CN109913538A - 一种快速检测snp位点的荧光定量试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种快速检测SNP位点的荧光定量试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括SNP位点识别的第一类引物、协助第一类引物进行SNP特征序列恒温扩增的第二类引物和第三类引物、核苷酸单体混合物、核糖核酸内切酶、核酸聚合酶和核酸双链荧光染料的反应混合液，以及使用说明书，反应体系采用引物激活式恒温链置换核酸扩增方式。本发明所述的一种快速检测SNP位点的荧光定量试剂盒灵敏度高，可以检测到22aM的目标物，该方法选择性好，有10000倍的错配区分率，反应一步完成且为闭管反应，避免了交叉污染，同时反应所需时间短，无需荧光标记，可以直接检测基因组样品，节省了时间和人力成本。

Description

一种快速检测SNP位点的荧光定量试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其是涉及一种快速检测SNP位点的荧光定量试剂盒。

背景技术

基因多态性广泛存在于生物体基因组中，其中单碱基多态性(SNP)是最常见的基因多态性形式。SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性，它是人类可遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，是基因突变的一种，主要是碱基置换突变，平均每500-1000个碱基对中就有1个，总数估计可达300万个甚至更多。SNP可提供重要的遗传数据，对于疾病的诊断、法医鉴定分析有极其重要的意义。

目前，国内外现有的SNP检测技术主要有以下几种，基于芯片技术的检测方法、高分辨率融解曲线检测法，Taqman荧光探针法、等位基因特异性扩增法、质谱法和高效液相层析法等，其中等位基因特异性扩增法主要采用PCR扩增的方式，PCR循环扩增的过程中引物链延伸反应容易发生模板与引物之间的碱基错配，导致合成的DNA片段不均一，PCR产物特异性较差。近几年，一系列的基因突变的检测方法层出不穷，同时经典的方法也在不断地被改进，激活式引物恒温链置换核酸扩增反应为聚合酶链式反应的一种特殊型式，在引物存在情况下，1小时内即可完成DNA或RNA的扩增反应，激活式引物恒温链置换核酸扩增反应是一种在等温条件下进行的高效率的核酸放大技术，这种技术只需要一种具有链置换活性的DNA聚合酶，加之其有较高的灵敏度与专一性，非常适合应用于各种核酸检测。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种快速检测SNP位点的荧光定量试剂盒，以解决SNP位点检测选择性不高、灵敏度低、交叉污染等问题。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种快速检测SNP位点的荧光定量试剂盒，包括包括SNP位点识别的第一类引物、协助第一类引物进行SNP特征序列恒温扩增的第二类引物和第三类引物、核苷酸单体混合物、核糖核酸内切酶RNase H2、核酸聚合酶Bst DNA和核酸双链荧光染料SYBR Green I的反应混合液，以及使用说明书。

进一步的，试剂盒的反应混合物包含pH值调节剂，使得所述反应混合物的pH值维持在7.5-9.5之间。

进一步的，试剂盒的反应混合物包含多种选择下组的成分：包含Mg²⁺、K⁺、(NH₄)⁺、H⁺、Cl^-、SO^2-、Tris-Cl和细胞表面活性剂。

进一步的，试剂盒包含的引物的设计原则为：第一类引物、第二类引物和第三类引物分别与所述基因组DNA中目标碱基位点前后的一段或两段序列一致或互补，条件是所述的第一类引物3’端序列与基因组DNA在目标碱基位点互补，并且所述的第一类引物中与目标碱基互补的碱基为核糖核苷酸，同时所述的第一类引物在3’端修饰有核酸聚合酶延伸反应阻断基团，所述的第二类引物和第三类引物仅由脱氧核糖核酸组成并且3’端可被核酸聚合酶延伸。

进一步的，试剂盒包含的反应混合液中核糖核酸内切酶RNase H2、核酸聚合酶BstDNA与所述第一类引物、第二类引物和第三类引物可分别至于不同的独立容器中。

进一步的，反应体系采用激活式引物恒温链置换核酸扩增方式，反应温度为55℃～95℃的任一温度，最终得到产物混合液，条件是：(1)将所述反应混合物置于能够打开所述基因组DNA的双链的温度；(2)将所述反应混合物置于能够使所述第一类引物、所述第二类引物、所述第三类引物与DNA单链模板结合的温度；(3)将所述反应混合物置于能够使所述第一类引物与DNA单链模板结合，并且在所述核糖核酸内切酶的作用下去除3’端阻断基团的温度，以产生可被核酸聚合酶延伸的激活的引物产物；(4)将所述反应混合物置于能够使与DNA单链模板结合的第一类引物在所述核酸聚合酶的作用下延伸长度的温度，以产生扩增产物；(5)将所述反应混合物置于能够使所述扩增产物脱落成单链的温度。

进一步的，荧光仪选择SYBR Green I检测通道，实时读取反应混合液荧光信号。

相对于现有技术，本发明所述的一种快速检测SNP位点的荧光定量试剂盒具有以下优势：

(1)本发明所述的试剂盒灵敏度高，可以检测到22aM的目标物，该方法选择性好，有10000倍的错配区分率，反应一步完成且为闭管反应，避免了交叉污染，同时反应所需时间短，无需荧光标记，可以直接检测基因组样品，无需放大步骤和其他处理，简化了实验步骤，节省了时间和人力成本，有利于进一步对疾病进行早期诊断和患病风险的预测。

(1)本发明所述的试剂盒，结合核糖核酸内切酶对目标碱基互补核糖核苷酸碱基的识别，激活引物序列介导恒温链置换核酸扩增反应，扩增效率高，1小时内可以完成扩增反应，灵敏度高，可以检测到22aM的目标物，该方法特异性好，有接近10000倍的单碱基错配区分率；

(2)本发明所述的试剂盒，反应恒温进行，不依赖复杂、精密的温控仪器，同时结果易判读，可直接目测或仅需借助简单的荧光仪观测结果。

(3)本发明所述的试剂盒，反应一步完成且为闭管反应，避免了交叉污染，同时反应所需时间短，无需荧光标记，可以直接检测基因组样品，无需放大步骤和其它处理，简化了实验步骤，节省了时间和人力成本。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明试剂盒的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明的反应原理图；

图2中图A为本发明试剂盒扩增和检测不同浓度Kras rs121913529突变序列的实时荧光曲线。

图B为本发明试剂盒实施例1所述的POI值与Kras rs121913529突变序列浓度对数的关系。

图3为本发明试剂盒实施例1所述的在Kras位点rs121913529野生型DNA背景下对突变型序列扩增和检测的实时荧光曲线，从左至右突变型DNA Mutant Target在野生型DNAWild Target中的比例依次为100％、10％、1％、0.1％、0.01％和0％，DNA的总浓度为2.2pM。

图4为本发明实施例2所述的HT29细胞(rs121913529突变阴性)和SW480细胞(rs121913529突变阳性)基因组DNA的rs121913529突变位点的扩增与检测实时荧光曲线。其中a、b分别为取10⁶个SW480细胞1％和0.1％细胞提取液的分析结果，c、d分别为取10⁶个HT29细胞1％和0.1％细胞提取液的分析结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图来详细说明本发明。

实施例1：基因Kras突变位点rs121913529的扩增与检测

使用含有rs121913529位点的突变型Kras质粒DNA Mutant Target和含有rs121913529位点的野生型Kras质粒DNA Wild Target分别作为检测靶标，用于验证本发明的灵敏度与特异性。Kras质粒DNA序列如表1所示(所示DNA序列及其互补链)。

表1质粒序列

试剂盒中引物依据Kras突变位点rs121913529设计，包括第一类引物DP1、第二类引物P2、第三类引物P3和P4，其中第一类引物DP1中的rU为核糖核苷酸，与Kras序列中目标突变位点互补，在3’端修饰有C3Spacer，可阻断核酸聚合酶对第一引物DP1的延伸反应，相应的序列及末端修饰如表2所示。

表2突变扩增与检测引物序列表

本实施例试剂盒的反应体系由如下组成：反应体系的体积为30μL，其中包含1×反应缓冲液，4mM MgSO₄，0.8μM的SEQ ID NO:1所示的第一引物DP1和SEQ ID NO:2所示第二引物P2，0.2μM的SEQ ID NO:3所示的第三引物P3和SEQ ID NO:4所示的第三引物P4，1mMdNTP，8U Bst DNA聚合酶,2U/mL RNase H2，其中1×反应缓冲液包含20mM Tris-HCl,10mM(NH₄)₂SO₄，10mM KCl，2mM MgSO₄，0.1％TritonX-100，pH为8.8。

反应体系采用激活式引物恒温链置换核酸扩增方式，反应温度设置为63℃。

反应过程中，第一引物DP1与DNA在目标单碱基处互补杂交，当DNA中目标碱基为突变型Mutant Target时，核糖核酸酶RNase H2识别并剪切第一引物DP1中与目标单碱基突变位点互补的核糖核苷酸rU上游的磷酸二酯键，迫使DP1带有阻断基团的C3Spacer的3’端从RNase H2剪切处掉落，同时在3’端留下可被Bst DNA聚合酶延伸的OH，得到激活的第一引物，并在核酸聚合酶作用下延伸，此延伸产物可被第三引物P4的延伸产物置换得到单链DNA，单链DNA的5’端进一步折叠形成一个发夹结构；同时，第二引物P2和第三引物P3可与该单链DNA在近3’端不同区域结合而被聚合酶延伸，且第二引物P2的延长产物可被第三引物P3的延长产物置换而变成单链，从而得到两端都具有发夹结构的扩增模板，在模板上，第一引物DP1被反复验证并激活，并与第二引物P2共同作用，使得模板不断被延伸并产生新的扩增模板，得到与目标碱基相关的高特异性和高灵敏的DNA扩增，助于目标碱基的准确检测。

用实时荧光光谱仪进行检测，对应染料SYBR Green I选择激发和发射通道，每间隔30s读取一次荧光值，结果记录为实时荧光曲线图，从灵敏度、定量分析性能和突变区分特异性三个方面验证本发明基于引物激活的碱基突变序列扩增检测的性能。

1.灵敏度验证

用实时荧光光谱仪进行检测，对应染料SYBR Green I选择激发波长497nm和发射波长520nm，每间隔30s读取一次荧光值，具体结果实时荧光曲线图请参见附图2A。实时荧光曲线图显示：对于突变型DNA Mutant Target，测得的实时荧光曲线的POI(point ofinflection)值随着靶标浓度的升高而降低，表明本发明试剂盒对目标突变碱基高灵敏的动态响应；同时，本实施例中突变型DNA Mutant Target可被检测到的浓度可低至22aM，表明本发明试剂盒的高灵敏度和极低的检测下限。

2.定量分析性能验证

使用图2A中各实时荧光曲线的POI值对突变型DNA靶标Mutant Target的浓度的对数作图，得到本实施例的定量工作曲线，如附图2B所示。定量工作曲线显示：当靶标MutantTarget浓度在220aM to 22pM之间时，POI值与标靶浓度线性相关，表明本发明试剂盒可用于靶标的定量分析。

3.特异性验证

在固定靶标总浓度为2.2pM的情况下，将Mutant Target与Wild Target混合，使得Mutant Target占有比例依次为100％、10％、1％、0.1％、0.01％和0％，并使用本发明试剂盒进行突变型序列的扩增和实时荧光检测，所得的实时荧光曲线请参见附图3。实时荧光曲线显示：当Mutant Target靶标比例低至0.01％时，本发明试剂盒依然能从比例高为99.99％的Wild Target靶标中区分0.01％的Mutant Target靶标，所得的实时荧光曲线POI值低于100％Wild Target靶标的信号(Mutant Target比例为0％)，对突变型靶标和野生型靶标的区分度约为10,000倍，表明本发明试剂盒优越的单碱基识别特异性。

实施例2：细胞基因组DNA的rs121913529突变位点的扩增与检测

分别将10⁶个HT29细胞(rs121913529突变阴性)和SW480细胞(rs121913529突变阳性)分别用ONE-4-ALL Genomic DNA Mini-Preps Kit提取，然后各取1％或0.1％的细胞提取液，并本发明试剂盒进行rs121913529突变位点的扩增和检测，所用扩增检测混合液与实施例1中一致。分析结果实时荧光曲线请参见附图4。实时荧光曲线显示：两个不同浓度的rs121913529突变阳性细胞SW480在40min左右给出了具有不同POI值的实时荧光曲线，不同浓度的rs121913529突变阴性细胞HT29则在90min内均未给出实时荧光曲线，表明本发明试剂盒对目标突变碱基扩增的高特异性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种快速检测SNP位点的荧光定量试剂盒，其特征在于：包括SNP位点识别的第一类引物、协助第一类引物进行SNP特征序列恒温扩增的第二类引物和第三类引物、核苷酸单体混合物、核糖核酸内切酶RNase H2、核酸聚合酶Bst DNA和核酸双链荧光染料SYBR Green I的反应混合液，以及使用说明书。

2.根据权利要求1所述的一种快速检测SNP位点的荧光定量试剂盒，其特征在于：所述反应混合物进一步包含pH值调节剂，使得所述反应混合物的pH值维持在7.5-9.5之间。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的一种快速检测SNP位点的荧光定量试剂盒，其中所述反应混合物进一步包含多种选择下组的成分：包含Mg²⁺、K⁺、(NH₄)⁺、H⁺、Cl^-、SO^2-、Tris-Cl和细胞表面活性剂。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的一种快速检测SNP位点的荧光定量试剂盒，所述的第一类引物、第二类引物和第三类引物分别与所述基因组DNA中目标碱基位点前后的一段或两段序列一致或互补，条件是所述的第一类引物3’端序列与基因组DNA在目标碱基位点互补，并且所述的第一类引物中与目标碱基互补的碱基为核糖核苷酸，同时所述的第一类引物在3’端修饰有核酸聚合酶延伸反应阻断基团，所述的第二类引物和第三类引物仅由脱氧核糖核酸组成并且3’端可被核酸聚合酶延伸。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的一种快速检测SNP位点的荧光定量试剂盒，所述反应混合液中核糖核酸内切酶RNase H2、核酸聚合酶Bst DNA与所述第一类引物、第二类引物和第三类引物可分别至于不同的独立容器中。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的一种快速检测SNP位点的荧光定量试剂盒，其特征在于：反应体系采用激活式引物恒温链置换核酸扩增方式，反应温度为55℃～95℃的任一温度，最终得到产物混合液，条件是：

(1)将所述反应混合物置于能够打开所述基因组DNA的双链的温度；

(2)将所述反应混合物置于能够使所述第一类引物、所述第二类引物、所述第三类引物与DNA单链模板结合的温度；

(3)将所述反应混合物置于能够使所述第一类引物与DNA单链模板结合，并且在所述核糖核酸内切酶的作用下去除3’端阻断基团的温度，以产生可被核酸聚合酶延伸的激活的引物产物；

(4)将所述反应混合物置于能够使与DNA单链模板结合的第一类引物在所述核酸聚合酶的作用下延伸长度的温度，以产生扩增产物；

(5)将所述反应混合物置于能够使所述扩增产物脱落成单链的温度。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的一种快速检测SNP位点的荧光定量试剂盒，其特征在于：荧光仪选择SYBR Green I检测通道，实时读取反应混合液荧光信号。