CN116096916A - 用于同时检测核酸和分析物的多分析物测定 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测来自一个样本的至少两种不同靶分子是否存在的方法和试剂盒,其中至少一种靶分子是感兴趣的靶分析物并且至少一种其他靶分子是感兴趣的靶核酸,其中该方法结合了:进行等温扩增反应,其中靶核酸或其扩增子用至少两种亲和标记标记;和配体结合测定,其中使用亲和分子,该亲和分子可以通过信号生成捕获和检测靶分析物和/或标记的靶核酸的存在。本发明还涉及该方法或试剂盒在各个领域中的用途。
Description
发明背景
技术领域
对于分子(例如核酸、分析物)的检测,现有技术中有几种检测方法可用。这些方法中的每一种都针对特定的生物分子类别进行专门化和优化(例如,用于核酸检测的PCR或等温扩增方法或用于蛋白质检测的免疫测定)。
在许多应用中,在单个步骤中同时检测几类分子是有利的。已经有人争论是否需要在单个步骤中对核酸和分析物进行多重检测,然而,方法需要面对几个挑战。需要考虑生物样本中核酸和分析物之间的浓度差异。可能无法同时测量分析物和核酸的生理相关浓度范围。因此,需要扩增靶核酸。然而,所需的扩增条件通常会导致分析物发生变化,例如蛋白质变性(例如PCR反应中的加热步骤)。一旦分析物具有例如非天然结构,它就不能通过标准免疫学测定被检测到。
相关技术的讨论
已经开发出用于同时检测分析物和核酸的第一种方法。然而,这些方法仍然有局限性。一种方法包括通过与探针杂交来检测核酸,以及通过抗原-抗体相互作用同时检测分析物(Mohan等人,2011年;Mao等人,2014年;Scott等人,2017年)。两种反应都需要不同的条件——这些条件会相互干扰。然而,在缓冲系统中检测分析物,杂交反应需要高盐浓度和相对高的温度。开发在37℃下与靶核酸杂交的探针允许同时检测分析物,但仍然会导致较弱的信噪比(Mohan等人,2011年)。此外,一些方法以顺序方法分析靶分子(Mohan等人,2011年)和/或需要单独的样本制备步骤(Mohan等人,2011年;Scott等人,2017年)。
有几种方法通过使用分析物检测分子(如与寡核苷酸连接的适体或抗体)而将分析物信息转化为核酸信息。(与抗体连接的)适体或寡核苷酸与靶核酸一起进行后续扩增允许同时检测靶分子。因此,相同的测量原理用于同时检测核酸和分析物。然而,在复杂粗样本基质中适体与抗体相比降低的稳定性以及选择性阻碍了适体在分析物检测中的广泛应用。另一方面,寡核苷酸与分析物检测抗体的结合可能是个耗时的过程。目前的方法使用不同的策略来扩增与靶分析物结合的寡核苷酸,包括两端接头连接法(two-ended adapterligation method)、支链测定和邻近延伸测定。除了用于检测靶核酸的引物和探针之外,所有这些方法都还需要设计几种引物和/或探针。这增加了系统的复杂性,会增加成本,并可能由于引物/探针二聚体形成而导致高背景。
在最先进的技术中,Mohan等人,2011年描述了一种可用于核酸和蛋白质检测的电化学传感器平台。蛋白质检测基于抗体-抗原反应,而核酸检测基于杂交反应。为了促进核酸检测与蛋白质免疫测定的集成,他们开发了针对37℃下杂交而优化的探针。检测基于辣根过氧化物酶(HRP)氧化还原反应。这种方法基于两种不同的测量原理。核酸通过探针杂交来检测,而蛋白质通过抗原-抗体反应来检测。一般来说,这两种测量原理需要不同的测定条件。然而,作者开发了一种具有相似参数的蛋白质和核酸检测方法。这种折中方法具有影响一种或两种检测的灵敏度和特异性的风险。此外,该方法没有考虑生物样本中蛋白质和核酸之间的浓度差异。无法同时测量蛋白质和核酸的生理相关浓度范围。此外,该方法还需要单独的样本制备和单独将蛋白质或核酸样本添加到传感器中。
Mao等人,2014年描述了一种用于同时检测核酸和蛋白质的侧流装置。在侧流条上进行两个单独的反应。蛋白质通过夹心型免疫反应检测,而核酸检测基于DNA杂交反应。靶核酸和蛋白质同时施加于样本施加区并结合到它们相应的测试线上。通过用检测探针或检测抗体官能化的金纳米粒子来检测靶分子。这种方法使用两种不同的测量原理。核酸通过探针杂交来检测,而蛋白质通过抗原-抗体反应来检测。这导致测定的灵敏度低。此外,该方法使用非常短的单链DNA,因此不适用于生物样本中较长的双链DNA。核酸在检测之前没有被扩增,因此只能检测量非常大的核酸,这在生理学上可能是没有意义的。
Scott等人,2017年描述了一种组合测定,这种组合测定提供了同时检测微阵列上的蛋白质和核酸的能力。检测基于抗体-抗原反应和检测靶核酸与微阵列的DNA杂交反应。该阵列用用于核酸检测的捕获探针和用于蛋白质检测的捕获抗体进行官能化。在测定之前,靶核酸的3'末端是生物素化的,靶蛋白质和生物素化靶核酸均被添加到阵列中。在与微阵列的相应区域结合后,添加生物素化抗体并与靶蛋白结合。随后,通过生物素-PEG连接的金纳米粒子检测靶分子。
这种方法使用两种不同的测量原理。核酸通过探针杂交来检测,而蛋白质通过抗原-抗体反应来检测。一般来说,这两种测量原理需要不同的测定条件以获得最佳的结果。此外,该方法需要单独的样本制备。核酸的3'末端需要在检测前用生物素化试剂盒进行生物素化,这增加了额外的样本制备步骤。生物素化非靶核酸也可以与生物素-PEG连接的金纳米粒子结合,从而占据结合位点,并可能导致高背景信号。此外,该方法仅适用于短的单链RNA或DNA序列,并且只能检测量非常大的核酸,因为核酸不会被扩增。为了使生物素化靶核酸与检测探针杂交,将样本与微阵列在45℃下孵育2小时。这些测定条件对于同时与其捕获抗体结合的蛋白质检测来说不是最理想的,并且可能导致蛋白质降解。
US8431367B2描述了一种使用适体技术在单个测定中检测靶核酸和靶蛋白质的方法。因此,可以在单个反应中扩增靶核酸和适体。随后,扩增的靶核酸和适体可通过标准核酸检测技术(例如荧光标记法测序)来检测。因此,检测到适体表明样本中存在靶蛋白质。一般来说,适体不如单克隆抗体或多克隆抗体成熟,它们的整体负电荷使它们具有亲水性,并且它们会被核酸酶迅速降解。此外,适体只有4种核酸结构单元(与蛋白质的22种氨基酸结构单元相比),限制了它们可能的二级和三级结构的多样性。此外,适体的定制合成增加了成本。特别是复杂粗样本基质中适体的稳定性和选择性阻碍了适体在蛋白质检测中的广泛应用。
WO2019157445A1描述了使用现有测序方法同时、多重检测并量化组织、细胞或亚细胞结构的使用定义区域(used-defined region)中的蛋白质和/或核酸表达。在描述为“两端接头连接法”的方法中使用探针来检测靶分析物。特异性探针包含靶结合域以及识别与靶结合域结合的靶分析物的标识符寡核苷酸。进一步地,探针可能在靶结合域和标识符寡核苷酸之间包含光可切割连接子(linker)。通过施加足够波长的光,连接子被切割,从而释放标识符寡核苷酸。在收集释放的标识符寡核苷酸后,第一核酸探针和第二核酸探针与释放的标识符寡核苷酸杂交。这些核酸探针包含不同的结构域。第一核酸探针包含与标识符寡核苷酸的一部分互补的序列,其是包含独特的分子标识符和扩增引物结合位点的序列。第二核酸探针包含与标识符寡核苷酸的一部分互补的序列和第二扩增引物结合位点。连接杂交的核酸探针,随后扩增连接产物。使用现有的测序方法,分析扩增的连接产物并鉴定靶分析物。
主要缺点是,这是一种依赖于单分子计数的方法。单分子计数需要复杂、昂贵且灵敏的读出设备,如专用显微镜,或者如果使用低成本光学器件,则必须针对每个靶分子设计复杂的长(条形码化)引物和探针,这同样非常昂贵并且需要大量的测定设计。此外,引物/探针二聚体形成导致的高背景也是一个问题。
US20120004132A1描述了一种使用基于支链的测定来检测多种核酸和蛋白质的方法。一般来说,这个系统非常复杂,需要几种引物和探针,这增加了测定的成本。此外,支链测定采用线性信号扩增而不是靶分子的指数扩增。
US10214773B2描述了一种使用邻近延伸测定来检测核酸和蛋白质的方法。这种方法使用很接近地结合靶蛋白的抗体对。每种抗体与核酸结合,该核酸与另一种抗体的核酸杂交。因此,这种方法在很大程度上取决于抗体质量——两种抗体都需要以相同的效率结合到靶标上,但要结合到非常接近的不同表位。因此,无法检测到小分子,例如药物或毒素或更小的蛋白质。此外,寡核苷酸与抗体的结合可能非常耗时。此外,核苷酸的非特异性连接和二聚体形成可导致高背景信号。
US20180208975A1和US20180251825A1公开了一种类似的方法来检测样本中的蛋白质和核酸。蛋白质由与DNA条形码缀合的蛋白质结合分子(例如抗体)识别。该寡核苷酸序列包含用于扩增和测序的引物(PCR把手(PCR handle))、识别蛋白质结合分子的蛋白质识别序列,以及与检测探针中的序列杂交的通用连接子序列。这些方法的不同之处在于蛋白质结合分子如何与DNA条形码结合。US20180251825A1使用链霉亲和素-生物素相互作用使DNA条形码与例如抗体连接。然而,在US20180208975A1中,蛋白质结合分子与胺化DNA条形码共价结合。然而,DNA条形码和核酸的通用连接子序列与相应的蛋白质检测探针和核酸检测探针杂交。随后,将序列扩增和测序以检测分析物的信号。
这两种方法都用于单细胞分析。主要限制是抗体的表位位置,抗体的表位位置目前仅限于细胞表面,因此不能检测细胞内蛋白质。要捕获单个细胞,需要单细胞悬浮液。此步骤通常使用酶处理来分解组织,这可能会影响细胞的转录谱和低RNA质量。此外,寡核苷酸与抗体的结合可能非常耗时。
总而言之,目前同时检测分析物和核酸的方法在灵敏度、重现性、信噪比方面存在局限性,或者需要针对不同的靶分子分别进行样本制备。
因此,需要开发一种避免现有技术缺点的多分析物方法。此外,反应方案是有益的,可以在不同的应用和平台中实施。
发明内容
该问题通过独立权利要求的特征解决。本发明的优选实施方式由从属权利要求提供。
在第一种实施方式中,本发明涉及一种检测来自一个样本的至少两种不同靶分子是否存在的方法,其中至少一种靶分子是感兴趣的靶分析物并且至少一种其他靶分子是感兴趣的靶核酸,所述方法包括:
·进行等温扩增反应,包括:
○使待分析至少一种靶核酸和/或至少一种靶分析物是否存在的样本与至少一组扩增引物接触,所述至少一组扩增引物包含至少两种扩增引物,
○其中两种扩增引物可以与所述靶核酸杂交,
○其中所述扩增引物中的至少一种包含第一亲和标记,
○其中第二亲和标记以可以被掺入到靶核酸的扩增子中的方式提供,
·同时进行配体结合测定,其中使用亲和分子,所述亲和分子可以通过信号生成来捕获和检测靶分析物和/或标记的靶核酸的存在,
·检测所述靶分析物和/或靶核酸是否存在。
一般来说,无法同时测量大多数生理相关浓度范围的分析物和核酸。然而,本发明使用核酸到亲和配体的转化(nucleic-acid-to-affinity-ligand-transformation),这扩增了靶核酸并用标记使扩增子官能化。因此,现在可以同时检测生理相关浓度范围的不同靶分子类别。
优选地,本发明的方法用于检测至少两种不同类别的靶分子的存在。
本发明提出了一种新的方案,该方案通过用标记使扩增的核酸序列官能化(核酸到亲和配体的转化)并且以相同的测量原理检测标记的靶核酸和靶分析物,一次性地从样本中同时检测核酸和分析物。这是通过以下实现的:(1)使用分析物兼容的等温扩增将标记引入靶核酸,和(2)通过配体结合测定来检测靶分子。
为了能够以相同的测量原理同时检测靶核酸和靶分析物,需要将不同靶分子的信息转化为单一信息格式。例如:将某种分析物如蛋白质的信息转化为核酸信息。例如,这可以通过与寡核苷酸连接的蛋白质结合分子来实现。
这种新颖的检测构思可以根据应用实施到不同的系统中,例如但不限于纸基传感器、微流体系统、微阵列、液体处理平台、试管或基于微孔板的系统。
该构思的特征是所谓的“核酸到亲和配体的转化”,其将核酸信息转化为分析物信息。这允许随后使用相同的测量原理同时检测靶核酸和靶分析物。此外,同时检测靶分子不需要单独的样本制备。对于核酸到亲和配体的转化,使用等温扩增方法,该方法同时扩增靶核酸并将接头(标记)引入核酸。由此,反应发生在与分析物如蛋白质兼容的条件下,因此不需要单独的样本制备和处理。在随后的配体结合测定中,标记的靶核酸和靶分析物被亲和分子捕获和检测到以生成针对相应靶分子的信号。
本发明基于这样的发现,即可以通过使用核酸到亲和配体的转化一次性地从一个样本中同时分析核酸和分析物。此外,本发明基于这样的发现,即分析物兼容的等温扩增可用于扩增和标记核酸以及随后同时检测靶分析物和标记的靶核酸两者。此外,本发明基于这样的发现,即使用相同的测量原理允许一次性地检测所有靶分子。
优选地,等温扩增的变体用于对靶核酸进行分析物兼容的扩增和对靶核酸进行标记。
一方面,本发明提供了一种一次性地从一个样本中同时检测靶分析物和/或靶核酸的方法。其中,不同的靶分子类别不需要单独的样本制备和处理,靶核酸在分析物兼容的等温扩增反应中扩增,从而将标记引入扩增产物。这个过程被描述为“核酸到亲和配体的转化”。随后,标记的靶核酸和/或靶分析物通过配体结合测定来检测。
本发明的方法也称为多分析物测定,并且是核酸到亲和配体的转化和配体结合测定的新组合。本发明的多分析物测定能够使用相同的测量原理同时检测靶分析物和靶核酸。
核酸到亲和配体的转化描述了用标记对扩增的靶核酸序列进行官能化,以便随后使用相同的测量原理检测靶分析物和靶核酸。分析物兼容的等温扩增用于在靶分析物存在的情况下扩增靶核酸并将标记引入扩增产物。随后通过配体结合测定一起检测标记的扩增子与靶分析物。各种等温扩增反应的设计参数是本领域技术人员熟知的。
优选地,第二标记不同于第一标记。
在优选的实施方式中,扩增靶核酸,并且至少将第一亲和标记和第二亲和标记同时引入到扩增的靶核酸中。
优选地,引物的长度为约10至80个核苷酸,特别优选为20至35个核苷酸,扩增产物的长度应为约50至20000个碱基对,特别优选为70至500个碱基对。至少一种引物包含亲和标签(标记1),优选在引物的5'端。
优选地,第一标记和第二标记选自包括生物素、FAM、洋地黄毒苷或二硝基苯(DNP)、四甲基罗丹明(TAMRA)、德州红、级联蓝、链霉亲和素或其衍生物、Cy5、丹酰、荧光素、叠氮化物、炔烃或其他生物正交官能团和/或标签的组。
还优选地,第二亲和标记通过第二引物提供并且不同于第一标记,但也优选是生物素、FAM、洋地黄毒苷或二硝基苯(DNP)、四甲基罗丹明(TAMRA)、德州红、级联蓝、链霉亲和素或其衍生物、Cy5、丹酰、荧光素、叠氮化物、炔烃或其他生物正交官能团和/或标签。
本发明的一个主要优势是感兴趣的核酸的检测与感兴趣的分析物的检测同时进行。靶分析物和标记的扩增产物(标记的靶核酸)均从上述扩增反应中获得。核酸到亲和配体的转化允许使用配体结合测定通过相同的测量原理同时检测靶分子。这里描述了典型配体结合测定的设计参数。在所谓的检测区中检测靶分析物和标记的靶核酸。
根据本发明的检测区是平台中发生靶分子检测的限定区域。检测区可以是表面的,也可以是溶液中的,例如侧流测试的测试线、微量滴定板的孔、管、微阵列上的斑点、或微流体装置内的腔室。
在一些实施方式中,靶分子在同一检测区中检测。在其他实施方式中,靶分析物和标记的靶核酸在不同的检测区中检测。通常,靶分子被亲和分子捕获和/或检测。靶分子与亲和分子的结合通常在缓冲溶液中进行。这可能是磷酸盐缓冲系统或碳酸氢盐缓冲系统。此外,可能会向缓冲系统中添加如封闭剂(如BSA)、糖类(如海藻糖)或去污剂(如吐温20)等添加剂。本领域技术人员无需自己付出创造性劳动即可选择缓冲液。反应时间和温度取决于靶分子和使用的平台。在一些实施方式中,各个靶分子的检测是通过将信号传递工具(例如标志物)连接到亲和分子来实现的。信号传递工具可能是但不限于酶、荧光报告物或电化学发光标记。在其他实施方式中,各个靶分子的检测是通过无标记检测方法实现的。
在另一种优选的实施方式中,提供了特异性探针,该特异性探针与位于至少两个扩增引物杂交位点之间的序列杂交。
还优选地,特异性探针包含第二亲和标记。在这种情况下,第二引物不需要标记。
还优选地,特异性探针还包含至少一个功能位点,优选无碱基残基或聚合酶延伸阻断基团。
在这些实施方式中,通过至少两种引物与靶序列的结合在样本中扩增靶核酸(例如DNA)。至少一种引物包含亲和标签(标记1),优选在引物的5'端。扩增导致产生第一单标记(SL)产物。该SL产物被特异性探针识别,该特异性探针与其位于两种扩增引物之间的互补序列杂交。在一些实施方式中,该探针包含亲和标签(标记2)并且还可以包含功能位点,如无碱基(abasic)残基(例如THF)或聚合酶延伸阻断基团(例如C3)。探针与SL产物的杂交导致产生第二双标记(DL)产物。通常,该DL产物通过配体结合测定进行检测。
扩增通常在引物和任选的探针与靶核酸结合后进行。扩增反应通常需要诸如核苷酸和DNA聚合酶的试剂。在一些实施方案中,使用缺乏5'至3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶。此外,在一些实施方式中,可以将额外的酶如逆转录酶添加到从RNA模板生成互补DNA的反应中。在一些实施方式中,反应需要另外的组分,这可能包括但不限于单链结合蛋白、重组酶、解旋酶或核酸内切酶。在一些实施方式中,需要添加乙酸镁或其他辅助因子。
如果使用探针,探针优选含有第二亲和标签(标记2),而不是第二标记引物。探针的位置位于上述两种引物之间。与探针同向的引物可以重叠。
可以使用现成的软件来设计与靶核酸互补的引物和/或探针。此外,引物和/或探针设计为避开诸如发夹和茎的二级结构区域。添加到反应混合物中以与靶核酸杂交的每种引物和/或探针的浓度通常为10至1000nM,优选为50至600nM和20至300nM。
进一步优选地,等温扩增反应产生被特异性探针识别的第一单标记产物,该特异性探针与位于至少两种扩增引物之间的序列杂交,从而产生第二DL产物。
可以如本文所述检测任何靶核酸和/或靶分析物。
还优选地,靶核酸是DNA分子,优选ssDNA、dsDNA、cDNA、rDNA、mtDNA、cpDNA或质粒DNA;RNA分子,优选mRNA、循环RNA、miRNA、snRNA、snoRNA、rRNA、tRNA、asRNA、circRNA、hnRNA、siRNA、shRNA、snoRNA、snRNA、IncRNA、piRNA或tracrRNA。
术语“分析物”是指要通过本发明的方法检测、定量或以其他方式分析的物质。典型的分析物可以包括但不限于蛋白质、肽、核酸片段、碳水化合物、脂质、抗体(单克隆或多克隆)、抗原、寡核苷酸、特异性受体蛋白、配体、分子、细胞、微生物、片段、产物及其组合,或可以被针对以开发连接位点、结合成员或受体(例如抗体)的任何物质。分析物也可以指来自所述实体的复合物。例如,分析物可以指由多个实体或分子形成的聚集体或复合物,例如蛋白质-蛋白质复合物,其中感兴趣的是实体/分子的相互作用。
特别优选地,靶分析物是蛋白质、肽、抗体、激素、酶、小分子、碳水化合物或任何其他物质,但不是核酸。
“蛋白质”是指链长足以产生更高水平的三级和/或四级结构的氨基酸序列。“肽”优选指较小分子量的蛋白质。
术语“核酸”是指任何核酸分子,包括但不限于单链或双链形式的DNA、RNA及其杂交体或修饰的变体和聚合物(“多核苷酸”)。除非特别限制,该术语包括含有已知的天然核苷酸类似物的核酸,这些类似物具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明,特定的核酸分子/多核苷酸还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。具体而言,简并密码子取代可以通过生成这样的序列来实现,在该序列中,一个或多个选定(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。核苷酸根据其碱基通过以下标准缩写表示:腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)。
进一步优选地,样本没有被拆分并且不需要单独的测定程序和/或方案。这种方法允许使用相同的测量原理同时检测不同的靶分子类别,因此不需要拆分样本。因此,需要的样本量更少,这对于只能获取有限样本材料的应用至关重要。此外,根据本发明的多分析物测定允许更快更容易地检测不同的靶分子,因为不必针对靶核酸和靶分析物执行单独的方案。
此外,反应条件是针对特定的检测原理定义的,因此不需要较大的缓冲液或温度变化。
包含感兴趣的核酸和/或分析物的样本可以从任何来源获得。这可能包括如细菌、病毒、真菌、细胞器、植物或哺乳动物的来源。其他样本可能获得自环境来源和生产产品(例如食品或药物)或体液(例如血液、尿液、伤口液、血清)。在典型的实施方式中,靶核酸是DNA分子(例如ssDNA、dsDNA、cDNA)。在其他实施方式中,靶核酸是RNA分子(例如mRNA、循环RNA、miRNA)。靶标可以包括例如与病原体(例如细菌、病毒或真菌)、疾病(例如过度表达和表达不足)相关的核酸或基于核酸的治疗剂。在典型的实施方式中,靶分析物是蛋白质。在其他实施方式中,靶分析物是肽、抗体、激素、小分子碳水化合物或任何其他物质,但不是核酸。在一些实施方式中,分析物可能与炎症(例如白细胞介素、CRP)、疾病、过敏原、治疗药物或调节功能相关。一般而言,本发明包括使用本文所述的多分析物测定一次性地从一个样本中同时检测靶核酸和靶分析物。这包括分析物兼容的核酸到亲和配体的转化以及配体结合测定。因此,这种方法不需要单独的样本制备和处理。靶核酸和靶分析物可以直接同时添加到扩增反应中。这是有可能的,因为扩增反应的分析物兼容性。此外,使用配体结合测定以相同的测量原理检测靶分子。
优选地,感兴趣的靶核酸的检测与感兴趣的分析物的检测同时进行,因此扩增反应条件与分析物稳定性兼容。扩增反应的时间和温度可能会有所不同,这取决于引物、探针(如果存在)和靶分析物。优选地,该反应在室温至45℃下需要10分钟至2小时。
因此,优选地,等温扩增反应发生在与分析物兼容的条件下。通常,这意味着必须以维持足够分析物结构使得亲和分子能够结合分析物的方式选择反应条件(例如温度、缓冲液)。因此,例如缓冲液必须是液体并且分析物不能变性,因此温度需要在0至100℃。条件取决于分析物以及所选的扩增方法和配体结合测定。本领域技术人员无需自己创造性地劳动即可选择合适的参数。对于温度敏感的分析物,例如热不稳定的蛋白质,必须选择可以在低温(25-40℃)下进行的扩增方法,例如重组酶聚合酶扩增(RPA)。其他分析物在较高温度下也很稳定,例如环介导等温扩增(LAMP)可以在40至70℃下进行。此外,有些分析物允许在等温扩增之前例如熔解dsDNA之前进行初始变性步骤(80至100℃)。
扩增通常在中性至弱碱性(pH7.0至8.3)的pH范围内进行。这与大多数分析物兼容。但是,如有必要,也可将pH值降低至弱酸性范围(pH5.0至7.0)。其他pH值也是可能的,并且本领域技术人员知道哪个pH范围与哪种分析物兼容,例如LAMP反应可以在6.0至10.0的pH范围内发生,或者HAD可以在约pH6.0至9.0的范围内发生(Tris-乙酸盐或Tris-HCI缓冲液)。
进一步优选的是,靶核酸的信号是通过亲和分子结合亲和标记生成的。因此,亲和分子是结合根据本发明的亲和标记的分子。因此,亲和分子优选是包含靶结合部分的分子,该靶结合部分可以结合靶分析物或标记的靶核酸。
亲和分子也用于结合和检测靶分析物。
术语“亲和分子”优选指结合对的一个成员,其中第二个成员是分析物和/或亲和标记,其中术语“结合对”包括任何类别的免疫型结合对,例如抗原/抗体或半抗原/抗半抗原系统;以及任何类别的非免疫型结合对,例如生物素/亲和素;生物素/链霉亲和素;叶酸/叶酸结合蛋白;互补核酸片段,例如互补DNA链或互补RNA链;蛋白A或G/免疫球蛋白;以及形成共价键的结合对,例如包括马来酰亚胺和卤代乙酰基衍生物的巯氢基反应基团,以及诸如异三氰酸酯、琥珀酰亚胺酯和磺酰卤的胺反应基团。聚合物基质,如分子印迹聚合物,也可以是根据本发明的亲和分子。
优选地,亲和分子是抗体和/或蛋白质,和/或适体和/或官能团和/或配体结合聚合物结构和/或分子印记聚合物(MIP)和/或可以包含官能团的(大)分子和/或其中信号传递工具(优选标志物)与亲和分子相连。
具有靶分析物兼容的反应条件的任何等温扩增方法均可用于本发明的方法。所描述的扩增反应只是示例,不应限制本发明。
在一些实施方式中,重组酶聚合酶扩增(RPA)可用于扩增靶核酸。RPA是在37至42℃下运行的等温扩增方法。该方法不使用温度循环,而是使用参与细胞DNA合成、重组和修复的蛋白质。在存在ATP和拥挤剂(crowding agent)的情况下,重组酶蛋白与引物结合并促进在同源序列处的链侵入。被置换的链由单链结合蛋白稳定。链置换DNA聚合酶负责引物的延伸。该过程的循环导致靶核酸的指数扩增。在一些实施方式中,使用逆转录RPA。在其他实施方式中,使用额外的特异性探针。
在该具体的实施方式中,优选设计一组引物来扩增靶核酸。至少一种引物包含亲和标签(标记1),优选在引物的5'端。亲和标签可以是生物素、FAM、洋地黄毒苷或DNP。一般而言,RPA引物的长度优选为30至35个核苷酸,扩增产物的长度可为约70至500个碱基对。为了增加特异性,可以添加特异性探针。通常,探针的长度为约46至53个核苷酸,其中至少30个核苷酸位于无碱基侧的5',至少另外15个核苷酸位于其3'。亲和标签(标记2)位于5'端,可以是生物素、FAM、洋地黄毒苷或DNP(应与标记1不同)。而聚合酶延伸阻断基团位于3'端,可以是磷酸盐、C3-间隔区或双脱氧核苷酸。探针的位置位于上述两种引物之间。与探针同向的引物可以重叠。然而,优选地,重叠限于探针的前30个核苷酸。添加到反应混合物中以与靶核酸杂交的每种引物和探针的浓度通常为150至600nM和50至300nM。
在一些实施方式中,解旋酶依赖性扩增(HDA)可用于靶核酸的扩增。通常,HDA使用解旋酶和单链结合蛋白来生成用于引物杂交的单链模板。链置换DNA聚合酶延伸引物并产生dsDNA。该过程的循环导致靶核酸的指数扩增。在一些实施方式中,使用逆转录HDA。
在该具体的实施方式中,设计一组引物来扩增靶核酸。至少一种引物含有如前所述的亲和标签。优选地,引物的长度为24至33个核苷酸,扩增产物的长度可为约80至129个碱基对。为了增加特异性,可以向反应中添加特异性探针。探针标记有亲和标签(标记2),亲和标签(标记2)位于3'端以避免延伸,并且可以是生物素、FAM、洋地黄毒苷或DNP(应与标记1不同)。探针的位置位于上述两种引物之间。因此,未标记的引物限制了反应。添加到反应混合物中的每种引物的浓度通常为50至200nM。
在一些实施方式中,链置换扩增(SDA)可用于靶核酸的扩增。SDA基于限制酶的切口活性(nicking activity)和DNA聚合酶在切口处启动复制并置换下游序列的能力。在典型的SDA中,设计了两种与靶核酸结合的引物组,即两种外部“缓冲”引物和两种包含切口酶识别位点的内部延伸引物。SDA的变体可使用CRISPR-Cas系统,其中一对Cas9核糖核蛋白识别靶DNA并诱导一对缺口。为了提高特异性,可以将靶向扩增子的两个不同区域的两种探针添加到反应中。捕获探针在5'端标记有亲和标签(标记1),而检测探针在3'端标记有亲和标签(标记2)。亲和标签可以是生物素、FAM、洋地黄毒苷或DNP。
然而,这些描述的扩增反应只是示例。在其他实施方式中,可以使用等温扩增方法,例如环介导的等温扩增(LAMP)或基于核酸序列的扩增(NASBA)。此外,内部扩增对照(IAC)核酸可能与靶核酸同时扩增,以排除假阴性结果。
该测定除等温扩增外还包括配体结合测定。配体结合测定是用于检测靶分子的分析程序,它依赖于靶分子与亲和分子的结合。这种相互作用/结合可以是共价的或非共价的。
配体结合测定是一种依赖于靶分子(配体)与亲和分子的共价或非共价结合的测定。在第一种实施方式中,使用抗原-抗体反应同时检测靶分子。而另一种实施方式描述了适体的使用。也可以同时使用两种变体。在其他实施方式中,可以实施不同的共价或非共价配体结合构思(例如配体结合聚合物结构)。
使用抗原-抗体反应来检测分析物是现有技术。抗体识别靶分析物并可与其表位结合。此外,DL扩增子的亲和标记可以被特异性抗体识别。各种免疫测定形式如竞争性免疫测定或夹心免疫测定可用于检测靶分析物和标记的靶核酸。
适体是与靶分析物结合的基于寡核苷酸的亲和分子。它们有足够的表面积来识别和结合它们的靶标,并且可以区分靶分析物(如单克隆抗体)的同种型和变体。各种免疫测定形式如竞争性免疫测定或夹心免疫测定可用于通过适体检测靶分子。
多分析物测定所需的所有组分均有市售,并且该测定不需要复杂的设计步骤(例如,使用寡核苷酸序列对抗体进行官能化或设计复杂的引物和探针系统)。
进一步优选地,该方法被集成到平台中。优选的平台是微量滴定板、侧流测试、基于阵列的平台,尤其优选微阵列、微流体平台、优选的芯片实验室或更大的系统或液体处理平台,或任何其他合适的平台。
使用微量滴定板检测是传统且直接的方法。该平台可在实验室中用于例如进行高通量蛋白质表达筛选。使用移液机器人可以使这个过程自动化。在具体的实施方式中,将样本添加到第一孔中。在该第一孔中,发生前面描述的核酸到亲和配体的转化反应。随后,将一定量的核酸到亲和配体的转化反应转移到第二孔(检测区)以进行配体结合测定。靶分子被亲和分子捕获和/或检测,该亲和分子针对相应的靶分子产生例如光学信号。最后,商业微量滴定板读板器执行板的光学读出。
侧流测试(LFT)是允许低成本、简单、快速和便携地检测靶分子的纸基装置。LFT广泛应用于不同行业,包括诊断、质量控制、食品生产中的产品安全、以及环境健康和安全。通常,样本通过毛细管力移动通过侧流条的各个区域。在一些实施方式中,核酸到亲和配体的转化反应发生在管或其他空腔内,随后一定量的反应被转移到侧流条上。然而,在其他实施方式中,核酸到亲和配体的转化反应被集成到侧流条中。随后的配体结合测定被集成到侧流条中。亲和分子(例如官能化的金纳米粒子)与靶分子结合,并且复合物被第二亲和分子(例如抗体)捕获到检测区(例如测试线)。随后,通过肉眼经光学读出来检测相应分子的信号。在进一步的实施方式中,读出可以基于电化学检测或荧光检测或本领域技术人员已知的其他检测形式(例如光声检测等)进行。
微阵列是高通量平台,并行检测多个靶分子是其主要优势。为了同时检测靶核酸和靶分析物,可以将一种扩增引物和靶分析物的捕获分子固定在检测区上。在将样本和核酸到亲和配体的转化反应组分的混合物添加到微阵列后,该装置孵育足够的时间。在其他实施方式中,核酸到亲和配体的转化反应可以在分离的反应室内发生,并且随后将一定量的反应转移到微阵列的检测区。添加检测分子后,检测到相应的信号。
微流体平台提供一组流体单元操作,这组流体单元操作允许使生化测定小型化、集成化、自动化和并行化。可能的微流体平台包括但不限于压力驱动微流体、离心微流体、电动微流体和“微流体大规模集成”方法。多分析物测定的所有试剂都可以预先储存在微流体平台中。添加样本后,所有处理步骤均由微流控平台执行。预先储存的试剂被输送到反应/检测室中,这允许自动化的核酸到亲和配体的转化以及随后通过配体结合测定法检测靶分子。
在另一种优选的实施方式中,本发明涉及用于执行根据前述权利要求中任一项或多项的方法的试剂盒,该试剂盒包含:
·至少一组与靶核酸杂交的扩增引物,
·其中所述扩增引物中的至少一种包含第一亲和标记,
·任选的特异性探针,
·第二亲和标记,所述第二亲和标记与第二引物或与可与靶核酸杂交的特异性探针缔合,
·用于进行等温扩增反应的试剂,和
·亲和分子。
所述方法的所有优选实施方式也是试剂盒的优选实施方式。
优选地,试剂盒包含发生扩增反应的溶液,并且可以包括但不限于聚合酶、重组酶、核酸内切酶、扩增试剂、扩增子、缓冲剂、阳离子、dNTP和/或其他组分。
在另一种优选的实施方式中,本发明涉及根据前述权利要求中任一项或多项的方法或试剂盒在体外进行诊断、药物开发、食品安全或环境安全中的用途。
本发明特别有利于可能仅能获得有限的样本材料的情况下的药物开发。同时检测核酸和分析物使得能够分析基因表达调节以及相应的分析物产物。在食品安全方面,同时检测分析物和核酸也非常有益,因为可以检测微生物污染物以及过敏成分、毒素或其他生物分子污染物。
所描述的发明可用于预测或检测疾病、或确定疾病的易感性、或监测疾病的治疗、或诊断治疗反应。
通过本发明的方法可以检测多种感染性疾病。通常,这些是由细菌、寄生虫、真菌或病毒引起的。本发明可用于鉴定病原体以及宿主的炎性蛋白标志物以检测感染性疾病。这对于在时延敏感(time-critical)的感染中做出快速治疗决策或监测感染状态特别有益。
一个例子是同时检测细菌基因组DNA(例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)gDNA)和炎性细胞因子标志物(例如白细胞介素6)。病原体和细胞因子可以在体液如伤口液或痰液中检测到。在该具体的实施方式中,在细胞因子的存在下扩增细菌DNA,随后通过配体结合测定检测靶分子。
在其他实施方式中,本发明可用于检测病毒RNA以及针对病毒或特定病毒抗原的特定抗体以增加测试的可靠性。使用逆转录,将RNA转录成cDNA,随后进行扩增,并通过多分析物测定与特定抗体/抗原同时检测。可以在体液如脑脊液、痰液或其他拭子样本中一起检测病毒和特定抗体/抗原。
在其他实施方式中,本发明可用于癌症的诊断或分期。可以使用体液如血液来确定肿瘤标志物的存在和/或数量。本发明允许同时检测癌症类型或阶段所特定的靶分析物(如蛋白质、激素和酶)、以及靶核酸(如循环微RNA或ctDNA)。这使得能够进行例如早期诊断、治疗策略指导和癌症状态监测。
本发明的多分析物测定也可用于筛选药物,例如药物开发,或筛选药物开发的靶标。同时检测核酸和分析物使得能够分析途径和基因表达调节以及相应的蛋白质。
本发明的多分析物测定也可用于食品安全领域。在食品安全方面,同时检测分析物和核酸可以非常有益,因为可以检测微生物污染物以及过敏成分、毒素或其他生物分子污染物。
本发明的一个主要优势是方法的灵活性。
另一个优势是,多分析物测定所需的所有组分均有市售,并且该测定不需要复杂的设计步骤(例如,使用寡核苷酸序列对抗体进行官能化或设计复杂的引物和探针系统)。由于该测定易于实施并且可以根据特定需求灵活定制,因此可以快速集成。
本发明引入了多重检测的新维度,使得能够对不同分子类别进行多重检测,并允许检测所有可通过配体结合测定来检测的分子。
本发明允许在大规模实验室自动化设备上快速轻松地适应该技术,以及将其集成到小型专用现场即时(point-of-care)护理装置中。
本发明(方法、试剂盒和用途)在许多应用中都是有利的。在单个步骤中同时检测几类、优选至少两类分子,一直是一个长期需要的目标。本发明可用于通过DNA分析以及宿主的炎性蛋白标志物来识别病原体,以检测感染性疾病。本发明具有巨大的影响,特别是对于在时延敏感的感染中做出快速治疗决策,因为没有时间遵循不同的测定方案和分析方法。与现有技术相比,使用本发明的新方法可以更快地获得具有关于病原体和宿主炎症的所有重要信息的生物分析结果。
专利和非专利文献的所有引用文件均通过引用整体并入本文。
附图和实施例
在关于实施例描述本发明之前,应理解本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的,而不旨在限制本发明的范围。
实施例:同时检测细菌基因组DNA和炎性细胞因子标志物。
同时检测病原体和炎性细胞因子使得能够同时考虑来自一个样本的感染和宿主反应。这对于在时延敏感的(time-critical)感染中做出快速治疗决策、监测感染状态或个性化治疗特别有益。例如,示出了同时检测铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa/P.aeruginosa)的基因组DNA(gDNA)与急性标志物白细胞介素6(IL-6)的组合。
核酸到亲和配体的转化描述了用标记对扩增的靶核酸序列进行官能化,以便随后使用相同的测量原理检测靶分析物和靶核酸。因此,我们的多分析物测定能够使用相同的测量原理同时检测靶分析物和靶核酸。在此特定实施例中,RPA用于在存在IL-6的情况下扩增和标记铜绿假单胞菌的gDNA。随后,通过在微量滴定板孔内进行夹心免疫测定来检测两种分析物。
此特定实施例中的引物和探针被设计为靶向铜绿假单胞菌LasB基因的高度保守区域。所用引物和探针的序列如表1所示。一组LasB特异性引物(LasB-fwd和LasB-rev引物)和探针(LasB-探针)产生单标记(洋地黄毒苷)的大小为161bp的产物和双标记(洋地黄毒苷和生物素)的大小为123bp的产物。通过配体结合测定仅检测双标记产物。
RPA使用nfo试剂盒(TwistDx)在50μl体积中进行。简言之,将29.5μl1×再水化缓冲液与1.25μl LasB-fwd引物(10μM)、1.25μl LasB-rev引物(10μM)和1.2μlLasB-探针(10μM)混合。随后,将6μl样本(含有基因组DNA和IL-6)和8.3μl ddH2O添加到反应混合物中。接下来,添加反应沉淀物和2.5μl醋酸镁(280nM),然后立即将试管置于37℃的块状加热器上持续15分钟。
随后,将RPA反应在100μl测定缓冲液(1xPBS,0.1%BSA)中以1:10稀释,并添加到包被有4μg/ml抗1L6抗体和4μg/ml链霉亲和素的微量滴定板中。微量滴定板预先用含有5%BSA的PBS封闭。将标记的靶DNA和靶分析物在室温下孵育1小时后,用含有0.05%吐温20的PBS洗涤微量滴定板3次。随后,通过抗洋地黄毒苷抗体缀合的荧光微球和抗IL6抗体缀合的荧光微球来检测靶分子。因此,将100μl的每种缀合荧光微球(75μg/ml)添加到微量滴定板中并在室温下孵育1小时。再次,用含有0.05%吐温20的PBS洗涤微量滴定板3次。最后,将100μl PBS添加到微量滴定板中,并通过商业微量滴定板读板器检测每个靶分子的荧光信号(图2)。
在不同的实施例中,IL-6和铜绿假单胞菌gDNA是通过侧流分析检测的(图3)。
表1
表1显示了用于同时检测铜绿假单胞菌gDNA和IL-6的引物和探针序列。
SEQ ID No.1GAGAATGACAAAGTGGAACTGGTGATCCGCCTG
SEQ ID No.2GCCAGGCCTTCCCACTGATCGAGCAC TTCGCCG
SEQ ID No.3GAACAACATCGCCCAACTGGTCTACAACGTTCCTACCTGATTCCC
图1显示了常规检测多个靶分子与一次性地从一个样本同时检测多个靶分子的对比。(上图)常规检测多个靶分子。(下图)通过根据本发明的多分析物测定同时检测靶分子。
图2显示了在微量滴定板内同时检测铜绿假单胞菌gDNA和IL-6。
图3显示了通过侧流测定同时检测铜绿假单胞菌gDNA和IL-6。
参考文献
Cook,Damon B.;McLucas,Brian C.;Montoya,Leticia A.;Brotski,Chris M.;Das,Shelley;Miholits,Markus;Sebata,Thao H.(2019):在单个Luminex平台上多重测量蛋白质和基因水平(Multiplexing protein and gene level measurements an a singleLuminex platform).Methods(San Diego,Calif.)158,S.27-32.DOI:10.1016/j.ymeth.2019.01.018。
Darmanis,Spyros;Gallant,Caroline Julie;Marinescu,Voichita Dana;Niklasson,Mia;Segerman,Anna;Flamourakis,Georgios等人(2016):单细胞中RNA和蛋白质的同时多重测量(Simultaneous Multiplexed Measurement of RNA and Proteins inSingle Cells).Cell reports 14(2),S.380-389.DOI:10.1016/j.celrep.2015.12.021。
Delley,Cyrille L.;Liu,Leclian;Sarhan,Maen F.;Abate,Adam R.(2018):结合适体和单细胞转录组测序(Combined aptamer and transcriptome sequencing ofsingle cells).Scientific reports 8(1),S.2919.DO1:10.1038/s41598-01821153-y。
Frei,Andreas P.;Bava,Felice-Alessio;Zunder,Eli R.;Hsieh,Elena W.Y.;Chen,Shih-Yu;Nolan,Garry P.;Gherardini,Pier Federico(2016):高度多重同时检测单细胞中的RNA和蛋白质(Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs andproteins in single cells).Nat Methods 13(3),S.269-275.DOI:10.1038/nmeth.3742。
Geiss,Gary K.;Bumgamer,Roger E.;Birditt,Brian;Dahl,Timothy;Dowidar,Naeem;Dunaway,Dwayne L.等人.(2008):用颜色编码的探针对直接多重测量基因表达(Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probepairs).Nature biotechnology 26(3),S.317-325.DO1:10.1038/nbt1385。
Gong,Haibiao;Wang,Xiaohui;Liu,Benjamin;Boutet,Stephane;Holcomb,Ilona;Dakshinamoorthy,Gajalakshmi等人.(2017):通过多重双分析物联合检测实现的单细胞蛋白质-mRNA相关分析(Single-cell protein-mRNA correlation analysis enabled bymultiplexed dual-analyte co-detection).Scientific reports 7(1),S.2776.DOI:10.1038/S41598-017-03057-5。
Katja Niemann,Vicky Trager(2015):核酸的等温扩增和定量及其在微系统中的应用(Isothermal Amplification and Quantification ofNucleic Acids and its Usein Microsystems).J Nanomed Nanotechnol 06(03).DOI:10.4172/2157-7439.1000282。
Mao,Xun;Gurung,Anant;Xu,Hui;Baloda,Meenu;He,Yuqing;Liu,Guodong(2014):使用金纳米粒子和侧流装置同时检测核酸和蛋白质(Simultaneous Detection ofNucleicAcid and Protein Using Gold Nanoparticles and Lateral Flow Device).Analyticalsciences:the international Journal of the Japan Society for AnalyticalChemistry 30(6),S.637-642。
Mohan,Ruchika;Mach,Kathleen E.;Bercovici,Moran;Pan,Ying;Dhulipala,Lakshmi;Wong,Pak Kin;Liao,Joseph C.(201 1):用于尿路感染诊断的电化学生物传感器阵列上集成核酸和蛋白质检测的临床验证(Clinical validation of integratednucleic acid and protein detection on an electrochemical biosensor array forurinary tract infection diagnosis).PloS one 6(10),e26846.DOI:10.1371/journal.pone.0026846。
Naik,Priyanka;Manna,Riddha;Paul,Debjani(2019):纸质基质上的核酸扩增(Nucleic Acid Amplification on Paper Substrates).Shantanu Bhattacharya,SanjayKumar und Avinash K.Agarwal(Hg.):Paper Microfluidics,Bd.43.Singapore:SpringerSingapore(Advanced Functional Materials and Sensors),5.115-146。
Ooi,Aik T.;Ruff,David W.(2019):同时靶向检测单细胞中的蛋白质和RNA(Simultaneous Targeted Detection of Proteins and RNAs in Single Cells).Methods in molecular biology(Clifton,N.J.)1979,S.379-392.DOI:10.1007/978-1-4939-9240-9_22。
Peterson,Vanessa M.;Zhang,Kelvin Xi;Kumar,Namit;Wong,Jerelyn;Li,Lixia;Wilson,Douglas C.等人.(2017):单细胞中蛋白质和转录物的多重定量(Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells).Nature biotechnology 35(10),S.936-939.D01:10.1038/nbt.3973。
Schulz,Daniel;Zanotelli,Vito Riccardo Tomaso;Fischer,Jana Raja;Schapiro,Denis;Engler,Stefanie;Lun,Xiao-Kang等人.(2018):通过质谱流式细胞术对乳腺癌组织样本中的mRNA和蛋白质进行亚细胞分辨率的同时多重成像(SimultaneousMultiplexed Imaging of mRNAand Proteins with Subcellular Resolution in BreastCancer Tissue Samples by Mass Cytometry).Cell systems 6(1),25-36.e5.DOI:10.1016/j.cels.2017.12.001。
Scott,Alexander W.;Garimella,Viswanadham;Calabrese,Colin M.;Mirkin,Chad A.(2017):用于同时检测核酸和蛋白质的通用生物素-PEG连接的金纳米粒子探针(Universal Biotin-PEG-Linked Gold Nanoparticle Probes for the SimultaneousDetection of Nucleic Acids and Proteins).In:Bioconjugate chemistry 28(1),S.203-211.DO1:10.1021/acs.bioconjchem.6b00529。
Stoeckius,Marion;Hafemeister,Christoph;Stephenson,William;Houck-Loomis,Brian;Chattopadhyay,Pratip K.;Swerdlow,Harold等人.(2017):单细胞中的同时表位和转录组测量(Simultaneous epitope and transcriptome measurement insingle cells).Nature methods 14(9),5.865-868.DO1:10.1038/nmeth.4380。
Todorovic,Vesna(2017):单细胞RNA-seq-现在与蛋白质一起(Single-cell RNA-seq—now with protein).Nat Methods 14(1 1),5.1028-1029.DOI:10.1038/nmeth.4488。
Ullal,Adeeti V.;Peterson,Vanessa;Agasti,Sarit S.;Tuang,Suan;Juric,Dejan;Castro,Cesar M.;Weissleder,Ralph(2014):通过条形码分析癌细胞可以在细针穿刺液中进行多重蛋白质分析(Cancer cell profiling by barcoding allowsmultiplexed protein analysis in fine-needle aspirates).Science transiationalmedicine 6(219),219ra9.D01:10.1126/scitranslmed.3007361。
Warren,Sarah(2018):在平台上同时多重检测RNA和蛋白质(Simultaneous,Multiplexed Detection of RNA and Protein an thePlatform).Methods in molecular biology(Clifton,N.J.)1783,S.105-120.D01:10.1007/9781-4939-7834-2_5。
Claims (15)
1.一种检测来自一个样本的至少两种不同靶分子是否存在的方法,其中至少一种靶分子是感兴趣的靶分析物并且至少一种其他靶分子是感兴趣的靶核酸,所述方法包括:
·进行等温扩增反应,包括:
○使待分析至少一种靶核酸和/或至少一种靶分析物是否存在的样本与至少一组扩增引物接触,
○其中两种扩增引物可以与所述靶核酸杂交,
○其中所述扩增引物中的至少一种包含第一亲和标记,
○其中第二亲和标记以可以被掺入到靶核酸的扩增子中的方式提供,
·同时进行配体结合测定,其中使用亲和分子,所述亲和分子可以通过信号生成来捕获和检测靶分析物和/或标记的靶核酸的存在,
·检测所述靶分析物和/或靶核酸是否存在。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,扩增所述靶核酸,并且至少将所述第一亲和标记和所述第二亲和标记同时引入到扩增的靶核酸中。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,提供了特异性探针,所述特异性探针与位于至少两个扩增引物杂交位点之间的序列杂交,并且
其中,所述特异性探针包含第二亲和标记。
4.根据前述权利要求所述的方法,其中,所述等温扩增反应产生被所述特异性探针识别的第一单标记产物,所述特异性探针与位于至少两种扩增引物之间的序列杂交,从而产生第二双标记产物。
5.根据前述权利要求中任一项或多项所述的方法,
其中,第二标记不同于第一标记。
6.根据前述权利要求中任一项或多项所述的方法,其中,所述靶核酸的信号是通过亲和分子结合亲和标记生成的。
7.根据前述权利要求中任一项或多项所述的方法,其中,所述靶核酸是DNA分子,优选是ssDNA、dsDNA、cDNA、rDNA、mtDNA、cpDNA或质粒DNA;
RNA分子,优选是mRNA、循环RNA、miRNA、snRNA、snoRNA、rRNA、tRNA、asRNA、circRNA、hnRNA、siRNA、shRNA、snoRNA、snRNA、IncRNA、piRNA或tracrRNA。
8.根据前述权利要求中任一项或多项所述的方法,其中,所述靶分析物是蛋白质、肽、抗体、激素、酶、小分子、碳水化合物或任何其他物质,但不是核酸。
9.根据前述权利要求中任一项或多项所述的方法,其中,所述样本没有被拆分并且不需要单独的测定程序和/或方案。
10.根据前述权利要求中任一项或多项所述的方法,其中,所述等温扩增反应发生在与分析物兼容的条件下。
11.根据前述权利要求中任一项或多项所述的方法,其中,所述第一标记是亲和标签,优选是生物素、FAM、洋地黄毒苷或二硝基苯(DNP)、四甲基罗丹明(TAMRA)、德州红、级联蓝、链霉亲和素和衍生物、Cy5、丹酰、荧光素、叠氮化物、炔烃或其他生物正交官能团和/或标签。
12.根据前述权利要求3至11中任一项或多项所述的方法,其中,所述特异性探针还包含至少一个功能位点,优选无碱基残基或聚合酶延伸阻断基团。
13.根据前述权利要求中任一项或多项所述的方法,其中,所述亲和分子是抗体、适体、官能团、蛋白质、配体结合聚合物结构、可包含官能团的(大)分子和/或分子印记聚合物(MIP),和/或其中,信号传递工具、优选标志物与亲和分子相连。
14.一种用于实施根据前述权利要求中任一项或多项所述的方法的试剂盒,所述试剂盒包含:
·至少一组与靶核酸杂交的扩增引物,
·其中所述扩增引物中的至少一种包含第一亲和标记,
·任选的特异性探针,所述特异性探针可以与所述靶核酸杂交,
·与第二引物或所述特异性探针缔合的第二亲和标记,
·用于进行等温扩增反应的试剂,和
·亲和分子。
15.根据前述权利要求中任一项或多项所述的方法或试剂盒用于在体外诊断、药物开发、食品安全或环境安全中的用途。
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