CN106929598A - 一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法，本发明所述数字核酸分析方法是以引物标记的磁珠为载体，在乳液中发生滚环扩增反应，磁珠在反应后生成大量的扩增产物并捕捉与之互补的荧光标记引物，形成磁珠‑扩增产物‑荧光标记引物的复合物，反应后的乳液经破乳后收集反应磁珠，使用显微镜和流式细胞仪采集磁珠的荧光信号，通过对荧光磁珠数的计数实现对目标DNA的数字核酸分析。本发明所述的一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法利用滚环扩增的优势缩短了时间、提高了效率，该方法为基因诊断和基因治疗等研究提供了一种工艺简单、信号稳定、具有较高的灵敏度与准确性的数字核酸分析手段。

Description

一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，尤其是涉及一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法。
背景技术
数字化PCR(digital polymerase chain reaction，dPCR)作为DNA定量的新技术，实现了单分子DNA绝对定量。dPCR是将单个DNA样品反应液分别进行数以百计的反应，并且每个反应分别进行扩增检测。此技术在临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达、环境微生物检测和下一代测序等方面的研究发挥了重要作用。乳液中的PCR是结合了数字PCR以及流式技术，它是基于Bead、Emulsion、Amplificaton和Magnetic这四个主要组分来构建的，称为BEAMing技术。其方法是每一类DNA分子都会专一的与磁性珠子相结合，PCR反应试剂与油相混合形成乳液，得到数以亿计的小液滴。这些小液滴组成独立的反应室，在这个微小且独立的反应室中DNA分子进行扩增反应，扩增后的产物富集在磁珠上，通过离心和磁分离收集磁珠，洗脱后对磁珠上的PCR产物进行测序。该技术可将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几十至几万个单元中进行反应，最后通过流式细胞仪检测评估样品的原始浓度或含量。乳液中进行数字PCR技术的由于PCR反应在乳液中的扩增效率不高，导致磁珠捕获扩增产物进行荧光标记后信号放大效果有限，通常需要对信号进行二次放大等步骤，乳液的形成过程中目标链与磁珠不在同一个液滴里面，存在漏检。PCR技术依赖精良设备，反应温度复杂，对于酶的保真性要求极高，成本高；此外乳液反应完成后破乳收集磁珠，仍需对磁珠进行后续标记处理，不能直接上机测样；PCR反应的所需的高温条件，导致要在标记双生物素来保证其与磁珠结合的稳定性。
发明内容
针对上述技术不足，本发明旨在提出一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法，该方法较于乳液PCR有更高的核酸扩增效率和信号放大效果，而且本发明待测的核酸样本无需预先进行PCR扩增，在扩增反应后直接破乳即可上样分析。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法，包括如下步骤：
(1)制备滚环扩增引物结合的磁珠；
(2)合成环探针溶液；
(3)捕获环探针：将步骤(1)制备的滚环扩增引物结合的磁珠加入步骤(2)中制备的环探针溶液中，放置于摇床，反应0.5～2h；
(4)制备乳液；
(5)破乳收集磁珠：在反应管中加入异丙醇，破乳洗涤，离心后弃去上清液，收集磁珠；
(6)将步骤(5)收集的磁珠进行显微镜检测，对产生荧光信号的磁珠进行计数；
(7)将步骤(5)收集的磁珠进行流式检测，对产生荧光信号的磁珠进行计数。
进一步的，所述滚环扩增引物结合的磁珠是通过如下步骤制备的：
用缓冲溶液洗涤链霉亲和素包被的直径0.5～2μm磁珠，洗涤三次后，将磁珠悬浮在缓冲溶液中，将生物素标记的滚环放大引物加入缓冲溶液中，室温下孵育15～30分钟，然后将磁珠用TE缓冲液洗涤三次。
进一步的，所述环探针是通过如下步骤合成的：
将挂锁探针和目标核酸孵育一定时间后将混合物冷却至室温，加入连接酶、连接酶反应缓冲液，反应1～3h，然后灭活连接酶，得到环探针溶液。
进一步的，所述乳液包括水相和油相；
所述水相由生物素标记的内引物与亲和素标记的磁珠复合物、环介导等温扩增的外引物、荧光标记的内引物、反应缓冲溶液、目标核酸、Bst聚合酶按体积比(3～6)：(6～10)：(2～6)：(8～13)：(0.5～2)：(3～8)混合均匀；
所述油相由DC5225C、DC749、Ar20按质量比(3～5)：(2～4)：(2～4)混合均匀；
将所述水相和油相按体积比1:2～1:3加入反应管中研磨，得到稳定乳液。
相对于现有技术，本发明所述的一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法具有以下优势：
(1)本发明所述的一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法，该方法不需要复杂的芯片、精密的控温设备等成本较高的设备即可完成对核酸的数字分析，实验步骤简单，利用滚环扩增的优势缩短了时间、提高了效率；
(2)本发明所述的一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法，该方法较于乳液PCR有更高的核酸扩增效率和信号放大效果，而且核酸样本无需预先进行PCR扩增，并在扩增反应后直接破乳即可上样分析。
(3)本发明所述的一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法，通过捕获步骤，减少目标的漏检概率，该方法为基因诊断和基因治疗等研究提供了一种工艺简单、信号稳定、具有高灵敏度与准确性的数字核酸分析手段。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明的实验原理图；
图2为本发明实施例所述的乳液的显微镜成像图。
图3为破乳收收集磁珠的显微镜成像图；
图4为流式细胞计数图。
图中：1、目标物 2、挂锁探针 3、磁珠 4、引物链 5、水相 6、微乳油相 7、荧光标记的反向引物链 8、具有荧光扩增信号的磁珠 9、连接酶
具体实施方式
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
实施例1：基于乳液中滚环扩增的核酸数字分析技术检测microRNA
(1)链设计：针对micro RNA 222(miR-222)设计滚环扩增(RCA)。寡核苷酸序列(5'→3')如下：
miR-222：AGC UAC AUC UGG CUA CUG GGU CUC
引物P1：Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGACCATTGTGCGCTATCTTCA
挂锁探针：p-CCA GAT GTA GCT TGT AAG ATG AAG ATA GCG CAC AAT GGT CGAATT CTC AAC CCC TAC GCG AGA CCC AGT AG
引物P2：Cy5-ATGGTCGAATTCTCAACCCCTA
(2)制备RCA引物结合的磁珠：用100μL B&W Buffer缓冲液(Bing and Washingbuffer,5mM NaCl,0.5mM EDTA,1M NaCl,pH值7.5)洗涤20μL(7-10×109个/mL)链霉亲和素包被的直径1μm磁珠。洗涤三次后，将磁珠悬浮在100μL B&W Buffer缓冲液中。取10μM生物素标记的RCA引物P1加入磁珠中，室温下孵育15～30分钟。反应后的磁珠用100μL TE缓冲液洗涤三次，备用。
(3)合成环探针：
10μL的反应体系中包含4mM Tris-HCl(pH 7.5)、28mM的NaCl、1mM MgCl2、1mMKCl、0.1mM EDTA，2.5μL的挂锁探针(10μM)和一定量的MiR 222，在95℃下孵育3分钟。然后在52℃、47℃、42℃下各孵育30分钟后将混合物冷却至室温，加入5μL SplintR连接酶(25UμL-1)、2.5μL 10×连接酶反应缓冲液(500mM Tris-HCl、100mM MgCl2、10mM ATP、100mM DTT，pH值7.5)和7.5μL超纯水，并在25℃下温育2小时。将混合物在65℃下加热10分钟灭活SplintR连接酶。最终得到的环探针溶液保存在4℃直至使用。
(4)捕获环探针：将P1结合的磁珠加入(3)制备的环探针中，放入摇床，350rmp、37℃条件下反应1小时，使磁珠捕获环探针。
(5)制备乳液：a、水相制备：将(4)中已捕获环探针的磁珠、13μL荧光标记的RCA引物P2(20μM)、20μL的dNTP(10mM)、2μL的BSA(1mg/mL)、4μL Bst 2.0Warmstart聚合酶(8UμL-1)，混合均匀，加灭菌超纯水至100μL；b、油相制备：将DC5225C、DC749、Ar20以质量比为40％、30％、30％混合均匀；c、形成乳液：将一个直径3毫米钢珠加入2毫升的反应管中，加入100μL水相和200μL油相，调整组织研磨器的频率为28HZ，研磨时间为5分钟，使其形成水相液滴直径约为3-10μm的稳定乳液，图2中白色箭头标记为引物标记的磁珠。
(6)破乳收集磁珠：在反应管中加入1毫升异丙醇，破乳洗涤两次，离心后弃去上清收集磁珠。用100μL TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH值8.0)洗涤磁珠三次，待测；
(7)荧光显微镜检测：调整荧光显微镜参数，在与荧光标记的内引物匹配的荧光通道下可以拍摄到产生Cy5荧光信号的磁珠，即为阳性磁珠，得到阳性磁珠的数量与目标核酸的加入量成正比，图4黑色点为阴性磁珠，说明该磁珠所在的液滴未发生滚环扩增反应，不存在目标核酸。深灰色点为阳性磁珠，说明该磁珠所在的液滴发生了滚环扩增反应，存在目标核酸。
(8)流式检测：调整流式细胞仪参数，对产生Cy5荧光信号的磁珠进行计数，得到阳性磁珠的数量与目标核酸的加入量成正比，图4中左峰为阴性磁珠计数，右峰为阳性磁珠计数。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)制备滚环扩增引物结合的磁珠；
(2)合成环探针溶液；
(3)捕获环探针：将步骤(1)制备的滚环扩增引物结合的磁珠加入步骤(2)中制备的环探针溶液中，放置于摇床，反应0.5～2h；
(4)制备乳液；
(5)破乳收集磁珠：在反应管中加入异丙醇，破乳洗涤，离心弃去上清液，收集磁珠；
(6)将步骤(5)收集的磁珠进行显微镜检测，对产生荧光信号的磁珠进行计数；
(7)将步骤(5)收集的磁珠进行流式检测，对产生荧光信号的磁珠进行计数。
2.根据权利要求1所述的一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法，其特征在于：所述滚环扩增引物结合的磁珠是通过如下步骤制备的：
用缓冲溶液洗涤链霉亲和素包被的直径0.5～2μm磁珠，将磁珠悬浮在缓冲溶液中，将生物素标记的滚环放大引物加入缓冲溶液中，室温下孵育15～30分钟，然后将磁珠用TE缓冲液洗涤三次。
3.根据权利要求1所述的一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法，其特征在于：所述环探针是通过如下步骤合成的：
将挂锁探针和目标核酸孵育一定时间后将混合物冷却至室温，加入连接酶、连接酶反应缓冲液，反应1～3h，然后灭活连接酶，得到环探针溶液。
4.根据权利要求1所述的一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法，其特征在于：所述乳液包括水相和油相：
所述水相由生物素标记的内引物与亲和素标记的磁珠复合物、环介导等温扩增的外引物、荧光标记的内引物、反应缓冲溶液、目标核酸、Bst聚合酶按体积比(3～6)：(6～10)：(2～6)：(8～13)：(0.5～2)：(3～8)混合均匀；
所述油相由DC5225C、DC749、Ar20按质量比(3～5)：(2～4)：(2～4)混合均匀；
将所述水相和油相按体积比1:2～1:3加入反应管中研磨，得到稳定乳液。
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