KR20230057233A - 표적 rna 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하는 방법 및 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생체 유래 샘플내에서 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하는 방법 및 이 방법에 사용되는 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 생체 유래 샘플내에서 표적 RNA 분자를 검출하는 방법, 표적 RNA 분자를 다중 검출하는 방법 및 이에 사용되는 키트에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 높은 민감도로 생체 유래 샘플에서 RNA 분자와 단백질 분자를 단일의 플랫폼에서 동시에 검출할 수 있다. 본 발명의 키트는 발색신호를 검출하는 고상지지체 기반의 LFA (Lateral Flow Assay) 형태로 제작될 수 있어 현장 진단에 적합하다.
Description
본 발명은 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하는 방법, 표적 RNA 분자 검출하는 방법, 표적 RNA 분자를 다중 검출하는 방법 및 이 방법에 사용되는 키트에 관한 것이다.
전통적인 조직 검사와 달리 혈액 등의 체액 검사를 이용한 암 액체생검 (Liquid biopsy)법은 비침습적이고 경제적이므로 암 검진에 대한 사회적 비용을 낮출 수 있다. 또한, 암의 진행 및 전이 등에 대한 상세한 관찰이 가능하고, 정밀-표적 항암 치료에 사용될 수 있기 때문에 암 치료를 위한 차세대 전략으로 떠오르고 있다. 액체생검을 위한 대표적인 바이오 마커인 엑소좀은 체액 내 순환하는 작은 소포체로, 유래된 부모세포와 유사한 유전 및 단백질 정보를 포함한다. 구조적으로 안정하며 혈액 내 풍부한 양(1012 particles/mL)으로 존재한다는 장점이 있어 가장 유망한 바이오 마커로 주목받고 있다.
현재 대부분의 엑소좀 분석 기술들은 엑소좀 핵산 또는 단백질 중 한 가지 만을 분석하는 기술이며, 엑소좀의 핵산 및 단백질의 바이오 마커를 동시에 분석하는 시스템의 개발은 이루어지지 않았다.
핵산을 검출하기 위한 가장 일반적인 기술은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)이다. 서멀 사이클링(thermal cycling)을 통해 표적 물질을 증폭하는 기술로, 적은 양의 표적 물질을 검출할 수 있어 다양한 표적 검출에 적용되고 있다. 대부분의 일반적인 PCR에서 검출하고자 하는 표적 물질은 DNA (deoxyribose nucleic acid)이다. PCR에서 표적 물질이 RNA (ribose nucleic acid)인 경우 이를 cDNA (complementary DNA)로 역전사한 후, cDNA에 대해 PCR을 진행하는 역전사 중합효소연쇄반응(Reverse transcription PCR, RT-PCR)이 필요하다.
효소결합면역흡착검사(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)는 항원-항체 반응 후, 항체에 결합된 효소의 효소-기질 반응을 통해 신호를 확인하는 기술인데, 항원인 표적 단백질을 검출하는 데 이용된다. 효소-기질 반응의 한계 때문에 저농도의 표적 물질 검출에는 적합하지 않다. Immuno-PCR은 효소 대신 DNA가 결합된 항체를 사용하고 이를 PCR로 신호를 증폭함으로써 ELISA보다 우수한 민감도를 가진다.
측방유동검사(Lateral Flow Assay, LFA)란 특수하고 고가의 장비 없이 액체 샘플에서 표적 물질을 간단하게 확인하기 위한 기술이다. LFA는 민감도가 좋지 않기 때문에 PCR 등 신호증폭 과정을 수반하는 경우가 많다. 일반적으로, 말단이 저분자 항원인 합텐(hapten)으로 변형된 PCR 프라이머를 사용한다. 변형된 PCR 프라이머로 증폭된 PCR 증폭산물은 LFA strip에 고정된 항체와 결합하면 발색 신호를 발생시킨다. 프라이머 변형에 사용될 수 있으면서 항체와 결합할 수도 있는 합텐의 종류가 적기 때문에 다중검출 적용에 제한적이다.
본 발명자들은 표적 RNA 분자 및 표적 단백질 분자를 동시에 검출하는 방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 역전사 반응, 항체 반응, DNA 태그의 항체로의 결합 반응 및 비대칭 증폭 반응을 통해 비대칭 증폭산물을 수득한 후에, 수득된 비대칭 증폭산물내에 포함된 증폭된 표적 올리고뉴클레오티드를 고상 지지체에 고정화된 캡처 프로브를 사용하여 검출함으로써, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질 분자를 동시에 효과적으로 검출할 수 있음을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.
또한, 본 발명자들은 단일의 표적 RNA 분자 또는 다중의 표적 RNA 분자를 단일의 고상 지지체상에 다중 검출할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 표적 RNA 분자 및 표적 단백질 분자를 동시에 검출하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 표적 RNA 분자 및 표적 단백질 분자를 동시에 검출하는 키트를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 표적 RNA 분자 검출하는 방법 또는 표적 RNA 분자를 다중 검출하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 표적 RNA 분자를 검출하기 위한 키트 또는 표적 RNA 분자를 다중 검출하기 위한 키트를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 일 측면은 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 표적 RNA 분자 검출하는 방법 또는 표적 RNA 분자를 다중 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 표적 RNA 분자를 검출하기 위한 키트 또는 표적 RNA 분자를 다중 검출하기 위한 키트를 제공한다.
용어
본 명세서에서 용어 "증폭(amplification)"은 유전자 또는 유전자의 단편과 같은 핵산 분자의 카피(copy)수를 증가시키는 것을 의미한다. 증폭된 생성물은 증폭 산물(amplification product)로 지칭할 수 있다. 인 비트로 증폭의 예는 샘플내에서 핵산 분자에 프라이머가 혼성화되도록 허용되는 조건하에서 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍과 샘플(예컨대, 생물학적 샘플)이 접촉하도록 하여 행하는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 들 수 있다. 또한, 인 비트로 증폭 기술의 다른 예는 실시간(real-time) PCR, 정량 실시간(quantitative real-time) PCR, 역전사(reverse transcription) PCR(RT-PCR), 정량(quantitative) RT-PCR (qRT-PCR), 루프매개 등온증폭(loop-mediated isothermal amplification, LAMP); 역전사(reverse-transcription) LAMP (RT-LAMP); SDA(strand displacement amplification)(U.S. Pat. No. 5,744,311), RPA(recombinase polymerase amplification) 등을 들 수 있다.
본 명세서에서 용어 "프라이머(primer)"는 길이가 짧은 핵산분자로서, 일반적으로 10개의 뉴클레오티드 이상의 길이, 예를 들어 10-60, 15-50, 20-40, 20-50, 25-50, 또는 30-60 뉴클레오티드 길이를 갖는 DNA 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머는 핵산 혼성화에 의해 상보적인 표적 핵산(DNA 또는 RNA) 가닥에 어닐링(annealing) 되고, DNA 중합효소에 의해 표적 핵산 가닥을 따라 연장될 수 있다. 프라이머의 쌍 또는 프라이머 세트(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 이 이상의 프라이머들)이 PCR 또는 공지된 다른 핵산 증폭 방법, 예를 들어 실시간 PCR, 정량 실시간 PCR, 역전사 PCR(RT-PCR), 정량 RT-PCR (qRT-PCR), 루프매개 등온증폭(LAMP); 역전사 LAMP (RT-LAMP); SDA(strand displacement amplification)(U.S. Pat. No. 5,744,311), RPA(recombinase polymerase amplification)에 의해 표적 핵산을 증폭하는 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "상보적 서열"은 단일 가닥(single stranded) 핵산들의 염기가 서로 매칭 염기쌍을 형성하여 이중 가닥(double strand) 구조를 안정하게 형성할 수 있는 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 예를 들어, 5'-C-A-T-G-3'의 염기 서열에 대한 상보적 서열은 3'-G-T-A-C-5' 서열이 될 수 있다. 본 발명에서 상보적 서열은 100% 매칭되는 염기 서열 뿐만 아니라 염기 서열의 일부 매칭, 예를 들어 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 또는 75%가 매칭되더라도 이중 가닥 구조를 안정하게 형성할 수 있다면, 이러한 서열도 본 발명에서의 상보적 서열에 포함된다.
본 명세서에서 염기서열에 관해 설명하면서 사용되는 표현 "실질적으로 동일한 서열"은 양쪽 서열을 비교시 100% 동일한 염기서열 뿐만 아니라, 일부 서열이 미스매치되어 60%-99% 동일성 있는 염기서열, 구체적으로 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 또는 60%의 동일성 있는 염기서열도 모두 포함하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서 용어 "합텐(hapten)"은 고분자에 결합되었을 때에 면역반응을 일으킬 수 있는 저분자 물질을 의미하며, 특히, 본 발명에서 합텐은 프라이머의 5'-말단 또는 프라이머 내부의 염기에 결합될 수 있고, 결합된 합텐은 다른 분자와의 결합을 유도할 수 있다. 예를 들어, 상기 결합을 유도하는 다른 분자는 신호발생분자일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "바코드(barcode) 서열"은 검출하려는 표적 RNA 분자 또는 단백질 분자에 따라 서로 다르게 특이적으로 부여하는 임의의 염기 서열을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "접촉(contacting)"은 2가지 이상의 성분 또는 분자들을 고체 또는 액체 형태에서 직접적인 물리적 결합 상태에 두는 것을 의미한다. 예를 들어, 이러한 접촉은 하나 이상의 프라이머와 핵산을 포함하는 인 비트로 반응 조성물내에서, 항체와 항원을 포함하는 인 비트로 반응 조성물내에서, 상보적 서열을 포함하는 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 인 비트로 반응 조성물내 또는 특이적 상호결합이 가능한 2 가지 이상의 분자를 포함하는 인 비트로 반응 조성물내에서 발생할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "생물학적 샘플(biological sample)"은 인간 또는 인간을 제외한 동물 등의 대상체(subject)로부터 얻어진 샘플로서, 예를 들어, 유체, 세포 및/또는 조직 샘플을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 생물학적 샘플은 유체 샘플일 수 있으며, 혈장, 소변, 혈액, 혈청, 분변, 타액, 뇌척수액, 또는 기관지폐포세척액일 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 생물학적 샘플은 엑소좀을 포함하는 샘플일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 단백질 분자를 의미하며, 그 예로, 단일클론항체, 다클론항체, 전장항체 (full-length antibody) 및 항체 단편(예컨대, scFv)을 모두 포함할 수 있다. 또한, 상기 항체는 이가 또는 이중 특이성 분자 (예컨대, 이중특이성 항체), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody) 또는 테트라바디(tetrabody)를 포함할 수 있다. 상기 항체는 완전한 형태의 항체인 전장항체 뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
본 발명에서 항체는 단일클론항체일 수 있으며, 단일클론항체는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 본 발명에서 용어, "전장항체"는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마 (γ), 뮤 (μ), 알파 (α), 델타 (δ) 및 엡실론 (ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1 (γ1), 감마2 (γ2), 감마3 (γ3), 감마4 (γ4), 알파1 (α1) 및 알파2 (α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파 (
) 및 람다 (
) 타입을 가진다. IgG는 아형 (subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
본 발명에서 용어, "단편", "항체 단편" 및 "항원 결합 단편"은 항체의 항원결합 기능을 보유하는 본 발명의 항체의 임의의 단편을 지칭하는 것으로 호환적으로 사용된다. 예시적인 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb, Fd, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일-쇄 항체(scFv), 2가 단일-쇄 항체, 단일-쇄 파지 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 폴리펩티드로의 특정 항원에 결합하기에 충분한 이뮤노글로블린의 하나 이상의 단편을 함유하는 폴리펩티드 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
검출 방법
본 발명의 일 측면은 다음의 단계를 포함하는 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 검출하고자 하는 표적 RNA 분자가 포함된 것으로 추정되는 생물학적 샘플을 상기 표적 RNA 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 서열을 포함하는 역전사(reverse transcription)용 프라이머가 포함된 반응액에 첨가하여 역전사 반응을 수행하는 단계;
(b) 상기 역전사 반응 생성물을, 제1의 바코드(barcode) 서열을 포함하는 전방향 프라이머(forward primer) 및 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 과량의 유니버설 역방향 프라이머(universal reverse primer)가 포함된 반응액에 첨가하여 비대칭 증폭 반응(asymmetric amplification reaction)을 수행하는 단계;
(c) 검출하고자 하는 표적 단백질이 포함된 것으로 추정되는 생물학적 샘플을 고상 지지체에 가하여 상기 표적 단백질을 상기 고상 지지체상에 고정화하는 단계;
(d) 상기 고상 지지체에 상기 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 접촉시키는 단계;
(e) 상기 항체를 접촉시킨 고상 지지체에, 상기 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 태그(tag)를 접촉시키는 단계로서, 상기 DNA 태그는 제2의 바코드(barcode) 서열, 유니버설 전방향 프라이머(universal forward primer) 서열과 동일한 서열, 및 유니버설 역방향 프라이머 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것인 단계;
(f) 상기 DNA 태그를 회수하는 단계;
(g) 상기 회수한 DNA 태그를, 유니버설 전방향 프라이머 및 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 과량의 유니버설 역방향 프라이머가 포함된 반응액에 첨가하여 비대칭 증폭 반응(asymmetric amplification reaction)을 수행하는 단계;
(h) 상기 단계 (b)의 비대칭 증폭 산물을 상기 제1의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 제1의 캡처 프로브가 고정화된 고상 지지체에 가하여 반응시키고, 상기 단계 (g)의 비대칭 증폭산물을 상기 제2의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 제2의 캡처 프로브가 고정화된 고상 지지체에 가하여 반응시키는 단계; 및
(i) 상기 반응시킨 단계 (h)의 고상 지지체에 상기 합텐(hapten)에 결합할 수 있는 신호발생분자를 접촉시키는 단계.
단계 (a): 검출하고자 하는 표적 RNA 분자가 포함된 것으로 추정되는 생물학적 샘플을 상기 표적 RNA 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 서열을 포함하는 역전사(reverse transcription)용 프라이머가 포함된 반응액에 첨가하여 역전사 반응을 수행하는 단계
본 발명의 역전사 반응은 역전사용 프라이머 및 역전사 효소를 포함하는 역전사 반응액에 표적 RNA 분자가 포함될 것으로 추정되는 생물학적 샘플을 가하여, 공지된 역전사 반응조건 하에서 수행할 수 있다.
상기 표적 RNA 분자는 역전사 반응의 주형(template)로 작용한다.
상기 표적 RNA 분자는 생물학적 샘플로부터 얻어지는 RNA 분자이면 제한없이 이용될 수 있으며, 예를 들어 miRNA, snRNA, siRNA 및 mRNA를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 역전사용 프라이머는 검출하고자 하는 표적 RNA 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 서열을 포함한다.
본 발명의 역전사용 프라이머는 표적 RNA 분자에 특이적으로 결합하여 역전사를 개시할 수 있다.
일 구현예에서, 역전사용 프라이머는 표적 RNA 분자의 서열에 대해 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 역전사용 프라이머의, 표적 RNA 분자의 서열에 대해 상보적인 서열은 역전사용 프라이머의 3'-말단 쪽에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 역전사용 프라이머는 프라이머내에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이룰 수 있는 상보적 서열을 프라이머내에 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 역전사용 프라이머는 프라이머내에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 역전사용 프라이머로부터 역전사 반응이 수행되면 역전사 반응 생성물이 생성된다.
본 발명에서 "역전사 반응 생성물"은 상기 역전사용 프라이머가 역전사 반응에 의해 3'-말단으로부터 연장된 염기 서열을 더 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자를 의미한다.
상기 역전사 반응 생성물은 상기 역전사용 프라이머의 3'-말단으로부터 연장된, 주형 표적 RNA 분자의 서열에 상보적인 서열을 더 포함한다.
단계 (b): 상기 역전사 반응 생성물을, 제1의 바코드(barcode) 서열을 포함하는 전방향 프라이머(forward primer) 및 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 과량의 유니버설 역방향 프라이머(universal reverse primer)가 포함된 반응액에 첨가하여 비대칭 증폭 반응(asymmetric amplification reaction)을 수행하는 단계.
역전사 반응을 수행한 역전사 반응 생성물을, 제1의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머 및 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 과량의 유니버설 역방향 프라이머가 포함된 반응액에 첨가하여 비대칭 증폭 반응을 수행한다.
본 발명에서 "바코드(barcode) 서열"은 검출하려는 표적 RNA 분자 또는 단백질 분자에 따라 서로 다르게 특이적으로 부여하는 임의의 염기서열을 의미한다.
본 발명에서 표적 RNA 분자에 특이적으로 부여하는 바코드 서열은 "제1의 바코드 서열"로 지칭하고, 표적 단백질 분자에 특이적으로 부여하는 바코드 서열은 "제2의 바코드 서열"로 지칭한다.
일 구현예에서, 상기 제1의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머는 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 역전사 반응 생성물에서, 전방향 프라이머의 서열과 상보적인 서열은, 단계 (a)에서 역전사 반응에 의해 역전사용 프라이머의 3'-말단으로부터 연장된 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 전방향 프라이머에서, 상기 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열은 전방향 프라이머의 3'-말단 쪽에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 전방향 프라이머에서, 상기 제1의 바코드 서열은 전방향 프라이머의 5'-말단 쪽에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다. 즉, 상기 역전사용 프라이머는 상기 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머의 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루는 서열과, 또는 이 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 "합텐으로 변형된 것"은 "합텐이 결합된 것"일 수 있다.
상기 "합텐(hapten)"은 유니버설 역방향 프라이머의 5'-말단 또는 프라이머 내부의 염기에 결합될 수 있고, 구체적으로 유니버설 역방향 프라이머의 5'-말단에 결합될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 합텐은 비오틴(biotin), FAM(fluorescein amidite), Alexa Fluor®, 또는 DIG(digoxigenin) 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 용어 "과량"은 비대칭 증폭 반응액내에서 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머의 양(또는 농도)이 제1 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머의 양(또는 농도)보다 더 많은 양(또는 농도)으로 존재한다는 것을 의미한다.
본 발명에서 증폭 반응액내에서, 역전사 반응 생성물에 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머를 제1 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머의 양보다 많은 양으로 접촉시켜 비대칭 증폭이 수행된다.
구체적으로 상기 "과량"은 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방항 프라이머의 양(또는 농도)가 제1 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머의 양(또는 농도)에 비해 2 - 40배, 3 - 40배, 4 - 40배, 5 - 40배, 2 - 35배, 3 - 35배, 4 - 35배, 5 - 35배, 2 - 35배, 3 - 35배, 4 - 35배, 5 - 35배, 2 - 30배, 3 - 30배, 4 - 30배, 또는 5 - 30배 많은 양(또는 농도)일 수 있으며, 구체적으로, 5-30배, 5-20배, 또는 5-10배 많은 양(또는 농도)일 수 있다.
일 구현예에서, 비대칭 증폭 반응에서 증폭 반응은 핵산을 증폭시킬 수 있는 반응이면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들어 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 루프매개 등온증폭(loop-mediated isothermal amplification, LAMP), 또는 RPA(recombinase polymerase amplification)를 사용할 수 있다.
단계 (c): 검출하고자 하는 표적 단백질이 포함된 것으로 추정되는 생물학적 샘플을 고상 지지체에 가하여 상기 표적 단백질을 상기 고상 지지체상에 고정화하는 단계
생물학적 샘플을 고상 지지체에 가함으로써 생물학적 샘플내에 존재하는 표적 단백질을 고상 지지체상에 고정화한다.
일 구현예에서, 상기 고상 지지체의 형태는 단백질이 안정적으로 고정화될 수 있는 형태이면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있다. 예를 들어 비드, 마이크로 비드, 플레이트, 마이크로 플레이트, 스트립, 스피어, 튜브의 형태일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 고상 지지체의 재질은 단백질이 안정적으로 고정화될 수 있는 재질이면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있다. 예를 들어, 합성 폴리머 또는 천연 폴리머 물질이 사용될 수 있고, 보다 구체적으로 스티렌, 스티렌 유도체, 디비닐벤젠, 아크릴아미드들, 아크릴레이트 에스테르류, 메타크릴레이트 에스테르류, 비닐 에스테르류, 비닐 아미드류를 포함하는 교차-연결된 합성 폴리머; 아가로오스, 알기네이트, 카라기난(carrageenan), 젤라틴, 셀룰로오스와 같은 천연 폴리머; 셀룰로오스 아세테이트, 니트로셀룰로오스, 실리카, 유리, 유리섬유 같은 유도체화된 천연 폴리머를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 고상 지지체에는 상기 표적 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 추가적으로 코팅된 것일 수 있다.
단계 (d): 상기 고상 지지체에 상기 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 접촉시키는 단계
표적 단백질이 고정화된 상기 고상 지지체에 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 접촉시킨다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 단계 (c) 이후 및 단계 (d)를 수행하기 전에 상기 고상 지지체를 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 단계 (c) 이후 및 단계 (d)를 수행하기 전에 상기 고상 지지체를 블로킹(blocking)하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단계 (d)의 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체는 상기 단계 (c)에서 고상 지지체에 코팅된 항체와 다른 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단계 (d)의 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체는 상기 단계 (c)에서 고상 지지체에 코팅된 항체와 표적 단백질에 결합하는 부위(에피토프)가 서로 다른 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단계 (d)의 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체는 후술하는 DNA 태그와의 결합을 위해 변형된 것일 수 있으며, 이러한 변형은 DNA 태그와의 결합이 가능한 변형이면 특별히 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 단계 (d)의 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체는 후술하는 DNA 태그와의 결합을 위해 비오틴이 결합된(biotinylated) 것일 수 있다.
일 구현예에서, 고상 지지체에 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 접촉시키는 단계 (d) 이후에, 고상 지지체를 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.
단계 (e): 상기 항체를 접촉시킨 고상 지지체에, 상기 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 태그(tag)를 접촉시키는 단계로서, 상기 DNA 태그는 제2의 바코드(barcode) 서열, 유니버설 전방향 프라이머(universal forward primer) 서열과 동일한 서열, 및 유니버설 역방향 프라이머 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것인 단계.
표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 접촉시킨 고상 지지체에 상기 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 태그를 접촉시켜, 항체와 DNA 태그와의 결합을 유도한다.
일 구현예에서, 상기 DNA 태그는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 DNA 태그는 상기 항체에 특이적으로 결합할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 DNA 태그는 링커를 통해 상기 항체에 특이적으로 결합할 수 있다.
상기 링커는 폴리뉴클레오티드인 DNA 태그를 상기 항체에 결합시킬 수 있는 물질이면 제한없이 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 DNA 태그는 5'-말단에 비오틴이 결합된(biotinylated) 것일 수 있다.
일 구현예에서, 5'-말단이 비오틴 결합된 DNA 태그와, 비오틴이 결합된 항체는 스트렙타비딘(streptavidin)에 의해 서로 결합될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단계 (e) 이전에, 상기 단계 (d)의 결과물에 스트렙타비딘(streptavidin)을 첨가하여 반응시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 고상 지지체에 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 접촉시키고, 고상 지지체를 세척한 후, 스트렙타비딘(streptavidin)을 첨가하여 반응시킬 수 있다.
상기 스트렙타비딘 매개에 의해, 상기 비오틴 결합된 항체와 비오틴 결합된 DNA 태그가 특이적으로 결합될 수 있다.
상기 DNA 태그는 제2의 바코드 서열, 유니버설 전방향 프라이머 서열과 동일한 서열 및 5’-말단이 합텐으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
본 발명에서 상기 제2의 바코드 서열은 표적 단백질 분자에 특이적으로 부여하는 임의의 서열을 의미한다.
본 발명에서 상기 유니버설 전방향 프라이머 및 5’-말단이 합텐으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 후술하는 단계 (g)에서 비대칭 증폭 반응에 사용되는 프라이머들을 의미한다.
일 구현예에서, 상기 DNA 태그에서 제2의 바코드 서열은 DNA 태그의 중앙에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 DNA 태그에서, 유니버설 전방향 프라이머 서열과 동일한 서열 및 유니버설 역방향 프라이머 서열에 상보적인 서열은 각각 DNA 태그의 서로 다른 양 말단 쪽에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 DNA 태그에서 유니버설 전방향 프라이머 서열과 동일한 서열은 DNA 태그의 5'-말단쪽에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 DNA 태그에서 유니버설 역방향 프라이머 서열에 상보적인 서열은 DNA 태그의 3'-말단쪽에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단계 (b)의 전방향 프라이머의 제1의 바코드 서열과 상기 단계 (e)의 제2의 바코드 서열은 서로 다른 서열을 포함할 수 있다.
단계 (f): 상기 DNA 태그를 회수하는 단계
상기 단계 (e) 이후에, 상기 항체에 결합된 DNA 태그를 회수한다.
DNA 태그를 회수하기 전에 항체에 DNA 태그를 접촉시킨 고상 지지체를 세척할 수 있다.
DNA 태그의 회수는 항체에 DNA 태그를 접촉시킨 고상 지지체를 열처리하여 행할 수 있으며, 열처리를 통해 항체와 DNA 태그와의 분리를 유도한다.
일 구현예에서, 상기 열처리는 80 - 98℃의 물에서 5-30분간 처리하는 것일 수 있다.
단계 (g): 상기 회수한 DNA 태그를, 유니버설 전방향 프라이머 및 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 과량의 유니버설 역방향 프라이머가 포함된 반응액에 첨가하여 비대칭 증폭 반응(asymmetric amplification reaction)을 수행하는 단계
상기 회수한 DNA 태그를, 유니버설 전방향 프라이머 및 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 과량의 유니버설 역방향 프라이머가 포함된 반응액에 첨가하여 비대칭 증폭 반응(asymmetric amplification reaction)을 수행한다.
본 발명에서 용어 "과량"은 비대칭 증폭 반응액내에서 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머의 양(또는 농도)이 유니버설 전방향 프라이머의 양(또는 농도)보다 더 많은 양(또는 농도)으로 존재한다는 것을 의미한다.
본 발명에서 비대칭 증폭 반응액내에서, 역전사 반응 생성물에 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머를 유니버설 전방향 프라이머의 양보다 많은 양(농도)로 접촉시켜 비대칭 증폭 반응이 수행된다.
상기 용어 "과량"은 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머의 양(또는 농도)가 유니버설 전방향 프라이머의 양(또는 농도)에 비해 2 - 40배, 3 - 40배, 4 - 40배, 5 - 40배, 2 - 35배, 3 - 35배, 4 - 35배, 5 - 35배, 2 - 35배, 3 - 35배, 4 - 35배, 5 - 35배, 2 - 30배, 3 - 30배, 4 - 30배, 또는 5 - 30배 많은 양(또는 농도)일 수 있으며, 구체적으로, 5-30배, 5-20배, 또는 5-10배 많은 양(또는 농도)일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 "합텐으로 변형된 것"은 "합텐이 결합된 것"일 수 있다.
상기 "합텐(hapten)"은 유니버설 역방향 프라이머의 5'-말단 또는 3'-말단에 결합될 수 있고, 구체적으로 유니버설 역방향 프라이머의 5'-말단에 결합될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 합텐은 비오틴(biotin), FAM(fluorescein amidite), Alexa Fluor®, 또는 DIG(digoxigenin) 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 단계 (g) 에서의 5’-말단이 합텐으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머와, 단계 (b)에서의 5’-말단이 합텐으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 동일한 서열을 포함하거나, 또는 서로 다른 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 단계 (g)에서의 유니버설 역방향 프라이머에 결합된 합텐과 단계 (b)에서의 유니버설 역방향 프라이머에 결합된 합텐은 서로 동일한 것이거나 또는 서로 다른 것일 수 있다.
일 구현예에서, 비대칭 증폭 반응에서 증폭 반응은 핵산을 증폭시킬 수 있는 반응이면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들어 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 루프매개 등온증폭(loop-mediated isothermal amplification, LAMP), 또는 RPA(recombinase polymerase amplification)를 사용할 수 있다.
단계 (h): 상기 단계 (b)의 비대칭 증폭 산물 및 상기 단계 (g)의 비대칭 증폭 산물을, 제1의 캡처 프로브 및 제2의 캡처 프로브가 고정화된 고상 지지체에 가하여 반응시키는 단계로서, 상기 제1의 캡처 프로브는 상기 제1의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하고, 상기 제2의 캡처 프로브는 상기 제2의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 것인, 단계
본 발명에서 상기 캡처 프로브는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명에서 제1의 캡처 프로브는 제1의 바코드 서열과 실질적으로 동일한서열을 포함하고, 제2의 캡처 프로브는 제2의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
상기 캡처 프로브는 3'-말단 또는 5'-말단에 아민기, 티올기, 비오틴기 등의 작용기를 포함할수 있다.
상기 캡처 프로브는 고상 지지체 표면에 고정화될 수 있으며, 상기 고상 지지체는 니트로셀룰로스(nitrocellulose), PES, 표면이 개질된 유리 슬라이드를 포함할 수 있다.
상기 캡처 프로브의 고정화 방법은 스트렙타비딘-비오틴 상호작용, UV 가교, 열처리 방법을 예로 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 (a)에서 생물학적 샘플내에 타겟 RNA 분자가 포함되어 있다면 상기 단계 (b)의 비대칭 증폭 반응의 증폭 산물은, 제1의 바코드 서열에 상보적인 서열을 갖고 5’-말단이 합텐으로 변형된 폴리뉴클레오티드를 포함하게 되고, 상기 제1의 바코드 서열에 상보적인 서열은 제1의 캡처 프로브에 결합되어 상기 폴리뉴클레오티드는 고상 지지체 상에 포획된다.
또한, 상기 단계 (c)에서 생물학적 샘플내에 표적 단백질이 포함되어 있다면 상기 단계 (h)의 비대칭 증폭 반응의 증폭 산물은 제2의 바코드 서열에 상보적인 서열을 갖고 5’-말단이 합텐으로 변형된 폴리뉴클레오티드를 포함하게 되고, 상기 제2의 바코드 서열에 상보적인 서열은 제2의 캡처 프로브에 결합되어 상기 폴리뉴클레오티드는 고상 지지체상에 포획된다.
일 구현예에서, 상기 제1의 캡처 프로브 및 상기 제2의 캡처 프로브는 단일한 고상 지지체상에 고정화된 것일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 제1의 캡처 프로브 및 상기 제2의 캡처 프로브는 단일의 고상 지지체상에서 서로 다른 영역에 각각 고정화된 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제1의 캡처 프로브 및 상기 제2의 캡처 프로브는 서로 다른 고상 지지체상에 각각 고정화된 것일 수 있다. 이 경우, 상기 단계 (b)의 비대칭 증폭 산물은 제1의 캡처 프로브가 고정화된 고상 지지체에 가하여 반응시키고, 상기 단계 (g)의 비대칭 증폭 산물은 제2의 캡처 프로브가 고정화된 고상 지지체에 가하여 반응시킨다.
일 구현예에서, 상기 제1의 캡처 프로브 및 상기 제2의 캡처 프로브가 고정화된 고상 지지체는 LFA (Lateral Flow Assay) 장치일 수 있다.
단계 (i): 상기 반응시킨 단계 (h)의 고상 지지체에 상기 합텐(hapten)에 결합할 수 있는 신호발생분자를 접촉시키는 단계
상기 합텐에 결합하여 신호를 발생시킬 수 있는 신호발생분자는 예를 들어, 금나노입자, 자성나노입자, 과산화효소, 형광물질, 발색효소 등의 자체의 색 또는 발색을 통해 신호를 발생할 수 있는 분자를 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 신호발생분자는 합텐과의 결합을 위해 변형된 것일 수 있다.
상기 합텐과 결합하기 위한 신호발생분자의 변형은 합텐의 분자 종류에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어 스트렙타비딘과의 결합, 비오틴과의 결합, 또는 합텐과 결합할 수 있는 항체와의 결합 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 합텐이 비오틴인 경우, 신호발생분자는 스트렙타비딘이 결합된 것일 수 있다. 이 경우 합텐과 신호발생분자간의 결합은 비오틴-스트렙타비딘간의 결합에 의해 행해질 수 있다.
일 구현예에서, 합텐이 FAM(fluorescein amidite), Alexa Fluor®, 또는 DIG(digoxigenin)인 경우, 신호발생분자는 항-FAM 항체, 항-Alexa 항체, 또는 항-DIG 항체가 결합된 것일 수 있다. 이 경우 합텐과 신호발생분자간의 결합은 상기 합텐과 이 합텐에 결합하는 항체들에 의해 매개된다.
신호발생분자에 의한 신호발생을 검출함으로써 샘플내에서의 표적 RNA 분자 및 표적 단백질의 존재 여부를 확인할 수 있다.
검출 키트
본 발명의 다른 측면은 다음의 제1 내지 제3의 컴포넌트 세트를 포함하는, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하기 위한 키트를 제공한다:
(a) 다음의 성분을 포함하는 표적 RNA 분자 증폭용 제1 컴포넌트 세트;
(i) 표적 RNA 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 서열을 포함하는 역전사(reverse transcription)용 프라이머;
(ii) 제1의 바코드(barcode) 서열을 포함하는 전방향 프라이머; 및
(iii) 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머;
(b) 다음의 성분을 포함하는 표적 단백질에 연관된 DNA 태그(tag) 서열 증폭용 제2 컴포넌트 세트;
(i) 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체;
(ii) 제2의 바코드(barcode) 서열, 유니버설 전방향 프라이머 서열과 동일한 서열, 및 유니버설 역방향 프라이머 서열에 상보적인 서열을 포함하는, 상기 항체에 결합할 수 있는 DNA 태그;
(iii) 유니버설 전방향 프라이머; 및
(iv) 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머; 및
(c) 다음의 성분을 포함하는 고상 검출용 제3 컴포넌트 세트;
(i) 상기 제1의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 제1의 캡처 프로브 및 상기 제2의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 제2의 캡처 프로브가 고정된 고상 지지체; 및
(ii) 상기 합텐(hapten)에 결합하여 신호를 발생할 수 있는 신호발생분자.
제1 컴포넌트 세트
본 발명에서 상기 제1 컴포넌트 세트의 역전사용 프라이머는 검출하고자 하는 표적 RNA 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 역전사용 프라이머는, 표적 RNA 분자의 서열에 대해 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 역전사용 프라이머의, 표적 RNA 분자의 서열에 대해 상보적인 서열은 역전사용 프라이머의 3'-말단 쪽에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 역전사용 프라이머는 프라이머내에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이룰 수 있는 상보적 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 역전사용 프라이머로부터 역전사 반응이 수행되면 역전사 반응 생성물이 생성된다.
본 발명에서 용어 "역전사 반응 생성물"은 상기 역전사용 프라이머가 역전사 반응에 의해 3'-말단으로부터 연장된 서열을 더 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다.
상기 역전사 반응 생성물은 상기 역전사용 프라이머의 3'-말단으로부터 연장된, 주형인 표적 RNA 분자의 서열에 상보적인 서열을 더 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제1의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머는 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 전방향 프라이머에서 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열은 상기 전방향 프라이머의 3'-말단 쪽에 위치할 수 있다.
상기 제1의 바코드 서열은 표적 RNA 분자에 특이적으로 부여하는 임의의 서열을 의미한다.
상기 용어 "바코드 서열"에 관한 내용을 상술한 본 발명의 검출방법에서 설명된 내용과 동일하므로 이를 원용하며 중복하여 설명하지 않는다.
일 구현예에서, 상기 전방향 프라이머에서 제1의 바코드 서열은 전방향 프라이머의 5'-말단 쪽에 위치할 수 있다.
일 구현예에서 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다. 즉, 상기 역전사용 프라이머는 상기 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머의 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 스템-루프(stem-loop) 구조 이루는 서열과, 또는 이 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 "합텐으로 변형된 것"은 "합텐이 결합된 것"일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 합텐은 비오틴(biotin), FAM(fluorescein amidite), Alexa Fluor®, 또는 DIG(digoxigenin) 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
제2 컴포넌트 세트
본 발명에서 제2 컴포넌트 세트와 관련하여 사용된 용어 "표적 단백질에 연관된 DNA 태그(tag)"는 표적 단백질이 존재하는 경우, 이를 검출할 수 있는 DNA 태그를 의미하며, 구체적으로는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 분자를 의미한다.
일 구현예에서, 상기 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체는 DNA 태그와의 결합을 위해 변형된 것일 수 있다.
구체적인 일 구현예에서, 상기 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체는 DNA 태그와의 결합을 위해, 비오틴이 결합된(biotinylated) 것일 수 있다.
상기 DNA 태그는 상기 항체에 특이적으로 결합할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 DNA 태그는 5'-말단에 비오틴이 결합된(biotinylated) 것일 수 있다.
상기 제2의 바코드 서열은 표적 단백질 분자에 특이적으로 부여하는 임의의 서열을 의미한다.
일 구현예에서, 상기 DNA 태그에서 제2의 바코드 서열은 DNA 태그의 중앙에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제2 컴포넌트 세트의 DNA 태그에서, 유니버설 전방향 프라이머 서열과 동일한 서열 및 유니버설 역방향 프라이머 서열에 상보적인 서열은 각각 DNA 태그의 서로 다른 양 말단 쪽에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 DNA 태그에서 유니버설 전방향 프라이머 서열과 동일한 서열은 DNA 태그의 5'-말단 쪽에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 DNA 태그에서 유니버설 역방향 프라이머 서열에 상보적인 서열은 DNA 태그의 3'-말단 쪽에 위치할 수 있다.
제3 컴포넌트 세트
일 구현예에서, 상기 제1의 캡처 프로브 및 제2의 캡처프로브는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 캡처 프로브는 3'-말단 또는 5'-말단에 아민기, 티올기, 비오틴기 등의 작용기를 포함할수 있다.
상기 캡처 프로브는 고상 지지체 표면에 고정화될 수 있으며, 상기 고상 지지체는 니트로셀룰로스(nitrocellulose), PES, 표면이 개질된 유리 슬라이드를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제1의 캡처 프로브 및 상기 제2의 캡처 프로브는 서로 다른 고상 지지체상에 고정화된 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제1의 캡처 프로브 및 상기 제2의 캡처 프로브는 동일한 단일의 고상 지지체상에 고정화된 것일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 제1의 캡처 프로브 및 상기 제2의 캡처 프로브는 동일한 단일의 고상 지지체상의 서로 다른 영역에 분리되어 고정화된 것일 수 있다.
상기 합텐에 결합하여 신호를 발생시킬 수 있는 신호발생분자는 예를 들어, 금나노입자, 자성나노입자, 과산화효소, 형광물질, 발색효소 등의 자체의 색 또는 발색을 통해 신호를 발생할 수 있는 분자를 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 신호발생분자는 합텐과의 결합을 위해 변형된 것일 수 있다.
상기 합텐과 결합하기 위한 신호발생분자의 변형은 합텐의 분자 종류에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어 스트렙타비딘과의 결합, 비오틴과의 결합, 또는 합텐과 결합할 수 있는 항체와의 결합 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 합텐이 비오틴인 경우, 신호발생분자는 스트렙타비딘이 결합된 것일 수 있다. 이 경우 합텐과 신호발생분자간의 결합은 비오틴-스트렙타비딘 간의 결합에 의해 행해질 수 있다.
일 구현예에서, 합텐이 FAM(fluorescein amidite), Alexa Fluor®, 또는 DIG(digoxigenin)인 경우, 신호발생분자는 항-FAM 항체, 항-Alexa 항체, 또는 항-DIG 항체가 결합된 것일 수 있다. 이 경우 합텐과 신호발생분자간의 결합은 상기 합텐과 이 합텐에 결합하는 항체들에 의해 매개된다.
상기 제1 컴포넌트 세트에서의 유니버설 역방향 프라이머와, 상기 제2 컴포넌트 세트에서의 유니버설 역방향 프라이머는 동일한 서열 또는 서로 다른 서열을 포함할 수 있다.
상기 제1 컴포넌트 세트에서의 합텐과 상기 제2 컴포넌트 세트에서의 합텐은 서로 동일하거나 서로 다른 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제1 컴포넌트 세트의 전방향 프라이머의 제1의 바코드 서열과 상기 제2 컴포넌트 세트의 제2의 바코드 서열은 서로 다른 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 상술한 본 발명의 검출방법을 실시할 수 있도록 구성된 것이므로, 본 발명의 키트와 검출방법 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 검출 키트는 추가 성분으로 버퍼, 역전사 효소, DNA 중합효소, DNA 중합효소 조인자, 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트와 같은 DNA 중합 반응 또는 역전사 반응에 필요한 시약, 신호발생분자의 신호발생을 위한 시약 또는 키트의 사용을 위한 설명서 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 양성 대조군 및 음성 대조군 반응을 실시하는 데 필요한 시약을 포함할 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트 (compartment)로 제작될 수 있다.
표적 RNA 분자의 검출 방법 및 다중 검출 방법
본 발명은 다음의 단계를 포함하는 표적 RNA 분자를 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 검출하고자 하는 표적 RNA 분자가 포함된 것으로 추정되는 생물학적 샘플을 상기 표적 RNA 분자에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 역전사(reverse transcription)용 프라이머가 포함된 반응액에 첨가하여 역전사 반응을 수행하는 단계;
(b) 상기 역전사 반응 생성물을, 제1의 바코드(barcode) 서열을 포함하는 전방향 프라이머(forward primer) 및 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 과량의 유니버설 역방향 프라이머(universal reverse primer)가 포함된 반응액에 첨가하여 비대칭 증폭 반응(asymmetric amplification reaction)을 수행하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 비대칭 증폭 산물을, 제1의 캡처 프로브가 고정화된 고상 지지체에 가하여 반응시키는 단계로서, 상기 제1의 캡처 프로브는 상기 제1의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 것인, 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)에서 비대칭 증폭 산물과 반응하는 고상 지지체에 상기 합텐(hapten)에 결합할 수 있는 신호발생분자를 접촉시키는 단계.
상기 단계 (a)의 역전사용 프라이머는 프라이머내에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이룰 수 있는 상보적 서열을 프라이머내에 포함할 수 있다.
상기 단계 (b)의 제1의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머는 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
상기 전방향 프라이머에서, 상기 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열은 상기 전방향 프라이머의 3'-말단 쪽에 위치할 수 있다.
상기 단계 (b)의 제1의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머에서 상기 제1의 바코드 서열은 전방향 프라이머의 5'-말단 쪽에 위치할 수 있다.
상기 단계 (b)의 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다.
상기 단계 (b)의 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루는 서열과 또는 이 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다.
상기 합텐(hapten)은 비오틴(biotin), FAM(fluorescein amidite), Alexa Fluor®, 또는 DIG(digoxigenin) 일 수 있다.
본 발명은 다음의 단계를 포함하는 표적 RNA 분자를 다중 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 검출하고자 하는 제1의 표적 RNA 분자가 포함된 것으로 추정되는 생물학적 샘플을 상기 표적 RNA 분자에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 역전사(reverse transcription)용 프라이머가 포함된 반응액에 첨가하여 역전사 반응을 수행하는 단계;
(b) 상기 제1의 표적 RNA 분자에 대한 역전사 반응 생성물을, 제1의 바코드(barcode) 서열을 포함하는 전방향 프라이머(forward primer) 및 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 과량의 유니버설 역방향 프라이머(universal reverse primer)가 포함된 반응액에 첨가하여 비대칭 증폭 반응(asymmetric amplification reaction)을 수행하는 단계;
(c) 검출하고자 하는 제2의 표적 RNA 분자가 포함된 것으로 추정되는 생물학적 샘플을 상기 제2의 표적 RNA 분자에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 역전사(reverse transcription)용 프라이머가 포함된 반응액에 첨가하여 역전사 반응을 수행하는 단계;
(d) 상기 제2의 표적 RNA 분자에 대한 역전사 반응 생성물을, 제2의 바코드(barcode) 서열을 포함하는 전방향 프라이머(forward primer) 및 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 과량의 유니버설 역방향 프라이머(universal reverse primer)가 포함된 반응액에 첨가하여 비대칭 증폭 반응(asymmetric amplification reaction)을 수행하는 단계;
(e) 상기 단계 (b)의 비대칭 증폭 산물 및 상기 단계 (d)의 비대칭 증폭 산물을, 제1의 캡처 프로브 및 제2의 캡처 프로브가 고정화된 고상 지지체에 가하여 반응시키는 단계로서, 상기 제1의 캡처 프로브는 상기 제1의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하고, 상기 제2의 캡처 프로브는 상기 제2의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 것인, 단계; 및
(f) 상기 단계 (e) 에서 비대칭 증폭 산물과 반응하는 고상 지지체에 상기 합텐(hapten)에 결합할 수 있는 신호발생분자를 접촉시키는 단계.
본 발명의 역전사 반응은 역전사용 프라이머 및 역전사 효소를 포함하는 역전사 반응액에 표적 RNA 분자가 포함될 것으로 추정되는 생물학적 샘플을 가하여, 공지된 역전사 반응조건 하에서 수행할 수 있다.
상기 표적 RNA 분자는 역전사 반응의 주형(template)로 작용한다.
상기 표적 RNA 분자는 생물학적 샘플로부터 얻어지는 RNA 분자이면 제한없이 이용될 수 있으며, 예를 들어 miRNA, snRNA, siRNA 및 mRNA를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 역전사용 프라이머는 검출하고자 하는 표적 RNA 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 서열을 포함한다.
본 발명의 역전사용 프라이머는 표적 RNA 분자에 특이적으로 결합하여 역전사를 개시할 수 있다.
일 구현예에서, 역전사용 프라이머는 표적 RNA 분자의 서열에 대해 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 역전사용 프라이머의, 표적 RNA 분자의 서열에 대해 상보적인 서열은 역전사용 프라이머의 3'-말단 쪽에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 역전사용 프라이머는 프라이머내에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이룰 수 있는 상보적 서열을 프라이머내에 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 역전사용 프라이머는 프라이머내에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 역전사용 프라이머로부터 역전사 반응이 수행되면 역전사 반응 생성물이 생성된다.
본 발명에서 "역전사 반응 생성물"은 상기 역전사용 프라이머가 역전사 반응에 의해 3'-말단으로부터 연장된 염기 서열을 더 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자를 의미한다.
상기 역전사 반응 생성물은 상기 역전사용 프라이머의 3'-말단으로부터 연장된, 주형 표적 RNA 분자의 서열에 상보적인 서열을 더 포함한다.
역전사 반응을 수행한 역전사 반응 생성물을, 제1의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머 및 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 과량의 유니버설 역방향 프라이머가 포함된 반응액에 첨가하여 비대칭 증폭 반응을 수행한다.
본 발명에서 "바코드(barcode) 서열"은 검출하려는 표적 RNA 분자 또는 단백질 분자에 따라 서로 다르게 특이적으로 부여하는 임의의 염기서열을 의미한다.
본 발명에서 제1의 표적 RNA 분자에 특이적으로 부여하는 바코드 서열은 "제1의 바코드 서열"로 지칭하고, 상기 제1의 표적 RNA 분자와 상이한 제2의 표적 RNA 분자에 특이적으로 부여하는 바코드 서열은 "제2의 바코드 서열"로 지칭한다.
하기에서 제1의 바코드 서열에 대한 설명의 내용은 제2의 바코드 서열에도 동등하게 적용될 수 있다.
본 발명에서 표적 RNA의 다중 분석 방법은 상술한 표적 RNA 분자에 특이적으로 부여되는 바코드 서열만을 다르게 하여, 2개 이상의 표적 RNA 분자를 단일한 고상 지지체 상에서 다중 분석할 수 있는 것에 특징이 있다.
예를 들어, 3개의 상이한 표적 RNA 분자들에 대해, 각각에 혼성화되어 역전사 반응을 일으킬 수 있는 3개의 역전사용 프라이머를 제작하고, 제1의 바코드 서열, 제2의 바코드 서열 및 제3의 바코드 서열을 포함하는 각각의 전방향 프라이머를 제작하여 사용하면, 3개의 상이한 표적 RNA 분자들을 단일의 고상 지지체상에서 다중 분석하는 것이 가능하다. 이때, 후술하는 바와 같이 상기 단일의 고상 지지체상에는 상기 제1의 바코드 서열, 제2의 바코드 서열 및 제3의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 캡처 프로브가, 고상 지지체상의 서로 다른 영역에 고정화된다.
일 구현예에서, 상기 제1의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머는 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 역전사 반응 생성물에서, 전방향 프라이머의 서열과 상보적인 서열은, 단계 (a)에서 역전사 반응에 의해 역전사용 프라이머의 3'-말단으로부터 연장된 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 전방향 프라이머에서, 상기 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열은 전방향 프라이머의 3'-말단 쪽에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 전방향 프라이머에서, 상기 제1의 바코드 서열은 전방향 프라이머의 5'-말단 쪽에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다. 즉, 상기 역전사용 프라이머는 상기 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머의 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루는 서열과, 또는 이 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 "합텐으로 변형된 것"은 "합텐이 결합된 것"일 수 있다.
상기 "합텐(hapten)"은 유니버설 역방향 프라이머의 5'-말단 또는 프라이머 내부의 염기에 결합될 수 있고, 구체적으로 유니버설 역방향 프라이머의 5'-말단에 결합될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 합텐은 비오틴(biotin), FAM(fluorescein amidite), Alexa Fluor®, 또는 DIG(digoxigenin) 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 용어 "과량"은 비대칭 증폭 반응액내에서 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머의 양(또는 농도)이 제1 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머의 양(또는 농도)보다 더 많은 양(또는 농도)으로 존재한다는 것을 의미한다.
본 발명에서 증폭 반응액내에서, 역전사 반응 생성물에 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머를 제1 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머의 양보다 많은 양으로 접촉시켜 비대칭 증폭이 수행된다.
구체적으로 상기 "과량"은 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방항 프라이머의 양(또는 농도)가 제1 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머의 양(또는 농도)에 비해 2 - 40배, 3 - 40배, 4 - 40배, 5 - 40배, 2 - 35배, 3 - 35배, 4 - 35배, 5 - 35배, 2 - 35배, 3 - 35배, 4 - 35배, 5 - 35배, 2 - 30배, 3 - 30배, 4 - 30배, 또는 5 - 30배 많은 양(또는 농도)일 수 있으며, 구체적으로, 5-30배, 5-20배, 또는 5-10배 많은 양(또는 농도)일 수 있다.
일 구현예에서, 비대칭 증폭 반응에서 증폭 반응은 핵산을 증폭시킬 수 있는 반응이면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들어 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 루프매개 등온증폭(loop-mediated isothermal amplification, LAMP), 또는 RPA(recombinase polymerase amplification)를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 캡처 프로브는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명에서 제1의 캡처 프로브는 제1의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하고, 제2의 캡처 프로브는 제2의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
상기 캡처 프로브는 3'-말단 또는 5'-말단에 아민기, 티올기, 비오틴기 등의 작용기를 포함할수 있다.
상기 캡처 프로브는 고상 지지체 표면에 고정화될 수 있으며, 상기 고상 지지체는 니트로셀룰로스(nitrocellulose), PES, 표면이 개질된 유리 슬라이드를 포함할 수 있다.
상기 캡처 프로브의 고정화 방법은 스트렙타비딘-비오틴 상호작용, UV 가교, 열처리 방법을 예로 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 (a)에서 생물학적 샘플내에 제1의 표적 RNA 분자가 포함되어 있다면 상기 단계 (b)의 비대칭 증폭 반응의 증폭 산물은, 제1의 바코드 서열에 상보적인 서열을 갖고 5’-말단이 합텐으로 변형된 폴리뉴클레오티드를 포함하게 되고, 상기 제1의 바코드 서열에 상보적인 서열은 제1의 캡처 프로브에 결합되어 상기 폴리뉴클레오티드는 고상 지지체 상에 포획된다.
또한, 상기 단계 (c)에서 생물학적 샘플내에 제2의 표적 RNA 분자가 포함되어 있다면 상기 단계 (d)의 비대칭 증폭 반응의 증폭 산물은 제2의 바코드 서열에 상보적인 서열을 갖고 5’-말단이 합텐으로 변형된 폴리뉴클레오티드를 포함하게 되고, 상기 제2의 바코드 서열에 상보적인 서열은 제2의 캡처 프로브에 결합되어 상기 폴리뉴클레오티드는 고상 지지체상에 포획된다.
일 구현예에서, 상기 제1의 캡처 프로브 및 상기 제2의 캡처 프로브는 단일한 고상 지지체상에 고정화된 것일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 제1의 캡처 프로브 및 상기 제2의 캡처 프로브는 단일의 고상 지지체상에서 서로 다른 영역에 각각 고정화된 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제1의 캡처 프로브 및 상기 제2의 캡처 프로브는 서로 다른 고상 지지체상에 각각 고정화된 것일 수 있다. 이 경우, 상기 단계 (b)의 비대칭 증폭 산물은 제1의 캡처 프로브가 고정화된 고상 지지체에 가하여 반응시키고, 상기 단계 (d)의 비대칭 증폭 산물은 제2의 캡처 프로브가 고정화된 고상 지지체에 가하여 반응시킨다.
일 구현예에서, 상기 제1의 캡처 프로브 및 상기 제2의 캡처 프로브가 고정화된 고상 지지체는 LFA (Lateral Flow Assay) 장치일 수 있다.
표적 RNA 분자의 검출 키트 및 다중 검출 키트
본 발명은 다음의 제1 및 제2의 컴포넌트 세트를 포함하는, 표적 RNA 분자를 검출하기 위한 키트를 제공한다:
(a) 다음의 성분을 포함하는 표적 RNA 분자 증폭용 제1 컴포넌트 세트;
(i) 표적 RNA 분자에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 역전사(reverse transcription)용 프라이머;
(ii) 제1의 바코드(barcode) 서열을 포함하는 전방향 프라이머; 및
(iii) 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머;
및
(b) 다음의 성분을 포함하는 고상 검출용 제2 컴포넌트 세트;
(i) 상기 제1의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 제1의 캡처 프로브가 고정된 고상 지지체; 및
(ii) 상기 합텐(hapten)에 결합하여 신호를 발생할 수 있는 신호발생분자.
일 구현예에서, 상기 제1 컴포넌트 세트의 역전사용 프라이머는 프라이머내에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이룰 수 있는 상보적 서열을 프라이머내에 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제1 컴포넌트 세트의 제1의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머는 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 전방향 프라이머에서 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열은 상기 전방향 프라이머의 3'-말단 쪽에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제1 컴포넌트 세트의 제1의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머에서 상기 제1의 바코드 서열은 전방향 프라이머의 5'-말단 쪽에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제1 컴포넌트 세트의 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제1 컴포넌트 세트의 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루는 서열과 또는 이 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 합텐(hapten)은 비오틴(biotin), FAM(fluorescein amidite), Alexa Fluor®, 또는 DIG(digoxigenin)일 수 있다.
본 발명은 다음의 제1, 제2 및 제3의 컴포넌트 세트를 포함하는, 표적 RNA 분자를 다중 검출하기 위한 키트를 제공한다:
(a) 다음의 성분을 포함하는 제1의 표적 RNA 분자 증폭용 제1 컴포넌트 세트;
(i) 제1의 표적 RNA 분자에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 역전사(reverse transcription)용 프라이머;
(ii) 제1의 바코드(barcode) 서열을 포함하는 전방향 프라이머; 및
(iii) 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머;
(b) 다음의 성분을 포함하는 제2의 표적 RNA 분자 증폭용 제2 컴포넌트 세트;
(i) 제2의 표적 RNA 분자에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 역전사(reverse transcription)용 프라이머;
(ii) 제2의 바코드(barcode) 서열을 포함하는 전방향 프라이머; 및
(iii) 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머; 및
(c) 다음의 성분을 포함하는 고상 검출용 제3 컴포넌트 세트;
(i) 상기 제1의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 제1의 캡처 프로브 및 상기 제2의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 제2의 캡처 프로브가 고정된 고상 지지체; 및
(ii) 상기 합텐(hapten)에 결합하여 신호를 발생할 수 있는 신호발생분자.
제1 컴포넌트 세트
본 발명에서 상기 제1 컴포넌트 세트의 역전사용 프라이머는 검출하고자 하는 제1의 표적 RNA 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 역전사용 프라이머는, 표적 RNA 분자의 서열에 대해 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 역전사용 프라이머의, 표적 RNA 분자의 서열에 대해 상보적인 서열은 역전사용 프라이머의 3'-말단 쪽에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 역전사용 프라이머는 프라이머내에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이룰 수 있는 상보적 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 역전사용 프라이머로부터 역전사 반응이 수행되면 역전사 반응 생성물이 생성된다.
본 발명에서 용어 "역전사 반응 생성물"은 상기 역전사용 프라이머가 역전사 반응에 의해 3'-말단으로부터 연장된 서열을 더 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다.
상기 역전사 반응 생성물은 상기 역전사용 프라이머의 3'-말단으로부터 연장된, 주형인 표적 RNA 분자의 서열에 상보적인 서열을 더 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제1의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머는 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 전방향 프라이머에서 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열은 상기 전방향 프라이머의 3'-말단 쪽에 위치할 수 있다.
상기 제1의 바코드 서열은 제1의 표적 RNA 분자에 특이적으로 부여하는 임의의 서열을 의미한다.
상기 용어 "바코드 서열"에 관한 내용을 상술한 본 발명의 검출방법에서 설명된 내용과 동일하므로 이를 원용하며 중복하여 설명하지 않는다.
일 구현예에서, 상기 전방향 프라이머에서 제1의 바코드 서열은 전방향 프라이머의 5'-말단 쪽에 위치할 수 있다.
일 구현예에서 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다. 즉, 상기 역전사용 프라이머는 상기 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머의 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 스템-루프(stem-loop) 구조 이루는 서열과, 또는 이 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 "합텐으로 변형된 것"은 "합텐이 결합된 것"일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 합텐은 비오틴(biotin), FAM(fluorescein amidite), Alexa Fluor®, 또는 DIG(digoxigenin) 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
제2 컴포넌트 세트
본 발명에서 상기 제2 컴포넌트 세트의 역전사용 프라이머는 검출하고자 하는 제2의 표적 RNA 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 역전사용 프라이머는, 표적 RNA 분자의 서열에 대해 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 역전사용 프라이머의, 표적 RNA 분자의 서열에 대해 상보적인 서열은 역전사용 프라이머의 3'-말단 쪽에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 역전사용 프라이머는 프라이머내에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이룰 수 있는 상보적 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 역전사용 프라이머로부터 역전사 반응이 수행되면 역전사 반응 생성물이 생성된다.
본 발명에서 용어 "역전사 반응 생성물"은 상기 역전사용 프라이머가 역전사 반응에 의해 3'-말단으로부터 연장된 서열을 더 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다.
상기 역전사 반응 생성물은 상기 역전사용 프라이머의 3'-말단으로부터 연장된, 주형인 표적 RNA 분자의 서열에 상보적인 서열을 더 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제2의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머는 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 전방향 프라이머에서 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열은 상기 전방향 프라이머의 3'-말단 쪽에 위치할 수 있다.
상기 제2의 바코드 서열은 제2의 표적 RNA 분자에 특이적으로 부여하는 임의의 서열을 의미한다.
상기 용어 "바코드 서열"에 관한 내용을 상술한 본 발명의 검출방법에서 설명된 내용과 동일하므로 이를 원용하며 중복하여 설명하지 않는다.
일 구현예에서, 상기 전방향 프라이머에서 제1의 바코드 서열은 전방향 프라이머의 5'-말단 쪽에 위치할 수 있다.
일 구현예에서 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다. 즉, 상기 역전사용 프라이머는 상기 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머의 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 스템-루프(stem-loop) 구조 이루는 서열과, 또는 이 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 "합텐으로 변형된 것"은 "합텐이 결합된 것"일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 합텐은 비오틴(biotin), FAM(fluorescein amidite), Alexa Fluor®, 또는 DIG(digoxigenin) 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
제3 컴포넌트 세트
일 구현예에서, 상기 제1의 캡처 프로브 및 제2의 캡처프로브는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 캡처 프로브는 3'-말단 또는 5'-말단에 아민기, 티올기, 비오틴기 등의 작용기를 포함할수 있다.
상기 캡처 프로브는 고상 지지체 표면에 고정화될 수 있으며, 상기 고상 지지체는 니트로셀룰로스(nitrocellulose), PES, 표면이 개질된 유리 슬라이드를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제1의 캡처 프로브 및 상기 제2의 캡처 프로브는 서로 다른 고상 지지체상에 고정화된 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제1의 캡처 프로브 및 상기 제2의 캡처 프로브는 동일한 단일의 고상 지지체상에 고정화된 것일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 제1의 캡처 프로브 및 상기 제2의 캡처 프로브는 동일한 단일의 고상 지지체상의 서로 다른 영역에 분리되어 고정화된 것일 수 있다.
상기 합텐에 결합하여 신호를 발생시킬 수 있는 신호발생분자는 예를 들어, 금나노입자, 자성나노입자, 과산화효소, 형광물질, 발색효소 등의 자체의 색 또는 발색을 통해 신호를 발생할 수 있는 분자를 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 신호발생분자는 합텐과의 결합을 위해 변형된 것일 수 있다.
상기 합텐과 결합하기 위한 신호발생분자의 변형은 합텐의 분자 종류에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어 스트렙타비딘과의 결합, 비오틴과의 결합, 또는 합텐과 결합할 수 있는 항체와의 결합 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 합텐이 비오틴인 경우, 신호발생분자는 스트렙타비딘이 결합된 것일 수 있다. 이 경우 합텐과 신호발생분자간의 결합은 비오틴-스트렙타비딘 간의 결합에 의해 행해질 수 있다.
일 구현예에서, 합텐이 FAM(fluorescein amidite), Alexa Fluor®, 또는 DIG(digoxigenin)인 경우, 신호발생분자는 항-FAM 항체, 항-Alexa 항체, 또는 항-DIG 항체가 결합된 것일 수 있다. 이 경우 합텐과 신호발생분자간의 결합은 상기 합텐과 이 합텐에 결합하는 항체들에 의해 매개된다.
상기 제1 컴포넌트 세트에서의 유니버설 역방향 프라이머와, 상기 제2 컴포넌트 세트에서의 유니버설 역방향 프라이머는 동일한 서열 또는 서로 다른 서열을 포함할 수 있다.
상기 제1 컴포넌트 세트에서의 합텐과 상기 제2 컴포넌트 세트에서의 합텐은 서로 동일하거나 서로 다른 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제1 컴포넌트 세트의 전방향 프라이머의 제1의 바코드 서열과 상기 제2 컴포넌트 세트의 제2의 바코드 서열은 서로 다른 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 상술한 본 발명의 검출방법을 실시할 수 있도록 구성된 것이므로, 본 발명의 키트와 검출방법 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 검출 키트는 추가 성분으로 버퍼, 역전사 효소, DNA 중합효소, DNA 중합효소 조인자, 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트와 같은 DNA 중합 반응 또는 역전사 반응에 필요한 시약, 신호발생분자의 신호발생을 위한 시약 또는 키트의 사용을 위한 설명서 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 양성 대조군 및 음성 대조군 반응을 실시하는 데 필요한 시약을 포함할 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트 (compartment)로 제작될 수 있다.
제4 컴포넌트 세트
본 발명에서 표적 RNA의 다중 분석 방법은 상술한 표적 RNA 분자에 특이적으로 부여되는 바코드 서열만을 다르게 하여, 2개 이상의 표적 RNA 분자를 단일한 고상 지지체 상에서 다중 분석할 수 있는 것에 특징이 있다.
예를 들어, 3개의 상이한 표적 RNA 분자들에 대해, 각각에 혼성화되어 역전사 반응을 일으킬 수 있는 3개의 역전사용 프라이머를 제작하고, 제1의 바코드 서열, 제2의 바코드 서열 및 제3의 바코드 서열을 포함하는 각각의 전방향 프라이머를 제작하여 사용하면, 3개의 상이한 표적 RNA 분자들을 단일의 고상 지지체상에서 다중 분석하는 것이 가능하다. 이때, 상술한 바와 같이 상기 단일의 고상 지지체상에는 상기 제1의 바코드 서열, 제2의 바코드 서열 및 제3의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 캡처 프로브가, 고상 지지체상의 서로 다른 영역에 고정화된다.
따라서, 본 발명의 키트에서 제3의 표적 RNA 분자 증폭용 제4의 컴포넌트 세트를 더 포함하면, 3개의 표적 RNA 분자를 다중 분석할 수 있다.
일 구현예에서 상기 제4의 컴포넌트 세트는 다음의 성분을 포함할 수 있다:
(i) 제3의 표적 RNA 분자에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 역전사(reverse transcription)용 프라이머;
(ii) 제1의 바코드(barcode) 서열을 포함하는 전방향 프라이머; 및
(iii) 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머.
다른 구현예에서, 본 발명의 키트에서 추가적인 표적 RNA 분자를 다중 분석하려는 경우, 추가적인 표적 RNA 분자에 대해 상술한 표적 RNA 분자 증폭용 컴포넌트 세트를 제작하면, 단일 또는 별도의 고상 지지체상에서 표적 RNA 분자를 다중 분석하는 것이 가능하다.
본 발명은 생체 유래 샘플내에서 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하는 방법 및 이 방법에 사용되는 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 생체 유래 샘플내에서 표적 RNA 분자를 검출하는 방법, 표적 RNA 분자를 다중 검출하는 방법 및 이에 사용되는 키트에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 높은 민감도로 생체 유래 샘플에서 RNA 분자와 단백질 분자를 단일의 플랫폼에서 동시에 검출할 수 있다. 본 발명의 키트는 발색신호를 검출하는 고상지지체 기반의 LFA (Lateral Flow Assay) 형태로 제작될 수 있어 현장진단에 적합하다.
도 1은 본 발명의 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하는 기술의 모식도이다.
도 2는 5'-말단이 비오틴(biotin)으로 변형된 화학적으로 합성한 비대칭 증폭 산물 유사체를 분석 샘플로 사용하여 실험한 결과이다.
도 3은 인간 대장 정상세포 (CCD-18Co), 인간 대장암 세포 (SW620, HT29)의 배양액에서 추출한 엑소좀의 RNA 분자를 검출한 결과이다. 도 3의 패널 A 내지 D는 LFA(Lateral Flow Assay) 이미지이다. 패널 A: miR-345, 패널 B: RNU6-1, 패널 C: miR-92a, 패널 D: miR-141. (1: Control, 2: CCD-18Co, 3: SW620, 4: HT29). 도 3의 패널 E는 LFA 이미지를 Normalized intensity로 분석한 결과이다. Normalized intensity는 각 엑소좀의 RNU6-1, miR-92a, miR-141의 분석결과를 miR-345 intensity로 나누어 계산하였다.
도 4는 인간 대장 정상세포(CCD-18Co), 인간 대장암 세포(SW620, HT29)의 배양액에서 추출한 엑소좀의 단백질을 분석한 결과이다. 도 4의 패널 A 및 패널 B는 LFA(Lateral Flow Assay) 이미지이다. 패널 A: CD63, 패널 B: EpCAM (1: Control, 2: CCD-18Co, 3: SW620, 4: HT29). 도 4의 패널 C는 LFA 이미지를 Normalized intensity로 분석한 결과이다. Normalized intensity는 각 엑소좀의 EpCAM의 분석 결과를 CD63 intensity로 나누어 계산하였다.
도 5는 인간 대장 정상세포(CCD-18Co), 인간 대장암 세포(SW620)의 배양액에서 추출한 엑소좀의 miR-141 RNA 및 CD63 단백질을 단일의 LFA 스트립상에 동시에 검출한 결과이다(1: Control, 2: CCD-18Co, 3: SW620).
도 6은 임상 시료에 대해 단일의 LFA 스트립상에서 복수의 RNA 분자를 검출한 다중 검출 결과이다. 패널 A는 대장암 환자(P17)로부터 miR-345, miR-92a 및 miR-141에 대한 역전사 및 비대칭 PCR 반응산물을 LFA 스트립상에서 검출한 결과이고, 패널 B는 상기 패널 A에서의 신호 강도(intensity)를 정규화시켜 나타내었다. NTC 및 P17에 대한 역전사 및 비대칭 PCR 반응산물을 상이한 조합으로 혼합하였다(a 내지 h). 패널 C는 건강한 정상인과 상이한 암 진행 단계(I-IV)에 있는 대장암 환자로부터의 시료에 대한 역전사 및 비대칭 PCR 반응산물을 LFA 스트립상에서 검출한 결과이다. 패널 D는 패널 C에서의 신호 강도를 정규화시켜 나타내었다.
도 2는 5'-말단이 비오틴(biotin)으로 변형된 화학적으로 합성한 비대칭 증폭 산물 유사체를 분석 샘플로 사용하여 실험한 결과이다.
도 3은 인간 대장 정상세포 (CCD-18Co), 인간 대장암 세포 (SW620, HT29)의 배양액에서 추출한 엑소좀의 RNA 분자를 검출한 결과이다. 도 3의 패널 A 내지 D는 LFA(Lateral Flow Assay) 이미지이다. 패널 A: miR-345, 패널 B: RNU6-1, 패널 C: miR-92a, 패널 D: miR-141. (1: Control, 2: CCD-18Co, 3: SW620, 4: HT29). 도 3의 패널 E는 LFA 이미지를 Normalized intensity로 분석한 결과이다. Normalized intensity는 각 엑소좀의 RNU6-1, miR-92a, miR-141의 분석결과를 miR-345 intensity로 나누어 계산하였다.
도 4는 인간 대장 정상세포(CCD-18Co), 인간 대장암 세포(SW620, HT29)의 배양액에서 추출한 엑소좀의 단백질을 분석한 결과이다. 도 4의 패널 A 및 패널 B는 LFA(Lateral Flow Assay) 이미지이다. 패널 A: CD63, 패널 B: EpCAM (1: Control, 2: CCD-18Co, 3: SW620, 4: HT29). 도 4의 패널 C는 LFA 이미지를 Normalized intensity로 분석한 결과이다. Normalized intensity는 각 엑소좀의 EpCAM의 분석 결과를 CD63 intensity로 나누어 계산하였다.
도 5는 인간 대장 정상세포(CCD-18Co), 인간 대장암 세포(SW620)의 배양액에서 추출한 엑소좀의 miR-141 RNA 및 CD63 단백질을 단일의 LFA 스트립상에 동시에 검출한 결과이다(1: Control, 2: CCD-18Co, 3: SW620).
도 6은 임상 시료에 대해 단일의 LFA 스트립상에서 복수의 RNA 분자를 검출한 다중 검출 결과이다. 패널 A는 대장암 환자(P17)로부터 miR-345, miR-92a 및 miR-141에 대한 역전사 및 비대칭 PCR 반응산물을 LFA 스트립상에서 검출한 결과이고, 패널 B는 상기 패널 A에서의 신호 강도(intensity)를 정규화시켜 나타내었다. NTC 및 P17에 대한 역전사 및 비대칭 PCR 반응산물을 상이한 조합으로 혼합하였다(a 내지 h). 패널 C는 건강한 정상인과 상이한 암 진행 단계(I-IV)에 있는 대장암 환자로부터의 시료에 대한 역전사 및 비대칭 PCR 반응산물을 LFA 스트립상에서 검출한 결과이다. 패널 D는 패널 C에서의 신호 강도를 정규화시켜 나타내었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 오로지 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다는 것은 통상의 기술자에게 자명하다.
실시예 1: RNA 분자의 검출
1-1. 역전사 반응
검체 시료로는 인간 대장 정상세포(CCD-18Co)와 인간 대장암 세포(SW620, HT29)의 배양액에서 추출한 엑소좀의 RNA 분자를 이용하였다.
엑소좀의 농축 및 정제는 다음과 같이 수행하였다. 먼저 배양 배지를 수집하고 원심분리하여 죽은 세포 및 세포 파편을 제거하였다. 상등액을 0.45μm 기공 크기 주사기 필터를 통해 여과한 다음, 0.2μm 기공 크기 주사기 필터(Sartorius, Gφttingen, Germany)를 통해 여과하여 크기가 200 nm보다 큰 입자를 제거하였다. 100 kDa 분자량 컷오프 필터를 사용하여 엑소좀을 농축하고, 크기배제크로마토그래피(qEV10 column, Izon Science, Christchurch, New Zealand)를 행하여 엑소좀을 분리하였다. 수득한 샘플을 3K Macrosep 원심분리기 튜브(Pall Corporation, NY, USA)에서 5,000 x g에서 15분 동안 수회 원심분리하여 엑소좀을 농축하였다. 이어서, RNA 추출 키트(miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit, Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 분리된 엑소좀에서 엑소좀 RNA를 추출하였다.
상기 추출한 RNA 분자의 검체시료, dNTPs 각 250 μM, 4 U/μL의 M-MLV 역전사 효소, 0.4 U/μL의 RNAse inhibitor, 100 nM의 스템-루프(stem-loop) 역전사 프라이머, 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 3 mM MgCl2, 10 mM dithiotreitol, 75 mM KCl을 포함하는 반응물을 16℃에서 30분, 42℃에서 60분, 및 85℃에서 5분간 반응시켜, 역전사 반응을 수행하였다. 검출할 표적 RNA 분자는 miR-345, miR-92a, miR-141, 및 RNU6-1으로 하였고, 이들 RNA 분자에 대한 역전사 프라이머의 염기서열은 아래 표 1에 나타내었다.
1-2. 비대칭 PCR 반응
역전사 반응을 통해 생성된 역전사 반응 생성물을 사용하여 비대칭 PCR 반응을 수행하였다. 2 μL의 역전사 반응 생성물(cDNA), dNTPs 각 250 μM, 0.025 U/μL Taq DNA 중합효소, 1 μM의 5'-말단이 비오틴 결합된 유니버설 역방향 프라이머, 100 nM 전방향 프라이머, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 및 2 mM MgCl2를 포함하는 반응물을 95℃에서 30초간 인큐베이션 후에, "94℃ 10초 - 57℃ 15초 - 72℃ 30초"의 반응을 40싸이클 수행하여 비대칭 PCR 반응을 수행하였다. 검출 RNA 분자 miR-345, miR-92a, miR-141, 및 RNU6-1에 대한 전방향 프라이머의 염기서열과 유니버설 역방향 프라이머의 염기서열은 아래 표 1에 나타내었다.
1-3. 표적 올리고뉴클레오티드의 고상 검출
스트렙타비딘 코팅된 금나노입자 및 LFA 스트립은 다음과 같이 제조하였다. 금나노입자(AuNP)는 0.04g의 HAuCl4를 400mL의 증류수에 첨가한 다음 3.2 mL의 1% trisodium citrate를 첨가하여 합성하였다. 혼합물을 교반하면서 15분 동안 끓인 다음 실온으로 냉각시켰고, 합성된 AuNP는 4℃에서 보관하였다. 합성한 금나노입자(AuNP)를 1400x g에서 60분간 원심분리하여 534 nm(A534)에서 흡광도 값이 5 unit가 되도록 준비하였다. 이어서, 탄산나트륨과 스트렙타비딘의 최종 농도가 각각 1.28mM 및 40㎍/mL이 되도록 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, BSA를 0.1 mg/mL의 최종 농도로 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 결합되지 않은 스트렙타비딘과 BSA를 제거하기 위해, 혼합물을 1400 x g에서 30분 동안 원심분리하고, 534 nm(A534) 5 unit에 도달할 때 까지 10mM Tris-HCl(pH 8)에 재현탁하였다. 제조된 스트렙타비딘 코팅된 금나노입자는 4℃에서 보관하였다.
LFA(Lateral Flow Assay) 스트립은 지지 카드(backing card), NC NC(nitrocellulose) 멤브레인 및 흡수 패드로 구성하였다. NC 멤브레인과 흡수 패드를 지지 카드상에서 서로 연결하여 연속적인 모세관 이동이 가능하도록 하였다. 22 x 300mm의 흡수 패드를 지지 카드에 부착된 NC 멤브레인의 하류 측에 배치하여, NC 멤브레인과 2 mm 겹치도록 하였다. 다음으로, LFA 스트립 어셈블리를 폭 3mm, 길이 43mm의 조각으로 자르고, 테스트 영역에 0.8M CaCl2와 함께 80 μM 캡처 DNA 0.3μL를 스폿팅하고 실온에서 10분 동안 건조하였다. 상기 캡처 DNA 프로브는 5'-말단을 아민기(amine group)으로 변형시킨 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 제조한 LFA 스트립을 UV 가교제(Korea Ace Science, Seoul, Korea)를 사용하여 총 에너지가 90mJ/cm2인 254nm UV 광에 5분간 노출시켰다.
비대칭 PCR 반응을 통해 생성된, 비대칭 PCR 반응 생성물과, 20 mM sodium borate (pH 8.0), 3% (w/v) sucrose, 0.6 M NaCl, 0.2% (v/v) Tween 20, 및 0.1% (w/v) sodium azide를 포함하는 반응물을, 캡처 프로브(capture probe)가 고정화된 LFA(Lateral Flow Assay) 스트립에 접촉시켰다. 상기 캡처 프로브는 5'-말단을 아민기(amine group)으로 변형시킨 올리고뉴클레오티드를 사용하였으며(표 1 참조), 상기 캡처 프로브가 고정화되는 고정상으로는 니트로셀룰로오스 페이퍼(nitrocellulose paper)를 사용하였고, 신호발생물질로는 스트렙타비딘(streptavidin)-금 나노입자를 사용하였다.
1-4. 프라이머 및 캡처 프로브의 염기서열
아래의 표 1에 상기한 RNA 분자 검출 실험에 사용된 역전사 프라이머들, 전방향 프라이머, 유니버설 역방향 프라이머 및 캡처 프로브의 염기서열을 표시하였다.
| Bio-marker | Name | 염기서열 (5'→ 3') |
| miR-345 | 스템-루프 역전사 프라이머 |
GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACG AGC CC (서열번호 1) |
| 전방향 프라이머 | CAG GCA GTA CAC AAT CTA CGT CGG CGG CTG ACT CCT AGT CCA (서열번호 2) | |
| miR-92a | 스템-루프 역전사 프라이머 |
GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA CAG GC (서열번호 3) |
| 전방향 프라이머 | CAG GCA GTA CAC AAT CTA CG CCG GCT ATT GCA CTT GTC CCG (서열번호 4) | |
| miR-141 | 스템-루프 역전사 프라이머 |
GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACC CAT CT (서열번호 5) |
| 전방향 프라이머 | CAG GCA GTA CAC AAT CTA CG GGC ACT AAC ACT GTC TGG TAA (서열번호 6) | |
| RNU6-1 | 스템-루프 역전사 프라이머 |
GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA AAA TAT G (서열번호 7) |
| 전방향 프라이머 | CAG GCA GTA CAC AAT CTA CGA CGC AAA TTC GTG AAG CGT TC (서열번호 8) | |
| 유니버설 역방향 프라이머 | GTG CAG GGT CCG AGG T (서열번호 9) | |
| 캡처 프로브 | NH2-CAG GCA GTA CAC AAT CTA CG (서열번호 10) | |
1-5. 실험 결과
도 2는 5'-말단이 비오틴(biotin)으로 변형된 화학적으로 합성한 비대칭 PCR 증폭 산물 유사체를 분석 샘플로 사용하여 실험한 결과이다. 도 2의 결과에서 캡처 프로브는 5'-말단을 아민기(amine group)으로 변형시킨 DNA를 사용하였으며, 캡처 프로브가 고정화되는 고정상으로는 니트로셀룰로오스 페이퍼(nitrocellulose paper)를 사용하였고, 신호발생물질로는 스트렙타비딘(streptavidin)-금 나노입자를 사용하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 증폭산물 유사체를 첨가한 양성 대조군(positive control)에서 신호가 발생한 반면, 증폭산물 유사체를 첨가하지 않은 음성 대조군(negative control)에서는 신호가 발생하지 않은 것을 확인할 수 있다.
도 3은 인간 대장 정상세포(CCD-18Co), 인간 대장암 세포(SW620, HT29)의 배양액에서 추출한 엑소좀의 RNA 분자를 검출한 결과이다. 도 3에서 패널 A: miR-345, 패널 B: RNU6-1, 패널 C: miR-92a, 패널 D: miR-141이고, 1: Control, 2: CCD-18Co, 3: SW620, 4: HT29이다. 도 3의 패널 A에서 알 수 있는 바와 같이, 참조(reference) RNA로 사용한 miR-345은 정상 세포와 암세포의 엑소좀에서 모두 유사한 신호를 나타냈다. 반면, 도 3의 패널 B 내지 D에서 보이는 바와 같이, 대장암 RNA 바이오 마커인 RNU6-1, miR-92a, miR-141는 정상 세포보다 암세포 엑소좀에서 높은 신호를 나타냈다. 도 3의 패널 E는 이미지 분석 후 참조 RNA인 miR-345의 측정결과에 기초하여, RNU6-1, miR-92a, miR-141의 측정값을 표준화한 값을 나타낸 그래프이다. 분석 결과, 대장암 RNA 바이오 마커인 RNU6-1, miR-92a, miR-141는 정상 세포보다 암세포의 엑소좀에서 높은 발현량을 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 단백질 분자의 검출
2-1. 항체 결합 반응 및 DNA 태그 결합 반응
검체 시료로는 인간 대장 정상세포 (CCD-18Co)와 인간 대장암 세포 (SW620, HT29)의 배양액에서 추출한 엑소좀의 단백질을 이용하였다. 엑소좀의 농축 및 정제는 상기 실시예 1의 1-1 항목에서 설명된 방법에 따라 수행하였다. 검출할 표적 단백질은 CD63 및 CD326(EpCAM)으로 하였다.
상기 추출한 총단백질 10μg/mL(총단백질의 농도)의 검체시료와 1XPBS를 혼합하여 플레이트(plate)에 가한 후, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 1X PBS, 및 0.1% (v/v) Tween-20을 포함하는 세척완충액 200μL로 2회 세척하고, 1X PBS, 0.1% (v/v) Tween-20, 1% (w/v) BSA, 및 1 mg/mL yeast RNA를 포함하는 블로킹 완충액 300μL로 37℃에서 1시간 동안 블로킹 반응을 수행하였다.
이어서, 세척완충액 200μL로 2회 세척하고, 1μg/mL의 비오틴 결합된(biotinylated) 항체(Anti-human CD63 항체 또는 Anti-human CD326(EpCAM) 항체), 1X PBS, 0.1% (v/v) Tween-20, 1% (w/v) BSA, 1 mg/mL yeast RNA를 포함하는 반응액으로 37℃에서 1시간 반응시켰다. 이후, 세척완충액 200μL로 4회 세척하고, 12 nM 스트렙타비딘(streptavidin), 1X PBS, 0.1% (v/v) Tween-20, 1% (w/v) BSA, 1 mg/mL yeast RNA를 포함하는 반응액으로 37℃에서 30분간 반응시켰다.
이어서, 세척완충액 200μL로 4회 세척하고, 비오틴 결합된 6 nM DNA 태그(표 3 참조), 1XPBS, 0.1% (v/v) Tween-20, 1% (w/v) BSA, 및 1 mg/mL yeast RNA를 포함하는 반응액과 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이어서, 세척완충액 200μL로 4회 세척하고, 증류수에서 90℃에서 15분간 두었다.
이어서, 반응물을 90℃의 증류수에서 15분간의 열처리를 통해 스트렙타비딘을 변성시킴으로써 비오틴화된 DNA 태그를 분리하여 회수하였다.
2-2. 비대칭 PCR 반응
DNA 태그 회수물 1 μL, dNTPs 각 250 μM , 0.025 U/μL Taq DNA 중합효소, 5'-말단 비오틴 결합된 1 μM 유니버설 역방향 프라이머, 100 nM 유니버설 전방향 프라이머, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 및 2 mM MgCl2를 포함하는 반응액을 제조하였다. 제조한 반응액을 95℃에서 30초간 인큐베이션하고, "94℃ 10초 - 57 ℃ 15초 - 72 °C 30초"를 40 싸이클 수행하여 비대칭 PCR 반응을 수행하였다. 상기 유니버설 역방향 프라이머 및 유니버설 전방향 프라이머의 염기서열은 표 3에 나타내었다.
2-3. 표적 올리고뉴클레오티드의 고상 검출
실시예 1의 1-3 항목에서 설명된 방법에 따라, 스트렙타비딘 코팅된 금나노입자 및 LFA(Lateral Flow Assay) 스트립을 제조하였다. 캡처 프로브가 고정화되는 고정상으로는 니트로셀룰로오스 페이퍼(nitrocellulose paper)를 사용하였고, 캡처 프로브(capture probe)는 5'-말단이 아민기(amine group)로 변형된 올리고뉴클레오티드를 사용하였으며, 신호물질로는 스트렙타비딘-금 나노입자를 사용하였다. 비대칭 PCR 반응 생성물, 20 mM sodium borate (pH 8.0), 3% (w/v) sucrose, 0.6 M NaCl, 0.2% (v/v) Tween 20, 및 0.1% (w/v) sodium azide를 포함하는 반응물을 캡처 프로브가 고정화된 LFA (Lateral Flow Assay) 스트립(strip)에 접촉시켰다. 캡처 프로브의 염기서열은 아래 표 3에 나타내었다.
2-4. 항체 정보 및 DNA 태그, 프라이머 및 캡처 프로브의 염기 서열
실험에 사용된 항체 정보를 아래의 표 2에 나타내었다.
| 항체 | Host | Clone | Catalog no. | 구입처 |
| Anti-human CD63 항체 | Mouse | H5C6 | 353017 | Biolegend |
| Anti-human CD326(EpCAM) 항체 | Mouse | 9C4 | 324215 | Biolegend |
실험에 사용된 DNA 태그 서열, 유니버설 전방향 프라이머, 유니버설 역방향 프라이머 및 캡처 프로브의 염기서열 정보를 아래의 표 3에 나타내었다.
| Name | 염기서열 (5'→ 3') | |
| 단백질 검출 |
DNA 태그(tag) | Biotin-GCA CAC CAC GAC ACA CAA GCC TCG ACC GTT AGC AGC ATG A (서열번호 11) |
| 유니버설 전방향 프라이머(F) | NH2-GCA CAC CAC GAC ACA CAA GC (서열번호 12) | |
| 유니버설 역방향프라이머(R) | Biotin-TCA TGC TGC TAA CGG TCG AG (서열번호 13) | |
| 캡처 프로브 | NH2-GCA CAC CAC GAC ACA CAA GC (서열번호 14) | |
2-5. 실험 결과
도 4는 인간 대장 정상세포(CCD-18Co), 인간 대장암 세포(SW620, HT29)의 배양액에서 추출한 엑소좀의 CD63 단백질 및 EpCAM 단백질을 분석한 결과이다. 도 4에서 패널 A: CD63, 패널 B: EpCAM이고, 패널 A 및 B에서 1: Control, 2: CCD-18Co, 3: SW620, 4: HT29이다. CD63을 검출 분석한, 도 4의 패널 A 에 나타난 바와 같이, 참조(reference) 단백질인 CD63은 정상 세포와 암세포 엑소좀에서 모두 유사한 신호를 나타냈다. 반면, EpCAM을 검출 분석한, 도 4의 패널 B에 나타난 바와 같이, 대장암 단백질 바이오 마커인 EpCAM은 정상 세포보다 암세포의 엑소좀에서 높은 신호를 나타냈다. 도 4의 패널 C는 이미지 분석 후 참조 단백질인 CD63의 결과에 기초하여, EpCAM의 측정값을 표준화한 값을 나타낸 그래프이다. 분석 결과, 대장암 단백질 바이오 마커인 EpCAM은 정상 세포보다 암세포 엑소좀에서 높은 발현량을 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 3: RNA 분자와 단백질의 단일 고상에서 동시 검출
3-1. 역전사 반응
검체 시료로는 인간 대장 정상세포(CCD-18Co)와 인간 대장암 세포(SW620)의 배양액에서 추출한 엑소좀의 RNA 분자를 이용하였다. 엑소좀 RNA 분자 중에서 검출할 표적 RNA 분자는 miR-141으로 하였다. 상기 추출한 RNA 분자의 검체시료, dNTPs 각 250 μM, 4 U/μL의 M-MLV 역전사 효소, 0.4 U/μL의 RNAse inhibitor, 100 nM의 스템-루프(stem-loop) 역전사 프라이머(서열번호 5), 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 3 mM MgCl2, 10 mM dithiotreitol, 75 mM KCl을 포함하는 반응물을 16℃에서 30분, 42℃에서 60분, 및 85℃에서 5분간 반응시켜, 역전사 반응을 수행하였다.
3-2. 항체 결합 반응 및 DNA 태그 결합 반응
검체 시료로는 인간 대장 정상세포(CCD-18Co)와 인간 대장암 세포(SW620)의 배양액에서 추출한 엑소좀의 단백질을 이용하였다. 상기 엑소좀 단백질 중에서 검출할 표적 단백질은 대장암 단백질 바이오 마커 CD63 단백질으로 하였다. 상기 추출한 단백질 10μg/mL(총단백질의 농도)의 검체시료와 1XPBS를 혼합하여 플레이트(plate)에 가한 후, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 1X PBS, 및 0.1% (v/v) Tween-20을 포함하는 세척완충액 200μL로 2회 세척하고, 1X PBS, 0.1% (v/v) Tween-20, 1% (w/v) BSA, 및 1 mg/mL yeast RNA를 포함하는 블로킹 완충액 300μL로 37℃에서 1시간 동안 블로킹 반응을 수행하였다.
이어서, 세척완충액 200μL로 2회 세척하고, 1μg/mL의 비오틴 결합된(biotinylated) 항체(Anti-human CD63 항체, Mouse, Clone: H5C6, Catalog No. 353017,
Biolegend), 1X PBS, 0.1% (v/v) Tween-20, 1% (w/v) BSA, 1 mg/mL yeast RNA를 포함하는 반응액으로 37℃에서 1시간 반응시켰다. 이후, 세척완충액 200μL로 4회 세척하고, 12 nM 스트렙타비딘(streptavidin), 1X PBS, 0.1% (v/v) Tween-20, 1% (w/v) BSA, 1 mg/mL yeast RNA를 포함하는 반응액으로 37℃에서 30분간 반응시켰다.
이어서, 세척완충액 200μL로 4회 세척하고, 비오틴 결합된 6 nM DNA 태그(서열번호 11), 1XPBS, 0.1% (v/v) Tween-20, 1% (w/v) BSA, 및 1 mg/mL yeast RNA를 포함하는 반응액과 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이어서, 세척 완충액 200μL로 4회 세척하고, 증류수에서 90℃에서 15분간 두었다. 이어서, 상기 반응물을 90℃의 증류수에서 15분 간의 열처리를 통해 스트렙타비딘을 변성시킴으로써 비오틴화된 DNA 태그를 분리하여 회수하였다.
3-3 비대칭 PCR 반응
상기 역전사 반응을 통해 생성된 역전사 반응 생성물을 사용하여 비대칭 PCR 반응을 수행하였다. 2 μL의 역전사 반응 생성물(cDNA), dNTPs 각 250 μM, 0.025 U/μL Taq DNA 중합효소, 1 μM의 5'-말단이 비오틴 결합된 유니버설 역방향 프라이머(서열번호 9), 100 nM 전방향 프라이머(서열번호 6), 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 및 2 mM MgCl2를 포함하는 반응물을 95℃에서 30초간 인큐베이션 후에, "94℃ 10초 - 57℃ 15초 - 72℃ 30초"의 반응을 40싸이클 수행하여 비대칭 PCR 반응을 수행하였다.
이어서, 상기 항체 및 DNA 태그 결합 반응에서 회수한 DNA 태그 회수물 1 μL, dNTPs 각 250 μM , 0.025 U/μL Taq DNA 중합효소, 5'-말단 비오틴 결합된 1 μM 유니버설 역방향 프라이머(서열번호 13), 100 nM 유니버설 전방향 프라이머(서열번호 12), 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 및 2 mM MgCl2를 포함하는 반응액을 제조하였다. 제조한 반응액을 95℃에서 30초간 인큐베이션하고, "94℃ 10초 - 57℃ 15초 - 72°C 30초"를 40 싸이클 수행하여 비대칭 PCR 반응을 수행하였다.
3-4. 표적 올리고뉴클레오티드의 고상 검출 반응
실시예 1의 1-3 항목에서 설명된 방법에 따라, 스트렙타비딘 코팅된 금나노입자 및 LFA(Lateral Flow Assay) 스트립을 제조하였다. LFA 스트립 제조시에 miR-141 분자 검출용 캡처 프로브(서열번호 10), CD63 단백질 검출용 캡처 프로브(5'→3': NH2-GCA CAT CAT GAC ACA CAA: 서열번호 15) 및 대조군(control) 캡처 프로브((5'→3': Biotin-CCC CCC CCC CAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA: 서열번호 16)를 각각 다른 영역에 스폿팅하여 제조하였다. 상기 대조군 캡처 프로브는 스트렙타비딘-코팅된 금나노입자를 대조군 영역(control zone)에서 포획하기 위한 것이다.
상술한 비대칭 PCR 반응을 통해 생성된, RNA 검출용 및 단백질 검출용의 2가지의 비대칭 PCR 반응 생성물, 스트렙타비딘 코팅된 금나노입자, 및 러닝 완충액(running buffer)[20 mM sodium borate (pH 8.0), 3% (w/v) sucrose, 0.6 M NaCl, 0.2% (v/v) Tween 20, 및 0.1% (w/v) sodium azide]를 혼합하였다. 제조한 혼합물에 캡처 프로브 DNA가 고정화된 LFA 스트립을 침지시켜, LFA에 상기 혼합용액이 흐르게 하였다.
상술한 표적 miR-141 및 CD63 단백질 검출 반응에 사용된 프라이머, DNA 태그 서열, 캡처 프로브의 염기서열 정보를 아래의 표 4에 정리하여 나타내었다.
| mi-RNA 검출 | ||
| Bio-marker | Name | 염기서열 (5'→ 3') |
| miR-141 | 스템-루프 역전사 프라이머 |
GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACC CAT CT (서열번호 5) |
| 전방향 프라이머 | CAG GCA GTA CAC AAT CTA CG GGC ACT AAC ACT GTC TGG TAA (서열번호 6) | |
| 유니버설 역방향 프라이머 | GTG CAG GGT CCG AGG T (서열번호 9) | |
| 캡처 프로브 | NH2-CAG GCA GTA CAC AAT CTA CG (서열번호 10) | |
| 단백질 검출 | ||
| Bio-marker | Name | 염기서열 (5'→ 3') |
| CD63 | DNA 태그(tag) | Biotin-GCA CAC CAC GAC ACA CAA GCC TCG ACC GTT AGC AGC ATG A (서열번호 11) |
| 유니버설 전방향 프라이머(F) | NH2-GCA CAC CAC GAC ACA CAA GC (서열번호 12) | |
| 유니버설 역방향프라이머(R) | Biotin-TCA TGC TGC TAA CGG TCG AG (서열번호 13) | |
| 캡처 프로브 | NH2-GCA CAT CAT GAC ACA CAA (서열번호 15) | |
| 대조군(Contro) 캡처 프로브 | Biotin-CCC CCC CCC CAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA (서열번호 16) | |
3-6. 실험결과
도 5는 인간 대장 정상세포(CCD-18Co), 인간 대장암 세포(SW620)의 배양액에서 추출한 엑소좀의 miR-141 RNA 분자 및 CD63 단백질을 단일의 LFA 스트립상에 동시에 검출한 결과이다. 도 5에서 1: Control, 2: CCD-18Co, 3: SW610이다. 도 5에서 나타난 바와 같이, 대장 정상 세포(CCD-18Co)에서는 참조(reference) 단백질인 CD63 단백질은 신호가 검출된 반면, 대장암 바이오마커인 miR-141 RNA는 신호가 검출되지 않았다. 또한, 대장암 세포(SW620)에서는 참조(reference) 단백질인 CD63 단백질 및 miR-141 RNA에 대한 신호가 모두 검출되었다. 위와 같은 실험결과로, 단일의 LFA 스트립상의 서로 다른 영역에 고정화된 서로 다른 캡처 프로브에 의해, 단일의 LFA 스트립상에서 miR-141의 신호 및 CD63 신호를 동시에 검출할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4: RNA 분자의 다중 검출
4-1. 역전사 반응
검체 시료로는 대장암 환자(P17)의 혈장 0.5 mL로부터 엑소좀을 분리한 후 RNA 분자를 추출하여 사용하였다. 엑소좀의 농축 및 정제는 상기 실시예 1의 1-1 항목에서 설명된 방법에 따라 수행하였다.
검출 표적 RNA 분자는 miR-345, miR-92a, miR-141 으로 하였으며, 상기 역전사 반응은 검출 표적인 miR-345, miR-92a, miR-141 분자에 대해 각각 별개의 반응액에서 수행하였다. 상기 추출한 RNA 분자의 검체시료, dNTPs 각 250 μM, 4 U/μL의 M-MLV 역전사 효소, 0.4 U/μL의 RNAse inhibitor, 100 nM의 스템-루프(stem-loop) 역전사 프라이머, 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 3 mM MgCl2, 10 mM dithiotreitol, 75 mM KCl을 포함하는 반응물을 16℃에서 30분, 42℃에서 60분, 및 85℃에서 5분간 반응시켜, 역전사 반응을 수행하였다.
4-2. 비대칭 PCR 반응
역전사 반응을 통해 생성된 역전사 반응 생성물을 사용하여 비대칭 PCR 반응을 수행하였다. 비대칭 PCR 반응은 miR-345, miR-92a, miR-141의 역전사 반응 생성물 각각에 대해 수행하였다. 2 μL의 역전사 반응 생성물(cDNA), dNTPs 각 250 μM, 0.025 U/μL Taq DNA 중합효소, 1 μM의 5'-말단이 비오틴 결합된 유니버설 역방향 프라이머, 100 nM 전방향 프라이머, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 및 2 mM MgCl2를 포함하는 반응물을 제조하였다. 비대칭 PCR용 반응물을 94℃에서 15분간 초기 변성 단계를 거친 후, 95℃에서 10초간 변성 - 57℃에서 15초간 어닐링 - 72℃에서 30초간 연장의 사이클을 타겟 RNA 분자에 따라 miR-345는 49 사이클, miR-92a는 39 사이클, miR-141는 46 사이클을 각각 수행하여, 비대칭 PCR을 수행하였다.
4-3. 표적 올리고뉴클레오티드의 고상 검출
실시예 1의 1-3 항목에서 설명된 방법에 따라, 스트렙타비딘 코팅된 금나노입자 및 LFA(Lateral Flow Assay) 스트립을 제조하였다.
LFA 스트립 제조시에, 하나의 LFA 스트립의 각각 다른 영역에, miR-345 분자 검출용 캡처 프로브(서열번호 10), miR-92a (서열번호 18), miR-141 분자 검출용 캡처 프로브(서열번호 19), 대조군 캡처 프로브((5'→3': Biotin-CCC CCC CCC CAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA: 서열번호 16)를 각각 스폿팅하여 제조하였다. 상기 대조군 캡처 프로브는 스트렙타비딘-코팅된 금나노입자를 대조군 영역에서 포획하기 위한 것이다.
임상 샘플의 RNA 분석을 위해, 0.3 μL의 비대칭 PCR 반응 생성물, 6μL의 스트렙타비딘 코팅된 금나노입자, 및 23.7 μL의 러닝버퍼[20 mM sodium borate (pH 8.0), 3% (w/v) sucrose, 0.6 M NaCl, 0.2% (v/v) Tween 20, 및 0.1% (w/v) sodium azide]를 혼합하고, 캡처 프로브(capture probe) DNA가 고정화된 LFA 스트립을 상기 혼합물에 10분간 침지시켰다.
임상 샘플(정상인 1명, 암 진행 단계 I-IV의 환자 4명)의 엑소좀 RNA의 다중 분석을 위해, miR-345에 대한 0.3 μL의 비대칭 PCR 반응 생성물, miR-92a에 대한 0.3 μL의 비대칭 PCR 반응 생성물, 및 miR-141에 대한 0.6 μL의 비대칭 PCR 반응 생성물, 6μL의 스트렙타비딘 코팅된 금나노입자, 및 22.8 μL의 러닝버퍼[20 mM sodium borate (pH 8.0), 3% (w/v) sucrose, 0.6 M NaCl, 0.2% (v/v) Tween 20, 및 0.1% (w/v) sodium azide]를 혼합하고, miR-345, miR-92a, 및 miR-141에 대한 캡처 프로브 DNA가 LFA 스트립상의 각각 상이한 구역에 고정화된 LFA 스트립을 상기 혼합물에 15분간 침지시켰다.
4-4. 프라이머 및 캡처 프로브의 염기서열
아래의 표 5에 상기한 RNA 분자 검출 실험에 사용된 역전사 프라이머, 전방향 프라이머, 유니버설 역방향 프라이머 및 캡처 프로브의 염기서열을 정리하여 나타내었다.
| Bio-marker | Name | 염기서열 (5'→ 3') |
| miR-345 | 스템-루프 역전사 프라이머 |
GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACG AGC CC (서열번호 1) |
| 전방향 프라이머 | CAG GCA GTA CAC AAT CTA CGT CGG CGG CTG ACT CCT AGT CCA (서열번호 2) | |
| miR-92a | 스템-루프 역전사 프라이머 |
GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA CAG GC (서열번호 3) |
| 전방향 프라이머 | TCG CAT AAC TAA CGG TCA ACC CGG CTA TTG CAC TTG TCC CG (서열번호 17) | |
| miR-141 | 스템-루프 역전사 프라이머 |
GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACC CAT CT (서열번호 5) |
| 전방향 프라이머 | ATA GCA CCG GAA TAA GGC CCG GCA CTA ACA CTG TCT GGT AA (서열번호 18) | |
| 유니버설 역방향 프라이머 | GTG CAG GGT CCG AGG T (서열번호 9) | |
| 캡처 프로브 | miR-345 | NH2-CAG GCA GTA CAC AAT CTA CG (서열번호 10) |
| miR-92a | NH2-TCG CAT AAC TAA CGG TCA AC (서열번호 19) | |
| miR-141 | NH2-ATA GCA CCG GAA TAA GGC CC (서열번호 20) | |
4-5. 실험 결과
도 6의 패널 A 및 B에서 보여지는 바와 같이, 검출 시료에 miR-345, miR-92a, miR-141 분자 중의 특정 엑소좀 miRNA 분자가 존재하는 경우, DNA 바코드 서열에 대응하는 특정 캡처 프로브가 고정화된, LFA 스트립상의 해당 영역에서 신호가 발생하였다. 도 6의 패널 C 및 D는 정상인과 상이한 암 진행단계에 있는 환자로부터의 시료에 대한 검출 결과이다. miR-345 분자에 대한 신호는 NTC 시료를 제외한 모든 시료에서 관찰된 반면, miR-92a, miR-141 분자에 대한 신호는 건강한 정상인 시료와 비교하여, 상이한 암 진행단계에 있는 환자의 시료에서 더 높게 나타났다. 위와 같은 결과는 단일의 LFA 스트립상에서 다양한 엑소좀 miRNA 분자들을 다중 검출할 수 있음을 보여준다.
상기에서는 본 출원의 대표적인 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 출원의 범위는 상기와 같은 특정 실시예만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 출원의 청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.
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Simultaneously and Kit for the Same Method
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<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-345 reverse transcription primer
<400> 1
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgagccc 50
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-345 forward primer
<400> 2
caggcagtac acaatctacg tcggcggctg actcctagtc ca 42
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-92a reverse transcription primer
<400> 3
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacacaggc 50
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-92a forward primer
<400> 4
caggcagtac acaatctacg ccggctattg cacttgtccc g 41
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-141 reverse transcription primer
<400> 5
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacccatct 50
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-141 forward primer
<400> 6
caggcagtac acaatctacg ggcactaaca ctgtctggta a 41
<210> 7
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNU6-1 reverse transcription primer
<400> 7
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacaaaata tg 52
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNU6-1 forward primer
<400> 8
caggcagtac acaatctacg acgcaaattc gtgaagcgtt c 41
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Universal Reverse Primer
<400> 9
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Capture Probe
<400> 10
caggcagtac acaatctacg 20
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA tag
<400> 11
gcacaccacg acacacaagc ctcgaccgtt agcagcatga 40
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Universal Forward Primer
<400> 12
gcacaccacg acacacaagc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Universal Reverse Primer
<400> 13
tcatgctgct aacggtcgag 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Capture Probe
<400> 14
gcacaccacg acacacaagc 20
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Capture Probe for CD63
<400> 15
gcacatcatg acacacaa 18
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Control Capture Probe
<400> 16
cccccccccc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 30
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer for miR-92a
<400> 17
tcgcataact aacggtcaac ccggctattg cacttgtccc g 41
<210> 18
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer for miR-141
<400> 18
atagcaccgg aataaggccc ggcactaaca ctgtctggta a 41
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Capture Probe for miR-92a
<400> 19
tcgcataact aacggtcaac 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Capture Probe for miR-141
<400> 20
atagcaccgg aataaggccc 20
Claims (40)
- 다음의 단계를 포함하는 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하는 방법:
(a) 검출하고자 하는 표적 RNA 분자가 포함된 것으로 추정되는 생물학적 샘플을 상기 표적 RNA 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 서열을 포함하는 역전사(reverse transcription)용 프라이머가 포함된 반응액에 첨가하여 역전사 반응을 수행하는 단계;
(b) 상기 역전사 반응 생성물을, 제1의 바코드(barcode) 서열을 포함하는 전방향 프라이머(forward primer) 및 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 과량의 유니버설 역방향 프라이머(universal reverse primer)가 포함된 반응액에 첨가하여 비대칭 증폭 반응(asymmetric amplification reaction)을 수행하는 단계;
(c) 검출하고자 하는 표적 단백질이 포함된 것으로 추정되는 생물학적 샘플을 고상 지지체에 가하여 상기 표적 단백질을 상기 고상 지지체상에 고정화하는 단계;
(d) 상기 고상 지지체에 상기 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 접촉시키는 단계;
(e) 상기 항체를 접촉시킨 고상 지지체에, 상기 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 태그(tag)를 접촉시키는 단계로서, 상기 DNA 태그는 제2의 바코드(barcode) 서열, 유니버설 전방향 프라이머(universal forward primer) 서열과 동일한 서열, 및 유니버설 역방향 프라이머 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것인 단계;
(f) 상기 DNA 태그를 회수하는 단계;
(g) 상기 회수한 DNA 태그를, 유니버설 전방향 프라이머 및 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 과량의 유니버설 역방향 프라이머가 포함된 반응액에 첨가하여 비대칭 증폭 반응(asymmetric amplification reaction)을 수행하는 단계;
(h) 상기 단계 (b)의 비대칭 증폭 산물 및 상기 단계 (g)의 비대칭 증폭 산물을, 제1의 캡처 프로브 및 제2의 캡처 프로브가 고정화된 고상 지지체에 가하여 반응시키는 단계로서, 상기 제1의 캡처 프로브는 상기 제1의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하고, 상기 제2의 캡처 프로브는 상기 제2의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 것인, 단계; 및
(i) 상기 반응시킨 단계 (h)의 고상 지지체에 상기 합텐(hapten)에 결합할 수 있는 신호발생분자를 접촉시키는 단계.
- 청구항 1에 있어서,
상기 단계 (a)의 역전사용 프라이머는 프라이머내에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이룰 수 있는 상보적 서열을 프라이머내에 포함하는 것인, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하는 방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 단계 (b)의 제1의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머는 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것인, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하는 방법.
- 청구항 3에 있어서,
상기 전방향 프라이머에서, 상기 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열은 상기 전방향 프라이머의 3'-말단 쪽에 위치하는 것인, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하는 방법.
- 청구항 3에 있어서,
상기 단계 (b)의 제1의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머에서 상기 제1의 바코드 서열은 전방향 프라이머의 5'-말단 쪽에 위치하는 것인, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하는 방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 단계 (b)의 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함하는 것인, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하는 방법.
- 청구항 6에 있어서,
상기 단계 (b)의 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루는 서열과 또는 이 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함하는 것인, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하는 방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 단계 (b), (g) 및 (i)에서의 합텐(hapten)은 비오틴(biotin), FAM(fluorescein amidite), Alexa Fluor®, 또는 DIG(digoxigenin) 인 것인, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하는 방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 단계 (d)의 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체는 비오틴(biotin)이 결합된 것인, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하는 방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 단계 (e)의 DNA 태그는 5'-말단에 비오틴이 결합된 것인, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하는 방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 단계 (h)에서, 상기 제1의 캡처 프로브 및 상기 제2의 캡처 프로브는 단일한 고상 지지체상에 고정화된 것인, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하는 방법.
- 청구항 11에 있어서,
상기 제1의 캡처 프로브 및 상기 제2의 캡처 프로브는 단일한 고상 지지체상에서 서로 다른 영역에 각각 고정화된 것인, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하는 방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 단계 (h)에서, 상기 제1의 캡처 프로브 및 상기 제2의 캡처 프로브는 서로 다른 고상 지지체에 각각 고정화된 것인, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하는 방법.
- 다음의 제1 내지 제3의 컴포넌트 세트를 포함하는, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하기 위한 키트:
(a) 다음의 성분을 포함하는 표적 RNA 분자 증폭용 제1 컴포넌트 세트;
(i) 표적 RNA 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 서열을 포함하는 역전사(reverse transcription)용 프라이머;
(ii) 제1의 바코드(barcode) 서열을 포함하는 전방향 프라이머; 및
(iii) 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머;
(b) 다음의 성분을 포함하는 표적 단백질에 연관된 DNA 태그(tag) 서열 증폭용 제2 컴포넌트 세트;
(i) 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체;
(ii) 제2의 바코드(barcode) 서열, 유니버설 전방향 프라이머 서열과 동일한 서열, 및 유니버설 역방향 프라이머 서열에 상보적인 서열을 포함하는, 상기 항체에 결합할 수 있는 DNA 태그;
(iii) 유니버설 전방향 프라이머; 및
(iv) 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머; 및
(c) 다음의 성분을 포함하는 고상 검출용 제3 컴포넌트 세트;
(i) 상기 제1의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 제1의 캡처 프로브 및 상기 제2의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 제2의 캡처 프로브가 고정된 고상 지지체; 및
(ii) 상기 합텐(hapten)에 결합하여 신호를 발생할 수 있는 신호발생분자.
- 청구항 14에 있어서,
상기 제1 컴포넌트 세트의 역전사용 프라이머는 프라이머내에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이룰 수 있는 상보적 서열을 프라이머내에 포함하는 것인, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하기 위한 키트.
- 청구항 14에 있어서,
상기 제1 컴포넌트 세트의 제1의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머는 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것인, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하기 위한 키트.
- 청구항 16에 있어서,
상기 전방향 프라이머에서 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열은 상기 전방향 프라이머의 3'-말단 쪽에 위치하는 것인, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하기 위한 키트.
- 청구항 14에 있어서,
상기 제1 컴포넌트 세트의 제1의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머에서 상기 제1의 바코드 서열은 전방향 프라이머의 5'-말단 쪽에 위치하는 것인, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하기 위한 키트.
- 청구항 14에 있어서,
상기 제1 컴포넌트 세트의 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함하는 것인, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하기 위한 키트.
- 청구항 15에 있어서,
상기 제1 컴포넌트 세트의 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루는 서열과 또는 이 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함하는 것인, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하기 위한 키트.
- 청구항 14에 있어서,
상기 제1 내지 제3의 컴포턴트 세트의 합텐(hapten)은 비오틴(biotin), FAM(fluorescein amidite), Alexa Fluor®, 또는 DIG(digoxigenin) 인 것인, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하기 위한 키트.
- 청구항 14에 있어서,
상기 제2 컴포넌트 세트의 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체는 비오틴(biotin)이 결합된 것인, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하기 위한 키트.
- 청구항 14에 있어서,
상기 제2 컴포넌트 세트의 DNA 태그는 5'-말단에 비오틴이 결합된 것인, 표적 RNA 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하기 위한 키트.
- 다음의 단계를 포함하는 표적 RNA 분자를 검출하는 방법:
(a) 검출하고자 하는 표적 RNA 분자가 포함된 것으로 추정되는 생물학적 샘플을 상기 표적 RNA 분자에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 역전사(reverse transcription)용 프라이머가 포함된 반응액에 첨가하여 역전사 반응을 수행하는 단계;
(b) 상기 역전사 반응 생성물을, 제1의 바코드(barcode) 서열을 포함하는 전방향 프라이머(forward primer) 및 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 과량의 유니버설 역방향 프라이머(universal reverse primer)가 포함된 반응액에 첨가하여 비대칭 증폭 반응(asymmetric amplification reaction)을 수행하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 비대칭 증폭 산물을, 제1의 캡처 프로브가 고정화된 고상 지지체에 가하여 반응시키는 단계로서, 상기 제1의 캡처 프로브는 상기 제1의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 것인, 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)에서 비대칭 증폭 산물과 반응하는 고상 지지체에 상기 합텐(hapten)에 결합할 수 있는 신호발생분자를 접촉시키는 단계.
- 다음의 단계를 포함하는 표적 RNA 분자를 다중 검출하는 방법:
(a) 검출하고자 하는 제1의 표적 RNA 분자가 포함된 것으로 추정되는 생물학적 샘플을 상기 표적 RNA 분자에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 역전사(reverse transcription)용 프라이머가 포함된 반응액에 첨가하여 역전사 반응을 수행하는 단계;
(b) 상기 제1의 표적 RNA 분자에 대한 역전사 반응 생성물을, 제1의 바코드(barcode) 서열을 포함하는 전방향 프라이머(forward primer) 및 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 과량의 유니버설 역방향 프라이머(universal reverse primer)가 포함된 반응액에 첨가하여 비대칭 증폭 반응(asymmetric amplification reaction)을 수행하는 단계;
(c) 검출하고자 하는 제2의 표적 RNA 분자가 포함된 것으로 추정되는 생물학적 샘플을 상기 제2의 표적 RNA 분자에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 역전사(reverse transcription)용 프라이머가 포함된 반응액에 첨가하여 역전사 반응을 수행하는 단계;
(d) 상기 제2의 표적 RNA 분자에 대한 역전사 반응 생성물을, 제2의 바코드(barcode) 서열을 포함하는 전방향 프라이머(forward primer) 및 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 과량의 유니버설 역방향 프라이머(universal reverse primer)가 포함된 반응액에 첨가하여 비대칭 증폭 반응(asymmetric amplification reaction)을 수행하는 단계;
(e) 상기 단계 (b)의 비대칭 증폭 산물 및 상기 단계 (d)의 비대칭 증폭 산물을, 제1의 캡처 프로브 및 제2의 캡처 프로브가 고정화된 고상 지지체에 가하여 반응시키는 단계로서, 상기 제1의 캡처 프로브는 상기 제1의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하고, 상기 제2의 캡처 프로브는 상기 제2의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 것인, 단계; 및
(f) 상기 단계 (e) 에서 비대칭 증폭 산물과 반응하는 고상 지지체에 상기 합텐(hapten)에 결합할 수 있는 신호발생분자를 접촉시키는 단계.
- 청구항 25에 있어서,
상기 단계 (b)의 제1의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머는 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것인, 표적 RNA 분자를 다중 검출하는 방법.
- 청구항 25에 있어서,
상기 단계 (d)의 제2의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머는 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것인, 표적 RNA 분자를 다중 검출하는 방법.
- 청구항 26 또는 청구항 27에 있어서,
상기 전방향 프라이머에서, 상기 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열은 상기 전방향 프라이머의 3'-말단 쪽에 위치하는 것인, 표적 RNA 분자를 다중 검출하는 방법.
- 청구항 26 또는 청구항 27에 있어서,
상기 단계 (b)의 제1의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머에서 상기 제1의 바코드 서열은 전방향 프라이머의 5'-말단 쪽에 위치하거나,
상기 단계 (d)의 제2의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머에서 상기 제2의 바코드 서열은 전방향 프라이머의 5'-말단 쪽에 위치하는 것인,
표적 RNA 분자를 다중 검출하는 방법.
- 청구항 25에 있어서,
상기 단계 (b)의 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함하는 것인, 표적 RNA 분자를 다중 검출하는 방법.
- 청구항 25에 있어서,
상기 단계 (d)의 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함하는 것인, 표적 RNA 분자를 다중 검출하는 방법.
- 다음의 제1 및 제2의 컴포넌트 세트를 포함하는, 표적 RNA 분자를 검출하기 위한 키트:
(a) 다음의 성분을 포함하는 표적 RNA 분자 증폭용 제1 컴포넌트 세트;
(i) 표적 RNA 분자에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 역전사(reverse transcription)용 프라이머;
(ii) 제1의 바코드(barcode) 서열을 포함하는 전방향 프라이머; 및
(iii) 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머;
및
(b) 다음의 성분을 포함하는 고상 검출용 제2 컴포넌트 세트;
(i) 상기 제1의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 제1의 캡처 프로브가 고정된 고상 지지체; 및
(ii) 상기 합텐(hapten)에 결합하여 신호를 발생할 수 있는 신호발생분자.
- 다음의 제1, 제2 및 제3의 컴포넌트 세트를 포함하는, 표적 RNA 분자를 다중 검출하기 위한 키트:
(a) 다음의 성분을 포함하는 제1의 표적 RNA 분자 증폭용 제1 컴포넌트 세트;
(i) 제1의 표적 RNA 분자에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 역전사(reverse transcription)용 프라이머;
(ii) 제1의 바코드(barcode) 서열을 포함하는 전방향 프라이머; 및
(iii) 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머;
(b) 다음의 성분을 포함하는 제2의 표적 RNA 분자 증폭용 제2 컴포넌트 세트;
(i) 제2의 표적 RNA 분자에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 역전사(reverse transcription)용 프라이머;
(ii) 제2의 바코드(barcode) 서열을 포함하는 전방향 프라이머; 및
(iii) 5’-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머; 및
(c) 다음의 성분을 포함하는 고상 검출용 제3 컴포넌트 세트;
(i) 상기 제1의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 제1의 캡처 프로브 및 상기 제2의 바코드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 제2의 캡처 프로브가 고정된 고상 지지체; 및
(ii) 상기 합텐(hapten)에 결합하여 신호를 발생할 수 있는 신호발생분자.
- 청구항 33에 있어서,
상기 제1 컴포넌트 세트의 제1의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머는 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열을 포함하거나,
상기 제2 컴포넌트 세트의 제2의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머는 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것인,
표적 RNA 분자를 다중 검출하기 위한 키트.
- 청구항 34에 있어서,
상기 전방향 프라이머에서 역전사 반응 생성물 서열에 상보적인 서열은 상기 전방향 프라이머의 3'-말단 쪽에 위치하는 것인,
표적 RNA 분자를 다중 검출하기 위한 키트.
- 청구항 33에 있어서,
상기 제1 컴포넌트 세트의 제1의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머에서 상기 제1의 바코드 서열은 전방향 프라이머의 5'-말단 쪽에 위치하는 것인, 표적 RNA 분자를 다중 검출하기 위한 키트.
- 청구항 33에 있어서,
상기 제2 컴포넌트 세트의 제2의 바코드 서열을 포함하는 전방향 프라이머에서 상기 제2의 바코드 서열은 전방향 프라이머의 5'-말단 쪽에 위치하는 것인, 표적 RNA 분자를 다중 검출하기 위한 키트.
- 청구항 33에 있어서,
상기 제1 컴포넌트 세트의 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함하거나,
상기 제2 컴포넌트 세트의 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함하는 것인,
표적 RNA 분자를 다중 검출하기 위한 키트.
- 청구항 33에 있어서,
상기 제1 컴포넌트 세트의 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루는 서열과 또는 이 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함하거나,
상기 제2 컴포넌트 세트의 5'-말단이 합텐(hapten)으로 변형된 유니버설 역방향 프라이머는 상기 역전사용 프라이머의 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루는 서열과 또는 이 서열 중 일부 서열과 동일한 서열을 포함하는 것인,
표적 RNA 분자를 다중 검출하기 위한 키트.
- 청구항 33에 있어서,
상기 제1 내지 제3의 컴포턴트 세트의 합텐(hapten)은 비오틴(biotin), FAM(fluorescein amidite), Alexa Fluor®, 또는 DIG(digoxigenin) 인 것인,
표적 RNA 분자를 다중 검출하기 위한 키트.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| KR1020210140646 | 2021-10-21 | ||
| KR20210140646 | 2021-10-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230057233A true KR20230057233A (ko) | 2023-04-28 |
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ID=86143404
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210169317A KR20230057233A (ko) | 2021-10-21 | 2021-11-30 | 표적 rna 분자 및 표적 단백질을 동시에 검출하는 방법 및 키트 |
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|---|---|
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20110129834A (ko) | 2010-05-26 | 2011-12-02 | 코닝 인코포레이티드 | 유동의 용융 유리 리본의 두께 조절 장치 및 방법 |
-
2021
- 2021-11-30 KR KR1020210169317A patent/KR20230057233A/ko unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20110129834A (ko) | 2010-05-26 | 2011-12-02 | 코닝 인코포레이티드 | 유동의 용융 유리 리본의 두께 조절 장치 및 방법 |
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