CN116179655A

CN116179655A - 一种实时荧光定量检测探针

Info

Publication number: CN116179655A
Application number: CN202111436744.4A
Authority: CN
Inventors: 潘伟业; 孙颖瑜; 彭琼芳; 孙阳
Original assignee: Beijing Xunzhi Biotechnology Co ltd; Zhejiang Xunzhi Biotechnology Co ltd; Beijing Xunzhi Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Xunzhi Biotechnology Co ltd; Zhejiang Xunzhi Biotechnology Co ltd; Beijing Xunzhi Technology Co ltd
Priority date: 2021-11-29
Filing date: 2021-11-29
Publication date: 2023-05-30

Abstract

本发明提供一种实时荧光定量检测探针，所述实时荧光定量检测探针包括3’引物区和与所述3’引物区连接的5’发夹区，所述5’发夹区由反向互补的核苷酸链形成或所述5’发夹区由反向互补的核苷酸链与位于所述反向互补的核苷酸链之间的核苷酸链形成，在所述5’发夹区的核苷酸链上连接有荧光基团和与其配对的淬灭基团，其中所述荧光基团和所述淬灭基团间隔给定距离。本发明的实时荧光定量检测探针结构适用于不带5’端外切活性的引物对指数型扩增体系，包括PCR、RAA、LAMP等含有一对、两对或者三对引物的扩增体系，无需中间再另外设计探针，使常规检测的设计更简洁。

Description

一种实时荧光定量检测探针

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种实时荧光定量检测探针。

背景技术

核酸定量检测在分子检测领域中有非常广泛的需求，而基于扩增技术的荧光实时定量检测，由于其灵敏度高、动态范围大和设计的便利性，已经成为目前主流的核酸实时定量检测技术。该技术体系通常由扩增引物，扩增酶及其缓冲液体系和带有荧光-淬灭基团对的寡核苷酸探针组成。荧光基团主要负责荧光报告，而配对的淬灭基团基于荧光共振能量转移原理在荧光基团一定的距离内，会吸收荧光基团的激发光而触发淬灭效果，根据此原理可以在核酸单/双链上进行荧光-淬灭基团的结构偶联标记，通过荧光量的改变来报告寡核苷酸探针是否有一、二结构上的改变。目前流行的荧光-淬灭寡核苷酸探针，应用在实时荧光定量PCR的主要类型有Taqman探针、双杂交探针、分子信标、蝎型探针、KASP技术等；在目前流行的RAA等温扩增中，适用的荧光-淬灭探针则是依赖Nfo或exo酶的Nfo或exo探针。

以上提及的几种探针技术，Taqman依赖于Taq DNA聚合酶的5’外切作用；双杂交探针需要合成两个较长的探针，合成成本相对较高，对设计和扩增条件要求高，目前应用的非常少，技术持有者Roche公司基本没有在推广；分子信标、蝎型探针和KASP依赖于竞争性杂交，对扩增效率影响较大，对整体设计要求比较高，因此对比Taqman探针信噪比相对低，精密度相对差，较少应用于需要高灵敏度检测的实时定量应用中，而更多应用于基因分型这种不需要大动态范围定量的场景；而在重组酶介导等温扩增(Recombinase AidedAmplification，以下称RAA)这种恒温扩增场景，则以上几种探针都不适用，一则RAA中没有外切酶的活性，无法实现最有效的类Taqman技术；二则分子信标和蝎型探针类似的技术在RAA中还没得实用性的验证仅存在少量的学术报道，仅在NASBA技术中有相关的应用；而RAA专利持有者Twistamp自身使用的Nfo或exo技术，在原有的引物设计不稳定的基础上，进一步引入了聚合酶无法利用的类核酸的结构，对扩增效率有一定的影响，使反应复杂化，只能有限地用于终点法报告。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种实时荧光定量检测探针。

具体来说，本发明涉及如下方面：

1.一种实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述实时荧光定量检测探针包括3’引物区和与所述3’引物区连接的5’发夹区，所述5’发夹区由反向互补的核苷酸链形成或所述5’发夹区由反向互补的核苷酸链与位于所述反向互补的核苷酸链之间的核苷酸链形成，在所述5’发夹区的核苷酸链上连接有荧光基团和与其配对的淬灭基团，其中所述荧光基团和所述淬灭基团间隔给定距离。

2.根据项1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述5’发夹区在聚合酶反应缓冲液中的融解温度大于等于65℃。

3.根据项1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述3’引物区的长度为10-50个，优选16-35个核苷酸(nt)。

4.根据项1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，形成5’发夹区的反向互补的核苷酸链的其中一条链的长度为5-30nt，优选为8-15nt。

5.根据项1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述位于所述反向互补的核苷酸链之间的核苷酸链的长度为1-10nt，优选为1-4nt。

6.根据项1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述荧光基团和淬灭基团分别位于所述反向互补的核苷酸链上，所述荧光基团和淬灭基团在反向互补的核苷酸链上相对的碱基距离小于等于10nt，优选为小于5nt。

7.根据项1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述荧光基团选自罗丹明类(RBITC/TAMRA)、荧光素及衍生物(FITC/FAM/TET)、菁染料类(Cy3/Cy5)、BODIPY类、AlexaFluor系列、SYTO系列、TYE系列、ATTO系列、HEX、FAM^TM、JOE^TM、NED^TM、ROX^TM、TAMRA^TM、TET^TM和

dyes中的一种，所述淬灭基团选自BHQ、MGB、Dabcyl、TAMRA、Eclipse、IBFQ和ZEN中的一种。

8.根据项1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述3’引物区的序列如SEQ ID NO:1所示，反向互补的核苷酸链的其中一条链的序列如SEQ ID NO:2和所示。

9.根据项1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述3’引物区的序列如SEQ ID NO:1所示，反向互补的核苷酸链的其中一条链的序列如SEQ ID NO:4所示。

10.项1-9中任一项所述的实时荧光定量检测探针在PCR、重组酶聚合酶扩增中的应用。

11.一种核酸检测的方法，其包括：使用项1-9中任一项所述的实时荧光定量检测探针。

本发明的实时荧光定量检测探针结构适用于不带5’端外切活性的引物对指数型扩增体系，包括PCR、RAA、LAMP等含有一对、两对或者三对引物的扩增体系，无需中间再另外设计探针，使常规检测的设计更简洁。

附图说明

图1为本发明的实时荧光定量检测探针的结构示意图；

图2为本发明的探针在TE缓冲液中的荧光强度随温度的变化曲线；

图3为本发明的探针在TE缓冲液、含有Taq的qPCR mix、含有KOD的PCR mix中的荧光强度随温度的变化曲线；

图4为本发明的探针在KOD PCR体系中的荧光强度随时间的变化曲线；

图5为本发明的探针在实时定量PCR体系中的荧光强度随时间的变化曲线；

图6为实施例5中模板浓度对数值对ct值的曲线；

图7为本发明的探针在RAA体系中的退火曲线；

图8为本发明的探针在退火处理后在RAA体系中的退火曲线；

图9为本发明的探针+假病毒模板在RAA体系中的荧光强度随时间的变化曲线；

图10为本发明的探针用于Cas12反式剪切技术中的共扩增内参报告。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。

除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。

在现有的荧光检测探针技术中，有一个比较大的特点是割裂开了扩增系统和探针系统，使探针杂交、水解和报告独立于扩增事件，与扩增事件是不同步的——探针杂交和扩增引物的退火是个竞争关系，扩增太强，会使报告系统来不及响应，导致报告效率下降；扩增太慢，或者杂交太强，又会造成整体检测效率的下降；另外，这种扩增效率和报告效率不同步的问题，会造成报告效率不稳定对酶及其缓冲液反应体系要求提高，当报告效率不高需要进行优化时，也会造成评价和系统调试复杂度增加，系统精密度或反应重复性受到挑战。再者，在扩增区中间预留额外检测探针的区域，限制了目前实时荧光定量的扩增子设计的长度，对于需要检测的区域天然就短的核酸靶标，例如miRNA，传统的实时荧光定量探针基本无法胜任检测，需要另辟蹊径。

本发明提供一种实时荧光定量检测探针。所述实时荧光定量检测探针的结构如图1所示，整体呈η型，包括3’引物区和与5’发夹区，所述3’引物区和所述5’发夹区连接。

其中所述3’引物区作为检测体系的引物，其相应的长度和序列可以根据所应用的检测体系，如体系中所使用的缓冲体系和酶进行调整。

在一个具体的实施方式中，所述3’引物区的长度为10-50个，优选为16-35nt，例如可以为16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt、30nt、31nt、32nt、33nt、34nt、35nt。

其中所述5’发夹区呈类似发夹的结构，由反向互补的核苷酸链形成形成，或所述5’发夹区由反向互补的核苷酸链与位于所述反向互补的核苷酸链之间的核苷酸链形成。反向互补的核苷酸链是指由两条链通过碱基配对的作用形成的结构，反向互补的核苷酸链之间可以有，也可以没有其它核苷酸链。在所述5’发夹区的核苷酸链上连接有荧光基团和与其配对的淬灭基团，其中所述荧光基团和所述淬灭基团间隔给定距离。

本发明的这种探针结构实质上是在引物区的末端进行延伸设计，增加了具有荧光基团和淬灭基团的发夹型结构，从而使得整个探针结构更加紧凑和简洁。在探针应用时，每一轮扩增中都引入了荧光充分产生的事件，而不需要考虑额外的探针退火条件干扰，因此在反应建立的过程中基本不必涉及到探针浓度的调整就能发挥接近100％的荧光反应效率，所谓的“所扩即所见”，降低了设计复杂度。

在常温下，本发明的实时荧光定量检测探针的荧光基团的荧光是被淬灭的状态，仅可被激发出微量的荧光。因此当本发明的实时荧光定量检测探针在引物对成功形成链式聚合反应时，5’发夹区被互补合成链推开，荧光基团和淬灭基团距离被强制拉开，从而激发荧光信号。

影响本发明检测探针效果的关键在于5’发夹区的融解温度(Tm)。对DNA加热时，两条链的氢键断开变成单链状态，把引起这种变化的温度称为融解温度。通常在中性的稀盐溶液中对DNA加热，测定紫外吸收，紫外吸收增高的中点也称为融解温度。融解温度依DNA种类而定，核苷酸链越长，GC含量越高则越增高。

根据PCR、RAA和LAMP(环介导等温扩增反应)等扩增体系，在其采集荧光的温阶，5’发夹区不能因为还未进行扩增处于打开的状态触发非特异的荧光，因此5’发夹区所设计的融解温度须高于其采光温阶的设定温度，一般高于65℃通用性较强，适用于PCR、LAMP和RAA，RAA由于等温扩增温度比较低，其5’发夹区的融解温度可以相应降低。

在一个具体的实施方式中，所述5’发夹区在聚合酶反应缓冲液中的融解温度大于等于65℃，例如可以为65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃。

每条反向互补的核苷酸链的长度和序列可以根据所应用的检测体系，如体系中所使用的缓冲体系和酶进行调整。

在一个具体的实施方式中，反向互补的核苷酸链的其中一条链的长度为5-30nt，优选为8-15nt，例如可以为8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt。

在一个具体的实施方式中，所述5’发夹区由反向互补的核苷酸链形成。

在一个具体的实施方式中，所述5’发夹区由反向互补的核苷酸链与位于所述反向互补的核苷酸链之间的核苷酸链形成。其中，所述位于所述反向互补的核苷酸链之间的核苷酸链用于连接反向互补的核苷酸链中的两条链，即处于所述5’发夹区的非互补连接部分，其长度为1-10nt，优选为1-4nt，例如可以为1nt、2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt。长度越短，5’发夹区的自由能就越低，发夹就越稳定。

荧光-淬灭基团的配对选择一般根据荧光共振能量转移原理进行，本发明的实时荧光定量检测探针的荧光-淬灭基团对由一个中间碱基修饰和一个近5’末端的修饰组成。如图1所示，淬灭基团为近5’末端的修饰，荧光基团为中间碱基修饰。在另一种实施方式中，淬灭基团为中间碱基修饰，荧光基团为近5’末端的修饰。

所述荧光基团和淬灭基团分别位于所述反向互补的核苷酸链上，所述荧光基团和淬灭基团之间的距离在反向互补的核苷酸链上相对的碱基距离，即两条互补链通过碱基配对形成二级结构后相对的碱基距离，为小于等于10nt，优选为小于5nt，例如可以为0nt、1nt、2nt、3nt、4nt。同时在原本一级结构上的距离，大于以上碱基距离的2倍，并大于10nt，优选的，为大于等于以上碱基距离的3倍，并大于15nt。

在一个优选的实施方式中，在反向互补的核苷酸链配对的自然状态下，荧光基团和淬灭基团各分布在反向互补的两条链上，其中一个尽量接近一条链的5’端，另一个设计在互补链的±4个碱基内，以保证淬灭效率，同时在原本一级结构上的距离为18-20nt，也能保证荧光激发的效率。

目前中间修饰可选基团比较多的以嘧啶碱基为主，首选的是T碱基，荧光和淬灭基团的光谱都比较全。荧光碱基两边尽量不含G碱基，减少G碱基对荧光信号的吸收。

在一个具体的实施方式中，所述荧光基团选自罗丹明类(RBITC/TAMRA)、荧光素及衍生物(FITC/FAM/TET)、菁染料类(Cy3/Cy5)、BODIPY类、Alexa Fluor系列、SYTO系列、TYE系列、ATTO系列、HEX、FAM^TM、JOE^TM、NED^TM、ROX^TM、TAMRA^TM、TET^TM和

dyes中的一种，所述淬灭基团选自BHQ、MGB、Dabcyl、TAMRA、Eclipse、IBFQ和ZEN中的一种。/>

在一个具体的实施方式中，所述3’引物区的序列如SEQ ID NO:1所示，反向互补的核苷酸链的两条核苷酸链的序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，没有位于所述反向互补的核苷酸链之间的核苷酸链，即非互补连接部分。淬灭基团为BHQ2，位于SEQ ID NO:2的5’末端，荧光基团为HEX，位于SEQ ID NO:3的第8位。

其中，SEQ ID NO:1为：

AGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGA

SEQ ID NO:2为：

GCAAACACCG

SEQ ID NO:3为：

CGGTGTTTGC

在一个具体的实施方式中，所述3’引物区的序列如SEQ ID NO:1所示，反向互补的核苷酸链的两条核苷酸链的序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，没有位于所述反向互补的核苷酸链之间的核苷酸链，淬灭基团为BHQ2，位于SEQ ID NO:4的5’末端，荧光基团为HEX，位于SEQ ID NO:5的第9位。

其中，SEQ ID NO:4为：

GGAGGAGGAGG

SEQ ID NO:5为：

CCTCCTCCTCC

本发明的上述实时荧光定量检测探针可以用于PCR、重组酶聚合酶扩增中中。

本发明的探针同时具有荧光基团、淬灭基团和引物区，结构更加紧凑和简洁。适用于不带5’端外切活性的引物对指数型扩增体系，包括PCR、RAA、LAMP等体系。具体地，本发明探针的融解曲线斜率较高而稳定连续，在TE buffer低盐的条件下均达到68℃以上，在很低的温度下已经开始产生荧光，而且不依赖于温度而更多的依赖时间，符合实际应用需求。在PCR反应体系中应用时，本发明探针的扩增曲线的指数期和线性期表现和一般的实时定量PCR扩增曲线非常相近，显示本发明探针的最终反应效率和普通引物接近，可以用于实时定量PCR体系。在反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)体系中同样具备良好的检测线性和重复性，在20～30min内能达到比较好的分离度，具备很好的检测应用潜力。

实施例

实施例1探针的设计以及融解温度的确定

对人的RPP30 RNA参考序列——PREDICTED:Pan paniscus ribonuclease P/MRPsubunit p30(RPP30),transcript variant X1,mRNA(Sequence ID:XM_034931076.1)基因片段进行了探针的设计，得到以下的三个探针。

探针1

探针1整体的结构如下所示：

5’--^BHQ2- ACAGCCGCTCTTCAAGAGAGAGCGGCT^HEXGTCTCCACAAGTCCGCGCAGAGCCTTCA-3’

其中，3’引物区的序列为CTCCACAAGTCCGCGCAGAGCCTTCA(SEQ ID NO:6)。5’发夹区中反向互补的核苷酸链的两条核苷酸链的序列分别为ACAGCCGCTCT(SEQ ID NO:7)和AGAGCGGCTGT(SEQ ID NO:8)，位于所述反向互补的核苷酸链之间的核苷酸链的序列为TCAAGAG(SEQ ID NO:9)。淬灭基团为BHQ2，位于SEQ ID NO:7的5’末端，荧光基团为HEX，位于SEQ ID NO:8的第9位。

探针1的计算Tm为42.7℃，实测为25℃。

探针1的位于所述反向互补的核苷酸链之间的核苷酸链较长，Tm降低，荧光本底较高。

其中，探针1由上海生工合成。

探针2

探针2整体的结构如下所示：

5’-^BHQ2-GCAAACACCG-CGGTGTTT^HEXGCAGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGA-3’

其中，3’引物区的序列为AGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGA(SEQ ID NO:1)。5’发夹区中反向互补的核苷酸链的两条核苷酸链的序列分别为GCAAACACCG(SEQ ID NO:2)和CGGTGTTTGC(SEQ ID NO:3)，没有位于所述反向互补的核苷酸链之间的核苷酸链。淬灭基团为BHQ2，位于SEQ ID NO:2的5’末端，荧光基团为HEX，位于SEQ ID NO:3的第8位。

探针2的计算Tm为33.7℃，实测为68.3℃。

其中，探针2由上海生工合成。

探针3

探针3整体的结构如下所示：

5’-^BHQ2-GGAGGAGGAGG-CCTCCTCCT^HEXCCAGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGA-3’

其中，3’引物区的序列为AGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGA(SEQ ID NO:1)。5’发夹区中反向互补的核苷酸链的两条核苷酸链的序列分别为GGAGGAGGAGG(SEQ ID NO:4)和CCTCCTCCTCC(SEQ ID NO:5)，没有位于所述反向互补的核苷酸链之间的核苷酸链。淬灭基团为BHQ2，位于SEQ ID NO:4的5’末端，荧光基团为HEX，位于SEQ ID NO:5的第9位。

探针3的计算Tm为37.8℃，实测68.3℃。

其中，探针3由上海生工合成。

其中计算Tm值可以按照以下方式进行模拟设计，但实际Tm值应以在聚合酶反应buffer中测定为准：

10个碱基以上的Tm值进行碱基邻近算法进行计算(可使用Oligo 7软件进行)，计算Tm值为两段独立互补双链在扩增条件下的半解链温度。在本发明的实时荧光定量检测探针中，位于所述反向互补的核苷酸链之间的核苷酸链越小，双链邻近的距离对Tm的加成系数越高：在无位于所述反向互补的核苷酸链之间的核苷酸链的情况下，加成系数在2以上，即实测温度在计算温度2倍以上；位于所述反向互补的核苷酸链之间的核苷酸链在5个碱基以上时，双链的自由度很高，基本没有邻近的加成。

把上述三个探针各200nM置于TE(10mM Tris，1mM EDTA)中，每分钟升高1℃，收集的Hex的荧光变化曲线如图2所示，当探针发夹打开时，荧光基团与淬灭基团的距离增加从而荧光能显著增加，因此可理解为探针本身的融解曲线。可见探针2和探针3的融解曲线斜率较高而稳定连续，在TE buffer低盐的条件下均达到68℃以上。探针2和探针3比较符合应用需求，后续实验采用探针2或探针3。探针1的溶解曲线斜率较小，在低温下发夹的稳定性已不足，在较低温度达到了荧光峰值，不符合应用需求。

实施例2探针用于缺失5’外切，耐受3’外切的PCR体系

分别把200nM探针3置于TE(10mM Tris，1mM EDTA)缓冲液、Taq PCRmix(HiScriptII U+One step qRT-PCR Probe Kit,Q222-CN-00，Vazyme)，以及KOD PCR mix(KOD OneTMPCR Master Mix,KMM-101,Toyobo)中，溶液置于qPCR仪器中进行溶解曲线分析，从25℃升温到95℃，每分钟升高1℃，收集的Hex的荧光变化曲线如图3所示。

可见探针3在Taq PCRmix中的溶解曲线，曲线变的平缓，在很低的温度已经开始有荧光产生，而且不依赖于温度而更多的依赖时间。而在KOD PCR mix中表现正常，曲线和TE缓冲液类似。而且KOD PCR mix体系由于体系里盐浓度的升高探针Tm提高了5.5℃，可正常用于PCR扩增条件中退火条件。说明探针适用于缺失5’外切，耐受3’外切的PCR体系，如KODPCR体系。

实施例3探针在KOD PCR体系中的扩增曲线

在KOD PCR体系中，分别使用200nM探针3、400nM反向引物RAARP-FB3(5’-CGGCTGTCTCCACAAGTCCGCGCAGAGCCT-3’(SEQ ID NO:10))以及400nM的正向引物F3(5’-AGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCT-3’(SEQ ID NO:11))对RPP30的模板(质粒)(模板序列为：GGACTTCAGCATGGCGGTGTTTGCAGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGCTCACCGTGAGTTGC，SEQ ID NO:12)进行PCR扩增，扩增的引物组合包括探针+正反向引物以及探针+反向引物得到图4所示的扩增曲线。结果发现两种引物组合探针扩增曲线的指数期和线性期表现和一般的实时定量PCR扩增曲线非常相近，可以以同样的方式画出阈值线。而且无论是否加入正向引物，其扩增的平台期接近，显示探针3的最终反应效率和普通引物接近，可以用于实时定量PCR体系。

实施例4探针在实时定量PCR体系中的表现

使用200nM探针2和400nM反向引物RAARP-FB3在KOD PCR扩增体系下对浓度为6E8、6E7、6E6、6E5、6E4拷贝/ml的RPP30的模板(质粒)进行扩增，得到图5所示的扩增曲线。

将模板的浓度对数值对扩增ct值作图，得到图6，所得拟合线的线性拟合度R²达0.998，证实了该方法具备实时荧光定量能力。

实施例5探针在RAA体系中退火工艺的确定和影响

如图7所示，本发明的探针3在RAA(RNA恒温快速扩增试剂盒(基础型),WLRB8204KIT,安普未来)体系中直接使用时，我们发现探针解链比在TE缓冲液中要快得多，而且呈现出多段退火的曲线，证明在RAA体系中探针的结构并不单一，而且受到RAA中多个酶的作用时分级退火的现象更明显了。

我们需要使所有探针都统一到第二段退火曲线，以保证探针可在55℃时不自行解旋。因此引入了预退火的处理。其中，预退火处理步骤为：将10μM浓度的探针3置于95℃2min后冰上骤冷退火10min后备用。

如图8所示，在对探针3进行了预退火处理后再置于RAA体系中，预退火后的探针在RAA体系中形成了稳定的二聚体结构，其反向互补区更长，达到了比较理想的退火温度，因此可用于RAA体系。

实施例6探针在反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)体系中的表现基于已预退火的200nM探针3和400nM反向引物RAARP-FB3(CGGCTGTCTCCACAAGTCCGCGCAGAGCCT(SEQ IDNO:10))，在RT-RAA(RNA恒温快速扩增试剂盒(基础型),WLRB8204KIT,安普未来)的体系中，对不同浓度的RPP30假病毒模板(SEQ ID NO：13)进行42℃反应60min等温扩增。

结果如图9所示，基于RNA样本的梯度稀释和检测，发现该体系在1E2～1E6，5个数量级跨度下的模板投入量范围内，具备良好的检测线性和重复性，在20～30min内能达到比较好的分离度，具备很好的检测应用潜力。

实施例7探针用于Cas12反式剪切技术中的共扩增内参报告

使用迅识生物新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测试剂盒(核酸探针反式切割法)，额外加入200nM探针3和200nM反向引物RAARP-FB3作为内参报告，使用人咽拭子样本RNA稀释的含400、8、4及0拷贝/μL的COVID-19RdRP基因片段的样本共10μL，42℃反应60min。结果如图10所示，获得FAM荧光为RdRP基因阳性报告曲线，VIC为内参基因RPP30-Hex荧光的报告曲线。可见在原有RdRP基因能获得扩增信号的情况下，探针3的扩增和报告在大概20min内完成，并不干扰原有的RdRP基因扩增灵敏度。

序列表

SEQ ID NO:1：

AGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGA

SEQ ID NO:2：

GCAAACACCG

SEQ ID NO:3：

CGGTGTTTGC

SEQ ID NO:4：

GGAGGAGGAGG

SEQ ID NO:5：

CCTCCTCCTCC

SEQ ID NO:6：

CTCCACAAGTCCGCGCAGAGCCTTCA

SEQ ID NO:7：

ACAGCCGCTCT

SEQ ID NO:8：

AGAGCGGCTGT

SEQ ID NO:9：

TCAAGAG

SEQ ID NO:10：

CGGCTGTCTCCACAAGTCCGCGCAGAGCCT

SEQ ID NO:11：

AGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCT

SEQ ID NO:12：

GGACTTCAGCATGGCGGTGTTTGCAGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGCTCACCGTGAGTTGC

SEQ ID NO:13：

GGACUUCAGCAUGGCGGUGUUUGCAGAUUUGGACCUGCGAGCGGGUUCUGACCUGAAGGCUCUGCGCGGACUUGUGGAGACAGCCGCUCACCGUGAGUUGC

SEQUENCE LISTING

<110> 北京迅识科技有限公司

北京迅识生物科技有限公司

浙江迅识生物科技有限公司

<120> 一种实时荧光定量检测探针

<130> TPE01729

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述:人工合成的序列

<400> 1

agatttggac ctgcgagcgg gttctgacct ga 32

<210> 2

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述:人工合成的序列

<400> 2

gcaaacaccg 10

<210> 3

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述:人工合成的序列

<400> 3

cggtgtttgc 10

<210> 4

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述:人工合成的序列

<400> 4

ggaggaggag g 11

<210> 5

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述:人工合成的序列

<400> 5

cctcctcctc c 11

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述:人工合成的序列

<400> 6

ctccacaagt ccgcgcagag ccttca 26

<210> 7

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述:人工合成的序列

<400> 7

acagccgctc t 11

<210> 8

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述:人工合成的序列

<400> 8

agagcggctg t 11

<210> 9

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述:人工合成的序列

<400> 9

tcaagag 7

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述:人工合成的序列

<400> 10

cggctgtctc cacaagtccg cgcagagcct 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述:人工合成的序列

<400> 11

agatttggac ctgcgagcgg gttctgacct 30

<210> 12

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述:人工合成的序列

<400> 12

ggacttcagc atggcggtgt ttgcagattt ggacctgcga gcgggttctg acctgaaggc 60

tctgcgcgga cttgtggaga cagccgctca ccgtgagttg c 101

<210> 13

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述:人工合成的序列

<400> 13

ggacuucagc auggcggugu uugcagauuu ggaccugcga gcggguucug accugaaggc 60

ucugcgcgga cuuguggaga cagccgcuca ccgugaguug c 101

Claims

2.根据权利要求1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述5’发夹区在聚合酶反应缓冲液中的融解温度大于等于65℃。

3.根据权利要求1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述3’引物区的长度为10-50个，优选16-35个核苷酸(nt)。

4.根据权利要求1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，形成5’发夹区的反向互补的核苷酸链的其中一条链的长度为5-30nt，优选为8-15nt。

5.根据权利要求1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述位于所述反向互补的核苷酸链之间的核苷酸链的长度为1-10nt，优选为1-4nt。

6.根据权利要求1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述荧光基团和淬灭基团分别位于所述反向互补的核苷酸链上，所述荧光基团和淬灭基团在反向互补的核苷酸链上相对的碱基距离小于等于10nt，优选为小于5nt。

7.根据权利要求1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述荧光基团选自罗丹明类(RBITC/TAMRA)、荧光素及衍生物(FITC/FAM/TET)、菁染料类(Cy3/Cy5)、BODIPY类、Alexa Fluor系列、SYTO系列、TYE系列、ATTO系列、HEX、FAM^TM、JOE^TM、NED^TM、ROX^TM、TAMRA^TM、TET^TM和

8.根据权利要求1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述3’引物区的序列如SEQ ID NO:1所示，反向互补的核苷酸链的其中一条链的序列如SEQ ID NO:2和所示。

9.根据权利要求1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述3’引物区的序列如SEQ ID NO:1所示，反向互补的核苷酸链的其中一条链的序列如SEQ ID NO:4所示。

10.权利要求1-9中任一项所述的实时荧光定量检测探针在PCR、重组酶聚合酶扩增中的应用。

11.一种核酸检测的方法，其包括：使用权利要求1-9中任一项所述的实时荧光定量检测探针。