶基因信使RNA(mRNA)，导致内源靶基因沉默的现象。RNAi首先发现于秀丽隐杆线虫中，随后逐渐成为一种有力的工具被用于新型转基因抗虫作物的培育。与传统转基因技术相比，RNAi技术应用于抗虫作物上时具有更高的特异性，效果更好。然而，RNAi技术潜在的风险包括非期望的基因沉默和对人与环境的危害也引起了人们的关注。

由于RNAi转基因作物不表达新的蛋白，所以dsRNA成了RNAi转基因作物检测的最佳候选物。然而，相比于MicroRNA(miRNA)，RNAi产生的dsRNA具有复杂的二级结构，这对于准确、灵敏地检测dsRNA是一个极大的挑战。

生物样品中dsRNA的检测方法包括逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和Northernblots。尽管变性的Northern blots可以检测出dsRNA的种类，但是这个方法的通量很低，而且需要大量的RNA样品。RT-PCR是一个高通量的检测方法，能够扩增具有复杂二级结构、反向重复序列的dsRNA。

但是，RT-PCR扩增dsRNA也存在一些缺点，比如RNA双向表达时的自启动会干扰模板的特异性，特异性地检测dsRNA时需要修改标准的RT-PCR方法。此外，RNA样品需要纯化，以消除与基因组DNA中同源序列的杂交。同时，dsRNA复杂的二级结构常常会导致检测结果准确度较低，且灵敏度较差。

因此，开发一种准确、灵敏度高且操作简单的dsRNA检测方法，是检测RNAi转基因植物中dsRNA时亟需解决的问题。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供了一种检测双链RNA的方法及其试剂盒与应用，即基于杂交的荧光平台并辅以DSN酶的信号放大手段，实现双链RNA的定量分析，且所述方法简单、快速、特异且灵敏度较高。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种检测双链RNA(dsRNA)的方法，所述方法包括如下步骤：taqman探针、RNA间隔探针(RNAspacer)与待测样品中的双链RNA杂交得到杂交产物，利用双链特异性核酸(DSN)酶进行切割，所述taqman探针从所述杂交产物上脱落并发出荧光，而后继续杂交并切割，分析荧光信号，得到所述双链RNA的检测结果。

本发明所提供的检测双链RNA的方法，操作简单，利用双链特异性核酸酶的切割特性，切割杂交所得到的DNA/RNA双链上的DNA，所述DNA为taqman探针，被切割之后从双链上脱落，并且发出荧光，由于dsRNA的结构较为复杂，所述RNA间隔探针能够促进RNA二级结构的展开，提高taqman探针与dsRNA的杂交效率，实现dsDNA的定量检测，检测范围广，能够检测1pM～50nM范围内的dsDNA。

由于dsRNA茎环结构容易改变，常常会阻碍taqman探针与dsRNA之间的下一轮杂交，这限制了DSN酶辅助的信号放大过程。然而，在存在RNA间隔探针的情况下，RNA间隔探针可以抵抗DSN酶的分解消化并继续与靶dsRNA结合，这有助于DNAtaqman探针和dsRNA之间的下一轮杂交。

作为本发明优选的技术方案，所述taqman探针的制备方法为：

根据待测样品中双链RNA的核苷酸序列设计出配对的DNA序列，合成，并在所述DNA序列的5′端修饰荧光基团，3′端修饰荧光淬灭基团得到所述taqman探针。

优选地，所述taqman探针的数量为至少两条。

本发明中，所述taqman探针的数量为至少两条，优选为2～5条，且探针数量不宜过多，否则会导致反应体系本身背景荧光值信号较高，影响检测结果。

作为本发明优选的技术方案，所述RNA间隔探针的制备方法为：根据待测样品中双链RNA的核苷酸序列设计出配对的RNA序列，合成得到所述RNA间隔探针。

优选地，所述RNA间隔探针的数量为至少两条。

本发明中所述RNA间隔探针的数量为三条，设计RNA间隔探针的目的在于促进RNA二级结构的展开，促进taqman探针与dsRNA的杂交，提高检测灵敏度，若是不添加RNA间隔探针，由于双链RNA本身复杂结构的影响，taqman探针与目的dsRNA的结合效率较低，不易检测，影响检测结果的准确度。

优选地，所述taqman探针配对的核苷酸序列位于所述RNA间隔探针配对的核苷酸序列之间。

作为本发明优选的技术方案，所述方法包括如下步骤：

(1)将taqman探针、RNA间隔探针与待测样品混合，加热后退火，杂交，所述taqman探针、RNA间隔探针与所述待测样品中的双链RNA发生杂交得到杂交产物；

(2)在双链特异性核酸酶的作用下对步骤(1)所述的杂交产物进行切割，所述杂交产物上的taqman探针被切割并脱落，发出荧光；

(3)taqman探针脱落后的杂交产物与体系中游离的完整的taqman探针杂交，而后再被所述双链特异性核酸酶切割，继续循环，分析被切割的taqman探针发出的荧光信号，得到所述双链RNA的检测结果。

作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述加热的温度为80-99℃，例如可以是80℃、82℃、84℃、86℃、88℃、90℃、92℃、94℃、96℃、98℃或99℃等；时间为5-15min，例如可以是5min、6min、8min、10min、12min、13min、14min或15min等。

优选地，步骤(2)所述双链特异性核酸酶的工作温度为55-65℃，例如可以是55℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃或65℃等。

优选地，步骤(3)所述循环的时间为20-60min，例如可以是20min、25min、28min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min等。

优选地，终止步骤(3)所述循环的方法为加入双链特异性核酸酶终止反应液。

作为本发明优选的技术方案，步骤(3)所述分析操作还包括制备标准曲线。

优选地，所述标准曲线的制备方法为：采用已知浓度的dsRNA、taqman探针与RNA间隔探针杂交得到杂交产物，利用双链特异性核酸酶进行切割，所述taqman探针从所述杂交产物上脱落并发出荧光，而后继续杂交并切割，分析荧光信号，并绘制浓度与荧光信号值的标准曲线。

优选地，所述方法包括如下步骤：

(1)将待测样品、taqman探针与RNA间隔探针混合，80-99℃加热5-15min，退火，所述待测样品中的双链RNA与所述taqman探针和RNA间隔探针发生杂交，得到杂交产物；

(2)双链特异性核酸酶在55-65℃下，对步骤(1)所述的杂交产物进行切割，所述杂交产物上的taqman探针被切割并脱落，发出荧光；

(3)taqman探针脱落后的杂交产物与体系中游离的完整的taqman探针杂交，而后再被所述双链特异性核酸酶切割，继续循环，所述循环的时间为20-60min，加入双链特异性核酸酶终止反应液，分析被切割的taqman探针发出的荧光信号，得到所述双链RNA的检测结果。

本发明所述的检测方法的具体实验原理如下：

在检测体系中包含DSN酶缓冲溶液，RNA酶抑制剂，两条taqman探针，记为P1和P2，三条RNA间隔探针RNA spacer-1(记为RS-1)、RNAspacer-2(记为RS-2)和RNA spacer-3(记为RS-3)，以及目标dsRNA。

为了克服目标dsRNA的强二级结构，本发明采用了3种RNA间隔探针，即与完全互补的RNA，在taqman探针与目标dsRNA的反应过程中能够被循环利用。且加入RNA间隔探针之后，所检测到的荧光信号比没有添加RNA间隔探针的荧光信号增加约26％。

本发明可以采用如下实验步骤：

首先加热使dsRNA打开复杂的二级结构，然后缓慢冷却至室温，使P1、P2、RS-1、RS-2和RS-3和dsRNA杂交。

随后加入DSN酶，在合适的反应温度下反应一段时间，由于DSN酶只特异性地切割DNA/RNA双链中的DNA，而不切割RNA以及游离的单链DNA，所以两条taqman探针P1和P2被切断，从dsRNA脱离下来。

其中，DSN酶的最佳用量、DSN的最佳反应温度和DSN的最佳反应时间可以根据目标dsRNA序列、探针序列进行适当的调整，使得检测方法的准确度和灵敏度得以提高。

而dsRNA和三条RNA间隔探针继续和新的两条taqman探针P1和P2结合，接着P1和P2又被DSN酶切断，如此循环往复，实现荧光信号的放大。

接着加入DSN酶终止反应液，使DSN酶失活，最后，将溶液转移到比色皿中，进行荧光信号检测。

第二方面，本发明还提供一种检测双链RNA的试剂盒，所述试剂盒利用如第一方面所述的方法检测双链RNA，该试剂盒中包括：taqman探针、RNA间隔探针、双链特异性核酸酶和RNA酶抑制剂。

优选地，所述试剂盒中包含至少两条taqman探针。

优选地，所述试剂盒中包含至少两条RNA间隔探针。

优选地，所述试剂盒中还包含双链特异性核酸酶缓冲液。

优选地，所述试剂盒中还包含双链特异性核酸酶终止反应液。

第三方面，本发明还提供一种如第二方面所述的试剂盒在检测RNAi转基因作物的双链RNA含量中的应用。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明所提供的检测双链RNA的方法，操作简单，无需复杂的操作和繁琐的仪器，利用双链特异性核酸酶、RNA间隔探针以及荧光平台，实现dsRNA的定量检测，该方法简单、快速，特异性高，灵敏度较好。本发明所述的方法允许在1pM到50nM(超过5个数量级)的范围内定量检测dsRNA，灵敏度较高，其检测限为1pM，当其直接应用于分析转基因玉米中提取的总RNA，其选择性较好。

附图说明

图1为基于DSN酶放大荧光信号检测dsRNA的原理示意图。

图2为实施例2中得到的凝胶电泳图，其中通道1～9分别表示不同体系得到的电泳条带，通道M表示DNA marker。

图3为不同体系下探针复合物的荧光发射光谱，其中曲线a表示体系中仅含有探针复合物，曲线b表示体系中含有探针复合物和dsRNA，曲线表示体系中含有探针复合物、dsRNA和DSN酶。

图4(a)为荧光信号值随着DSN酶的用量变化曲线图。

图4(b)为荧光信号值随着反应温度的变化曲线图。

图4(c)为荧光信号值随着反应时间的变化曲线图。

图5(a)为加入不同浓度的dsRNA后观察到的荧光发射光谱。

图5(b)为dsRNA浓度分别为1pM、10pM、100pM、500pM和1000pM时检测到的信号值柱状图。

图5(c)为荧光信号值随着dsRNA浓度变化曲线图。

图6为实施例5中检测不同样本时所得荧光信号值对比图。

图7为加入与未加入RNA间隔探针所得到的荧光信号值对比图。

图8(a)为探针复合物S1与dsRNA杂交后的杂交产物结构示意图。

图8(b)为探针复合物S2与dsRNA杂交后的杂交产物结构示意图。

图8(c)为探针复合物S3与dsRNA杂交后的杂交产物结构示意图。

图9为在DSN酶的存在下三种探针复合物与dsRNA反应后检测到的荧光信号值对比图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

首先，结合图1对本发明提供的检测方法进行简单说明：

在检测体系中，包含DSN缓冲溶液，RNA酶抑制剂，两条taqman探针P1和P2，三条RNA间隔探针RS-1、RS-2和RS-3以及dsRNA目标。

首先95℃加热10min，使dsRNA打开复杂的二级结构，然后缓慢冷却至室温，P1、P2、RS-1、RS-2和RS-3和dsRNA杂交。

随后加入DSN酶，60℃反应30min，由于DSN酶只特异性地切割DNA/RNA双链中的DNA，而不切割RNA以及游离的单链DNA，所以两条taqman探针P1和P2被切断，从dsRNA脱离下来。

而dsRNA和三条RNA间隔探针继续和新的两条taqman探针P1和P2结合，接着P1和P2又被DSN酶切断，如此循环往复，经过N次循环之后，实现荧光信号的放大。

以下实施例中，植物总RNA提取试剂盒、RNA纯化试剂盒、体外转录试剂盒和数字PCR混合试剂盒均购自Thermofisher(中国上海)；Ex Taq酶、DNA片段纯化试剂盒和1^st链cDNA合成试剂盒均购自Takara(中国大连)；质粒提取试剂盒购自Macherey Nagel(美国)；RNA生物分析仪购自美国安捷伦公司；双链特异核酸酶(DSN)由Evrogen(俄罗斯莫斯科)提供；RNase抑制剂和焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水购自Sangon(中国上海)。

以下实施例中，dsRNA中852bp的DNA片段由Bioligo(上海)合成并克隆；高效液相色谱纯的单链RNA由Takara(大连)合成；荧光/猝灭基团标记的Taqman探针由Invitrogen(上海)合成。

以下实施例中，所有其他化学品均为分析试剂级，未经进一步纯化即可使用，超纯水是从电阻率为18.2MΩ·cm的Mili-Q净水系统中获得的；为了创造和维持无核糖核酸酶的环境，本发明中使用的所有水溶液均经0.1％DEPC处理和高压灭菌，并且实验过程中使用的耗材如枪头和试管等均为无核糖核酸酶(RNase-free)，不需要预处理来灭活核糖核酸酶。

实施例1

本实施例提供一种双链RNA(dsRNA)的检测方法，所用的taqman探针和RNA间隔探针的序列如SEQ ID NO.1～5所示，用于检测目标dsRNA：

具体检测过程如下：

(1)含dsRNA片段的目标RNA的体外转录

本实施例中合成了一个含有目标dsRNA的反向重复序列(inverted repeats，261bp)和中性间隔区(neutral spacer，98bp)的DNA片段，其长度为852bp，并将其克隆到含T7启动子的pET-28a(+)载体中；

然后用PCR方法从重组质粒中扩增出一段长度为1034bp的含有dsRNA和T7启动子序列的片段；其使用的引物序列如SEQ ID NO.6～7所示，分别为：

PCR primer F(SEQ ID NO.6)：

TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTG；

PCR primer R(SEQ ID NO.7)：AAGCTTTACATGCTTAACGTAATTC。

PCR产物经凝胶纯化试剂盒纯化，作为体外转录的模板DNA；

纯化的PCR产物在转录缓冲液中与RNA聚合酶在37℃孵育1h进行体外转录，转录反应混合物在37℃下用Dnase I处理30min，去除模板DNA，用RNA纯化试剂盒进行纯化，所得到的RNA作为检测方法的参考标准品；

使用生物分析仪(安捷伦2100)确认该RNA的大小和纯度，并使用Nanodrop-2000(Thermofisher)测量其浓度，将其置于-80℃冰箱中保存待用。

(2)dsRNA的检测：DSN酶放大荧光信号

将100μL混合物在95℃的PCR仪中孵育10分钟并缓慢冷却至室温；

所述混合物中含有1×DSN缓冲液(50mM Tris HCl，pH 8.0；5mM MgCl₂，1mM DTT)、20U RNase抑制剂、10nM P1、10nM P2、10nM RNA space-1、10nM RNA space-2、10nM RNAspace-3和目标dsRNA。

向混合物加入1U DSN(溶于25mM Tris HCl中，pH 8.0；50％甘油)，在60℃下孵育30分钟；将100μL 2×DSN酶终止反应液(10mM EDTA)加入混合物中以灭活DSN酶；最后将反应混合物转移到比色皿中测量荧光信号。

实施例2

本实施例使用凝胶电泳(Gel electrophoresis analysis)验证实施例1提供的基于DSN酶辅助信号扩增的dsRNA荧光检测方法的可行性。

具体方法为：

采用20％聚丙烯酰胺凝胶进行凝胶电泳，电泳液为1×TBE(pH 8.0)中，120V恒压下置于冰上电泳30min，反应液的进样量为10μL。

电泳结束后将所得凝胶染色15min，并用凝胶图像系统拍摄凝胶得到图2。

如图2所示，其通道M表示DNA marker；

通道1～6分别为P1、P2、RS-1、RS-2、RS-3和dsRNA。

通道7：有DSN酶但没有目标dsRNA(即体系中包括P1、P2、RS-1、RS-2、RS-3和DSN)，体系中两个taqman探针和三个RNA间隔物保持完整，没有可检测到的裂解。

通道8：含有杂交产物和dsRNA(即体系中包括P1、P2、RS-1、RS-2、RS-3和dsRNA)。

通道9：含有杂交产物、DSN酶、dsRNA以及裂解后的探针，(即体系中包括P1、P2、RS-1、RS-2、RS-3、dsRNA、DSN酶)，通道9下方的一条微弱的带(见图中框线部分)清楚地显示了被DSN酶降解的探针，证明了所述检测方法确实能够实现taqman探针的降解，所述检测方法是可行的。

利用荧光发射光谱检测不同体系下荧光信号的差异，由图3可知，曲线a表示体系中仅包括探针复合物(即P1、P2、RS-1、RS-2和RS-3)，曲线b表示体系中包括探针复合物和dsRNA，曲线c表示体系中包括探针复合物、dsRNA和DSN酶。其中，taqman探针(P1，P2)，RNA间隔区(RS-1，RS-2，RS-3)与目标dsRNA的浓度分别为10nM，10nM和10nM。三种体系下荧光信号值差异较为明显，当体系中同时含有taqman探针、dsRNA以及DSN酶时，荧光信号最强。

实施例3

为了获得良好的检测效果，本实施例对DSN酶用量、DSN酶解温度、DSN酶解时间等重要参数进行了优化，实验方法与实施例1相同。

最佳DSN酶用量：如图4(a)所示，随着DSN酶的量从0.2U增加到1.0U，信号值(F/F₀-1)显著增加。然而，当DSN酶的量达到1.0U时，信号值不再增加。因此，1U DSN酶被认为是最佳使量。

DSN最佳反应温度：本实施例研究了DSN的各种反应温度，包括45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃。如图4(b)所示，最佳反应温度为60℃，温度升高或降低都会导致信号值降低，符合DSN自身的温度要求。

DSN酶最佳反应时间：从图4(c)可以看出，随着反应时间的增加，信号值逐渐增大，直至30min。

因此，DSN酶的最佳用量、DSN的最佳反应温度和DSN的最佳反应时间分别为1U、60℃和30min。

实施例4

在实施例3所得的最佳实验条件下，本实施例研究了实施例1所述的检测方法的灵敏度。

如图5(a)所示，加入不同浓度的dsRNA后观察到的荧光发射光谱，dsRNA的浓度从0pM增加至20nM。且荧光强度随目标RNA浓度的增加而显著增加，直至20nM左右达到平台期。(图中各曲线表示的浓度由低到高逐渐变大，其浓度分别为0pM、1pM、10pM、100pM、500pM、1nM、2nM、5nM、10nM和20nM)

图5(b)显示了在目标dsRNA的浓度为1pM、10pM、100pM、500pM、1000pM时所检测到的信号值，由该图可知，在dsRNA的浓度为1pM时，所述方法仍然能够检测到荧光信号，即检测限(LOD)为1pM。

如图5(c)所示，信号值(F/F₀-1)与目标RNA浓度之间存在非线性拟合关系：y＝-10.4exp(-x/5589)+10.5，其中y是信号值(F/F₀-1)，x是dsRNA浓度。

实施例5

本实施例利用所述检测方法，检测基于RNAi的转基因玉米叶片中的总RNA。

其中，转基因玉米(DBN11061、DBN11048和DBN11019)的叶片组织由北京大北农集团提供；

植物RNA提取的方法为：在液氮冷却条件下将冷冻玉米叶片组织在研钵中研磨成细粉，然后将粉末与RNA纯化试剂盒提供的裂解缓冲液混合，根据所述RNA纯化试剂盒的说明书步骤进行提取，得到植物总RNA。

使用生物分析仪评估提取得到的植物总RNA的纯度和完整性，并使用Nanodrop-2000测定其浓度，纯化后的总RNA在-80℃下长期保存。

数字PCR定量：采用微芯片数字PCR系统(

3D数字PCR系统，ThermoFisher，美国)对基于RNAi的转基因玉米的总RNA中的dsRNA进行定量分析。

从转基因玉米叶片组织中提取总RNA后，用第一链cDNA合成试剂盒(1^st strandcDNA synthesis kit)进行反转录；

将合成的第一链cDNA连续稀释至合适的浓度进行dPCR测定，其反应体系为：20μL的dPCR反应混合物，包括1×dPCR master mix、0.2μM引物对、0.05μM探针和cDNA模板；将反应混合物加载到微芯片上进行PCR反应。

其中，所述引物对和探针的序列为SEQ ID NO.8～10，分别为：

数字PCR primer F(SEQ ID NO.8)：

ACATACCAATACCAACTGCTGTCAA；

数字PCR primer R(SEQ ID NO.9)：

TTGAAAGGTGGAGTTAAAGATAAGTTGT；

数字PCR探针(SEQ ID NO.10)：FAM-AGAGCTGTGAATTGGT-MGB。

本实施例提取并分析了不同的RNA样品：以11061-P为特异靶点，11048-P和11019-P为两个具有不同“茎”序列的茎环dsRNA分子，11061-N为非转基因玉米叶片组织。

如图6所示，RNAi非互补和非转基因的信号值(F/F₀-1)低至空白，目标RNA的信号值(F/F₀-1)约为非特异靶标的6倍，表明所述检测方法对真实的植物样本具有优异的选择性。

对比例1

比较不存在和存在RNA间隔区时的荧光比(F/F₀-1)，其中F0和F分别是不存在和存在dsRNA时的FAM荧光信号。

为了克服靶dsRNA的强二级结构，采用了3种RNA间隔基(RS-1、RS-2和RS-3)，即完全互补的靶dsRNA，对taqman探针的消化过程进行了循环利用。如预期的那样，加入RNA间隔物后的荧光信号比没有RNA间隔物的荧光信号增加约26％(如图7所示)。

对比例2

本对比例用于比较探针种类对于dsRNA检测的荧光方法的影响。本对比例中比较了三种不同的探针复合物：

S1：由5个DNA taqman探针(DP-1、P1、DP-2、P2和DP-3)组成；

其中，P1和P2的序列与SEQ ID NO.1～2相同；DP-1、DP-2和DP-3的序列如SEQ IDNO.11～13所示，并且在5′端连接FAM基团，3′端连接BHQ1基团；

SEQ ID NO.11：TTGTGCTGCTGGCGCGCCCTAGTGGCCGCT；

SEQ ID NO.12：GTAGCGGAAGCATTTCTAACAACTTGTTTA；

SEQ ID NO.13：TCAACCTGTAATTGTTTCTGAATTTGTTTC。

SEQ ID NO.11～13所示序列与SEQ ID NO.3～5所示序列的区别在于将序列中的尿嘧啶U替换为胸腺嘧啶T；

S2：由3个DNA间隔探针(DS-1、DS-2和DS-3)和2个DNA taqman探针(P1和P2)组成；其中，DS-1、DS-2和DS-3的序列也如SEQ ID NO.11～13所示，与DP-1、DP-2和DP-3区别在于不连接荧光基团和荧光淬灭基团；

S3：由3个RNA间隔探针(RS-1、RS-2和RS-3)和2个DNA taqman探针(P1和P2)组成，(即实施例1提供的探针)。

首先将探针复合物(S1，S2和S3)与dsRNA杂交，其杂交产物分别如图8(a)、图8(b)和图8(c)所示，图8(a)为S1与dsRNA杂交后的产物、图8(b)为S2与dsRNA杂交后的产物，图8(c)为S3与dsRNA杂交后的产物，三种探针复合物与dsRNA杂交形成线性结构。然后，在DSN酶的存在下切割DNA/RNA杂交体中的DNA taqman探针和DNA间隔探针，导致dsRNA和FAM荧光团的释放。荧光检测结果如图9所示，S3获得最大信号值(F/F₀-1)，S1和S2远小于S3。

由于dsRNA茎环结构容易改变，常常会阻碍DNAtaqman探针/DNA间隔探针与dsRNA之间的下一轮杂交，这限制了DSN酶辅助的信号放大过程。

然而，在存在RNA间隔探针的情况下，RNA间隔探针可以抵抗DSN酶的分解消化并继续与靶dsRNA结合，这有助于DNA taqman探针和dsRNA之间的下一轮杂交。

因此，在RNA间隔探针的帮助下，DNA taqman探针不断地与dsRNA结合再被DSN酶消化，该循环过程能够不断进行，显着地提高了该方法的灵敏度。

综上所述，本发明所述的dsRNA检测方法是一个以杂交为基础的荧光平台，利用DSN信号放大技术，实现dsDNA的定量检测，比较检测范围广，能够检测1pM～50nM范围内的dsDNA。该方法操作简单，无需复杂的操作和繁琐的仪器，制备成试剂盒之后，能够用于RNAi转基因植物中双链RNA的检测。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市计量测试技术研究院

<120> 一种检测双链RNA的方法及其试剂盒与应用

<130> 20200410

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgaatagctc ttcctaaagc caacaattgt c 31

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agtcttgcag ttctaggtcc ttgttcaaca 30

<210> 3

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

uugugcugcu ggcgcgcccu aguggccgcu 30

<210> 4

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

guagcggaag cauuucuaac aacuuguuua 30

<210> 5

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

ucaaccugua auuguuucug aauuuguuuc 30

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

taatacgact cactataggg gaattgtg 28

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aagctttaca tgcttaacgt aattc 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acataccaat accaactgct gtcaa 25

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttgaaaggtg gagttaaaga taagttgt 28

<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agagctgtga attggt 16

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttgtgctgct ggcgcgccct agtggccgct 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtagcggaag catttctaac aacttgttta 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tcaacctgta attgtttctg aatttgtttc 30

Claims

1.一种检测双链RNA的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

待测样品中的双链RNA、taqman探针与RNA间隔探针杂交得到杂交产物，利用双链特异性核酸酶进行切割，所述taqman探针从所述杂交产物上脱落并发出荧光，而后继续杂交并切割，分析荧光信号，得到所述双链RNA的检测结果。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述taqman探针的制备方法为：

根据待测样品中双链RNA的核苷酸序列设计出配对的DNA序列，合成，并在所述DNA序列的5′端修饰荧光基团，3′端修饰荧光淬灭基团得到所述taqman探针；

优选地，所述taqman探针的数量为至少两条。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述RNA间隔探针的制备方法为：

根据待测样品中双链RNA的核苷酸序列设计出配对的RNA序列，合成得到所述RNA间隔探针；

优选地，所述RNA间隔探针的数量为至少两条；

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将待测样品、taqman探针与RNA间隔探针混合，加热后退火，所述待测样品中的双链RNA与所述taqman探针和RNA间隔探针发生杂交，得到杂交产物；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述加热的温度为80-99℃，时间为5-15min；

优选地，步骤(2)所述双链特异性核酸酶的工作温度为55-65℃；

优选地，步骤(3)所述循环的时间为20-60min；

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述分析操作还包括制备标准曲线；

优选地，所述标准曲线的制备方法为：

采用已知浓度的dsRNA、taqman探针与RNA间隔探针杂交得到杂交产物，利用双链特异性核酸酶进行切割，所述taqman探针从所述杂交产物上脱落并发出荧光，而后继续杂交并切割，分析荧光信号，并绘制浓度与荧光信号值的标准曲线。

7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

8.一种检测双链RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒利用如权利要求1-7任一项所述的方法检测双链RNA，所述试剂盒中包括：taqman探针、RNA间隔探针、双链特异性核酸酶和RNA酶抑制剂，。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含至少两条taqman探针；

优选地，所述试剂盒中包含至少两条RNA间隔探针；

优选地，所述试剂盒中还包含双链特异性核酸酶缓冲液；

10.如权利要求8或9所述的试剂盒在检测RNAi转基因作物的双链RNA含量中的应用。