CN112210589A - 一种核酸分子定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸分子定量检测方法，可用于核酸分子单分子浓度级别的定量检测。本发明利用在颗粒材料上修饰用于核酸分子扩增的引物，将单个核酸分子的所有扩增产物固定在颗粒材料表面或内部，利用信号标记物进行扩增产物信号标记，利用检测系统实现单分子扩增产物的检测，从而实现单分子浓度水平的核酸分子检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸分子定量检测的方法，用于核酸分子的高灵敏度定量检测。
背景技术
生物标志物尤其是与重大疾病相关的生物标志物在人体内的含量与多种生物学过程密切相关。这些生物标志物在疾病发生的早期阶段含量较低,传统方法难以实现准确有效地检测分析。要实现生物标志物，例如DNA、RNA等核酸分子的早期准确诊断，需要超高灵敏度乃至单分子级别的定量检测手段辅助。
现有的核酸检测方法主要依赖于传统PCR技术。它通过巢式PCR扩增，将待检测核酸分子指数级扩增后，利用荧光染料或分子信标来实现扩增产物浓度的检测。然而由于检测设备都是有一定背景噪音信号的，当样品中的靶标分子浓度低到一定程度时，溶液整体的光强信号将被背景信号所淹没，造成检测方法在低值区间偏差变大，难以实现准确定量分析。因此，无论是传统的通过核酸扩增后进行凝胶电泳的核酸分子定量方法或是通过对扩增产物进行实时荧光动态检测的实时荧光定量PCR技术，都难以实现超高灵敏度的核酸分子定量检测。
为了克服传统PCR技术在检测灵敏度水平的限制，20世纪90年代，Stephen Quake等人提出了数字PCR的概念。数字PCR技术通过微流控芯片将待检测的核酸分子模板分散到高通量的体积极小的液滴中，以每个液滴为一个微反应器，在反应器内对每个核酸分子进行扩增。由于物理上的隔离作用，使得单个核酸分子的扩增产物只能被束缚在单独的微反应器内，从而实现单分子核酸扩增产物的浓缩与信号识别。现有的数字PCR技术由于检测底层原理的突破，极大程度的提高了核酸分子的检测灵敏度和准确度水平。然而受限于微流控芯片技术的限制、繁琐的检测流程以及复杂的反应体系，现有的数字PCR技术依然面临着成本高、操作复杂、稳定性差等众多问题。
综上所述，现有的核酸检测技术有着检测体系复杂、检测设备精密度要求极高、检测试剂稳定性差、辅助耗材精密度高、成本难以控制等众多缺陷。这些问题极大程度的阻碍了单分子检测技术在科研和医疗诊断市场的推广和应用。
因此，需要开发出一套简单有效、低成本的检测方法，通过简单的流体中的液相核酸分子扩增，实现超高灵敏度核酸分子定量检测。
发明内容
本发明针对现有核酸分子检测所面临的瓶颈，发展了一种基于固相颗粒的简单有效、低成本的，可直接在单一流体溶液相实现的超高灵敏度核酸分子定量检测。
本发明的技术方案如下：
一种核酸分子定量检测的方法，主要包括如下步骤：
a)使用至少一种颗粒材料，并在所述的颗粒材料表面或内部偶联用于核酸分子扩增的引物；
b)将颗粒材料分散于流体中进行核酸分子扩增，所述的核酸分子扩增产物被固定于颗粒材料表面或内部；
c)使用信号标记物对所述的核酸分子产物进行信号标记，利用检测设备对所述信号标记物信号进行检测；
d)利用定量分析系统进行定量检测。所述的定量分析系统：
(1)通过直接对带有信号标记物信号的颗粒材料个数进行计数，通过所述的颗粒个数进行定量分析；
(2)或通过对颗粒材料的信号强度进行分析，通过所述的信号强度进行定量分析。
在本发明中，
所述的核酸分子为待检测物质，可以为脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或锁核酸(LDNA)中的一种或多种。
所述的颗粒材料用于偶联核酸分子扩增的引物，并将引物扩增后形成的产物固定于颗粒材料表面或内部，并将所述形成的扩增产物以颗粒材料为单元在检测设备中进行检测。
在一些实施例中，所述的颗粒材料可以是高分子聚合物、金属、无机物颗粒中的至少一种。
所述的颗粒材料尺寸为10nm至100μm；优选为100nm至10μm；最优选为100nm至1μm。
在一些实施例中，所述的高分子聚合物可以是葡聚糖、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、环氧树脂聚合物、聚乙二醇、聚丙烯酰胺中的一种或多种；
在一些实施例中，所述的金属包括金、铂、铜、铁等金属元素及其氧化物中的一种或多种形成的颗粒；
在一些实施例中，所述的无机物颗粒包括硅、二氧化硅、稀土掺杂纳米颗粒中的一种或多种。
所述的核酸分子引物用于待检测核酸分子的扩增，形成与待检测核酸分子模板互补序列，并在颗粒材料表面或内部形成扩增产物；
在一些实施例中，所述的引物包括一对正向引物和反向引物；
在另一些实施例中，所述的引物包括两对正向引物和反向引物；
在另一些实施例中，所述的引物包括一个正向引物。
所述的流体为溶解核酸分子待测样本的溶液，包含扩增所需的必须物质，用于实现核酸分子在颗粒材料表面或内部的扩增；
在一些实施例中，所述的流体为脑脊液、血浆、血清、唾液、泪液、尿液、粪便溶液中的一种或多种；
在另一些实施例中，所述的流体为水溶液、缓冲溶液、油相溶液中的一种或多种；
在一些实施例中，所述的扩增所需必须物质包括dNTP、酶、金属离子、缓冲液盐离子、酶稳定剂、增溶剂、核酸稳定剂、非特异性扩增抑制剂以及防腐剂中的一种或多种。
所述的核酸分子扩增，是一种核酸分子的复制模式，用于实现核酸分子线性或指数级的复制增长，实现信号放大；
在一些实施例中，所述的核酸分子扩增方法包括聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction，PCR)、反转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription-PolymeraseChain Reaction，PCR)、环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplificationmethod，LAMP)、滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)、重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)、核酸依赖性扩增检测技术(Nuclearacid sequence-based amplification，NASBA)以及基于上述扩增反应衍生的核酸扩增方法中的一种或多种。
所述的核酸分子扩增产物是利用核酸分子扩增产生的大量产物分子，是用于实现后续信号标记的主要依据；
在一些实施例中，所述的扩增产物可以是单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA、DNA-RNA杂交链、DNA-RNA复合链、三链DNA或三链DNA-RNA杂交体中的一种或多种；
在另一些实施例中，扩增产物可以是小分子、聚合物、蛋白质、荧光材料、电磁信号材料中的一种或多种；
所述的信号标记物用于核酸分子扩增产物的信号标记，可以使含有核酸分子扩增产物的颗粒材料特异性的发出标记信号；
在一些实施例中，所述的信号标记物可以是能产生光、电、磁信号的材料中的一种或多种；
所述可以产生光、电、磁信号的材料，
在一些实施例中，可以是有机小分子、无机盐离子、稀土元素、金属离子、金属氧化物、高分子聚合物、金属纳米粒子、量子点、无机纳米颗粒中的一种或多种；
所述的标记信号为信号标记物产生的特殊信号，是所述含有核酸分子扩增产物的颗粒材料发出的所述特异性标记信号可被后续检测设备检测出；
在一些实施例中，所述的特异性标记信号可以是荧光、化学发光、光吸收信号中的一种或多种；
在另一些实施例中，所述的特异性标记信号可以是电阻、电流、电磁感应、电容、电压信号中的一种或多种；
在另一些实施例中，所述的特异性标记信号可以使磁场强度、电磁感应、磁场图形信号中的一种或多种；
所述的检测设备可以特异性的识别所述信号标记物发出的信号，对所述含有核酸分子扩增产物的颗粒材料发出所述特异性标记信号的强度、个数进行有效读取和记录；
在一些实施例中，所述的检测设备可以是流式细胞仪，通过对颗粒材料的逐个扫描实现信号标记物光学信号的检测；
在另一些实施例中，所述的检测设备可以是荧光显微镜，通过与控制芯片的配合，实现信号标记物光学信号的检测；
在另一些实施例中，所述的检测设备可以是磁力检测装置，通过与控制芯片的配合，实现信号标记物磁力信号的检测；
在另一些实施例中，所述的检测设备可以是电学检测工作站，通过与控制芯片的配合，实现信号标记物中电阻、电容、电压、电流的检测；
所述控制芯片使用微流控芯片，
在一些实施例中，使用流聚焦型通道设计，迫使颗粒材料成单一方向排列；
在另一些实施例中，使用鞘液设计，迫使颗粒材料成单一方向排列。
所述定量分析系统是一种可以对所述设备读取和记录的所述标记信号进行有效处理，通过一定的信号处理与计算实现对所述待测核酸分子的定量检测。
在一些实施例中，所述的定量分析系统直接对含有标记物标记信号的颗粒材料个数进行统计，通过标准曲线校正实现流体中核酸分子浓度的定量检测分析；
在另一些实施例中，所述的定量分析系统通过对颗粒材料的平均荧光强度进行分析，通过标准曲线校正实现流体中核酸分子浓度的定量检测分析；
在另一些实施例中，所述的定量分析系统同时采用对含有标记物标记信号的颗粒材料个数进行统计，并利用采集到的所有颗粒材料平均荧光强度进行分析，综合评判流体中核酸分子浓度，实现定量检测分析；
本发明的优点如下：
本发明的一些实施例中，所述的一种核酸分子定量检测的方法，可应用于核酸分子的超高灵敏度定量检测；其中，所述的一种核酸分子定量检测的方法的在核酸分子的检测，在一些实施例中，其灵敏度可以达到1000copy核酸；其中，所述的一种核酸分子定量检测的方法，在一些实施例中，其密度可以达到100copy核酸；其中，所述的一种核酸分子定量检测的方法，在一些实施例中，其密度可以达到10copy核酸；其中，所述的一种核酸分子定量检测的方法，在一些实施例中，其密度可以达到1copy核酸。
本发明所述的一种核酸分子定量检测的方法，与传统荧光定量PCR技术相比，灵敏度提高了100-1000倍；
本发明所述的一种核酸分子定量检测的方法，与现有的数字PCR技术相比，具有相同的检测灵敏度，但是由于本发明所述的一种核酸分子定量检测的方法，在检测过程中，所有的反应都发生在一种流体中，无需使用第二种流体对第一种流体进行分隔，极大程度地简化了反应条件和实验设备的精密度需求；同时本发明所述的一种核酸分子定量检测的方法，由于在检测过程中，所产生的所有核酸扩增产物都富集固定在颗粒材料表面或内部，反应流体中无任何扩增产物，不会发生气溶胶污染问题，极大程度地简化了实验环境的要求。
本发明所述的一种核酸分子定量检测的方法，将极大程度地推进核酸检测技术在检测性能发明的发展以及相关技术产业化实现。
附图说明
图1为本发明一种核酸分子定量检测的方法实施方法原理示意图
图2为本发明在实施例1中标准曲线绘制结果
图3为本发明在实施例1中缓冲液中不同浓度的λDNA的检测结果。
具体实施方式
实施例1：
1.1实验组分
2.丙烯酰胺(Sigma)、硫酸铵(国药)、四甲基乙二胺(国药)、磷酸盐缓冲液(PBS)、矿物油(Sigma)、丙酮(国药)、异丙醇(国药)、10X PCR Buffer(NEB)、EasyTaq酶(NEB)、dNTPs(NEB)、SyberGreen(上海生工)、λDNA from Ecoli.(Sigma)。
2.1制备方法
2.1.1标记有PCR引物的丙烯酰胺纳米材料合成
(1)取0.5mL水溶液，溶解0.1％的硫酸铵，2％丙烯酰胺单体，1μM丙烯酰胺-正向引物和1μM丙烯酰胺-反向引物。取1mL矿物油，加入1％四甲基乙二胺。将两相溶液混匀后，超声1h，过夜反应。
(2)加入破乳剂，离心使油水分层。取水相溶液，依次加入丙酮、异丙醇、水对水相溶液进行清洗，每次清洗后7000rpm离心，收集沉淀。最后用100μL水溶液复溶。
2.2实验方法
2.2.1水相PCR扩增反应
按照下表所示配方进行PCR扩增反应：
| 试剂 | 浓度单位 | 加入体积(μL) |
| 10X PCR buffer | 10X | 2 |
| 丙烯酰胺纳米颗粒 | 5μM | 2 |
| EasyTaq酶 | 20U | 1 |
| dNTPs | 2mM | 5 |
| SyberGreen | 10X | 2 |
| 待测样本体积 | —— | 5 |
| 水 | —— | 3 |
PCR过程在95℃3分钟预热变性后，按照95℃20秒，62度20秒，75度20秒反应30个循环，4℃冷却。
2.2.2流式细胞仪检测
将反应后的丙烯酰胺微球使用100μL 10mM磷酸缓冲液稀释后，使用流式细胞仪对样本进行检测，获得荧光信号分布结果。
2.2.3标准曲线的制作
使用10mM磷酸缓冲液对λDNA标准品进行稀释，分别获得每微升内含有1、10、100、1000、10000、100000个λDNA模板的浓度梯度样品。使用1.3.1和1.3.2所述实验方案对6个不同标准样本进行检测分析，获得相对应的荧光信号分布结果，按照捕获得的含有荧光信号的颗粒数对浓度做相关性散点图，拟合标准曲线。
2.2.4缓冲液中不同浓度的λDNA的检测
选取5个不同浓度的待测样本，使用1.3.1和1.3.2所述实验方案对样本进行盲测，通过标准曲线对样本浓度进行定量分析，计算不同浓度样本回收率，进行检测结果的评估。
2.3实验结果
2.3.1标准曲线的绘制
检测结果如图2所示，随着样本里的λDNA模板数量增加，检测出的含有荧光信号的丙烯酰胺微球个数也逐渐增加。含有10个λDNA的样本的事件数可以有效与背景区分开。
2.3.2缓冲液中不同浓度的λDNA的检测
| 样本编号 | 计算浓度 | 检测浓度 |
| 1 | 1pM | 1.09pM |
| 2 | 500fM | 473.3fM |
| 3 | 125fM | 112.9fM |
| 4 | 12.5fM | 10.7fM |
| 5 | 1.2fM | 0.98fM |
检测结果如上表和图3所示，5个不同样本的检测回收率均在80％-120％内，计算浓度与检测浓度的相关性R2为0.989，证明了检测结果的可靠性。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围。
Claims (10)
1.一种核酸分子定量检测的方法，包括如下步骤：
a)使用至少一种颗粒材料，并在所述的颗粒材料表面或内部偶联用于核酸分子扩增的引物；
b)将颗粒材料分散于流体中进行核酸分子扩增，所述的核酸分子扩增产物被固定于颗粒材料表面或内部；
c)使用信号标记物对所述的核酸分子产物进行信号标记，利用检测设备对所述信号标记物信号进行检测；
d)利用定量分析系统进行定量检测，所述的定量分析系统：
(1)通过直接对带有信号标记物信号的颗粒材料个数进行计数，通过所述的颗粒个数进行定量分析；
(2)或通过对颗粒材料的信号强度进行分析，通过所述的信号强度进行定量分析。
2.根据权利要求1所述的一种核酸分子定量检测的方法，其特征在于：所述的颗粒材料包括高分子聚合物、金属、无机物颗粒中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的一种颗粒材料，其特征在于：所述的颗粒材料尺寸为10nm至100μm。
4.根据权利要求1所述的一种用于核酸分子定量检测的方法，其特征在于：所述的核酸分子包括脱氧核糖核酸、核糖核酸、锁核酸中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的一种用于核酸分子定量检测的方法，其特征在于：所述的流体仅为一种流体，无需第二种流体对第一种流体进行物理上的隔离或分割。
6.根据权利要求1所述的一种用于核酸分子定量检测的方法，其特征在于：所述将颗粒材料分散于流体中进行核酸分子扩增，流体中不含有游离的引物。
7.根据权利要求1所述的一种用于核酸分子定量检测的方法，其特征在于：所述的核酸分子扩增产物固定于颗粒材料表面或内部。
8.根据权利要求1所述的一种用于核酸分子定量检测的方法，其特征在于：所述的固定于颗粒材料表面或内部的核酸分子扩增产物，每个颗粒表面或内部的核酸分子扩增产物来自于一个或大于一个核酸分子模板。
9.根据权利要求1所述的一种用于核酸分子定量检测的方法，其特征在于：所述的信号标记物包括有机小分子、有机大分子、蛋白质、核酸分子、无机材料、金属材料、稀土元素、纳米材料中的至少一种。
10.根据权利要求1所述的一种用于核酸分子定量检测的方法，其特征在于：所述的信号标记物信号包括光信号、电信号、磁信号中的至少一种。
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