CN107447031A - 一种乳液中进行环介导等温扩增的突变核酸数字分析方法 - Google Patents

一种乳液中进行环介导等温扩增的突变核酸数字分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种乳液中进行环介导等温扩增的突变核酸数字分析方法，将生物素标记的环引物与亲和素标记的磁珠结合后，与环介导等温扩增的内引物、另一荧光标记的内引物、环引物及缓冲溶液、目标核酸、酶等反应试剂混合均匀，与油相在机械作用力下混合均匀，形成稳定的乳液，在适宜的反应温度下，乳液中存在目标突变核酸的液滴发生环介导等温扩增反应，得到磁性颗粒‑LAMP产物‑荧光标记内引物的复合物，破乳后收集反应得到的磁珠，通过显微镜和流式细胞仪实现突变核酸的数字分析。本发明所述的突变核酸数字分析方法利用环介导等温扩增的优势缩短了时间、提高了效率，实现了突变核酸的定量分析。

Description

一种乳液中进行环介导等温扩增的突变核酸数字分析方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其是涉及一种乳液中进行环介导等温扩增的突变核酸数字分析方法。
背景技术
乳液PCR的原理简单来说是通过单链DNA模板与捕获磁珠结合后，PCR反应试剂与油相混合形成乳液，得到一系列皮升大小的小液滴-小而独立的反应室。在这个微小的反应室中进行扩增反应，扩增后的产物富集在磁珠上，通过离心和磁分离收集磁珠，洗脱后对磁珠上的PCR产物进行测序。该技术可将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几十至几万个单元中进行反应，最后通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。然而，目前数字PCR技术的由于PCR反应在乳液中的扩增效率不高，导致磁珠捕获扩增产物进行荧光标记后信号放大效果有限，通常需要对信号进行二次放大等步骤，需要使用更为精密的仪器以及较昂贵的控温设备，这在一定程度上制约了其在核酸数字定量上的发展。另外，在单碱基的变异检测方面，传统的检测方法包括凝胶电泳和MADLI-TOF质谱等，这些方法不仅费用高、分析周期长，而且操作程序复杂，不利于单碱基的变异检测的精确定量分析。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提出了一种乳液中进行环介导等温扩增的突变核酸数字分析方法，该方法较于乳液PCR有更高的核酸扩增效率和信号放大效果，而且核酸样本无需预先进行PCR扩增，并在扩增反应后直接破乳即可上样分析，相比于传统的单碱基突变检测，此方法不仅费用低，而且操作简单，可以实现突变核酸的定量分析。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种乳液中进行环介导等温扩增的突变核酸数字分析方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将生物素标记的环引物与亲和素标记的磁珠结合；
(2)制备乳液；
(3)将反应管放入恒温水浴中，在55℃～65℃下反应0.5～5小时；
(4)在反应管中加入1毫升异丙醇，破乳洗涤两次，离心后弃去上清收集磁珠；
(5)将步骤(4)得到的磁珠进行显微镜检测，对产生荧光信号的磁珠进行计数；
(6)将步骤(4)得到的磁珠进行流式检测，对产生荧光信号的磁珠进行计数。
进一步的，所述步骤(1)是通过如下步骤制备的：
在离心管中用TES缓冲液洗涤链霉亲和素包被的直径为0.5～4μm的磁珠，洗涤两次后向磁珠中加入5～25μM生物素标记的引物，室温下孵育15～30分钟，得到生物素标记的内引物与亲和素标记的磁珠复合物。
进一步的，所述步骤(2)中乳液包括水相和油相，乳液制备步骤如下：
所述水相将生物素标记的环引物-链霉亲和素磁珠复合物、与环介导等温扩增的外引物、内引物、反应缓冲溶液、目标核酸、RNase H2酶、Bst聚合酶按体积比(2～6)：(5～15)：(1～8)：(5～20)：(0.5～2)：(2～10)：(1～5)混合均匀；
所述油相由DC5225C、DC749、Ar20以质量比(2～5)：(2～4)：(2～4)混合均匀；
将所述水相和油相按体积比1:2～1:3加入反应管中研磨，得到稳定乳液。
进一步的，所述油相由DC5225C、DC749、Ar20以质量比4：3：3混合均匀。
进一步的，所述水相将生物素标记的环引物-链霉亲和素磁珠复合物、与环介导等温扩增的外引物、内引物、反应缓冲溶液、目标核酸、RNase H2酶、Bst聚合酶按体积比3：8：4：10：1：6：2混合均匀。
相对于现有技术，本发明所述的一种乳液中进行环介导等温扩增的突变核酸数字分析方法具有以下优势：
(1)本发明所述的一种乳液中进行环介导等温扩增的突变核酸数字分析方法不需要复杂的芯片、可控的温控设备等成本较高的设备即可完成对突变核酸的数字分析，简化了实验步骤，利用环介导等温扩增的优势缩短了时间、提高了效率，此方法不仅费用低，而且操作简单，可以实现突变核酸的定量分析；
(2)本发明所述的一种乳液中进行环介导等温扩增的突变核酸数字分析方法为基因诊断和基因治疗等研究提供了一种工艺简单、信号稳定、具有较高的灵敏度与准确性的突变核酸数字分析手段。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为该方法的工作原理图；
其中图1a为在存在突变目标链的液滴里，带RNA碱基及封闭链的引物FIP与目标链杂交；
图1b为在RNase H2酶的作用下，与突变目标链互补的引物FIP的封闭链被切掉；
图1c为激活的引物和突变目标链在Bst聚合酶的作用下发生Lamp扩增反应；
图1d为扩增产物的一端与磁珠上的引物互补，另一端与荧光标记的BIP引物链互补；
图2为本发明实施例1乳液的显微镜成像图，白色箭头标记为引物标记的磁珠；
图3为本发明实施例1破乳收收集磁珠的显微镜成像图；
图4为本发明实施例1流式细胞计数图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
实施例1
(1)引物设计：使用http://primerexplorer.jp/e/的设计软件，针对Braf基因突变V600E设计环介导等温扩增(LAMP)引物。引物序列如下(5'-3')：
Braf基因突变V600E目标链：
TAAACTCTTCATAATGCTTGCTCTGATAGGAAAATGAGATCTACTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAGATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGAGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGTAAGAATTGAGGCTATTTTTCCACTGATTAAATTTTTGGCCCTGAGATGCTGCTGAGTTACTAGAAAGTCATTGAAGGTCTCAACTATAGTATTTTCATAGTTCCCAGTATTCACAAAAATCAGTGTTCTTATTTTTTATGTAAATAGATTTTTTAACTTTTTTCTTTA
BRAF-F3引物：TCTTCATGAAGACCTCACAG
BRAF-B3引物：TTGAGACCTTCAATGACTTTC
BRAF-BIP引物：Cy5-CTGGATCCATTTTGTGGATGGTAA-TAGTAACTCAGCAGCATCTC
BRAF-LF引物：CCACTCCATCGAGATTTC
BRAF-LB引物：GAGGCTATTTTTCCACTGATTAA
BRAF-bio-LF-Capture引物：Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-spacer18-CCACTCCATCGAGATTTCBRAF-FIP-(RNA)-4D-C3a-RNAbase引物：
ACAACTGTTCAAACTGATGGGACGTGATTTTGGTCTAGCTACAG(a)GAAA-C3spacer
(2)制备引物标记的磁珠：
在1.5毫升微量离心管中，用100μL TES缓冲液(20mM Tris-HCl，pH值7.5；1MNaCl)洗涤10μL(7-12×107)链霉亲和素包被的直径1μm磁珠。每次洗涤后，将管放在磁铁上1分钟以浓缩珠子然后用吸管除去上清液，洗涤2次后重新悬浮在100μLTES缓冲液中。取10μM生物素标记的引物加入磁珠中，室温下孵育15～30分钟。反应后的磁珠用100μL TES缓冲液洗涤三次，备用。
(3)制备乳液：a、水相制备：将生物素标记的环引物(LF)-链霉亲和素磁珠复合物3μL，环介导等温扩增的外引物F3(5μM)、B3(5μM)各4μL，环引物LB(10μM)、荧光标记的内引物BIP(40μM)4μL,Thermopol(10×)缓冲溶液10μL，带封闭链的FIP(40μM)4Μl，突变核酸1μL(预先淬火)、MgSO4(10mM)4μL，dNTP(10mM)14μL，BSA(1mg/mL)1μL，Bst2.0Warmstart聚合酶4μL，6μL RNase H2酶(100×稀释液)，混合均匀，加灭菌超纯水至100μL。b、油相制备：将DC5225C、DC749、Ar20以质量比为40％、30％、30％混合均匀。c、形成乳液：将两个直径3毫米钢珠加入2毫升的反应管中，加入100μ水相反应液和200μL油相，调整组织研磨器的频率28HZ,研磨时间1min，使其形成水相液滴直径约为3-10μm的稳定乳液。
(4)LAMP反应：将反应管放入恒温水浴中，在63℃下反应2小时；
(5)破乳收集磁珠：在反应管中加入1毫升异丙醇，破乳洗涤两次，离心后弃去上清收集磁珠。用100μL TES缓冲液(20mM Tris-HCl，pH值7.5；100mMNaCl)洗涤磁珠三次，待测；
(6)显微镜检测：调整荧光显微镜参数，在与荧光标记的内引物匹配的640荧光通道下可以拍摄到产生Cy5荧光信号的磁珠，即为阳性磁珠，得到阳性磁珠的数量与突变核酸的加入量成正比，图3中白色磁珠为含有液滴中突变核酸链，反应后大量扩增产物和荧光标记引物与之结合的阳性磁珠；
(7)流式检测：调整流式细胞仪参数，对产生Cy5荧光信号的磁珠进行计数，得到阳性磁珠的数量与突变核酸的加入量成正比，图4中，左峰为阴性磁珠计数，右峰为阳性磁珠计数。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种乳液中进行环介导等温扩增的突变核酸数字分析方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)将生物素标记的环引物与亲和素标记的磁珠结合；
(2)制备乳液；
(3)将反应管放入恒温水浴中，在55℃～65℃下反应0.5～5小时；
(4)在反应管中加入1毫升异丙醇，破乳洗涤两次，离心后弃去上清收集磁珠；
(5)将步骤(4)得到的磁珠进行显微镜检测，对产生荧光信号的磁珠进行计数；
(6)将步骤(4)得到的磁珠进行流式检测，对产生荧光信号的磁珠进行计数。
2.根据权利要求1所述的一种乳液中进行环介导等温扩增的突变核酸数字分析方法，其特征在于：所述步骤(1)是通过如下步骤制备的：
在离心管中用TES缓冲液洗涤链霉亲和素包被的直径为0.5～4μm的磁珠，洗涤两次后向磁珠中加入5～25μM生物素标记的引物，室温下孵育15～30分钟，得到生物素标记的内引物与亲和素标记的磁珠复合物。
3.根据权利要求1所述的一种乳液中进行环介导等温扩增的突变核酸数字分析方法，其特征在于：所述步骤(2)中乳液包括水相和油相，乳液制备步骤如下：
所述水相将生物素标记的环引物-链霉亲和素磁珠复合物、与环介导等温扩增的外引物、内引物、反应缓冲溶液、目标核酸、RNase H2酶、Bst聚合酶按体积比(2～6)：(5～15)：(1～8)：(5～20)：(0.5～2)：(2～10)：(1～10)混合均匀；
所述油相由DC5225C、DC749、Ar20以质量比(2～5)：(2～4)：(2～4)混合均匀；
将所述水相和油相按体积比1:2～1:3加入反应管中研磨，得到稳定乳液。
4.根据权利要求3所述的一种乳液中进行环介导等温扩增的突变核酸数字分析方法，其特征在于：所述油相由DC5225C、DC749、Ar20以质量比4：3：3混合均匀。
5.根据权利要求3所述的一种乳液中进行环介导等温扩增的突变核酸数字分析方法，其特征在于：所述水相将生物素标记的环引物-链霉亲和素磁珠复合物、与环介导等温扩增的外引物、内引物、反应缓冲溶液、目标核酸、RNase H2酶、Bst聚合酶按体积比3：8：4：10：1：6：4混合均匀。
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