CN106916898A - 一种乳液中进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法 - Google Patents

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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Abstract

本发明提供了一种乳液中进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法。本发明的技术方案是以引物标记的磁珠为载体，在稳定的乳液液滴中发生环介导等温扩增反应，磁珠在反应后生成大量的扩增产物并捕捉与之互补的荧光标记引物，破乳后收集反应磁珠，通过显微镜和流式细胞仪对目标DNA/mRNA实现数字核酸分析的目的。本发明所述的数字miRNA分析方法的建立为基因诊断和基因治疗等研究提供了一种工艺简单、信号稳定、具有较高的灵敏度与准确性的数字miRNA分析手段。

Description

一种乳液中进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其是涉及一种乳液中进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法。
背景技术
乳液PCR的原理简单来说是通过单链DNA模板与捕获磁珠结合后，PCR反应试剂与油相混合形成乳液，得到一系列皮升大小的小液滴-小而独立的反应室。在这个微小的反应室中进行扩增反应，扩增后的产物富集在磁珠上，通过离心和磁分离收集磁珠，洗脱后对磁珠上的PCR产物进行测序。该技术可将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几十至几万个单元中进行反应，最后通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。
然而，目前数字PCR技术的由于PCR反应在乳液中的扩增效率不高，导致磁珠捕获扩增产物进行荧光标记后信号放大效果有限，通常需要对信号进行二次放大等步骤，需要使用更为精密的仪器以及较昂贵的控温设备，这在一定程度上制约了其在核酸数字定量上的发展。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明旨在提出一种乳液中进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法，该方法较于乳液PCR有更高的核酸扩增效率和信号放大效果，而且本发明待测的miRNA样本无需预先进行PCR扩增，在扩增反应后直接破乳即可上样分析。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种用于环介导等温扩增的数字miRNA分析方法的乳液，包括水相和油相：
所述水相由生物素标记的引物与亲和素标记的磁珠复合物、目标miRNA介导的连接DNA模板、荧光标记的引物、反应缓冲溶液、Bst聚合酶按体积比(3～6)：(0.5～2)：(2～6)：(8～13)：(3～8)混合均匀；
所述油相由DC5225C、DC749、Ar20按质量比(3～5)：(2～4)：(2～4)混合均匀；
将所述水相和油相按体积比1:2～1:3加入反应管中研磨，得到稳定乳液。
进一步的，乳液在环介导等温扩增的数字miRNA分析方法中的应用。
进一步的，所述的乳液进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法包括如下步骤：
(1)制备引物标记的磁珠；
(2)以目标miRNA为模板设计两条DNA发夹探针H1和H2；
(3)在目标存在的情况下，目标miRNA与H1和H2退火杂交，用连接酶将H1和H2连接形成双哑铃DNA结构；
(4)配制乳液；
(5)将反应管放入恒温水浴槽中，在55℃～65℃下反应4～6小时，得到磁性颗粒-环介导等温扩增产物-荧光标记引物的复合物；
(6)在反应管中加入1毫升异丙醇，破乳洗涤两次，离心后弃去上清收集磁珠；
(7)将步骤(4)得到的磁珠进行显微镜检测，对产生荧光信号的磁珠进行计数；
(8)将步骤(4)得到的磁珠进行流式检测，对产生荧光信号的磁珠进行计数。
进一步的，步骤(1)所述制备引物标记的磁珠是通过如下步骤制备的：
在离心管中用TES缓冲液洗涤链霉亲和素包被的直径为0.5～2μm的磁珠，洗涤两次后，向磁珠中加入7～15μM生物素标记的引物，室温下孵育15～30分钟，得到制备生物素标记的引物与亲和素标记的磁珠复合物；
进一步的，所述水相由生物素标记的引物与亲和素标记的磁珠复合物、目标miRNA介导的连接DNA模板、荧光标记的引物、反应缓冲溶液、Bst聚合酶按体积比3：1：4：10：6混合均匀。
相对于现有技术，本发明所述的一种乳液中进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法具有以下优势：
(1)本发明所述的一种乳液中进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法，该方法较于乳液PCR有更高的miRNA扩增效率和信号放大效果，而且miRNA样本无需预先进行PCR扩增，并在扩增反应后直接破乳即可上样分析。
(2)本发明所述的一种乳液中进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法，此方法对目标序列没有依赖性，只要进行配套的引物设计即可开展目标miRNA的数字分析
(3)本发明所述的一种乳液中进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法，该方法不需要复杂的芯片、温控设备等成本较高的设备即可完成对miRNA的数字分析，简化了实验步骤，利用环介导等温扩增的优势缩短了时间、提高了效率，为基因诊断和基因治疗等研究提供了一种工艺简单、信号稳定、具有较高的灵敏度与准确性的数字miRNA分析手段。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1中为整个分析方法的流程图；
图2为磁珠在乳液中的反应原理图；
图3为乳液的显微镜成像图，白色箭头标记为引物标记的磁珠；
图4为破乳收收集磁珠的显微镜成像图；
图5为流式细胞计数图；
具体实施方式
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
实施例1基于环介导等温扩增的数字分析方法检测miRNA
(1)引物设计：针对miRNA设计环介导等温扩增引物。序列如下：
(2)制备引物标记的磁珠：
在1.5毫升微量离心管中，用100μL TES缓冲液(20mMTris-HCl，pH值7.5；1MNaCl)洗涤100μL(7-12×108)链霉亲和素包被的直径1μm磁珠。每次洗涤后，将管放在磁铁上1分钟以浓缩珠子然后用吸管除去上清液，洗涤2次后重新悬浮在100μLTES缓冲液中。取10μM生物素标记的引物加入磁珠中，室温下孵育15～30分钟。反应后的磁珠用100μL TES缓冲液洗涤三次，备用。
(2)以目标miRNA为模板设计两条DNA发夹探针H1和H2；
(3)在目标存在的情况下，目标miRNA与H1和H2退火杂交，用连接酶将H1和H2连接形成双哑铃DNA结构；
(4)制备乳液：a、水相制备：将生物素标记的引物(FIP)-链霉亲和素磁珠复合物3μL，目标miRNA介导的连接DNA模版(5μM)、BP(5μM)各4μL，荧光标记的引物BIP(40μM)4μL,Thermopol(10X)缓冲溶液10μL，目标miRNA1μL、MgSO4(10mM)4μL，dNTP(10mM)14μL，BSA(1mg/mL)1μL，Bst2.0Warmstart聚合酶6μL，混合均匀，加灭菌超纯水至100μL。b、油相制备：将DC5225C、DC749、Ar20以质量比为40％、30％、30％混合均匀。c、形成乳液：将一个直径3毫米钢珠加入2毫升的反应管中，加入100μ水相反应液和200μL油相，调整组织研磨器的频率28HZ,研磨时间1min，使其形成水相液滴直径约为3-10μm的稳定乳液，图3中白色箭头标记为引物标记的磁珠。
(5)LAMP反应：将反应管放入恒温水浴中，在63℃下反应1小时，
图4中黑色点为阴性磁珠，说明该磁珠所在的液滴未发生环介导等温扩增
反应，不存在目标miRNA。白色点为阳性磁珠，说明该磁珠所在的液滴
发生了环介导等温扩增反应，存在目标miRNA。
(6)破乳收集磁珠：在反应管中加入1毫升异丙醇，破乳洗涤两次，离心后弃去上清收集磁珠。用100μL TES缓冲液(20mMTris-HCl，pH值7.5；100mMNaCl)洗涤磁珠三次，待测；
(7)显微镜检测：调整荧光显微镜参数，在与荧光标记的内引物匹配的640荧光通道下可以拍摄到产生Cy5荧光信号的磁珠，即为阳性磁珠，得到阳性磁珠的数量与目标miRNA的加入量成正比；
(8)流式检测：调整流式细胞仪参数，对产生Cy5荧光信号的磁珠进行计数，得到阳性磁珠的数量与目标miRNA的加入量成正比，图5中，左峰为阴性磁珠计数，右峰为阳性磁珠计数。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种用于环介导等温扩增的数字miRNA分析方法的乳液，其特征在于：包括水相和油相：
所述水相由生物素标记的引物与亲和素标记的磁珠复合物、目标miRNA介导的连接DNA模板、荧光标记的引物、反应缓冲溶液、Bst聚合酶按体积比(3～6)：(0.5～2)：(2～6)：(8～13)：(3～8)混合均匀；
所述油相由DC5225C、DC749、Ar20按质量比(3～5)：(2～4)：(2～4)混合均匀；
将所述水相和油相按体积比1:2～1:3加入反应管中研磨，得到稳定乳液。
2.如权利要求1所述的乳液在环介导等温扩增的数字miRNA分析方法中的应用。
3.一种利用如权利要求1所述的乳液进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)制备引物标记的磁珠；
(2)以目标miRNA为模板设计两条DNA发夹探针H1和H2；
(3)在目标存在的情况下，目标miRNA与H1和H2退火杂交，用连接酶将H1和H2连接形成双哑铃DNA结构；
(4)配制乳液；
(5)将反应管放入恒温水浴槽中，在55℃～65℃下反应4～6小时，得到磁性颗粒-环介导等温扩增产物-荧光标记引物的复合物；
(6)在反应管中加入1毫升异丙醇，破乳洗涤两次，离心后弃去上清收集磁珠；
(7)将步骤(4)得到的磁珠进行显微镜检测，对产生荧光信号的磁珠进行计数；
(8)将步骤(4)得到的磁珠进行流式检测，对产生荧光信号的磁珠进行计数。
4.根据权利要求3所述的一种乳液中进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法，其特征在于：步骤(1)所述制备引物标记的磁珠是通过如下步骤制备的：
在离心管中用TES缓冲液洗涤链霉亲和素包被的直径为0.5～2μm的磁珠，洗涤两次后，向磁珠中加入7～15μM生物素标记的引物，室温下孵育15～30分钟，得到制备生物素标记的引物与亲和素标记的磁珠复合物；
5.根据权利要求1所述的一种用于环介导等温扩增的数字miRNA分析方法的乳液，其特征在于：所述水相由生物素标记的引物与亲和素标记的磁珠复合物、目标miRNA介导的连接DNA模板、荧光标记的引物、反应缓冲溶液、Bst聚合酶按体积比3：1：4：10：6混合均匀。
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