KR20230044218A - 핵산 및 분석물의 동시 검출을 위한 다중분석물 검정 - Google Patents

핵산 및 분석물의 동시 검출을 위한 다중분석물 검정 Download PDF

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Abstract

본 발명은 1개의 샘플로부터 적어도 2개의 상이한 표적 분자의 존재 또는 부재를 검출하는 방법 및 키트에 관한 것으로서, 여기서 적어도 1개의 표적 분자는 관심 표적 분석물이고 적어도 1개의 다른 표적 분자는 관심 표적 핵산이고, 여기서 방법은 등온 증폭 반응을 수행하는 것을 조합하고, 여기서 표적 핵산 또는 이의 앰플리콘은 적어도 2개의 친화성 표지 및 리간드 결합 검정으로 표지되고, 여기서 신호 생성을 통해 표적 분석물 및/또는 표지된 표적 핵산의 존재를 포획 및 검출할 수 있는 친화성 분자가 사용된다. 본 발명은 또한 다양한 분야에서 이 방법 또는 키트의 용도에 관한 것이다.

Description

핵산 및 분석물의 동시 검출을 위한 다중분석물 검정
분자(예: 핵산, 분석물)의 검출을 위해 여러 검출 방법이 최신 기술에서 이용가능하다. 이들 각각의 방법은 특정 생체분자 부류에 대해 특화되고 최적화된다(예: 핵산 검출을 위한 PCR 또는 등온 증폭 방법 또는 단백질 검출을 위한 면역검정).
많은 적용에 있어서, 단일 단계에서 동시에 여러 부류의 분자를 검출하는 것이 유리하다. 단일 단계에서 핵산 및 분석물의 멀티플렉스 검출의 필요성에 대해 논쟁이 이루어졌으나, 접근법은 여러 문제점에 직면할 필요가 있다. 이들은 생물학적 샘플에서 핵산과 분석물 사이의 농도 차이를 고려할 필요가 있다. 분석물 및 핵산의 생리학적 관련 농도 범위는 동시에 측정되지 않을 수 있다. 따라서, 표적 핵산의 증폭이 요구된다. 그러나, 요구되는 증폭 조건은 종종 분석물 변화, 예를 들어 단백질 변성(예: PCR 반응에서의 가열 단계)으로 이어진다. 분석물이 예를 들어 비-천연 구조를 가지면, 이는 표준 면역학적 검정에 의해 검출될 수 없다.
분석물 및 핵산의 동시 검출을 위한 제1 접근법이 개발되었다. 그러나 이들 접근법은 여전히 한계를 갖는다. 한 접근법은 프로브에 대한 혼성화를 통한 핵산의 검출 및 항원-항체 상호작용을 통한 분석물의 동시 검출을 포함한다(Mohan et al. 2011; Mao et al. 2014; Scott et al. 2017). 두 반응 모두 서로 간섭하는 상이한 조건을 필요로 한다. 분석물은 완충된 시스템에서 검출되는 반면, 혼성화 반응은 높은 염 농도 및 비교적 높은 온도를 필요로 한다. 37℃에서 표적 핵산에 혼성화하는 프로브의 개발은 분석물의 동시 검출을 허용하지만, 여전히 약한 신호-대-잡음 비를 유도한다(Mohan et al. 2011). 또한, 일부 접근법은 순차적 접근법으로 표적 분자를 분석하고/거나(Mohan et al. 2011), 개별 샘플 제조 단계를 필요로 한다(Mohan et al. 2011; Scott et al. 2017).
여러 접근법은 올리고뉴클레오티드에 연결된 압타머 또는 항체와 같은 분석물 검출 분자를 사용함으로써 분석물 정보를 핵산 정보로 변환시킨다. 표적 핵산과 함께 압타머 또는 (항체에 연결된) 올리고뉴클레오티드의 후속 증폭은 표적 분자의 동시 검출을 가능하게 한다. 따라서, 동일한 측정 원리가 핵산 및 분석물의 동시 검출에 사용된다. 그러나, 항체에 비해 압타머의 감소된 안정성 및 복합체 및 조 샘플 매트릭스에서의 선택성은 분석물 검출을 위한 압타머의 광범위한 적용을 방해한다. 다른 측면에서, 분석물 검출 항체에 대한 올리고뉴클레오티드의 접합은 시간-소모적 과정일 수 있다. 현행 접근법은 2-말단 어댑터 라이게이션 방법, 분지쇄 검정 및 근접 연장 검정을 포함한, 표적 분석물-결합 올리고뉴클레오티드를 증폭시키기 위한 상이한 전략을 사용한다. 모든 이들 접근법은 표적 핵산의 검출을 위해 프라이머 및 프로브에 추가로 여러 프라이머 및/또는 프로브의 설계를 필요로 한다. 이는 시스템의 복잡성을 증가시키고, 비용을 증가시킬 수 있으며, 프라이머/프로브 이량체 형성으로 인해 높은 배경으로 이어질 수 있다.
최신 기술에서, 문헌 [Mohan et al. 2011]은 핵산 및 단백질 검출 둘 다를 위해 채택될 수 있는 전기화학적 센서 플랫폼을 기재한다. 단백질 검출은 항체-항원 반응을 기초로 하는 반면, 핵산 검출은 혼성화 반응을 기초로 한다. 핵산 검출과 단백질 면역검정의 통합을 용이하게 하기 위해, 이들은 37℃에서 혼성화에 최적화된 프로브를 개발하였다. 검출은 양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP) 산화환원 반응에 기초한다. 이러한 접근법은 2가지 상이한 측정 원리에 기초한다. 핵산은 프로브의 혼성화를 통해 검출되는 반면, 단백질은 항원-항체 반응을 통해 검출된다. 일반적으로, 이들 2가지 측정 원리는 상이한 검정 조건을 필요로 한다. 그러나, 저자들은 유사한 파라미터를 공유하는 단백질 및 핵산 검정을 개발하였다. 이러한 절충은 하나 또는 둘 다의 검정의 감수성 및 특이성에 영향을 미칠 위험을 보유한다. 또한, 이러한 접근법은 생물학적 샘플 내의 단백질과 핵산 사이의 농도 차이를 고려하지 않는다. 단백질 및 핵산의 생리학적 관련 농도 범위는 동시에 측정될 수 없다. 추가로, 접근법은 또한 개별 샘플 제조 및 센서로의 단백질 또는 핵산 샘플의 개별 첨가를 필요로 한다.
문헌 [Mao et al. 2014]은 핵산 및 단백질의 동시 검출을 위한 측면 유동 장치를 기재한다. 2개의 개별 반응이 측면 유동 스트립 상에서 수행된다. 단백질은 샌드위치-유형 면역반응을 통해 검출되는 반면, 핵산 검출은 DNA 혼성화 반응을 기초로 한다. 표적 핵산 및 단백질을 샘플 적용 구역에 동시에 적용하고, 그에 상응하는 시험 라인에 결합시킨다. 표적 분자는 검출 프로브 또는 검출 항체로 관능화된 금 나노입자를 통해 검출된다. 이러한 접근법은 2가지 상이한 측정 원리를 사용한다. 핵산은 프로브의 혼성화를 통해 검출되는 반면, 단백질은 항원-항체 반응을 통해 검출된다. 이는 검정의 낮은 감도를 초래한다. 또한, 이러한 접근법은 매우 짧은 단일 가닥 DNA를 사용하고, 따라서 생물학적 샘플 내의 더 긴 이중 가닥 DNA에 적절하지 않다. 핵산은 검출 전에 증폭되지 않고, 따라서 단지 매우 많은 양의 핵산이 검출될 수 있으며, 이는 생리학적으로 관련되지 않을 수 있다.
문헌 [Scott et al. 2017]은 마이크로어레이 상에서 단백질 및 핵산을 동시에 검출하는 능력을 제공하는 조합 검정을 기재한다. 검출은 마이크로어레이에 대한 표적 핵산의 검출의 항체-항원 반응 및 DNA 혼성화 반응에 기초한다. 어레이는 핵산 검출을 위한 포획 프로브 및 단백질 검출을 위한 포획 항체로 관능화된다. 검정 전에, 표적 핵산의 3' 말단을 비오티닐화하고, 표적 단백질 및 비오티닐화된 표적 핵산 둘 다를 어레이에 첨가한다. 마이크로어레이의 상응하는 영역에 결합한 후, 비오티닐화 항체가 첨가되고, 표적 단백질에 결합한다. 후속적으로, 표적 분자를 비오틴-PEG-연결된 금 나노입자를 통해 검출하였다.
이러한 접근법은 2가지 상이한 측정 원리를 사용한다. 핵산은 프로브의 혼성화를 통해 검출되는 반면, 단백질은 항원-항체 반응을 통해 검출된다. 일반적으로, 이들 2가지 측정 원리는 최적의 결과를 위해 상이한 검정 조건을 필요로 한다. 또한, 접근법은 별도의 샘플 제조를 필요로 한다. 핵산의 3' 말단은 검출 전에 비오티닐화 키트로 비오티닐화될 필요가 있으며, 이는 추가적인 샘플 제조 단계를 추가한다. 비오티닐화 비-표적 핵산은 또한 비오틴-PEG-연결된 금 나노입자에 결합할 수 있고, 따라서 결합 부위를 점유하고, 높은 배경 신호를 유도할 수 있다. 또한, 접근법은 짧은 단일-가닥 RNA 또는 DNA 서열에 대해서만 적합하고, 핵산이 증폭되지 않기 때문에 매우 많은 양의 핵산만이 검출될 수 있다. 비오티닐화 표적 핵산을 검출 프로브에 혼성화하기 위해, 샘플은 마이크로어레이와 함께 45℃에서 2시간 동안 인큐베이션된다. 이들 검정 조건은 이의 포획 항체에 동시에 결합하고 단백질 분해로 이어질 수 있는 단백질 검출에 대해 준최적이다.
US8431367B2는 압타머 기술을 사용하여 단일 검정에서 표적 핵산 및 표적 단백질을 검출하는 방법을 기재한다. 따라서, 단일 반응에서 표적 핵산 및 압타머를 증폭시키는 것이 가능하다. 후속적으로, 증폭된 표적 핵산 및 압타머는 표준 핵산 검출 기술, 예컨대 형광 표지 방법의 서열분석을 통해 검출될 수 있다. 따라서, 압타머의 검출은 샘플 중 표적 단백질의 존재를 나타낸다. 일반적으로, 압타머는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체보다 덜 확립되고, 그의 전체 음전하는 압타머를 친수성이 되게 하여, 압타머는 뉴클레아제에 의해 신속하게 분해된다. 또한, 압타머는 (단백질의 22개 아미노산 빌딩 블록과 비교하여) 단지 4개의 핵산 빌딩 블록을 가지며, 이는 그의 가능한 2차 및 3차 구조의 다양성을 제한한다. 추가로, 그의 맞춤 합성은 비용을 증가시킨다. 특히, 복합체 및 조 샘플 매트릭스에서의 압타머 안정성 및 선택성은 단백질 검출을 위한 압타머의 광범위한 적용을 방해한다.
WO2019157445A1은 기존 서열분석 방법을 사용한 조직, 세포 또는 세포하 구조의 사용된-정의된 영역(used-defined region)에서의 단백질 및/또는 핵산 발현의 동시, 멀티플렉스화 검출 및 정량화를 기재한다. "2-말단 어댑터 라이게이션 방법"으로 기재된 방법으로 프로브를 사용하여 표적 분석물이 검출되었다. 특이적 프로브는 표적 결합 도메인, 및 표적 결합 도메인에 결합된 표적 분석물을 확인하는 식별자 올리고뉴클레오티드를 함유한다. 추가로, 프로브는 표적 결합 도메인과 식별자 올리고뉴클레오티드 사이에 광-절단가능한 링커를 함유할 수 있다. 충분한 파장의 광을 적용함으로써, 링커는 절단되고, 따라서 식별자 올리고뉴클레오티드를 방출한다. 방출된 식별자 올리고뉴클레오티드를 수집한 후, 제1 핵산 프로브 및 제2 핵산 프로브는 방출된 식별자 올리고뉴클레오티드에 혼성화된다. 이들 핵산 프로브는 상이한 도메인을 함유한다. 제1 핵산 프로브는 식별자 올리고뉴클레오티드의 일부에 상보성인 서열, 특유한 분자 식별자 및 증폭 프라이머 결합 부위를 포함하는 서열을 함유한다. 제2 핵산 프로브는 식별자 올리고뉴클레오티드의 일부에 상보적인 서열 및 제2 증폭 프라이머 결합 부위를 함유한다. 혼성화된 핵산 프로브는 라이게이션되고, 후속적으로 라이게이션 생성물이 증폭된다. 기존의 서열분석 방법을 사용하여, 증폭된 라이게이션 생성물이 분석되고, 표적 분석물이 확인된다.
주요 결점은 이것이 단일 분자 카운팅에 의존하는 방법이라는 것이다. 단일 분자 카운팅은 특수 현미경과 같은 복잡하고, 고가이며, 민감한 판독 장비를 필요로 하거나, 또는 저비용 광학이 사용되는 경우, 복잡하고, 긴 (바코드) 프라이머 및 프로브가 모든 표적 분자에 대해 설계되어야 하며, 이는 다시 매우 고가이고, 광범위한 검정 설계를 필요로 한다. 또한, 프라이머/프로브 이량체 형성으로 인한 높은 배경이 문제이다.
US20120004132A1은 분지쇄 기반 검정을 사용하여 다중 핵산 및 단백질을 검출하는 방법을 기재한다. 일반적으로, 이러한 시스템은 매우 복잡하고, 여러 프라이머 및 프로브를 필요로 하며, 이는 검정 비용을 증가시킨다. 또한, 분지쇄 검정은 표적 분자의 지수적 증폭보다는 선형 신호 증폭을 사용한다.
US10214773B2는 근접 연장 검정을 사용하여 핵산 및 단백질을 검출하는 방법을 기재한다. 이러한 접근법은 표적 단백질에 매우 근접하여 결합하는 항체 쌍을 사용한다. 각각의 항체는 다른 항체의 핵산에 혼성화하는 핵산에 접합된다. 따라서, 이러한 접근법은 항체 품질에 고도로 좌우된다 - 두 항체 모두 동일한 효율로 표적에 결합할 필요가 있지만 매우 근접한 서로 다른 에피토프에 결합해야 한다. 따라서, 약물 또는 독소 또는 더 작은 단백질과 같은 소분자는 검출될 수 없다. 또한, 항체에 대한 올리고뉴클레오티드의 접합은 시간 소모적일 수 있다. 추가로, 뉴클레오티드의 비특이적 라이게이션 및 이량체의 형성은 높은 배경 신호를 유도할 수 있다.
US20180208975A1 및 US20180251825A1은 샘플에서 단백질 및 핵산을 검출하기 위한 유사한 접근법을 개시한다. 단백질은 DNA 바코드에 접합된 단백질-결합 분자(예: 항체)에 의해 인식된다. 이러한 올리고뉴클레오티드 서열은 증폭 및 서열분석을 위한 프라이머(PCR 핸들), 단백질-결합 분자를 식별하는 단백질 식별 서열, 및 검출 프로브 내의 서열에 혼성화하는 범용 링커 서열을 함유한다. 접근법은 단백질-결합 분자가 DNA 바코드에 접합되는 방법에 있어서 상이하다. US20180251825A1은 DNA 바코드를 예를 들어 항체에 연결하기 위해 스트렙타비딘-비오틴 상호작용을 사용한다. 반면에, US20180208975A1에서는 단백질 결합 분자가 아미노화된 DNA 바코드에 공유 결합된다. 그러나, DNA 바코드의 범용 링커 서열 및 핵산은 상응하는 단백질 검출 프로브 및 핵산 검출 프로브에 혼성화한다. 이어서, 서열이 증폭되고 분석물에 대한 신호를 검출하기 위해 서열분석된다.
두 접근법 모두 단일 세포 분석에 사용된다. 주요 제한은 현재 세포 표면으로 제한되어 세포내 단백질이 검출되지 않는 항체의 에피토프 위치이다. 개별 세포를 포획하기 위해 단일-세포 현탁액이 요구된다. 이 단계는 종종 조직을 분해하기 위해 효소적 처리를 사용하는데, 세포의 전사 프로파일 및 낮은 RNA 품질에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 항체에 대한 올리고뉴클레오티드의 접합은 시간 소모적일 수 있다.
대체로, 분석물 및 핵산의 동시 검출을 위한 현재의 접근법은 감도, 재현성, 신호-대-잡음 비에 관한 한계를 갖거나, 또는 상이한 표적 분자에 대한 분리된 샘플 제조를 필요로 한다.
따라서, 최신 기술의 결점을 피하는 다중분석물 접근법을 개발할 필요성이 존재한다. 추가로, 반응 프로토콜이 유익하며, 이는 상이한 적용 및 플랫폼으로 구현될 수 있다.
이 문제는 독립항의 특징에 의해 해결된다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 종속항에 의해 제공된다.
제1 실시양태에서, 본 발명은 1개의 샘플로부터 적어도 2개의 상이한 표적 분자의 존재 또는 부재를 검출하는 방법에 관한 것이고, 여기서 적어도 1개의 표적 분자는 관심 표적 분석물이고 적어도 1개의 다른 표적 분자는 관심 표적 핵산이고, 상기 방법은
· 등온 증폭 반응을 수행하는 것;
˚ 적어도 1개의 표적 핵산 및/또는 적어도 1개의 표적 분석물의 존재 또는 부재에 대해 분석하고자 하는 샘플을 적어도 2개의 증폭 프라이머를 포함하는, 적어도 1개의 증폭 프라이머 세트에 접촉시키는 것을 포함하고,
˚ 여기서 2개의 증폭 프라이머는 표적 핵산과 혼성화할 수 있고,
˚ 여기서 적어도 1개의 증폭 프라이머는 제1 친화성 표지를 포함하고,
˚ 여기서 제2 친화성 표지는 표적 핵산의 앰플리콘 내로 혼입될 수 있는 방식으로 제공되고,
· 리간드 결합 검정을 동시에 수행하는 것; 여기서 신호 생성을 통해 표적 분석물 및/또는 표지된 표적 핵산의 존재를 포획 및 검출할 수 있는 친화성 분자가 사용되고,
· 상기 표적 분석물 및/또는 표적 핵산의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다.
일반적으로, 분석물 및 핵산의 대부분의 생리학적 관련 농도 범위는 동시에 측정될 수 없다. 그러나, 본 발명은 표적 핵산을 증폭시키고 앰플리콘을 표지로 관능화시키는 핵산-대-친화성-리간드-형질전환을 사용한다. 따라서, 이제는 상이한 표적 분자 부류의 생리학적 관련 농도 범위의 동시 검출이 가능하다.
본 발명의 방법은 적어도 2종의 상이한 부류의 표적 분자의 존재를 검출하는데 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명은 증폭된 핵산 서열을 표지로 관능화시키고(핵산-대-친화성-리간드-형질전환), 표지된 표적 핵산 및 표적 분석물을 동일한 측정 원리로 검출함으로써 샘플로부터 한 번에 핵산 및 분석물을 동시에 검출하기 위한 신규한 해결책을 제시한다. 이는 (1) 표지의 표적 핵산 내로의 도입을 위한 분석물 상용성 등온 증폭을 사용하고, (2) 리간드 결합 검정을 통해 표적 분자를 검출함으로써 달성된다.
동일한 측정 원리로 표적 핵산 및 표적 분석물의 동시 검출을 가능하게 하기 위해, 상이한 표적 분자의 정보는 단일 정보 포맷으로 변환될 필요가 있다. 예를 들어, 특정 분석물, 예를 들어 단백질의 정보는 핵산 정보로 변환된다. 이는 예를 들어 올리고뉴클레오티드에 연결된 단백질-결합 분자를 통해 달성될 수 있다.
이러한 신규 검정 개념은 상이한 시스템, 예컨대, 비제한적으로, 종이-기반 센서, 마이크로유체 시스템, 마이크로어레이, 액체 취급 플랫폼, 튜브, 또는 마이크로플레이트-기반 시스템으로의 적용에 기초하여 구현될 수 있다.
개념의 특징은 핵산 정보를 분석물 정보로 변환시키는 소위 "핵산-대-친화성-리간드-형질전환"이다. 이는 동일한 측정 원리로 표적 핵산 및 표적 분석물의 후속 동시 검출을 가능하게 한다. 추가로, 표적 분자의 동시 검출을 위해 별도의 샘플 제조가 요구되지 않는다. 핵산-대-친화성-리간드-형질전환을 위해, 표적 핵산을 동시에 증폭시키고 어댑터 분자 (표지)를 핵산 내로 도입하는 등온 증폭 방법이 사용된다. 이에 의해, 반응은 분석물, 예컨대 단백질과 상용성인 조건에서 일어나고, 따라서 별도의 샘플 제조 및 가공이 요구되지 않는다. 후속 리간드 결합 검정에서, 표지된 표적 핵산 및 표적 분석물은 친화성 분자에 의해 포획 및 검출되어 상응하는 표적 분자에 대한 신호를 생성한다.
본 발명은 핵산 및 분석물이 핵산-대-친화성-리간드-형질전환을 사용하여 1개의 샘플로부터 한 번에 동시에 분석될 수 있다는 발견에 기초한다. 또한, 본 발명은 분석물 상용성 등온 증폭이 핵산을 증폭 및 표지하고, 후속적으로 표적 분석물 및 표지된 표적 핵산 둘 다를 동시에 검출하는데 사용될 수 있다는 발견에 기초한다. 또한, 본 발명은 동일한 측정 원리를 사용하는 것이 모든 표적 분자의 검출을 한 번에 허용한다는 발견에 기초한다.
등온 증폭의 변이체가 표적 핵산의 분석물 상용성 증폭 및 표적 핵산의 표지에 사용되는 것이 바람직하다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 1개의 샘플로부터 한번에 표적 분석물 및/또는 표적 핵산을 동시에 검출하는 방법을 제공한다. 여기서, 상이한 표적 분자 부류에 대해 별도의 샘플 제조 및 가공이 요구되지 않고, 표적 핵산이 분석물 상용성 등온 증폭 반응에서 증폭되어, 표지가 증폭 생성물 내로 도입된다. 이 공정은 "핵산-대-친화성-리간드-형질전환"으로 기재된다. 후속적으로, 표지된 표적 핵산 및/또는 표적 분석물은 리간드 결합 검정을 통해 검출된다.
본 발명의 방법은 또한 다중분석물 검정으로도 불리며, 핵산-대-친화성-리간드-형질전환 및 리간드 결합 검정의 신규한 조합이다. 본 발명의 다중분석물 검정은 동일한 측정 원리로 표적 분석물 및 표적 핵산을 동시에 검출할 수 있다.
핵산-대-친화성-리간드-형질전환은 동일한 측정 원리로 표적 분석물 및 표적 핵산을 후속적으로 검출하기 위해 표지를 사용한 증폭된 표적 핵산 서열의 관능화를 기재한다. 분석물 상용성 등온 증폭은 표적 분석물의 존재 하에서의 표적 핵산의 증폭 및 증폭 생성물 내로의 표지의 도입을 위해 사용된다. 표지된 앰플리콘은 후속적으로 리간드 결합 검정을 통해 표적 분석물과 함께 검출된다. 다양한 등온 증폭 반응의 설계 파라미터는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
제2 표지는 제1 표지와 상이한 것이 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 표적 핵산이 증폭되고, 동시에 적어도 제1 및 제2 친화성 표지는 증폭된 표적 핵산 내로 도입된다.
프라이머는 약 10 내지 80개 뉴클레오티드 길이, 특히 바람직하게는 20 내지 35개 뉴클레오티드 길이이고, 증폭 생성물은 약 50 내지 20000개 염기 쌍 길이, 특히 바람직하게는 70 내지 500개 염기 쌍 길이인 것이 바람직하다. 적어도 1개의 프라이머는 바람직하게는 이의 5' 말단에 친화성 태그(표지 1)를 함유한다.
제1 및 제2 표지는 비오틴, FAM, 디곡시게닌, 또는 디니트로페닐(dinitrophenyl, DNP), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine, TAMRA), 텍사스 레드, 캐스케이드 블루, 스트렙타비딘 또는 이의 유도체, Cy5, 단실, 플루오레세인, 아지드, 알킨, 또는 다른 생물직교성 관능기 및/또는 태그를 포함하는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
제2 친화성 표지가 제2 프라이머를 통해 제공되고 제1 표지와 상이한 것이 또한 바람직하지만, 비오틴, FAM, 디곡시게닌, 또는 디니트로페닐(DNP), 테트라메틸로다민(TAMRA), 텍사스 레드, 캐스케이드 블루, 스트렙타비딘 또는 이의 유도체, Cy5, 단실, 플루오레세인, 아지드, 알킨, 또는 다른 생물직교성 관능기 및/또는 태그가 또한 바람직하다.
본 발명의 한 가지 주요 이점은 관심 핵산의 검출이 관심 분석물의 검출과 동시에 수행된다는 것이다. 표적 분석물 및 표지된 증폭 생성물(표지된 표적 핵산) 둘 다는 상기 기재된 증폭 반응으로부터 수득된다. 핵산-대-친화성-리간드-형질전환은 리간드 결합 검정을 사용하여 동일한 측정 원리에 의해 표적 분자의 동시 검출을 가능하게 한다. 여기서 전형적인 리간드 결합 검정의 설계 파라미터가 기재된다. 표적 분석물 및 표지된 표적 핵산은 소위 검출 구역에서 검출된다.
본 발명에 따른 검출 구역은 표적 분자의 검출이 일어나는 플랫폼의 한정된 영역이다. 검출 구역은 표면일 수 있지만, 또한 용액, 예를 들어 측면 유동 시험(lateral flow test, LFT)의 시험 라인, 마이크로타이터 플레이트의 웰, 튜브, 마이크로어레이 상의 스폿, 또는 마이크로유체 장치 내의 챔버일 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 분자는 동일한 검출 구역에서 검출된다. 다른 실시양태에서, 표적 분석물 및 표지된 표적 핵산은 상이한 검출 구역에서 검출된다. 일반적으로, 표적 분자는 친화성 분자에 의해 포획 및/또는 검출된다. 표적 분자의 친화성 분자에 대한 결합은 전형적으로 완충제 용액 중에서 수행된다. 이는 포스페이트 완충제 시스템 또는 탄산 비카르보네이트 완충제 시스템일 수 있다. 또한, 차단제(예: BSA), 사카라이드(예: 트레할로스) 또는 세제(예: 트윈-20)와 같은 첨가제가 완충제 시스템에 첨가될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 독창적인 것 없이 완충제를 선택할 수 있다. 반응 시간 및 온도는 표적 분자 및 사용된 플랫폼에 좌우된다. 일부 실시양태에서, 각각의 표적 분자의 검출은 시그널링 도구(예: 마커)를 친화성 분자에 부착시킴으로써 달성된다. 시그널링 도구는 효소, 형광 리포터, 또는 전기화학발광 표지일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 실시양태에서, 각각의 표적 분자의 검출은 무표지 검출 방법을 통해 달성된다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 적어도 2개의 증폭 프라이머 혼성화 부위 사이에 위치하는 서열과 혼성화하는 특이적 프로브가 제공된다.
또한, 특이적 프로브가 제2 친화성 표지를 포함하는 것이 바람직하다. 이 경우에, 제2 프라이머는 표지를 필요로 하지 않는다.
또한, 특이적 프로브가 적어도 하나의 기능적 부위, 바람직하게는 무염기성 잔기 또는 폴리머라제 연장 차단기를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
이들 실시양태에서, 표적 핵산(예: DNA)은 표적 서열에 대한 적어도 2개의 프라이머의 결합에 의해 샘플에서 증폭된다. 프라이머 중 적어도 1개는 바람직하게는 이의 5' 말단에 친화성 태그(표지 1)를 함유한다. 증폭은 1차 단일 표지된(single labeled, SL) 생성물을 유도한다. 상기 SL 생성물은 2개의 증폭 프라이머 사이에 위치하는 이의 상보성 서열에 혼성화하는 특이적 프로브에 의해 인식된다. 일부 실시양태에서, 이 프로브는 친화성 태그(표지 2)를 함유하고, 무염기성 잔기(예: THF) 또는 폴리머라제 연장 차단기(예: C3)와 같은 기능적 부위를 추가로 포함할 수 있다. SL 생성물에 대한 프로브의 혼성화는 2차 이중 표지된(double labeled, DL) 생성물을 유도한다. 전형적으로, 이러한 DL 생성물은 리간드 결합 검정을 통해 검출된다.
증폭은 전형적으로 프라이머 및 임의로 프로브의 표적 핵산에의 결합 후에 수행된다. 뉴클레오티드 및 DNA 폴리머라제와 같은 시약이 전형적으로 증폭 반응에 요구된다. 일부 실시양태에서, 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 DNA 폴리머라제가 사용된다. 또한, 일부 실시양태에서, 추가의 효소, 예컨대 역전사효소가 반응에 첨가되어 RNA 주형으로부터 상보적 DNA를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 성분이 반응에 요구되며, 이는 단일-가닥 결합 단백질, 레콤비나제, 헬리카제, 또는 엔도뉴클레아제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 마그네슘-아세테이트 또는 다른 보조인자의 첨가가 요구된다.
프로브가 사용되는 경우에, 프로브는 제2 표지된 프라이머 대신에 제2 친화성 태그(표지 2)를 함유하는 것이 바람직하다. 프로브의 위치는 2개의 상기 기재된 프라이머 사이에 위치한다. 프로브와 동일한 방향을 갖는 프라이머는 중첩될 수 있다.
표적 핵산에 상보적인 프라이머 및/또는 프로브를 설계하기 위해 쉽게 이용가능한 소프트웨어가 사용될 수 있다. 또한, 프라이머 및/또는 프로브는 헤어핀 및 스템과 같은 2차 구조의 영역을 피하도록 설계된다. 표적 핵산에 혼성화하기 위해 반응 혼합물에 첨가되는 각각의 프라이머 및/또는 프로브의 농도는 전형적으로 10 내지 1000 nM, 바람직하게는 50 내지 600 nM 및 20 내지 300 nM의 범위이다.
등온 증폭 반응이 적어도 2개의 증폭 프라이머 사이에 위치하는 서열에 혼성화하는 특이적 프로브에 의해 인식되는 1차 단일 표지된 생성물을 유도하여 2차 DL 생성물을 유도하는 것이 추가로 바람직하다.
임의의 표적 핵산 및/또는 표적 분석물은 본원에 기재된 바와 같이 검출될 수 있다.
표적 핵산은 DNA 분자, 바람직하게는 ssDNA, dsDNA, cDNA, rDNA, mtDNA, cpDNA 또는 플라스미드 DNA, RNA 분자, 바람직하게는 mRNA, 순환 RNA, miRNA, snRNA, snoRNA, rRNA, tRNA, asRNA, circRNA, hnRNA, siRNA, shRNA, snoRNA, snRNA, IncRNA, piRNA 또는 tracrRNA인 것이 또한 바람직하다.
용어 "분석물"은 본 발명의 방법에 의해 검출, 정량화 또는 달리 검정되는 물질을 지칭한다. 전형적인 분석물은 단백질, 펩티드, 핵산 절편, 탄수화물, 지질, 항체(모노클로날 또는 폴리클로날), 항원, 올리고뉴클레오티드, 특이적 수용체 단백질, 리간드, 분자, 세포, 미생물, 단편, 생성물 및 이의 조합, 또는 부착 부위, 결합 구성원 또는 수용체(예컨대 항체)가 발생할 수 있는 임의의 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 분석물은 또한 상기 엔티티로부터의 복합체를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 분석물은 다중 엔티티 또는 분자로 형성된 응집체 또는 복합체, 예를 들어 단백질-단백질 복합체를 지칭할 수 있으며, 여기서 이는 관심 엔티티/분자의 상호작용이다.
표적 분석물은 단백질, 펩티드, 항체, 호르몬, 효소, 소분자, 탄수화물 또는 임의의 다른 물질이나, 핵산은 아닌 것이 특히 바람직하다.
"단백질"은 쇄 길이가 보다 높은 수준의 3차 및/또는 4차 구조를 생성하기에 충분한 아미노산의 서열을 의미한다. "펩티드"는 바람직하게는 더 작은 분자량의 단백질을 지칭한다.
용어 "핵산"은 단일- 또는 이중-가닥 형태의 DNA, RNA 및 하이브리드 또는 이의 변형된 변이체 및 중합체("폴리뉴클레오티드")를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 임의의 핵산 분자를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 핵산 분자/폴리뉴클레오티드는 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예: 축중성 코돈 치환) 및 상보적 서열 뿐만 아니라 명백하게 나타낸 서열을 함축적으로 포괄한다. 구체적으로, 축중성 코돈 치환은 1개 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081(1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608(1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98(1994)). 뉴클레오티드는 하기 표준 약어에 의해 그의 염기로 표시된다: 아데닌(A), 시토신(C), 티민(T), 및 구아닌(G).
샘플이 분할되지 않고 별도의 검정 절차 및/또는 프로토콜이 요구되지 않는 것이 추가로 바람직하다. 이러한 접근법은 동일한 측정 원리로 상이한 표적 분자 부류의 동시 검출을 가능하게 하고, 따라서 샘플의 분할이 요구되지 않는다. 따라서, 보다 적은 부피의 샘플이 필요하며, 이는 제한된 샘플 물질만 접근할 수 있는 적용에 있어서 중요하다. 또한, 본 발명에 따른 다중분석물 검정은 상이한 표적 분자의 보다 빠르고 보다 용이한 검출을 가능하게 하는데, 이는 표적 핵산 및 표적 분석물에 대한 개별 프로토콜을 추구할 필요가 없기 때문이다. 또한, 반응 조건은 특정 검출 원리에 대해 규정되고, 따라서 더 큰 완충제 또는 온도 변화가 요구되지 않는다.
관심 핵산 및/또는 분석물을 포함하는 샘플은 임의의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 이는 박테리아, 바이러스, 진균, 소기관, 식물 또는 포유동물과 같은 공급원을 포함할 수 있다. 다른 샘플은 환경 공급원 및 생산 제품(예: 식품 또는 약물), 또는 체액(예: 혈액, 소변, 상처 유체, 혈청)으로부터 수득될 수 있다. 전형적인 실시양태에서, 표적 핵산은 DNA 분자(예: ssDNA, dsDNA, cDNA)이다. 다른 실시양태에서, 표적 핵산은 RNA 분자(예: mRNA, 순환 RNA, miRNA)이다. 표적은 예를 들어 병원체(예: 박테리아, 바이러스 또는 진균), 질환(예: 과다발현 및 과소발현) 또는 핵산 기반 치료제와 연관된 핵산을 포함할 수 있다. 전형적인 실시양태에서, 표적 분석물은 단백질이다. 다른 실시양태에서, 표적 분석물은 펩티드, 항체, 호르몬, 소분자 탄수화물 또는 임의의 다른 물질이나, 핵산은 아니다. 일부 실시양태에서, 분석물은 염증(예: 인터류킨, CRP), 질환, 알레르겐, 치료 약물, 또는 조절 기능과 연관될 수 있다. 일반적으로, 본 발명은 본원에 기재된 다중분석물 검정을 사용하여 1개의 샘플로부터 한번에 표적 핵산 및 표적 분석물을 동시에 검출하는 것을 포함한다. 이는 리간드 결합 검정과 함께 분석물 상용성 핵산-대-친화성-리간드-형질전환을 포함한다. 따라서, 이러한 접근법은 별도의 샘플 제조 및 가공을 필요로 하지 않는다. 표적 핵산 및 표적 분석물은 증폭 반응에 직접 동시에 첨가될 수 있다. 이는 증폭 반응의 분석물 상용성으로 인해 가능하다. 또한, 표적 분자는 리간드 결합 검정을 사용하여 동일한 측정 원리로 검출된다.
관심 표적 핵산의 검출이 관심 분석물의 검출과 동시에 수행되고, 따라서 증폭 반응 조건이 분석물 안정성과 상용성인 것이 바람직하다. 증폭 반응의 시간 및 온도는 프라이머, 프로브(존재하는 경우) 및 표적 분석물에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는, 반응은 실온 내지 45℃에서 10분 내지 2시간을 필요로 한다.
따라서, 등온 증폭 반응은 분석물과 상용성인 조건에서 일어나는 것이 바람직하다. 일반적으로, 이는 친화성 분자가 분석물에 결합할 수 있도록 적절한 분석물 구조를 유지하는 방식으로 반응 조건(예: 온도, 완충제)이 선택되어야 함을 의미한다. 따라서, 예를 들어 완충제는 액체여야 하고, 분석물은 변성되지 않아야 하므로, 온도는 0 내지 100℃일 필요가 있다. 조건은 분석물 뿐만 아니라 선택된 증폭 방법 및 리간드 결합 검정에 따라 달라진다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 독창적인 것 없이 적합한 파라미터를 선택할 수 있다. 온도 감수성 분석물, 예를 들어 열 불안정성 단백질의 경우, 저온(25 - 40℃)에서 수행될 수 있는 증폭 방법, 예를 들어 레콤비나제 폴리머라제 증폭(recombinase polymerase amplification, RPA)이 선택되어야 한다. 다른 분석물은 또한 보다 높은 온도에서 안정하고, 예를 들어 루프-매개 등온 증폭(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)은 40 - 70℃에서 수행될 수 있다. 또한, 등온 증폭 전에 초기 변성 단계(80 - 100℃)를 허용하는, 예를 들어 dsDNA를 용융시키는 분석물이 존재한다.
증폭은 통상적으로 중성 내지 약염기성(pH 7.0 - 8.3) pH 범위에서 수행된다. 이는 대부분의 분석물과 상용성이다. 그러나, 필요한 경우, pH 값은 또한 약산성 범위(pH 5.0 - 7.0)로 감소될 수 있다. 다른 pH 값이 또한 가능하고, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 어느 pH 범위가 어떤 종류의 분석물과 상용성인지, 예를 들어 LAMP 반응이 6.0 - 10.0의 pH 범위 내에서 또는 HAD가 약 pH 6.0 - 9.0의 범위 내에서(트리스-아세테이트 또는 트리스-HCl의 완충제) 발생할 수 있는지를 알고 있다.
표적 핵산에 대한 신호가 친화성 분자에 의한 친화성 표지의 결합을 통해 생성되는 것이 추가로 바람직하다. 따라서, 친화성 분자는 본 발명에 따른 친화성 표지에 결합하는 분자이다. 따라서, 친화성 분자는 표적 분석물 또는 표지된 표적 핵산에 결합할 수 있는 표적 결합 모이어티를 함유하는 바람직한 분자이다.
친화성 분자는 또한 표적 분석물에 결합하고 이를 검출하는데 사용된다.
용어 "친화성 분자"는 바람직하게는 결합 쌍의 한 구성원을 지칭하며, 여기서 제2 구성원은 분석물 및/또는 친화성 표지이고, 용어 "결합 쌍"은 면역-유형 결합 쌍의 부류 중 임의의 것, 예컨대 항원/항체 또는 합텐/항-합텐 시스템; 및 또한 비면역-유형 결합 쌍의 부류 중 임의의 것, 예컨대 비오틴/아비딘; 비오틴/스트렙타비딘; 폴산/폴레이트 결합 단백질; 상보적 핵산 절편, 예컨대 상보적 DNA 가닥 또는 상보적 RNA 가닥; 단백질 A 또는 G/이뮤노글로불린; 및 공유 결합을 형성하는 결합 쌍, 예컨대 말레이미드 및 할로아세틸 유도체를 포함한 술프히드릴 반응성 기, 및 아민 반응성 기, 예컨대 이소트리이소시아네이트, 숙신이미딜 에스테르 및 술포닐 할라이드를 포함한다. 중합체 매트릭스, 예컨대 분자적으로 각인된 중합체는 또한 본 발명에 따른 친화성 분자일 수 있다.
친화성 분자가 항체 및/또는 단백질, 및/또는 압타머 및/또는 관능기 및/또는 리간드 결합 중합체 구조 및/또는 분자적으로 각인된 중합체(molecularly imprinted polymer, MIP) 및/또는 관능기를 함유할 수 있는 (거대-) 분자이고/거나 시그널링 도구, 바람직하게는 마커가 친화성 분자에 부착되는 것이 바람직하다.
표적 분석물 상용성 반응 조건을 갖는 임의의 등온 증폭 방법이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 기재된 증폭 반응은 단지 예이고, 본 발명을 제한하지 않을 것이다.
일부 실시양태에서, 레콤비나제 폴리머라제 증폭(RPA)을 사용하여 표적 핵산을 증폭시킬 수 있다. RPA는 37 내지 42℃에서 작동하는 등온 증폭 방법이다. 온도 사이클링 대신에 상기 방법은 세포 DNA 합성, 재조합 및 복구에 관여하는 단백질을 사용한다. ATP 및 크라우딩 작용제의 존재 하에, 레콤비나제 단백질은 프라이머에 결합하고, 상동성 서열에서 가닥 침습을 촉진한다. 대체된 가닥은 단일-가닥 결합 단백질에 의해 안정화된다. 가닥 치환 DNA 폴리머라제는 프라이머의 신장을 담당한다. 공정의 사이클링은 표적 핵산의 지수적 증폭을 초래한다. 일부 실시양태에서, 역전사 RPA가 사용된다. 다른 실시양태에서, 추가의 특이적 프로브가 사용된다.
이러한 구체적 실시양태에서, 1개의 프라이머 세트가 표적 핵산을 증폭시키도록 설계되는 것이 바람직하다. 적어도 1개의 프라이머는 바람직하게는 이의 5' 말단에 친화성 태그(표지 1)를 함유한다. 친화성 태그는 비오틴, FAM, 디곡시게닌, 또는 DNP일 수 있다. 일반적으로, RPA 프라이머는 30 내지 35개 뉴클레오티드 길이인 것이 바람직하고, 증폭 생성물은 약 70 내지 500개 염기 쌍 길이일 수 있다. 특이성을 증가시키기 위해, 특이적 프로브가 첨가될 수 있다. 전형적으로, 프로브는 약 46-53개 뉴클레오티드 길이이고, 그 중 적어도 30개 뉴클레오티드는 무염기성 측의 5'에 위치하고, 적어도 추가의 15개 뉴클레오티드는 이에 대해 3'에 위치한다. 친화성 태그(표지 2)는 5' 말단에 위치하고, 비오틴, FAM, 디곡시게닌, 또는 DNP일 수 있다(표지 1과 상이하여야 한다). 반면에, 폴리머라제 연장 차단기는 3' 말단에 위치하고, 포스페이트, C3-스페이서 또는 디데옥시 뉴클레오티드일 수 있다. 프로브의 위치는 2개의 상기 기재된 프라이머 사이에 위치한다. 프로브와 동일한 방향을 갖는 프라이머는 중첩될 수 있다. 그러나, 중첩은 프로브의 처음 30개의 뉴클레오티드로 제한되는 것이 바람직하다. 표적 핵산에 혼성화하기 위해 반응 혼합물에 첨가되는 각각의 프라이머 및 프로브의 농도는 전형적으로 150 내지 600 nM 및 50 내지 300 nM의 범위이다.
일부 실시양태에서, 헬리카제-의존성 증폭(helicase-dependent amplification, HDA)이 표적 핵산의 증폭에 사용될 수 있다. 일반적으로, HDA는 헬리카제 및 단일-가닥 결합 단백질을 사용하여 프라이머 혼성화를 위한 단일-가닥 주형을 생성한다. 가닥-치환 DNA-폴리머라제는 프라이머를 연장시켜 dsDNA를 생성한다. 공정의 사이클링은 표적 핵산의 지수적 증폭을 초래한다. 일부 실시양태에서, 역전사 HDA가 사용된다.
이러한 구체적 실시양태에서, 1개의 프라이머 세트는 표적 핵산을 증폭시키도록 설계된다. 적어도 1개의 프라이머는 상기 기재된 바와 같은 친화성 태그를 함유한다. 바람직하게는, 프라이머는 24 내지 33개 뉴클레오티드 길이이고, 증폭 생성물은 약 80 내지 129개 염기 쌍 길이일 수 있다. 특이성을 증가시키기 위해, 특이적 프로브가 반응에 첨가될 수 있다. 프로브는 3' 말단에 위치하여 연장을 피하고 비오틴, FAM, 디곡시게닌 또는 DNP일 수 있는 친화성 태그(표지 2)로 표지된다(표지 1과 상이해야 함). 프로브의 위치는 2개의 상기 기재된 프라이머 사이에 위치한다. 이에 의해, 비-표지된 프라이머는 반응을 제한한다. 반응 혼합물에 첨가되는 각각의 프라이머의 농도는 전형적으로 50 내지 200 nM의 범위이다.
일부 실시양태에서, 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA)이 표적 핵산의 증폭에 사용될 수 있다. SDA는 제한 효소의 닉킹 활성, 및 닉에서 복제를 개시하고 하류 서열을 대체하는 DNA 폴리머라제의 능력에 기초한다. 전형적인 SDA에서, 표적 핵산에 결합하는 2개의 프라이머 세트 - 2개의 외부 "범퍼" 프라이머 및 닉킹 효소 인식 부위를 함유하는 2개의 내부 연장 프라이머가 설계된다. SDA의 변이는 CRISPR-Cas 시스템을 사용할 수 있으며, 여기서 한 쌍의 Cas9 리보핵단백질은 표적 DNA를 인식하고 한 쌍의 닉을 유도한다. 특이성을 증가시키기 위해, 앰플리콘의 2개의 상이한 영역을 표적화하는 2개의 프로브가 반응에 첨가될 수 있다. 포획 프로브는 5' 말단에서 친화성 태그(표지 1)로 표지되는 반면, 검출 프로브는 3' 말단에서 친화성 태그(표지 2)로 표지된다. 친화성 태그는 비오틴, FAM, 디곡시게닌, 또는 DNP일 수 있다.
그러나, 이들 기재된 증폭 반응은 단지 예이다. 다른 실시양태에서, 등온 증폭 방법, 예컨대 루프-매개 등온 증폭(LAMP), 또는 핵산 서열-기반 증폭(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)이 사용될 수 있다. 또한, 내부 증폭 대조군(internal amplification control, IAC) 핵산은 표적 핵산과 동시에 증폭되어 가음성 결과를 배제할 수 있다.
검정은 등온 증폭 이외에 리간드 결합 검정을 포함한다. 리간드 결합 검정은 친화성 분자에 대한 표적 분자의 결합에 의존하는, 표적 분자의 검출을 위한 분석 절차이다. 이러한 상호작용/결합은 공유 또는 비-공유일 수 있다.
리간드 결합 검정은 친화성 분자에 대한 표적 분자(리간드)의 공유 또는 비-공유 결합에 의존하는 검정이다. 제1 실시양태에서, 항원-항체 반응은 표적 분자의 동시 검출을 위해 사용된다. 반면, 또 다른 실시양태는 압타머의 용도를 기재한다. 두 변이체를 동시에 사용하는 것 또한 가능하다. 다른 실시양태에서, 상이한 공유 또는 비-공유 리간드 결합 개념(예: 리간드 결합 중합체 구조)이 구현될 수 있다.
분석물의 검출을 위한 항원-항체 반응의 사용은 최신 기술이다. 항체는 표적 분석물을 인식하고, 이의 에피토프에 결합할 수 있다. 또한, DL 앰플리콘의 친화성 표지는 특이적 항체에 의해 인식될 수 있다. 다양한 면역검정 포맷, 예컨대 경쟁적 면역검정 또는 샌드위치 면역검정이 표적 분석물 및 표지된 표적 핵산의 검출에 사용될 수 있다.
압타머는 표적 분석물에 결합하는 올리고뉴클레오티드-기반 친화성 분자이다. 이들은 그의 표적을 인식하고 결합하기에 충분한 표면적을 갖고, 이소형과 표적 분석물(예컨대 모노클로날 항체)의 변이체 사이를 구별할 수 있다. 다양한 면역검정 포맷, 예컨대 경쟁적 면역검정 또는 샌드위치 면역검정이 압타머를 통한 표적 분자의 검출에 사용될 수 있다.
다중분석물 검정의 모든 요구되는 성분은 상업적으로 입수가능하고, 검정은 복잡한 설계 단계(예: 올리고뉴클레오티드 서열을 사용한 항체의 관능화 또는 복잡한 프라이머 및 프로브 시스템의 설계)를 필요로 하지 않는다.
상기 방법은 플랫폼에 통합되는 것이 추가로 바람직하다. 바람직한 플랫폼은 마이크로타이터 플레이트, 측면 유동 시험, 어레이 기반 플랫폼, 특히 바람직하게는 마이크로어레이, 마이크로유체 플랫폼, 바람직하게는 랩-온-어-칩 또는 더 큰 시스템 또는 액체 취급 플랫폼, 또는 임의의 다른 적합한 플랫폼이다.
마이크로타이터 플레이트 검정의 사용은 통상적이고 간단한 접근법이다. 이 플랫폼은 예를 들어 고처리량 단백질 발현 스크리닝을 수행하기 위해 실험실에서 사용될 수 있다. 피펫팅 로봇의 사용은 이 공정을 자동화할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 샘플을 제1 웰에 첨가한다. 상기 제1 웰 내에서, 상기 기재된 핵산-대-친화성-리간드-형질전환 반응이 일어난다. 후속적으로, 특정 양의 핵산-대-친화성-리간드-형질전환 반응을 제2 웰(검출 구역)로 옮겨 리간드 결합 검정을 수행한다. 표적 분자는 예를 들어 각각의 표적 분자에 대한 광학 신호를 생성하는 친화성 분자에 의해 포획 및/또는 검출된다. 최종적으로, 상업적 마이크로타이터 플레이트 판독기는 플레이트의 광학 판독을 수행한다.
측면 유동 시험(LFT)은 표적 분자의 저비용, 단순, 신속 및 휴대용 검출을 가능하게 하는 종이-기반 장치이다. LFT는 진단, 품질 관리, 식품 생산에서의 제품 안전성, 및 환경적 건강 및 안전성을 비롯한 다양한 산업에서 널리 사용된다. 일반적으로, 샘플은 측면 유동 스트립의 다양한 구역을 통해 모세관력을 통해 이동한다. 일부 실시양태에서, 핵산-대-친화성-리간드-형질전환 반응은 튜브 또는 다른 공동 내에서 일어나고, 후속적으로 특정 양의 반응이 측면 유동 스트립 상으로 전달된다. 반면, 다른 실시양태에서, 핵산-대-친화성-리간드-형질전환 반응은 측면 유동 스트립 내로 통합된다. 후속 리간드 결합 검정은 측면 유동 스트립 내로 통합된다. 친화성 분자(예: 관능화된 금 나노입자)는 표적 분자에 결합하고, 복합체는 제2 친화성 분자(예: 항체)에 의해 검출 구역(예: 시험 라인)에서 포획된다. 후속적으로, 상응하는 분자에 대한 신호는 육안에 의한 광학적 판독을 통해 검출된다. 추가 실시양태에서, 판독은 전기화학 또는 형광 검출, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 검출 포맷, 예를 들어 광음향 등에 기초할 수 있다.
마이크로어레이는 고처리량 플랫폼이고, 다중 표적 분자의 병렬 검출이 그의 주요 이점이다. 표적 핵산 및 표적 분석물을 동시에 검출하기 위해, 하나의 증폭 프라이머 및 표적 분석물에 대한 포획 분자가 검출 구역 상에 고정될 수 있다. 샘플 및 핵산-대-친화성-리간드-형질전환 반응 성분의 혼합물을 마이크로어레이에 첨가한 후, 장치를 충분한 시간 동안 인큐베이션하였다. 다른 실시양태에서, 핵산-대-친화성-리간드-형질전환 반응은 분리된 반응 챔버 내에서 일어날 수 있고, 후속적으로 특정 양의 반응이 마이크로어레이의 검출 구역으로 전달된다. 검출 분자의 첨가 후, 상응하는 신호가 검출된다.
마이크로유체 플랫폼은 생화학적 검정의 소형화, 통합, 자동화 및 병렬화를 가능하게 하는 한 세트의 유체 유닛 작동을 제공한다. 가능한 마이크로유체 플랫폼은 압력 구동 마이크로유체공학, 원심 마이크로유체공학, 동전기적 마이크로유체공학, 및 "마이크로유체 대규모 통합" 접근법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다중분석물 검정을 위한 모든 시약은 마이크로유체 플랫폼 내에 사전-저장될 수 있다. 샘플을 첨가한 후, 모든 가공 단계를 마이크로유체 플랫폼에 의해 수행한다. 미리 저장된 시약은 반응/검출 챔버 내로 수송되고, 이는 자동화된 핵산-대-친화성-리간드-형질전환 및 리간드 결합 검정을 통한 표적 분자의 후속 검출을 가능하게 한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 선행 청구항 중 어느 하나 이상에 따른 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이며, 상기 키트는
· 표적 핵산과 혼성화하는 적어도 1개의 증폭 프라이머 세트,
· 여기서 적어도 1개의 증폭 프라이머는 제1 친화성 표지를 포함하고,
· 임의로 특이적 프로브,
· 표적 핵산과 혼성화할 수 있는, 제2 프라이머 또는 특이적 프로브와 연관된 제2 친화성 표지,
· 등온 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및
· 친화성 분자를 포함한다.
방법에 대해 기재된 모든 바람직한 실시양태는 키트의 바람직한 실시양태이기도 하다.
바람직하게 키트는 증폭 반응이 일어나는 용액을 포함하고, 폴리머라제, 레콤비나제, 엔도뉴클레아제, 증폭 시약, 앰플리콘, 완충제, 양이온, dNTP, 및/또는 다른 성분을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 시험관내 진단, 약물 개발, 식품 안전성 또는 환경 안전성을 위한, 선행 청구항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 키트의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 제한된 샘플 물질만이 접근할 수 있는 약물 개발에서 특히 유리하다. 핵산 및 분석물의 동시 검출은 상응하는 분석물 생성물과 함께 유전자 발현 조정의 분석을 가능하게 한다. 식품 안전성의 관점에서, 분석물 및 핵산의 동시 검출은 또한 미생물 오염물이 알레르겐성 성분, 독소 또는 다른 생체분자 오염물과 함께 검출될 수 있기 때문에 매우 유익하다.
기재된 발명은 질환을 예측 또는 검출하거나, 또는 질환에 대한 소인을 결정하거나, 또는 질환의 치료를 모니터링하거나, 또는 치료 반응을 진단하는데 사용될 수 있다.
매우 다양한 감염성 질환이 본 발명의 공정에 의해 검출될 수 있다. 전형적으로, 이들은 박테리아, 기생충, 진균 또는 바이러스에 의해 유발된다. 본 발명은 감염성 질환의 검출을 위해 숙주의 염증성 단백질 마커와 함께 병원체를 확인하는데 사용될 수 있다. 이는 시간-결정적 감염에서의 빠른 요법 결정, 또는 감염 상태의 모니터링에 특히 유익하다.
한 예는 염증성 시토카인 마커(예: 인터류킨-6(interleukin-6))와 함께 박테리아 게놈 DNA(예: 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) gDNA)의 동시 검출이다. 병원체 및 시토카인은 상처 유체 또는 객담과 같은 체액에서 검출될 수 있다. 이러한 구체적 실시양태에서, 박테리아 DNA는 시토카인의 존재 하에 증폭되고, 후속적으로 표적 분자는 리간드 결합 검정을 통해 검출된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 바이러스에 대한 특이적 항체 또는 특이적 바이러스 항원과 함께 바이러스 RNA를 검출하여 시험의 신뢰성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 역전사를 사용하여, RNA는 cDNA로 전사되고, 후속적으로 증폭되고, 동시에 다중분석물 검정을 통해 특이적 항체/항원으로 검출된다. 바이러스는 뇌척수액, 객담 또는 다른 면봉 샘플과 같은 체액에서 특이적 항체/항원과 함께 검출될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 암의 진단 또는 병기결정에 사용될 수 있다. 혈액과 같은 체액을 사용하여 종양 마커의 존재 및/또는 양을 결정할 수 있다. 본 발명은 순환 마이크로 RNA 또는 ctDNA와 같은 표적 핵산과 함께 암 유형 또는 병기에 특이적인 단백질, 호르몬 및 효소와 같은 표적 분석물의 동시 검출을 가능하게 한다. 이는 예를 들어 조기 진단, 치료 전략에 대한 안내 및 암 상태의 모니터링을 가능하게 한다.
본 발명의 다중분석물 검정은 또한 약물의 스크리닝, 예를 들어 약물 개발, 또는 제약 개발을 위한 표적의 스크리닝에 사용될 수 있다. 핵산 및 분석물의 동시 검출은 상응하는 단백질과 함께 경로 및 유전자 발현 조정의 분석을 가능하게 한다.
본 발명의 다중분석물 검정은 또한 식품 안전 분야에서 사용될 수 있다. 식품 안전성의 관점에서, 분석물 및 핵산의 동시 검출은 미생물 오염물이 알레르겐성 성분, 독소 또는 다른 생체분자 오염물과 함께 검출될 수 있기 때문에 매우 유익할 수 있다.
본 발명의 한 가지 주요 이점은 접근법의 융통성이다.
또 다른 이점은 다중분석물 검정에서 모든 요구되는 성분이 상업적으로 입수가능하고, 검정이 복잡한 설계 단계(예: 올리고뉴클레오티드 서열을 사용한 항체의 관능화 또는 복잡한 프라이머 및 프로브 시스템의 설계)를 필요로 하지 않는다는 것이다. 검정은 수행하기가 용이하고, 특정 필요에 대해 유연하게 맞춤화될 수 있기 때문에, 신속한 통합이 가능하다.
본 발명은 멀티플렉싱의 새로운 치수를 도입하고, 상이한 분자 부류에 대한 멀티플렉싱을 가능하게 하고, 리간드 결합 검정을 통해 검출될 수 있는 모든 분자의 검출을 가능하게 한다.
본 발명은 대규모 실험실 자동화에 대한 기술의 신속하고 용이한 적응뿐만 아니라 소형 및 특수화된 현장 관리 장치로의 통합을 가능하게 한다.
본 발명(방법, 키트 및 용도)은 많은 적용에서 유리하다. 단일 단계에서 동시에 여러 부류, 바람직하게는 적어도 2종의 분자를 검출하는 것은 기다리고 기다리던 목표였다. 본 발명은 감염성 질환의 검출을 위한 숙주의 염증성 단백질 마커와 함께 DNA 분석으로 병원체를 확인하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 상이한 검정 프로토콜 및 분석 방법을 따를 시간이 없기 때문에 특히 시간-결정적 감염에서의 빠른 요법 결정에 큰 영향을 미친다. 본 발명의 신규 접근법으로, 최신 기술과 비교하여 병원체 및 숙주 염증에 대한 모든 중요한 정보를 갖는 생물분석 결과를 훨씬 더 빠르게 이용가능하다.
특허 및 비-특허 문헌의 모든 인용된 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
도면 및 실시예
본 발명을 실시예와 관련하여 설명하기 전에, 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 기재하기 위한 것이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
실시예: 염증성 시토카인 마커와 함께 박테리아 게놈 DNA의 동시 검출
병원체 및 염증성 시토카인의 동시 검출은 1개의 샘플로부터의 감염 및 숙주 반응의 동시 고려를 가능하게 한다. 이는 시간-결정적 감염에서의 빠른 요법 결정, 감염 상태의 모니터링, 또는 개인맞춤형 요법에 특히 유익하다. 예로서, 급성 마커 인터류킨-6(interleukin-6, IL-6)과 조합된 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa)의 게놈 DNA(gDNA)의 동시 검출이 제시된다.
핵산-대-친화성-리간드-형질전환은 동일한 측정 원리로 표적 분석물 및 표적 핵산을 후속적으로 검출하기 위한 표지를 사용한 증폭된 표적 핵산 서열의 관능화를 기재한다. 따라서, 본 발명자들의 다중분석물 검정은 동일한 측정 원리로 표적 분석물 및 표적 핵산을 동시에 검출할 수 있다. 이러한 특정한 예에서, RPA를 사용하여 IL-6의 존재 하에 피. 아에루기노사의 gDNA를 증폭시키고 표지하였다. 후속적으로, 두 분석물을 마이크로타이터 플레이트의 웰 내에서 샌드위치 면역검정을 통해 검출하였다.
상기 구체적인 예에서 프라이머 및 프로브는 피. 아에루기노사의 LasB 유전자의 고도로 보존된 영역을 표적화하도록 설계하였다. 사용된 프라이머 및 프로브의 서열은 표 1에 나타내었다. LasB 특이적 프라이머(LasB-정방향 및 LasB-역방향 프라이머) 및 프로브(LasB-프로브)의 세트는 단일-표지된(디곡시게닌) 161 bp 크기의 생성물 및 이중-표지된(디곡시게닌 및 비오틴) 123 bp 크기의 생성물을 생산하였다. 이중-표지된 생성물만이 리간드 결합 검정을 통해 검출되었다.
RPA는 TwistAmp® nfo 키트(TwistDx)를 사용하여 50 μl 부피로 수행하였다. 간략하게, 29.5 μl 1x 재수화 완충제를 1.25 μl LasB-정방향 프라이머(10 μM), 1.25 μl LasB-역방향 프라이머(10 μM), 및 1.2 μl LasB-프로브(10 μM)와 혼합하였다. 이어서, 6 μl의 샘플(게놈 DNA 및 IL-6 함유) 및 8.3 μl의 ddH2O를 반응 혼합물에 첨가하였다. 이어서 반응 펠릿 및 2.5 μl의 아세트산마그네슘(280 nM)을 첨가하고, 튜브를 즉시 37℃에서 15분 동안 블록 히터 상에 두었다.
후속적으로, RPA 반응물을 100 μl 검정 완충제(1xPBS, 0.1% BSA) 중에 1:10으로 희석하고, 4 μg/ml 항-IL6 항체 및 4 μg/ml 스트렙타비딘으로 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 첨가하였다. 마이크로타이터 플레이트를 5% BSA를 함유하는 PBS로 미리 차단하였다. 표지된 표적 DNA 및 표적 분석물을 1시간 동안 RT에서 인큐베이션한 후, 마이크로타이터 플레이트를 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. 후속적으로, 표적 분자를 항-디곡시게닌-접합된 형광 마이크로구체 및 항-IL6-접합된 형광 마이크로구체를 통해 검출하였다. 따라서, 100 μl의 각각의 접합된 형광 마이크로구체(75 μg/ml)를 마이크로타이터 플레이트에 첨가하고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다시, 마이크로타이터 플레이트를 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. 최종적으로, PBS 100 μl를 마이크로타이터 플레이트에 첨가하고, 각 표적 분자에 대한 형광 신호를 시판 마이크로타이터 플레이트 판독기를 통해 검출하였다(도 2).
상이한 예로서, IL-6 및 피. 아에루기노사 gDNA를 측면 유동 검정을 통해 검출하였다(도 3).
Figure pct00001
표 1은 피. 아에루기노사 gDNA 및 IL-6의 동시 검출을 위해 기재된 프라이머 및 프로브 서열을 나타낸다.
서열식별번호(SEQ ID NO) 1 GAGAATGACAAAGTGGAACTGGTGATCCGCCTG
서열식별번호 2 GCCAGGCCTTCCCACTGATCGAGCAC TTCGCCG
서열식별번호 3 GAACAACATCGCCCAACTGGTCTACAACGTTCCTACCTGATTCCC
도 1은 1개의 샘플로부터 한번에 다중 표적 분자의 동시 검출에 대한 다중 표적 분자의 통상적인 검출을 나타낸다. (상단) 다중 표적 분자의 통상적인 검출. (하단) 본 발명에 따른 다중분석물 검정을 통한 표적 분자의 동시 검출.
도 2는 마이크로타이터 플레이트 내에서의 피. 아에루기노사 gDNA 및 IL-6의 동시 검출을 나타낸다.
도 3은 측면 유동 검정을 통한 피. 아에루기노사 gDNA 및 IL-6 동시 검출을 나타낸다.
참고문헌
Figure pct00002
Figure pct00003
<110> Albert-Ludwigs-Universitaet Freiburg HAHN-SCHICKARD-GESELLSCHAFT FUR ANGEWANDTE FORSCHUNG E.V. <120> Multianalyte Assay for the simultaneous detection of nucleic acid and analytes <130> XII2184/20WO <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gagaatgaca aagtggaact ggtgatccgc ctg 33 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gccaggcctt cccactgatc gagcacttcg ccg 33 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 gaacaacatc gcccaactgg tctacaacgt tcctacctga ttccc 45

Claims (13)

1개의 샘플로부터 적어도 2개의 상이한 표적 분자의 존재 또는 부재를 검출하는 방법이며, 여기서 적어도 1개의 표적 분자는 관심 표적 분석물이고 적어도 1개의 다른 표적 분자는 관심 표적 핵산이고, 상기 방법은
· 등온 증폭 반응을 수행하는 것;
˚ 적어도 1개의 표적 핵산 및/또는 적어도 1개의 표적 분석물의 존재 또는 부재에 대해 분석하고자 하는 샘플을 적어도 1개의 증폭 프라이머 세트에 접촉시키는 것을 포함하고,
˚ 여기서 2개의 증폭 프라이머는 표적 핵산과 혼성화할 수 있고,
˚ 여기서 적어도 1개의 증폭 프라이머는 제1 친화성 표지를 포함하고,
˚ 여기서 제2 친화성 표지는 표적 핵산의 앰플리콘 내로 혼입될 수 있는 방식으로 제공되고,
· 리간드 결합 검정을 동시에 수행하는 것; 여기서 신호 생성을 통해 표적 분석물 및/또는 표지된 표적 핵산의 존재를 포획 및 검출할 수 있는 친화성 분자가 사용되고,
· 상기 표적 분석물 및/또는 표적 핵산의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하고,
· 여기서 표적 분석물은 단백질, 펩티드, 항체, 호르몬, 효소, 소분자, 탄수화물 또는 임의의 다른 물질이나, 핵산은 아니고,
· 여기서 샘플이 분할되지 않고, 별도의 검정 절차 및/또는 프로토콜이 요구되지 않는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 표적 핵산이 증폭되고, 동시에 적어도 제1 및 제2 친화성 표지가 증폭된 표적 핵산으로 도입되는 것인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 2개의 증폭 프라이머 혼성화 부위 사이에 위치하는 서열과 혼성화하는 특이적 프로브가 제공되고, 여기서 특이적 프로브는 제2 친화성 표지를 포함하는 것인, 방법.
제3항에 있어서, 등온 증폭 반응이, 적어도 2개의 증폭 프라이머 사이에 위치하는 서열에 혼성화하여 2차 이중 표지된 생성물을 유도하는, 특이적 프로브에 의해 인식되는, 1차 단일 표지된 생성물을 유도하는 것인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 표지는 제1 표지와 상이한 것인, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산에 대한 신호가 친화성 분자에 의한 친화성 표지의 결합을 통해 생성되는 것인, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산이 DNA 분자, 바람직하게는 ssDNA, dsDNA, cDNA, rDNA, mtDNA, cpDNA 또는 플라스미드 DNA, RNA 분자, 바람직하게는 mRNA, 순환 RNA, miRNA, snRNA, snoRNA, rRNA, tRNA, asRNA, circRNA, hnRNA, siRNA, shRNA, snoRNA, snRNA, IncRNA, piRNA, 또는 tracrRNA인, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 등온 증폭 반응이 분석물과 상용성인 조건에서 일어나는 것인, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표지가 친화성 태그, 바람직하게는 비오틴, FAM, 디곡시게닌 또는 디니트로페닐(dinitrophenyl, DNP), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine, TAMRA), 텍사스 레드, 캐스케이드 블루, 스트렙타비딘 및 유도체, Cy5, 단실, 플루오레세인, 아지드, 알킨 또는 다른 생물직교성 관능기 및/또는 태그인, 방법.
제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 특이적 프로브가 적어도 1개의 관능 부위, 바람직하게는 무염기성 잔기 또는 폴리머라제 연장 차단기를 더 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 친화성 분자가 항체, 압타머, 관능기, 단백질, 리간드 결합 중합체 구조, 관능기를 함유할 수 있는 (거대-) 분자 및/또는 분자적으로 각인된 중합체(molecularly imprinted polymer, MIP)이고/이거나 여기서 시그널링 도구, 바람직하게 마커는 상기 친화성 분자에 부착되는 것인, 방법.
· 표적 핵산과 혼성화하는 적어도 1개의 증폭 프라이머 세트,
· 여기서 적어도 1개의 증폭 프라이머는 제1 친화성 표지를 포함하고,
· 임의로 표적 핵산과 혼성화할 수 있는 특이적 프로브,
· 제2 프라이머 또는 특이적 프로브와 연관된 제2 친화성 표지,
· 등온 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및
· 친화성 분자를 포함하는, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 키트.
시험관내 진단, 약물 개발, 식품 안전성, 또는 환경 안전성을 위한 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제12항에 따른 키트의 용도.
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