CN114959002A - 一种诊断急性心肌梗死的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种诊断急性心肌梗死的方法，具体的，本发明提供了用于诊断急性心肌梗死的生物标志物，所述的标志物包括GZMA、S100A8和/或SLAMF7。本发明有助于解决现存在于生物医药领域中的问题，即缺少特异性和敏感性高的用于急性心肌梗死早期诊断的方法，从而及时有效的治疗患者。

Description

一种诊断急性心肌梗死的方法
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及一种诊断急性心肌梗死的方法。
背景技术
急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。临床上多有剧烈而持久的胸骨后疼痛，休息及硝酸酯类药物不能完全缓解，伴有血清心肌酶活性增高及进行性心电图变化，可并发心律失常、休克或心力衰竭，常可危及生命。
现有技术中用于诊断急性心肌梗死的方法包括：(1)心电图特征性改变为新出现Q波及ST段抬高和ST-T动态演变；(2)心肌坏死血清生物标志物升高，肌酸激酶同工酶(CK-MB)及肌钙蛋白(T或I)升高。可于发病3～6小时开始增高，CK-MB于3～4d恢复正常，肌钙蛋白于11～14天恢复正常；(3)其他，白细胞数增多，中性粒细胞数增多，嗜酸性粒细胞数减少或消失，血沉加快，血清肌凝蛋白轻链增高。关于心电图特征性改变的诊断方法，由于国内外缺乏较大样本的临床对照研究，目前各个权威机构推荐的AMI的心电图诊断标准的灵敏度和特异性尚不清楚，没有统一标准，限制了其应用。用于诊断急性心肌梗死的血清蛋白标志物经常联合使用，且血清蛋白标志物的检测特异性、准确性均不尽人意。通过白细胞数等免疫细胞的检测来诊断急性心肌梗死却不能体现早期诊断的理念。因此，基于现有技术中检测急性心肌梗死的手段的局限性，寻找一种特异性和灵敏性高的用于急性心肌梗死早期诊断的方法是亟待解决的问题。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种特异性和灵敏性高的用于急性心肌梗死早期诊断的方法。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种用于诊断急性心肌梗死的生物标志物，所述的标志物包括GZMA、S100A8和/或SLAMF7。
术语“生物标志物”是指以可用于预测个体的疾病状态的不同浓度存在于个体中的生物分子。生物标志物可包括，但不限于，核酸、蛋白质及其变体和片段。生物标志物可以是包含编码该生物标志物的全部或部分核酸序列或这类序列的互补体的DNA。可用于本发明的生物标志物核酸被认为包括包含任何目的核酸序列的全部或部分序列的DNA和RNA。
在本发明中，生物标志物例如GZMA(geneID：3001)、S100A8(geneID：6279)、SLAMF7(geneID：57823)，包括gene及其编码的蛋白及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的生物标志物，以及源自细胞中加工的任何形式的生物标志物。该术语涵盖生物标志物的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。
第二方面，本发明提供了一种试剂，所述的试剂能够检测本发明第一方面所述的生物标志物的表达水平。
作为一种实施方式，所述的试剂包括能够检测所述生物标志物的mRNA的表达水平的试剂、能够检测所述生物标志物的编码蛋白的表达水平的试剂。
作为一种实施方式，所述的试剂包括引物、探针、抗体。
术语“引物”或“探针”涵盖具有特定序列的寡核苷酸或具有特定序列的寡核苷酸。在其他实施方案中，通过间接检测方法检测核酸。例如，生物素化的探针可以与链霉亲和素缀合的染料组合以检测结合的核酸。链霉亲和素分子结合扩增的生物标志物上的生物素标记，并且结合的生物标志物通过检测附着在链霉亲和素分子上的染料分子来检测。在一个实施方案中，缀合链霉亲和素的染料分子包含PHYCOLINK。链霉亲和素R-藻红蛋白(PROzyme)。其他缀合染料分子是本领域技术人员已知的。
标记包括，但不限于：发光、光散射和吸光化合物，其产生或淬灭可检测的荧光、化学发光或生物发光信号。在一些实施方案中使用包括报告荧光团和淬灭剂荧光团的双重标记的荧光探针。应当理解，选择具有不同发射光谱的成对荧光团，使得它们可以容易地区分。在某些实施方案中，标记是杂交稳定部分，其用于增强、稳定或影响双链体的杂交，例如，嵌入剂和嵌入染料。
本发明的引物或探针可以使用亚磷酰胺固相载体方法或其他公知的方法化学合成。这种核酸序列可以利用本领域中公知的多种手段来进行变形。这种变形的非限制性例包括甲基化、封装、天然核苷酸的一种以上的同源物的取代以及核苷酸之间的变形，例如，变形为不带电的连接体(例：膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)或带电的连接体(例：硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)。
在本发明中，可通过优化步骤在一系列过程中确定使探针与cDNA分子杂交的合适条件。该步骤由本领域普通技术人员通过一系列过程进行，以建立用于在研究室中使用的协议。例如，温度、成分浓度、杂交及洗涤时间、缓冲液成分及其pH以及离子强度等条件取决于探针的长度、GC量及靶核苷酸序列等各种因素。用于杂交的详细条件可从“JosephSambrook,et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold SpringHarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)；以及M.L.M.Anderson,NucleicAcidHybridization,Springer-Verlag New York Inc.N.Y.(1999)”中确认。例如，在上述严格条件中的高严格条件是指在65℃下在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS，sodium dodecyl sulfate)、1mM EDTA中进行杂交，并且在68℃下在0.1×标准柠檬酸盐水(SSC，standard saline citrate)/0.1％十二烷基硫酸钠中进行洗涤。或者，高严格条件是指在48℃下在6×标准柠檬酸盐水/0.05％焦磷酸钠中进行洗涤。低严格条件是指例如在42℃下在0.2×标准柠檬酸盐水/0.1％十二烷基硫酸钠中进行洗涤。
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其通过至少一个抗原结合位点识别并特异性结合靶标，诸如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述的组合。如本文所用，该术语涵盖完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、单链抗体、抗体片段(诸如Fab、Fab′、F(ab')2和Fv片段)、单链Fv(scFv)抗体、多特异性抗体(诸如双特异性抗体)、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白，以及包含抗原结合位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要该抗体表现出所需的生物结合活性。抗体可以是五种主要类别的免疫球蛋白中的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。不同类别的免疫球蛋白具有不同的和熟知的亚单位结构和三维构型。抗体可以是裸露的或与其他分子缀合，包括但不限于毒素和放射性同位素。
作为一种优选的实施方式，所述的检测所述生物标志物的mRNA的表达水平使用选自聚合酶链反应、实时荧光定量逆转录多聚酶链反应、逆转录聚合酶链反应、竞争性聚合酶链反应、核酸酶保护分析、原位杂交法、核酸微阵列、RNA印迹或DNA芯片的方法中的任何一种来进行。
作为一种优选的实施方式，所述的检测所述生物标志物的编码蛋白的表达水平使用选自多重邻位延伸分析、酶联免疫吸附、放射免疫测定、夹心分析、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、荧光免疫测定、酶底物显色、抗原抗体聚集、荧光激活细胞分选、质谱分析或蛋白质芯片测量中的任何一种来进行。
第三方面，本发明提供了一种芯片，所述的芯片包括本发明第二方面所述的试剂。
在本发明中，“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。
“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。
第四方面，本发明提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括本发明第二方面所述的试剂。
本发明提供了用于诊断受试者中的急性心肌梗死的试剂盒，该试剂盒用于确定前面所述生物标志物的表达水平。试剂盒可以包括适于选择性检测来源于受试者的样品中用于诊断急性心肌梗死的生物标志物或生物标志物组的存在的材料和试剂。例如，在一个实施方案中，该试剂盒可以包括与生物标志物特异性杂交的试剂。这类试剂可以是适于用于在mRNA水平上测量生物标志物基因的mRNA表达量的试剂，例如，探针或引物。该类试剂还可以是在蛋白质水平上测量生物标志物基因的编码蛋白的表达量的制剂，例如，抗体。该试剂盒可以包括用于进行测定以检测一种或多种生物标志物的试剂。
在进一步的实施方案中，试剂盒可以含有标记或产品插页形式的合适操作参数的说明书。例如，说明书可以包括关于如何收集样品，如何确定样品中一种或多种生物标志物的水平，或如何将样品中一种或多种生物标志物的水平与受试者患急性心肌梗死风险相关联的信息或指导。
在另一个实施方案中，试剂盒可以含有一个或多个容器，其具有生物标志物样品，以用作参比标准，合适的对照，或用于测定的校准以检测测试样品中的生物标志物。
第五方面，本发明提供了如下任一项所述的应用：
(1)本发明第一方面所述的标志物在制备诊断急性心肌梗死的工具中的应用；
(2)本发明第二方面所述的试剂在制备诊断急性心肌梗死的工具中的应用；
(3)本发明第三方面所述的芯片在制备诊断急性心肌梗死的工具中的应用；
(4)本发明第四方面所述的试剂盒在制备诊断急性心肌梗死的工具中的应用。
第六方面，本发明提供了一种筛选治疗急性心肌梗死的候选化合物的方法，所述的方法包括：
(1)在测试组中，向待测对象施用测试化合物，检测测试组中来源于所述对象的样本中生物标志物的水平V1；在对照组中，向待测对象施用空白对照，检测对照组中来源于所述对象的样本中生物标志物的水平V2；
(2)比较上一步骤检测得到的水平V1和水平V2，从而确定所述测试化合物是否是治疗急性心肌梗死的候选化合物；
所述的生物标志物包括GZMA、S100A8和/或SLAMF7。
术语“样本”是指体液样本，分离的细胞的样本或来自组织或器官的样本。体液样本可以通过公知的技术获得，并且包括，血液、尿液、淋巴液、痰液、腹水、支气管灌洗液或任意其他身体分泌物或其衍生物的样本。组织或器官样本可以从任意组织或器官获得，例如，通过组织活检获得。分离的细胞可以通过分离技术，如离心或细胞分选，从体液或组织或器官获得，例如，细胞、组织或器官样品可以从表达或产生生物标记的这些细胞、组织或器官获得。样本可以是冷冻的、新鲜的、固定的(例如，福尔马林固定的)、离心的和/或包埋的(例如，石蜡包埋的)等。当然，在评估样本中标记的量之前，细胞样本可以进行多种公知的收集后制备和存储技术(例如，核酸和/或蛋白提取，固定，保存，冷冻，超滤，浓缩，蒸发，离心等)。同样地，组织活检样本也可以进行收集后制备和存储技术，例如，固定。样本可以在治疗之前、治疗过程中或治疗后采集。样本可以从怀疑患有或诊断患有急性心肌梗死并且因此可能需要治疗的患者采集，或者从不被怀疑患有任何病症的正常个体采集。在本发明的具体实施例中，所述的样本为血液、细胞。
附图说明
图1是GZMA相对表达水平的箱线图；
图2是S100A8相对表达水平的箱线图；
图3是SLAMF7相对表达水平的箱线图；
图4是GZMA诊断急性心肌梗死的ROC曲线图；
图5是S100A8诊断急性心肌梗死的ROC曲线图；
图6是SLAMF7诊断急性心肌梗死的ROC曲线图；
图7是GZMA+S100A8诊断急性心肌梗死的ROC曲线图；
图8是S100A8+SLAMF7诊断急性心肌梗死的ROC曲线图；
图9是GZMA+SLAMF7诊断急性心肌梗死的ROC曲线图；
图10是GZMA+S100A8+SLAMF7诊断急性心肌梗死的ROC曲线图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1筛选差异表达基因
一、研究对象
收集3例急性心肌梗死患者和3例健康对照者的血液样本。
二、纳入及排除标准
1、纳入标准
(1)急性心肌梗死患者
纳入标准：血清心肌标志物，主要是肌钙蛋白升高，至少超过99％参考值上限，同时伴有CAG或CCTA证实冠状动脉内血栓形成，一支或一支以上冠状动脉主干或分支狭窄，程度大于70％。
(2)健康对照者
纳入标准：心电图无冠心病特点，血清心肌酶标志物，主要是肌钙蛋白正常，CAG或CCTA示冠状动脉管腔无任何异常狭窄。
2、排除标准
(1)患有其他心脏疾病的患者，如风湿性心脏病，瓣膜性心脏病病或
先天性心脏病等疾病的患者；
(2)合并有以下疾病，如结缔组织病，急、慢性肾功能不全，恶性肿瘤，或其他免疫炎症参与或相关的疾病；
(3)合并有栓塞性疾病，如弥漫性血管内凝血、肺栓塞、下肢动静脉栓塞、肠系膜动静脉栓塞等血管栓塞性疾病；
(4)正在服用抗炎药物的患者。
三、实验步骤
1、提取血液总RNA
(1)匀浆处理：用含EDTA的抗凝真空管采集受试者lml血液，按照1：3的比例加入3m1 TRIpure LS Reagent，用漩涡混合器震荡涡旋15-20s以裂解血液中的细胞。
(2)15-30℃孵育5min以使核蛋白体完全分解。
(3)加入0.6m1三氯甲烷，盖紧样品管盖，剧烈震荡15s并在室温下孵育3min。
(4)在4℃12000rpm的高速低温离心机上离心10min，之后样品会分为三层，此时RNA便溶在上层的水相中，将上清液移入到新的离心管中。
(5)加入等体积的75％的乙醇，轻柔颠倒混匀，可能会有沉淀，将沉淀和液体一起分次倒入套着收集管的吸附柱RA中。
(6)反复于4℃10 000rpm离心45s，弃掉废液，直至所有沉淀与溶液都过柱。
(7)加入500μl去蛋白液RE(Bioteke)，12000rpm离心45s，弃掉废液。
(8)加入700μl漂洗液RW(Bioteke)，12000rpm离心60s，弃掉废液。
(9)于4℃12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(10)取出吸附柱RA，放入RNase free的离心管中，加入80μL RNase free water(提前65-70℃热浴)，室温下放置2min，12 000rpm离心1min。
2、RNA质量检测
使用紫外分光光度计测定总RNA的浓度和纯度。
3、文库的构建与转录组测序
(1)DNase消化去除DNA：利用DNase I消化Total RNA样品中存在的DNA片段，磁珠纯化回收反应产物，最后溶解于DEPC水。
(2)去除rRNA：取消化好的Total RNA样品，使用试剂盒去除rRNA，去除之后进行Agilent 2100检测，验证rRNA去除效果；
(3)RNA打断：取上一步样品，加入打断Buffer，置于PCR仪中进行热打断，打断到130-160nt；
(4)反转录一链的合成：向打断后的样品中加入适量引物，充分混匀后在Thermomixer适温反应一定时间，使之打开二级结构并与引物结合，再加入提前配制的一链合成反应体系Mix，在PCR仪上按相应程序合成一链cDNA；
(5)反转录二链的合成：配制二链合成反应体系，在Thermomixer上适温反应一定时间，合成二链cDNA，反应产物用磁珠进行纯化回收。产物用磁珠进行纯化回收；
(6)末端修复：配制末端修复反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，对反转录得到的cDNA双链的粘性末端进行修复。末端修复产物用磁珠进行纯化回收，最后将样品溶于EB Solution；
(7)cDNA末端加“A”：配制加“A”反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使末端修复的产物cDNA的3’末端加上A碱基；
(8)cDNAadapter的连接：配制接头连接反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使接头与A碱基连接，产物用磁珠进行纯化回收。
(9)PCR反应及产物回收：配制PCR反应体系，选择适当的PCR反应程序，对上步骤得到的产物进行扩增。对PCR产物进行磁珠纯化回收。回收产物溶于EB溶液中。贴上标签，文库制备至此完成。
(10)文库质量检测：使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent DNA1000Reagents)检测文库的片段大小及浓度。
(11)PCR产物环化：将PCR产物变性为单链后，配制环化反应体系，充分混匀适温反应一定时间，得到单链环形产物，消化掉未被环化的线性DNA分子后，即得到最终的文库。
(12)上机测序：单链环状DNA分子通过滚环复制，形成一个包含200多个拷贝的DNA纳米球(DNB)。将得到的DNBs采用高密度DNA纳米芯片技术，加到芯片上的网状小孔内。通过边合成边测序的方法，得到50bp/100bp的测序读长。
4、测序数据质量控制
对原始测序数据进行过滤，从而得到高质量的测序数据(clean data)，步骤如下：去除reads中的adapter序列；剪切前去除5’端含有非AGCT的碱基；修剪测序质量较低的reads末端(测序质量值小于Q20)；去除含N的比例达到10％的reads；舍弃去adapter及质量修剪后长度小于25bp的小片段。
5、与参考基因组比对
使用hisat2分析软件将测序数据比对到参考基因组上。参考基因组来自于Ensembl数据库。
6、基因表达水平分析
通过比对到参考基因组区域的序列(clean reads)的数量来计算基因的表达水平。使用Stringtie根据Hisat2软件的比对结果，计算每个基因/转录本在样本中的FPKM值，以该值作为基因/转录本在样本中的表达量。
7、mRNA差异表达分析
使用DESeq2比较对照组跟疾病组mRNA的表达差异，差异分析步骤如下：首先对原始的read count进行标准化(normalization)，主要是对测序深度的校正；通过统计学模型进行假设检验概率(P-value)的计算，进行多重假设检验校正(BH)，得到padj值(错误发现率)，差异表达基因的筛选标准为：pvalue<0.01。
三、实验结果
与健康对照组相比，急性心肌梗死患者组血液中的GZMA、SLAMF7表达下调，S100A8表达上调。
实施例2大样本验证差异表达基因
从GEO数据库下载GSE66360数据(该数据集包含49名急性心肌梗死患者和50名健康者的循环内皮细胞样本)，用GPL570注释文档将探针注释到基因上，把对应多个基因的探针取平均数，用R语言limma包对其进行差异分析，得到1371个差异表达基因，筛选标准为：PVALUE<0.001。其中，本发明所涉及的差异表达基因的表达情况如表1、图1-3所示。
表1生物标志物在急性心肌梗死患者中的表达情况
Symbol logFC AveExpr P.Value adj.P.Val UpDown
GZMA -1.094 11.150 0.000 0.001 down
S100A8 1.736 10.956 0.000 0.000 up
SLAMF7 -0.829 7.311 0.000 0.002 down
本发明使用R语言pROC对上述基因进行ROC诊断分析，以验证上述基因的诊断价值。结果如表2、图4-10所示。
表2生物标志物/生物标志物组合诊断效能
Figure BDA0003447790990000111
Figure BDA0003447790990000121
上述结果证明，本发明所涉及的生物标志物可用于诊断急性心肌梗死。
以上结合附图详细描述了本申请的优选实施方式，但是，本申请并不限于上述实施方式中的具体细节，在本申请的技术构思范围内，可以对本申请的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本申请的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本申请对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本申请的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本申请的思想，其同样应当视为本申请所公开的内容。

Claims (10)

1.一种用于诊断急性心肌梗死的生物标志物，其特征在于，所述的生物标志物包括GZMA、S100A8和/或SLAMF7。
2.一种试剂，其特征在于，所述的试剂能够检测权利要求1所述的生物标志物的表达水平。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述的试剂包括能够检测所述生物标志物的mRNA的表达水平的试剂、能够检测所述生物标志物的编码蛋白的表达水平的试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述的试剂包括引物、探针、抗体。
5.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述的检测所述生物标志物的mRNA的表达水平使用选自聚合酶链反应、实时荧光定量逆转录多聚酶链反应、逆转录聚合酶链反应、竞争性聚合酶链反应、核酸酶保护分析、原位杂交法、核酸微阵列、RNA印迹或DNA芯片的方法中的任何一种来进行。
6.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述的检测所述生物标志物的编码蛋白的表达水平使用选自多重邻位延伸分析、酶联免疫吸附、放射免疫测定、夹心分析、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、荧光免疫测定、酶底物显色、抗原抗体聚集、荧光激活细胞分选、质谱分析或蛋白质芯片测量中的任何一种来进行。
7.一种芯片，其特征在于，所述的芯片包括权利要求2-6任一项所述的试剂。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求2-6任一项所述的试剂。
9.如下任一项所述的应用：
(1)权利要求1所述的标志物在制备诊断急性心肌梗死的工具中的应用；
(2)权利要求2-6任一项所述的试剂在制备诊断急性心肌梗死的工具中的应用；
(3)权利要求7所述的芯片在制备诊断急性心肌梗死的工具中的应用；
(4)权利要求8所述的试剂盒在制备诊断急性心肌梗死的工具中的应用。
10.一种筛选治疗急性心肌梗死的候选化合物的方法，其特征在于，所述的方法包括：
(1)在测试组中，向待测对象施用测试化合物，检测测试组中来源于所述对象的样本中生物标志物的水平V1；在对照组中，向待测对象施用空白对照，检测对照组中来源于所述对象的样本中生物标志物的水平V2；
(2)比较上一步骤检测得到的水平V1和水平V2，从而确定所述测试化合物是否是治疗急性心肌梗死的候选化合物；
所述的生物标志物包括GZMA、S100A8和/或SLAMF7。
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