CN109321637A - 一种病原体核酸捕获扩增检测方法 - Google Patents

一种病原体核酸捕获扩增检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于核酸靶基因扩增或者检测技术领域，尤其涉及一种病原体核酸捕获扩增检测方法。相对于传统的等温扩增技术，本发明提出的基于核酸分子的捕获技术实现了目标基因的准确定位获取，并以捕获磁珠为基础进行扩增反应，使得核酸模版与磁珠在反应过程中充分分散接触，有效降低了目标模版的漏检率，改善现有技术中精度交叉的问题，同时简化了扩增流程，降低了DNA聚合酶的干扰影响，整个流程中简化了常规手段中热循环控制、染色以及预扩增等前置内容，大大降低了整个流程的复杂度以及流程的硬件和工作量需求，同时具有更加灵活的操作条件，便于进行扩大检测以及诊断应用等延伸内容，具有很好的应用前景。

Description

一种病原体核酸捕获扩增检测方法
技术领域
本发明属于核酸靶基因扩增或者检测技术领域，尤其涉及一种病原体核酸捕获扩增检测方法。
背景技术
核酸的等温扩增技术是用于在一定的温度下扩增特定的DNA或者RNA等目标核酸或靶基因载体的技术，其具有技术要求相对较低、反应时间相对较短的特点，因此能够更好的应用在快速检测以及现场测试等快速、简洁和迅速的需求。
但对于医学以及生物学中对某些复杂载体的研究以及检测的需求上，由于常规的等温扩增技术其自身特异性难以把握，并且容易受到核酸量的精度以及DNA聚合酶的影响，因此难以进行有效的定量和精确分析，其直接导致目标模版检测结果的错误、检测过程复杂、效率低下且有效性无法保证等不利结果，而随着现代医学对核酸特别是病原体核酸方面研究以及技术分析的需求，市场上需要一种能够为病原体核酸进行快速分析检测提供基础的分析技术。
发明内容
本发明创造的目的在于，提供一种流程简单、操作内容少、对过程要求较低的病原体核酸捕获扩增检测方法。
为实现上述目的，本发明创造采用如下技术方案。
本发明的一种病原体核酸捕获扩增检测方法，包括如下步骤：
步骤一、制备由上游外引物A修饰的磁珠悬浮液，具体是指，将已被生物素标记的磁珠在缓冲液中洗涤，缓冲液是指5nM‐PH7.5的氨丁三醇、0.5nM的乙二胺四乙酸和1M氯化钠的混合溶液，使用磁力架将磁珠吸附至管壁后清除缓冲液，将洗净后的磁珠加入缓冲液制备成50μL的磁珠悬浮液，将2μL‐10μM已被生物素标记的上游外引物A加入至磁珠悬浮液内，室温下孵育0.5h制得经过上游外引物A修饰的磁珠；将由上游外引物A修饰的磁珠进行洗涤后悬浮至50μL的缓冲液内；
步骤二、利用磁珠捕获病原体核酸，具体是指，将数目不低于5×106颗由上游外引物A修饰的磁珠与1ml的病原体样本进行恒温混合杂交1小时，恒温混合杂交过程中保持振荡以使磁珠均匀悬浮在混合溶液内；恒温混合杂交结束后进行洗涤，获得捕获有病原体核酸的磁珠；将捕获有病原体核酸的磁珠悬浮至50μL‐1×ThermoPo1缓冲液内制备捕获有病原体核酸的磁珠悬浮液；
步骤三、制备含捕获有病原体核酸的磁珠的反应混合液，其中，每100μL的反应混合液组分含量/浓度为1×ThermoPo1、4mM的硫酸镁、3.2μM的已标记下游外引物B、0.4μM的内引物、、3.2nM的三磷酸碱基脱氧核苷酸、0.1mg/mL牛血清蛋白、4μL(8000U/mL)的DNA聚合酶、5×106颗捕获有病原体核酸的磁珠；
步骤四、制备乳液，具体是指，将100μL的反应混合液加入至含有200μL乳油液相的2mL旋盖冻存管内盖紧，在均质器上均质形成乳液，将制备的乳液在恒温下水浴反应1.5小时；
步骤五、检测及统计，具体是指，将上述乳液涡旋混匀10秒后破乳，进行离心后去除上清液并加入1ml异丙醇再次离心去除异丙醇上清液，利用磁力架吸附磁珠至反应器管壁后分别用300μL、150μL、150μL的TE‐PH8.0缓冲液洗涤磁珠，将磁珠悬浮至500μL的TE缓冲液内使用细胞仪进行计数以及生物素检测。
对于上述病原体核酸捕获扩增检测方法，特别的是，在各离心以及洗涤操作之后使用移液枪等设备将反应器内壁聚集或吸附的磁珠进行分散。
对于上述病原体核酸捕获扩增检测方法，特别的是，所述步骤四中，乳液的制备方法是，将两个直径3mm的钢珠加入至旋盖冻存管内，加入100μL水相反应液和200μL的油相并以28Hz的频率均质1分钟后得到稳定的乳液。
对于上述病原体核酸捕获扩增检测方法，特别的是，所述步骤一还包括，将上述由上游外引物A修饰的磁珠悬浮液应当被分置在至少含有100μL的反应溶液的反应器中，每个反应器内由上游外引物A修饰的磁珠的初始浓度为7～12×109珠/mL，在每个用于检测的混合溶液内，混合物中由上游外引物A修饰的磁珠的数目不低于5×106颗。
对于上述病原体核酸捕获扩增检测方法，特别的是，油相反应液的组分为，以质量份数计算的40％环甲基硅氧烷油包水乳化剂、30％的DC749、30％的Ar20，基于上述油相反应液，经过实验对比，当采用24‐32Hz均值频率均可制备得到稳定的乳液，通过显微镜成像对比，其中采用24Hz的均值频率处理后获得的乳液具有更好的成像性能，其阳性和阴性磁珠群能够更好的区分，其实际效果如图1所示。
其有益效果在于：
相对于传统的等温扩增技术，本发明提出的基于核酸分子的捕获技术实现了目标基因的准确定位获取，并以捕获磁珠为基础进行扩增反应，使得核酸模版与磁珠在反应过程中充分分散接触，有效降低了目标模版的漏检率，改善现有技术中精度交叉的问题，同时简化了扩增流程，降低了DNA聚合酶的干扰影响，整个流程中简化了常规手段中热循环控制、染色以及预扩增等前置内容，大大降低了整个流程的复杂度以及流程的硬件和工作量需求，同时具有更加灵活的操作条件，便于进行扩大检测以及诊断应用等延伸内容，具有很好的应用前景。
说明书附图
图1是实施例中不同乳液下显微镜成像效果比较图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明创造作详细说明。
本发明的一种病原体核酸捕获扩增检测方法，包括
步骤一、制备由上游外引物A修饰的磁珠悬浮液，具体是指，将已被生物素标记的磁珠在缓冲液中洗涤，缓冲液是指5nM‐PH7.5的氨丁三醇、0.5nM的乙二胺四乙酸和1M氯化钠的混合溶液，使用磁力架将磁珠吸附至管壁后清除缓冲液，将洗净后的磁珠加入缓冲液制备成50μL的磁珠悬浮液，将2μL‐10μM已被生物素标记的上游外引物A加入至磁珠悬浮液内，室温下孵育0.5h制得经过上游外引物A修饰的磁珠；将由上游外引物A修饰的磁珠进行洗涤后悬浮至50μL的缓冲液内；
特别的为实现重复检测以及利用，上述由上游外引物A修饰的磁珠悬浮液应当被分置在至少含有100μL的反应溶液的反应器中，每个反应器内由上游外引物A修饰的磁珠的初始浓度为7～12×109珠/mL，在每个用于检测的混合溶液内，混合物中由上游外引物A修饰的磁珠的数目不低于5×106颗；
步骤二、利用磁珠捕获病原体核酸，具体是指，将数目不低于5×106颗由上游外引物A修饰的磁珠与1ml的病原体样本进行恒温混合杂交1小时，恒温混合杂交过程中保持振荡以使磁珠均匀悬浮在混合溶液内；恒温混合杂交结束后进行洗涤，获得捕获有病原体核酸的磁珠；将捕获有病原体核酸的磁珠悬浮至50μL‐1×ThermoPo1缓冲液内制备捕获有病原体核酸的磁珠悬浮液；
步骤三、制备含捕获有病原体核酸的磁珠的反应混合液，其中，每100μL的反应混合液组分含量/浓度为1×ThermoPo1、4mM的硫酸镁、3.2μM的已标记下游外引物B、0.4μM的内引物、、3.2nM的三磷酸碱基脱氧核苷酸、0.1mg/mL牛血清蛋白、4μL(8000U/mL)的DNA聚合酶、5×106颗捕获有病原体核酸的磁珠；
步骤四、制备乳液，具体是指，将100μL的反应混合液加入至含有200μL乳油液相的2mL旋盖冻存管内盖紧，在均质器上均质形成乳液，将制备的乳液在恒温下水浴反应1.5小时。乳液制备较优的方法是，将两个直径2.5‐3.5mm的钢珠加入至旋盖冻存管内，加入100μL水相反应液和200μL的油相反应液并以20‐32Hz的频率均质1分钟后得到稳定的乳液；
步骤五、检测及统计，具体是指，将上述乳液涡旋混匀10s后破乳，进行离心后去除上清液并加入1ml异丙醇再次离心去除异丙醇上清液，利用磁力架吸附磁珠至反应器管壁后分别用300μL、150μL、150μL的TE‐PH8.0缓冲液洗涤磁珠，将磁珠悬浮至500μL的TE缓冲液内使用细胞仪进行计数以及生物素检测。
其中，在各离心以及洗涤操作之后应当使用移液枪等设备将反应器内壁聚集或吸附的磁珠进行分散。
其中，油相反应液的组分为，以质量份数计算的40％环甲基硅氧烷油包水乳化剂、30％的DC749、30％的Ar20，基于上述油相反应液，经过实验对比，当采用24‐32Hz均值频率均可制备得到稳定的乳液，通过显微镜成像对比，其中采用24Hz的均值频率处理后获得的乳液具有更好的成像性能，其阳性和阴性磁珠群能够更好的区分，其实际效果如图1所示。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明创造的技术方案，而非对本发明创造保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明创造作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明创造的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明创造技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种病原体核酸捕获扩增检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、制备由上游外引物A修饰的磁珠悬浮液，具体是指，将已被生物素标记的磁珠在缓冲液中洗涤，缓冲液是指5nM‐PH7.5的氨丁三醇、0.5nM的乙二胺四乙酸和1M氯化钠的混合溶液，使用磁力架将磁珠吸附至管壁后清除缓冲液，将洗净后的磁珠加入缓冲液制备成50μL的磁珠悬浮液，将2μL‐10μM已被生物素标记的上游外引物A加入至磁珠悬浮液内，室温下孵育0.5h制得经过上游外引物A修饰的磁珠；将由上游外引物A修饰的磁珠进行洗涤后悬浮至50μL的缓冲液内；
步骤二、利用磁珠捕获病原体核酸，具体是指，将数目不低于5×106颗由上游外引物A修饰的磁珠与1ml的病原体样本进行恒温混合杂交1小时，恒温混合杂交过程中保持振荡以使磁珠均匀悬浮在混合溶液内；恒温混合杂交结束后进行洗涤，获得捕获有病原体核酸的磁珠；将捕获有病原体核酸的磁珠悬浮至50μL‐1×ThermoPo1缓冲液内制备捕获有病原体核酸的磁珠悬浮液；
步骤三、制备含捕获有病原体核酸的磁珠的反应混合液，其中，每100μL的反应混合液组分含量/浓度为1×ThermoPo1、4mM的硫酸镁、3.2μM的已标记下游外引物B、0.4μM的内引物、、3.2nM的三磷酸碱基脱氧核苷酸、0.1mg/mL牛血清蛋白、4μL(8000U/mL)的DNA聚合酶、5×106颗捕获有病原体核酸的磁珠；
步骤四、制备乳液，具体是指，将100μL的反应混合液加入至含有200μL乳油液相的2mL旋盖冻存管内盖紧，在均质器上均质形成乳液，将制备的乳液在恒温下水浴反应1.5小时；
步骤五、检测及统计，具体是指，将上述乳液涡旋混匀10秒后破乳，进行离心后去除上清液并加入1ml异丙醇再次离心去除异丙醇上清液，利用磁力架吸附磁珠至反应器管壁后分别用300μL、150μL、150μL的TE‐PH8.0缓冲液洗涤磁珠，将磁珠悬浮至500μL的TE缓冲液内使用细胞仪进行计数以及生物素检测。
2.根据权利要求1所述一种病原体核酸捕获扩增检测方法，其特征在于，在各离心以及洗涤操作之后使用移液枪等设备将反应器内壁聚集或吸附的磁珠进行分散。
3.根据权利要求1所述一种病原体核酸捕获扩增检测方法，其特征在于，所述步骤四中，乳液的制备方法是，将两个直径2.5‐3.5mm的钢珠加入至旋盖冻存管内，加入100μL水相反应液和200μL的油相并以20‐32Hz的频率均质1分钟后得到稳定的乳液。
4.根据权利要求1所述一种病原体核酸捕获扩增检测方法，其特征在于，所述步骤一还包括，将上述由上游外引物A修饰的磁珠悬浮液应当被分置在至少含有100μL的反应溶液的反应器中，每个反应器内由上游外引物A修饰的磁珠的初始浓度为7～12×109珠/mL，在每个用于检测的混合溶液内，混合物中由上游外引物A修饰的磁珠的数目不低于5×106颗。
5.根据权利要求3所述一种病原体核酸捕获扩增检测方法，其特征在于，油相反应液的组分为，以质量份数计算的40％环甲基硅氧烷油包水乳化剂、30％的DC749、30％的Ar20，基于上述油相反应液，均质器的均值频率为24Hz。
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