CN105018604A - 一种探针室温下检测耐药基因多态性的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明一种探针室温下检测耐药基因多态性的试剂盒，属于分子生物学领域，具体说是涉及一种用分子信标二联体探针检测多药耐药基因<i>ABCG2</i>？C421A的单核苷酸多态性。其特征在于：探针中的分子信标二联体具有双茎环结构，是由寡核苷酸单链基于碱基互补原则形成的二级结构，分为茎环结构I和茎环结构II，这两个茎环结构均由外环和茎秆两部分组成；本发明的目的在于解决传统探针在室温条件下特异性差，单体不能检测双等位基因的问题。

Description

一种探针室温下检测耐药基因多态性的试剂盒
技术领域：本发明属于分子生物学领域，具体说是涉及一种用分子信标二联体探针检测多药耐药基因ABCG2 C421A的单核苷酸多态性。
背景技术：传统分子信标长约25-35个碱基，具有类似发夹形状的二级结构，被称为茎环结构。茎环结构分为外环结构和茎秆结构两部分，外环结构是与目的片段互补的核苷酸单链，其功能是识别目的片段，并与之杂交。茎秆结构为长度约5-8个碱基的双螺旋结构，其功能是形成二级结构，不直接参与目的片段的识别与杂交。在茎的5'端和3'端分别连有荧光基团和荧光淬灭基团。当分子信标以茎环结构的形态存在时，位于两端的荧光分子与和淬灭分子非常接近(小于10nm)，此时给予荧光基团的激发波长，会有荧光共振能量转移现象发生，荧光基团发出的荧光被淬灭分子吸收并以热的形式散发，因此检测不到荧光信号。当有靶序列存在时，分子信标的序列与靶序列特异性结合，形成的双螺旋体比分子信标的茎环结构更稳定，荧光分子与淬灭分子分开，荧光共振能量转移现象终止，此时荧光分子发出的荧光可以被检测到，且所检测到的荧光强度与杂交体系中靶序列浓度成正比。因此，分子信标无需洗脱操作，可以连续输出信号，具有实时分辨力。
传统分子信标常用于基因表达的实时监控，也可用于SNPs检测，这种无需第二次开盖加样的“一站式”方法优势在于对于操作的简化达到了极致，但同时也存在不足。首先，传统分子信标的应用范围在高温区，需要精密的温控设备辅助，并绘制熔解曲线。为了获得与目的单链的的互补链竞争结合位置，需要提高外环序列的Tm值，目前的做法是延长外环序列的长度，或修饰更多的非天然核酸。前者导致了对单碱基错配识别能力的降低，后者则使成本大幅攀升。其次，传统分子信标至少要制备一对才能检测一种双等位基因。因此市场急需开发一种室温下高特异性，不依赖温控设备，单体即可检测一种双等位基因的探针。
发明内容：
发明目的：本发明设计了一种带有新型分子信标二联体探针的试剂盒，实现了探针单体在室温条件下快速检测基因ABCG2 C421A的单核苷酸多态性，解决了传统探针在室温条件下特异性差，单体不能检测双等位基因的问题。
技术方案：
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种探针室温下检测耐药基因多态性的试剂盒，包括一种分子信标二联体探针，以及室温杂交预混液，其特征在于：所述的分子信标二联体具有双茎环结构，是由寡核苷酸单链基于碱基互补原则形成的二级结构，分为茎环结构I和茎环结构II，这两个茎环结构均由外环和茎秆两部分组成；构成双茎环结构的一级核苷酸序列为5’gcaggtgTTGAATGTCAAGAGTCGcacctgctctgcgagTTGAATTTCAAGAGTCGctcgcag 3’，其中大写碱基组成茎环结构的外环部分，小写无下划线碱基组成茎环结构的茎秆部分，5’端修饰绿色荧光基团6FAM，3’端修饰红色荧光基团HEX，中间位置用t表示的T碱基，该试剂盒用于检测耐药基因ABCG2的C421A单核苷酸多态性，检测样本为PCR产物。
所述外环部分的核苷酸用来识别目的序列，茎秆部分的核苷酸用于形成二级结构，其不直接参与目的序列识别。
这两个功能独立的茎环结构，茎环结构I用于检测ABCG2 C421A的C亚型等位基因，茎环结构II用于检测ABCG2 C421A的A亚型。
所述探针的PCR的正向引物序列5’TTGTGATGGGCACTCTGACG3’，反向引物序列5’CGTCATAGT TGTTGCAAGCCG3’。
构成双茎环结构一级核苷酸序列中间位置的t不属于茎环结构，仅用于修饰荧光淬灭基团BHQ1。
室温杂交预混液：每10μL杂交预混液中由5μL浓度为25mmol/L的MgCl2、4μL甲酰胺和1μL浓度为1μmol/L的分子信标二联体组成。
所述的分子信标二联体的制备是通过如下步骤实现的：
(1)向8联管中加入室温预混液10μL；
(2)对目的基因进行不对称PCR扩增；
(3)吸取10μL不对称PCR产物至装有室温预混液的8联管中；混匀后利用QPCR仪等能够检测荧光强度的仪器检测荧光强度值。
优点及效果：
本发明实现了一个分子信标二联体单体可以同时检测两个等位基因，无需加入第二个探针，并且在室温条件下显示了对单碱基错配序列显示了极高的识别能力。只修饰一种淬灭基团，减少了合成成本。如将分子信标二联体单体用于微阵列固体表面的修饰，可以节省一半的偶联位置大幅减少偶联所用的时间及成本。
附图说明：
图1：分子信标二联体二级结构图；
图2：分子信标二联体分别与模板G和模板A杂交的熔解曲线；
图3：从NCBI Gene数据库中获取的基因ABCG2 C421A附近的序列(含C421A位点)；
图4：由NCBI-BLAST得到的PCR产物匹配结果；
图5：分子信标二联体与不同浓度模板杂交的荧光强度-模板浓度线性图；
图6：实例2中部分PCR产物的基因测序图(由生工生物工程(上海)股份有限公司提供)。
具体实施方式：
一种室温下检测多药耐药基因ABCG2 C421A的单核苷酸多态性的试剂盒，包括一种新型的分子信标二联体探针，以及室温杂交预混液，其特征在于：分子信标二联体具有独特的双茎环结构，是由寡核苷酸单链基于碱基互补原则形成的二级结构，分为茎环结构I和茎环结构II，见图1所示。
分子信标二联体由两个茎环结构均由外环和茎秆两部分组成，外环部分的核苷酸用来识别目的序列，茎秆部分的核苷酸用于形成二级结构，不直接参与目的序列识别。
构成双茎环结构的一级核苷酸序列为5’gcaggtgTTGAATGTCAAGAGTCGcacctgctctgcgagTTGAATTTCAAGAGTCGctcgcag 3’，其中大写碱基组成茎环结构的外环部分，小写无下划线碱基组成茎环结构的茎秆部分，5’端修饰绿色荧光基团6FAM和3’端修饰红色荧光基团HEX，中间位置用t表示的T碱基不属于茎环结构，仅用于修饰荧光淬灭基团BHQ1。
双茎环结构是两个功能独立的茎环结构，茎环结构I用于检测基因ABCG2C421A的C亚型，茎环结构II用于检测A亚型。每个茎环结构在与互补的序列或单碱基错配序列杂交时产生的熔解曲线都具有显著差异，见图2A、B。选取荧光强度值差异最大的温度作为观测点见图2C，并利用甲酰胺将观测点调整至25，见图2D。茎环结构的熔解曲线为降温曲线，曲线走向为从高温向低温(从右向左)。图2中，A：分子信标二联体与模板G的熔解曲线(茎环结构I的熔解曲线为红色，茎环结构II的熔解曲线为蓝色，下同)；B：分子信标二联体与模板A的熔解曲线；C：图A与图B的合图，双箭头位置的荧光强度差异最大；D：甲酰胺的加入使荧光强度差异最大位置被降低至25℃附近。
利用具有荧光扫描及读取功能的仪器，在25℃下直接读取荧光强度值，凡高于临界值的样本为基因型检出阳性，低于或等于临界值的样本为基因型检出阴性。
阳性样本临界值的定义：人工合成两种基因型模板，用A亚型模板代替实际样本做为C亚型的阴性对照，绘制熔解曲线，见图2中的③号线；用C亚型模板代替实际样本做为A亚型的阴性对照，绘制熔解曲线，见图2中的②号线。包括阴性对照在内的每例待测样本做3个副孔，以阴性对照样本荧光强度的“均值+2×标准差”作为临界值，与被测样本荧光强度的均值比较，凡荧光强度值高于临界值的被测样本视为该基因型检出阳性，荧光强度值低于或等于临界值的被测样本视为该基因型检出阴性。
进一步的，人工合成的两种基因型模板序列为：TTGTGATGGGCACTCTGACGGTGAGAGAAAACTTA[C/A]AGTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTTGCAACAACTATGACG。该序列与PCR产物序列相同。括号内的碱基为突变位点的二等位基因。
分子信标二联体在室温下检测ABCG2 C421A的单核苷酸多态性是通过如下步骤实现的：
(1)向8联管中加入室温预混液10μL；
(2)对目的基因进行不对称PCR扩增；
(3)吸取10μL不对称PCR产物至装有室温预混液的8联管中；
(4)混匀后利用Q PCR仪等能够检测荧光强度的仪器检测荧光强度值。
进一步的，室温预混液的组成为：每10μL杂交预混液中含5μL浓度为25mmol/L的MgCl2、4μL甲酰胺和1μL浓度为1μmol/L的分子信标二联体。分子信标二联体的固体粉末用pH 7.4的TE溶解，TE中含Tris-HCl 10mmol/L，EDTA 1mmol/L。
进一步的，不对称PCR的反应体系为：2×Taq DNA polymerase缓冲液25μL(含MgCl2 3mmol/L、dNTP 0.22mmol/L、Taq DNA polymerase 5U/μL)、基因组DNA样本、浓度为10μmol/L的正向引物2μL和浓度为0.5μmol/L反向引物2μL、超纯H2O 20μL。
进一步的，不对称PCR反应步骤为：第一步，94℃4分钟；第二步，94℃30秒→57℃30秒→72℃30秒，循环40次。
进一步的，不对称PCR目的产物序列为：TTGTGATGGGCACTCTGACGGTGAGAGAAAACTTA[C/A]AGTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTTGCAACAACTATGACG，PCR产物序列与人工合成的模板序列相同，括号内的碱基为突变位点的二等位基因。基因序列、引物及产物的BLAST结果由NCBI数据库获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，详见图3和图4。
进一步的，应用Q PCR仪检测波长为：6FAM发射波长492nm，发射波长521nm；HEX的激发波长为535nm，发射波长556nm。
实施例1
向8联管各样本孔中加入室温预混液10μL，然后依次加入浓度为20μmol/L、2μmol/L、200nmol/L、20nmol/L和2nmol/L的模板G 10μL，使模板终浓度为10μmol/L、1μmol/L、100nmol/LM、10nmol/L和1nmol/L；平行试验组加入相同浓度的模板A 10μL，阴性对照样本用人工合成模板代替实例样本，混匀后送检。
应用Stratagene Mx-3000p PCR仪，在25℃下扫描并读取荧光强度值，6FAM发射波长492nm，发射波长521nm；HEX的激发波长为535nm，发射波长556nm。
检测结果：Stratagene Mx-3000p PCR仪的能读取的荧光强度值上限为65535，模板浓度低于1nmol/L-以后，荧光强度值低于临界值。有效数据见表1。
表1.分子信标二联体与不同浓度的模板杂交后的荧光强度值
线性范围：相同浓度的6FAM与HEX的荧光强度不同，但线性范围一致均为范围为10μmol/L-1nmol/L，见图5A和B。图5中，A：C亚型模板(6FAM，492nm)的荧光强度-浓度线性关系图；B：A亚型模板(HEX，535nm)的荧光强度-浓度线性关系图。
实施例2：
取40例志愿者外周血液DNA组样本，进行不对称PCR扩增，其产物通过4％琼脂糖电泳确认。
向8联管中加入室温预混液10μL；吸取10μL不对称PCR产物至装有室温预混液的8联管中，混匀后送检。具体操作步骤见。
应用Stratagene Mx-3000p PCR仪，在25℃下扫描并读取荧光强度值，6FAM发射波长492nm，发射波长521nm；HEX的激发波长为535nm，发射波长556nm。
检测结果为，基因ABCG2 C421A的C/C纯合型15例，A/A纯合型2例，C/A杂合型13例，详见见表2：
表2 40例志愿者血液DNA样本基因ABCG2 C421A的检测结果
将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因测序，将测序结果与分子信标二联体的检测结果比对，所得结论完全一致。测序图见图6。
图6中，A：实例样本基因ABCG2 C421A测序结果为C/C纯合型的图谱；B：实例样本基因ABCG2 C421A测序结果为A/A纯合型的图谱；C：实例样本基因ABCG2 C421A测序结果为C/A杂合型的图谱；D：实例样本基因ABCG2C421A测序结果为C/A杂合型的图谱。

Claims (7)

1.一种探针室温下检测耐药基因多态性的试剂盒，包括一种分子信标二联体探针，以及室温杂交预混液，其特征在于：所述的分子信标二联体具有双茎环结构，是由寡核苷酸单链基于碱基互补原则形成的二级结构，分为茎环结构I和茎环结构II，这两个茎环结构均由外环和茎秆两部分组成；构成双茎环结构的一级核苷酸序列为5’gcaggtgTTGAATGTCAAGAGTCGcacctgctctgcgagTTGAATTTCAAGAGTCGctcgcag 3’，其中大写碱基组成茎环结构的外环部分，小写无下划线碱基组成茎环结构的茎秆部分，5’端修饰绿色荧光基团6FAM，3’端修饰红色荧光基团HEX。该试剂盒用于检测耐药基因ABCG2的C421A单核苷酸多态性，检测样本为PCR产物。
2.根据权利要求1所述的一种探针室温下检测耐药基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述外环部分的核苷酸用来识别目的序列，茎秆部分的核苷酸用于形成二级结构，其不直接参与目的序列识别。
3.根据权利要求1所述的一种探针室温下检测耐药基因多态性的试剂盒，其特征在于：这两个功能独立的茎环结构，茎环结构I用于检测ABCG2 C421A的C亚型等位基因，茎环结构II用于检测ABCG2 C421A的A亚型。
4.根据权利要求1所述的一种探针室温下检测耐药基因多态性的试剂盒，其特征在于：PCR反应所用的正向引物序列5’TTGTGATGGGCACTCTGACG3’，反向引物序列5’CGTCATAGT TGTTGCAAGCCG3’。
5.根据权利要求1所述的一种探针室温下检测耐药基因多态性的试剂盒，其特征在于：构成双茎环结构一级核苷酸序列中间位置的t不属于茎环结构，仅用于修饰荧光淬灭基团BHQ1。
6.根据权利要求1所述的一种探针室温下检测耐药基因多态性的试剂盒，其特征在于：室温杂交预混液：每10μL杂交预混液中由5μL浓度为25mmol/L的MgCl2、4μL甲酰胺和1μL浓度为1μmol/L的分子信标二联体组成。
7.根据权利要求1所述的一种探针室温下检测耐药基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述的分子信标二联体的制备是通过如下步骤实现的：
(1)向8联管中加入室温预混液10μL；
(2)对目的基因进行不对称PCR扩增；
(3)吸取10μL不对称PCR产物至装有室温预混液的8联管中；混匀后利用QPCR仪等能够检测荧光强度的仪器检测荧光强度值。
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