WO2018003550A1 - ２以上の標的核酸を検出するためのプライマーセット、キット及び方法 - Google Patents

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重彦 宮本
貴志 西園
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to a primer set for amplifying two or more target nucleic acids as one linked amplification product.
  • the present invention also relates to a method for detecting two or more target nucleic acids.
  • the present invention also relates to a kit for detecting two or more target nucleic acids.
  • a method for specifically detecting an amplification product obtained by the nucleic acid amplification method there is a method in which an amplification product containing a target nucleic acid is immobilized on a solid phase and detected. In this method, by capturing the target nucleic acid specifically on the solid phase, nonspecific nucleic acid sequences can be easily removed by washing or the like, and detection specificity can be increased.
  • a probe comprising a polynucleotide having a sequence complementary to the tag region, by introducing a single-stranded tag region into one end of the amplification product containing the target nucleic acid.
  • a target nucleic acid is indirectly immobilized on a solid phase through hybridization of a tag region and a probe.
  • Patent Document 1 discloses a technique for visual detection by further binding a labeling substance to a target nucleic acid.
  • FIG. 2 shows an example in which a plurality of target nucleic acid amplification products are immobilized on a solid phase and analyzed using a labeling substance as an index.
  • a labeling substance as an index.
  • the analysis method using the position and number of regions labeled in this manner as an index is difficult when the target nucleic acid to be targeted is large or individual amplification products of a plurality of target nucleic acids are not separated on the solid phase carrier.
  • the discriminability may be low in some cases.
  • the discriminability may be similarly low.
  • the present invention provides an improved means for detecting two or more target nucleic acids.
  • a primer set for preparing a nucleic acid amplification product that can be detected on a solid phase carrier A terminal primer A comprising a polynucleotide comprising a base sequence that hybridizes to the 3 ′ end portion of the complementary sequence of the base sequence of the first target nucleic acid at the 3 ′ end portion;
  • Two polynucleotides linked at the 5 ′ end, and one of the two polynucleotides includes, at the 3 ′ end, a base sequence that hybridizes to the 3 ′ end of the base sequence of the kth target nucleic acid,
  • the k th double-headed primer wherein the other of the two polynucleotides comprises a base sequence that hybridizes to the 3 ′ end of the complementary sequence of the base sequence of the (k + 1) th target nucleic acid at the 3 ′ end;
  • a terminal primer B comprising a polynucleotide containing a base sequence that
  • a primer set for preparing a nucleic acid amplification product that can be detected on a solid phase carrier A terminal primer A comprising a polynucleotide comprising a base sequence that hybridizes to the 3 ′ end portion of the complementary sequence of the base sequence of the first target nucleic acid at the 3 ′ end portion; 'The nucleotide sequence A k that hybridizes to the distal end 3' 3 of the base sequence of the k-th target nucleic acid comprises at the distal end, including further comprising a polynucleotide the nucleotide sequence B k at the 5 'end of the nucleotide sequence A k , K-th reverse primer, The base sequence C k + 1 that hybridizes to the 3 ′ end of the complementary sequence of the base sequence of the (k + 1) th target nucleic acid is included at the 3 ′ end, and the base sequence B k is located at the 5 ′ end of the base sequence C k
  • a (k + 1) th forward primer comprising a polynucleotide further comprising a base sequence D k + 1 that hybridizes with A terminal primer B comprising a polynucleotide comprising a base sequence that hybridizes to the 3 ′ end of the base sequence of the Nth target nucleic acid at the 3 ′ end, N is an integer greater than or equal to 2, k is an integer from 1 to N ⁇ 1;
  • the k-th reverse primer and the (k + 1) -th forward primer each include a case where k is 1 to a case where k is N ⁇ 1,
  • One of the terminal primer A and the terminal primer B further includes a labeling part that is a labeling substance or a tag that can bind to the labeling substance, and the other further includes a binding part that is a tag that can bind to the solid phase carrier.
  • a primer set for preparing a nucleic acid amplification product that can be detected on a solid phase carrier A terminal primer A comprising a polynucleotide comprising a base sequence that hybridizes to the 3 ′ end portion of the complementary sequence of the base sequence of the first target nucleic acid at the 3 ′ end portion; A polynucleotide comprising 'the nucleotide sequence E k that hybridizes to the distal end 3' 3 of the base sequence of the k-th target nucleic acid at the distal end, which is linked to the 5 'end of the polynucleotide comprising the nucleotide sequence E k A k-th reverse primer comprising a polynucleotide comprising a base sequence F k that is not double-stranded in a nucleic acid amplification reaction, A polynucleotide comprising a base sequence G k + 1 that hybridizes to the 3 ′ end of the complementary
  • a primer set for preparing a nucleic acid amplification product that can be detected on a solid phase carrier A terminal primer A comprising a polynucleotide comprising a base sequence that hybridizes to the 3 ′ end portion of the complementary sequence of the base sequence of the first target nucleic acid at the 3 ′ end portion; A polynucleotide comprising 'the nucleotide sequence I k that hybridizes to the distal end 3' 3 of the base sequence of the k-th target nucleic acid at the distal end, which is linked to the 5 'end of the polynucleotide comprising the nucleotide sequence I k , a polynucleotide comprising a nucleotide sequence J k not two stranded in a nucleic acid amplification reaction, and the k reverse primer, A polynucleotide comprising a base sequence L k + 1 that hybridizes to the 3 ′ end
  • a method for detecting two or more target nucleic acids A detection nucleic acid comprising two or more linked target nucleic acids, a labeling part that is a labeling substance or a tag that can be bound to the labeling substance, and a binding part that is a tag that can be bound to a solid phase carrier A possible detection sample is brought into contact with a solid phase carrier that includes at least a portion that can bind to the binding portion, and the nucleic acid for detection in the portion of the solid phase carrier is used with the labeling portion as an index.
  • a method comprising a detecting step of detecting.
  • a detection sample preparation step comprising performing a nucleic acid amplification reaction using the nucleic acid obtained from the sample to be analyzed as a template and using the primer set according to any one of (1) to (5), In the detection step, the product of the nucleic acid amplification reaction obtained in the detection sample preparation step is used as the detection sample.
  • the detection sample preparation step includes two or more detection nucleic acids having different combinations of two or more target nucleic acids and having the binding portion capable of binding to different positions of the solid phase carrier.
  • a primer set according to any one of (1) to (5) wherein two or more sets designed to be prepared, and performing a nucleic acid amplification reaction using a nucleic acid obtained from a sample to be analyzed as a template
  • the detection sample obtained in the detection sample preparation step is brought into contact with the solid phase carrier, and each of the two or more detection nucleic acids is detected on the solid phase carrier using the labeling portion as an index.
  • the method according to (7) including: (9) A kit for detecting two or more target nucleic acids in a sample to be analyzed, (1) to the primer set according to any one of (5), A kit comprising a solid phase carrier including at least a part capable of binding to the binding part.
  • the labeling part is a tag that can bind to a labeling substance
  • (12) A nucleic acid comprising the labeling substance and the solid phase carrier, the solid phase carrier, a labeling substance holding part for holding the labeling substance, and a reaction system receiving part for receiving a product of a nucleic acid amplification reaction
  • a primer set for preparing a nucleic acid amplification product A terminal primer A comprising a polynucleotide comprising a base sequence that hybridizes to the 3 ′ end portion of the complementary sequence of the base sequence of the first target nucleic acid at the 3 ′ end portion; Two polynucleotides linked at the 5 ′ end, and one of the two polynucleotides includes, at the 3 ′ end, a base sequence that hybridizes to the 3 ′ end of the base sequence of the kth target nucleic acid, The k th double-headed primer, wherein the other of the two polynucleotides comprises a base sequence that hybridizes to the 3 ′ end of the complementary sequence of the base sequence of the (k + 1) th target nucleic acid at the 3 ′ end; A terminal primer B comprising a polynucleotide containing a base sequence that hybridizes to the 3 ′ end of the base sequence of the Nth target nucleic acid at the 3
  • Primer set (14) A method for detecting two or more target nucleic acids, A nucleic acid amplification step in which a nucleic acid obtained from an analysis target sample is used as a template and a nucleic acid amplification reaction is performed using the primer set described in (13); And a detection step of detecting the nucleic acid amplification product in the product of the nucleic acid amplification reaction in the nucleic acid amplification step.
  • an amplification product in which two or more target nucleic acids are linked in series can be obtained. Detection of such an amplification product is easier than detecting two or more target nucleic acids individually.
  • the amplification product in which three target nucleic acids are linked in series by the method of the present invention is labeled and bound to a solid phase carrier for detection, it can be judged as positive if the label is detected on the solid phase carrier (A) If no label is detected on the solid support, it can be judged negative (B1, B2, B3). For this reason, the discriminability is high.
  • the amplified products obtained by individually amplifying the three target nucleic acids are labeled and bound to a solid phase carrier for detection, if the label is detected at three positions on the solid phase carrier, it is judged positive (A), If no label is detected on the phase carrier, or if a label is detected at one or two places, it is judged negative (B1, B2, B3).
  • FIG. 7 shows a schematic diagram of a lateral flow type nucleic acid detection device 700.
  • 71 Solid phase carrier
  • 72 Conjugate pad (labeling substance holding part)
  • 73 Sample pad (reaction system receiving part)
  • 74 Absorption pad
  • 75 Base material
  • 76 Tag capturing means of solid phase carrier 71 Including part.
  • the result of the gel electrophoresis of the amplification product of Example 1 is shown.
  • the result of the nucleic acid chromatography of the amplification product of Example 1 is shown.
  • the result of the nucleic acid chromatography of the amplification product of Example 1 is shown.
  • the result of the gel electrophoresis of the amplification product by the conventional method which amplifies three target nucleic acids separately is shown.
  • the upper row shows the result of nucleic acid chromatography of the amplification product of Example 2.
  • the lower part shows the result of gel electrophoresis of the amplification product of Example 2.
  • nucleic acid and polynucleotide refer to DNA or RNA, typically DNA.
  • the terms nucleic acid and polynucleotide are not particularly limited in terms of the number of bases, and include oligonucleotides.
  • an oligonucleotide that hybridizes and extends with a target nucleic acid that serves as a template for a nucleic acid amplification reaction or a complementary strand of the target nucleic acid refers to an oligonucleotide that can be double-stranded in a nucleic acid amplification reaction, Typically, it is a polymer of natural nucleotides.
  • Natural nucleotides are nucleotides composed of natural adenine, thymine, guanine, cytosine, uracil base, deoxyribose, ribose sugar moiety, and phosphate group. It is a nucleotide that has not undergone any modification. Natural nucleotides are usually D-type nucleotides. A D-type nucleotide refers to a nucleotide whose sugar moiety consists of D-type deoxyribose or ribose.
  • the “target nucleic acid” includes not only a nucleic acid itself having a base sequence to be detected and / or amplified, but also a nucleic acid having a complementary base sequence. Therefore, in the present invention, “detecting a target nucleic acid” or “amplifying a target nucleic acid” means not only detection or amplification performed for the purpose of the target nucleic acid itself, but also complementary strand of the target nucleic acid through detection or amplification of the target nucleic acid. It also includes detecting or amplifying the double-stranded nucleic acid of the target nucleic acid.
  • the “base sequence of target nucleic acid” or “target sequence” includes not only a base sequence to be detected and / or amplified but also a base sequence complementary thereto.
  • target nucleic acid base sequence or “target sequence” refers to a base sequence contained in one of the strands.
  • target nucleic acid one strand of a double-stranded target nucleic acid may be referred to as “target nucleic acid”.
  • the total length of the target nucleic acid in the present invention is not particularly limited, and is usually 20 bases or more, 40 bases or more, or 100 bases or more.
  • the upper limit of the total length of the target nucleic acid is not particularly limited, but is usually 1000 bases or less, 500 bases or less, or 400 bases or less.
  • the nucleic acid serving as a template for the nucleic acid amplification reaction may be DNA or RNA. Further, it may be a double-stranded nucleic acid or a single-stranded nucleic acid. In the case of a double-stranded nucleic acid, it can be made into a single strand by denaturation treatment.
  • the nucleic acid used as a template may be a natural one or an artificially synthesized one.
  • it may be a natural nucleic acid extracted from a biological sample, may be amplified by PCR or the like, or may be cDNA synthesized by a reverse transcription reaction.
  • the nucleotide sequence X “hybridizes” to the nucleotide sequence Y means that a polynucleotide (especially DNA) containing the nucleotide sequence X is converted to a polynucleotide (especially DNA) containing the nucleotide sequence Y under stringent conditions.
  • stringent conditions mean conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • stringent conditions can be set according to the temperature at the time of Southern hybridization and the salt concentration contained in the solution, and the temperature at the time of the washing step of Southern hybridization and the salt concentration contained in the solution. More specifically, as stringent conditions, for example, in the hybridization step, the sodium concentration is 25 to 500 mM, preferably 25 to 300 mM, and the temperature is 40 to 68 ° C., preferably 40 to 65 ° C. More specifically, hybridization can be performed at 1 to 7 ⁇ SSC, 0.02 to 3% SDS, and a temperature of 40 ° C. to 60 ° C.
  • a washing step may be performed after the hybridization, and the washing step can be performed, for example, at 0.1 to 2 ⁇ SSC, 0.1 to 0.3% SDS, and a temperature of 50 to 65 ° C.
  • the washing step can be performed, for example, at 0.1 to 2 ⁇ SSC, 0.1 to 0.3% SDS, and a temperature of 50 to 65 ° C.
  • hybridization between a labeling tag described later and a labeling substance added with a polynucleotide and hybridization between an immobilization tag described later and a solid phase carrier added with a polynucleotide are listed here. It is not necessary to carry out under stringent conditions, and it can be carried out under the conditions described later.
  • the polynucleotide (particularly DNA) containing the base sequence X and the polynucleotide (particularly DNA) containing the base sequence Y hybridize under the annealing conditions of the nucleic acid amplification reaction. Any combination that can form hydrogen bonds sufficient to form a stable double strand may be used, and it is not necessary for the nucleotide sequences to be completely complementary to each other.
  • mismatches between a polynucleotide containing base sequence X and a polynucleotide containing base sequence Y such as 1 mismatch in 10 nucleotides, 1 mismatch in 20 nucleotides, or 1 mismatch in 30 nucleotides. You may do it.
  • the complementary sequence of the base sequence X and the base sequence Y are the same.
  • one of the complementary sequence of base sequence X and base sequence Y is a DNA base sequence and the other is an RNA base sequence, thymine on one side and uracil on the other side are regarded as the same base.
  • the base sequence Y is a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, added and / or inserted in the complementary sequence of the base sequence X.
  • the base sequence Y is a base sequence having 70% or more identity with the complementary sequence of the base sequence X.
  • one or several preferably refers to 1 to 5, more preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, particularly preferably 1 or 2, most preferably One.
  • the identity value indicates a value calculated by default setting using software (for example, FASTA, DANASYS, and BLAST) that calculates the identity between a plurality of base sequences.
  • the base sequence identity value is calculated by calculating the number of matching bases when aligning a pair of base sequences so that the degree of matching is maximized. Calculated as a percentage of the number.
  • the total number of bases is the number of bases obtained by counting one gap as one base.
  • the identity is more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more. More preferably, the identity is 99% or more.
  • the polynucleotide constituting the primer set, the primers containing the polynucleotide, and the method for producing the linking polynucleotide are not particularly limited, and may be produced using a polynucleotide synthesizer, or commissioned synthesis. You may manufacture using a service.
  • the “3 ′ end portion” of a base sequence or polynucleotide refers to a partial base sequence consisting of a plurality of consecutive bases or the partial base sequence including the base at the 3 ′ end of the base sequence or polynucleotide. Refers to the region of the polynucleotide that contains it. ⁇ 1.
  • Primer set of the present invention In the primer set of the present invention, when the sample to be analyzed contains two or more predetermined target nucleic acids, the two or more predetermined target nucleic acids are obtained by a nucleic acid amplification reaction using the nucleic acid obtained from the sample to be analyzed as a template. And a labeling part that is a labeling substance or a tag that can be bound to the labeling substance and a binding part that is a tag that can be bound to the solid phase carrier in a linked form can be generated. Primer set.
  • N target nucleic acids from the first target nucleic acid to the Nth target nucleic acid.
  • N is an integer of 2 or more.
  • the upper limit of N is not particularly limited, and can be 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or a larger number.
  • Embodiment 1 of the primer set of the present invention comprises A terminal primer A comprising a polynucleotide comprising a base sequence that hybridizes to the 3 ′ end portion of the complementary sequence of the base sequence of the first target nucleic acid at the 3 ′ end portion; Two polynucleotides linked at the 5 ′ end, and one of the two polynucleotides includes, at the 3 ′ end, a base sequence that hybridizes to the 3 ′ end of the base sequence of the kth target nucleic acid, The k th double-headed primer, wherein the other of the two polynucleotides comprises a base sequence that hybridizes to the 3 ′ end of the complementary sequence of the base sequence of the (k + 1)
  • the length of the “base sequence that hybridizes to the 3 ′ end portion of the complementary sequence of the base sequence of the first target nucleic acid” is not particularly limited, but for example, 8 bases or more, 12 bases or more, or 15 It can be not less than 40 bases, not more than 30 bases, or not more than 25 bases.
  • the polynucleotide contained in the terminal primer A (when the terminal primer A includes a polynucleotide as a labeling part or binding part described later), the polynucleotide other than the labeling part or binding part) is the base sequence of the first target nucleic acid.
  • a base sequence that hybridizes to the 3 ′ end of the complementary sequence may be included at the 3 ′ end, and another base sequence may be further added to the 5 ′ end.
  • the total length of the polynucleotide contained in the terminal primer A is not particularly limited. For example, it can be 8 bases or more, 12 bases or more, or 15 bases or more, and 40 bases or less, 30 bases or less, or 25 bases or less. Can do.
  • “Two polynucleotides linked at the 5 ′ end” in the k-th double-headed primer is a form in which the 3 ′ end of each polynucleotide of the two polynucleotides is released, and the two polynucleotides are linked at the 5 ′ end side. It means being.
  • the structure for linking the 5' ends is not particularly limited, and can be constituted by an appropriate divalent group.
  • the simplest structure includes a 5′-5 ′ bond in which the 5 ′ positions of the sugars of the 5 ′ terminal nucleotides of each of the two polynucleotides are bonded via a phosphate group. It is not limited.
  • the divalent group may have a long chain structure.
  • Examples of other structures for linking the 5 ′ ends of two polynucleotides in the k-th double-headed primer include the following fatty chain spacers.
  • Examples of the fatty chain spacer include a spacer represented by the following formula (II). 5′-O—C m H 2m —O-5 ′ Formula (II) (In the formula, 5 ′ represents an oxygen atom of a phosphodiester bond at the 5 ′ end of each polynucleotide, and m represents an integer of 1 to 40. H may be substituted with a substituent. ) In the formula (II), m is preferably 2 or more and 36 or less, more preferably 3 or more and 16 or less. H in the formula (II) may be substituted with a substituent, and typical examples of the substituent include an alkyl group, an alkoxy group, and a hydroxyl group.
  • the alkyl group and alkoxy group as a substituent preferably have 1 to 8 carbon atoms, and more preferably 1 to 4 carbon atoms. Moreover, when it has two or more substituents, the substituents may be the same or different. Furthermore, it is also preferable that it does not have a substituent.
  • Examples of other fatty chain spacers include the following divalent groups.
  • the phosphate group at one end of each divalent group is linked to the phosphorous of the nucleotide at the 5 ′ end of one polynucleotide molecule. It refers to an acid group, and the oxygen atom at the other end forms a phosphate ester bond with the phosphate group of the nucleotide at the 5 ′ end of the other polynucleotide molecule.
  • the total length of the two polynucleotides included in the k-th double-headed primer is not particularly limited.
  • each may be 8 bases or more, 12 bases or more, or 15 bases or more, and 40 bases or less, 30 bases or less, Or it can be 25 bases or less.
  • One of the two polynucleotides contained in the k-th double-headed primer contains a base sequence that hybridizes to the 3 'end of the base sequence of the k-th target nucleic acid at the 3' end.
  • the length of the “base sequence that hybridizes to the 3 ′ end of the base sequence of the kth target nucleic acid” is not particularly limited, but may be, for example, 8 bases or more, 12 bases or more, or 15 bases or more. 40 bases or less, 30 bases or less, or 25 bases or less.
  • a polynucleotide containing at the 3 ′ end a “base sequence that hybridizes to the 3 ′ end of the base sequence of the k-th target nucleic acid” only needs to contain the base sequence at the 3 ′ end, and its 5 ′ end. Further, another base sequence may be added to the side.
  • the other of the two polynucleotides contained in the k-th double-headed primer contains a base sequence that hybridizes to the 3 'end of the complementary sequence of the base sequence of the (k + 1) -th target nucleic acid at the 3' end.
  • the “base sequence that hybridizes to the 3 ′ end portion of the complementary sequence of the base sequence of the (k + 1) th target nucleic acid” is not particularly limited in length. It can be set as above, and can be 40 bases or less, 30 bases or less, or 25 bases or less.
  • a polynucleotide containing at the 3 ′ end a “base sequence that hybridizes to the 3 ′ end of the complementary sequence of the base sequence of the (k + 1) th target nucleic acid” only needs to contain the base sequence at the 3 ′ end. Further, another base sequence may be added to the 5 ′ end side.
  • the length of the “base sequence that hybridizes to the 3 ′ end of the base sequence of the Nth target nucleic acid” is not particularly limited, but for example, 8 bases or more, 12 bases or more, or 15 bases or more It can be 40 bases or less, 30 bases or less, or 25 bases or less.
  • the polynucleotide contained in the terminal primer B (when the terminal primer A includes a polynucleotide as a labeling part or binding part described later), the polynucleotide other than the labeling part or binding part) is the base sequence of the Nth target nucleic acid.
  • a base sequence that hybridizes to the 3 ′ end may be included at the 3 ′ end, and another base sequence may be further added to the 5 ′ end.
  • the total length of the polynucleotide contained in the terminal primer B is not particularly limited. For example, it can be 8 bases or more, 12 bases or more, or 15 bases or more, and 40 bases or less, 30 bases or less, or 25 bases or less. Can do.
  • one of the terminal primer A and the terminal primer B further includes the label part, and the other further includes the binding part.
  • Each of the terminal primer A and the terminal primer B has one of the label part and the binding part, and one of the label part and the binding part has the polynucleotide and, if necessary, an appropriate spacer described later. It is chemically connected through.
  • one of the label part and the binding part is linked to the polynucleotide at the position where the polynucleotide is annealed with the target nucleic acid or with the nucleic acid complementary to the target nucleic acid and polymerase.
  • it is 5 'terminal of the said polynucleotide.
  • the labeling part is either a tag that can be bound to the labeling substance or a labeling substance, preferably a tag that can be bound to the labeling substance.
  • a tag that can bind to a labeling substance may be referred to as a labeling tag.
  • the labeling part is a tag for labeling
  • the tag contained at one end of the amplification product can be labeled by bringing the amplification product of the nucleic acid amplification reaction into contact with the labeling substance.
  • an amplification product containing the labeling substance at one end can be obtained as an amplification product of the nucleic acid amplification reaction.
  • the labeling substance is not particularly limited as long as it can detect the amplification product, but preferably allows visual detection of the amplification product.
  • a labeling substance include colored particles, pigments, enzymes (peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, etc.), and preferably colored particles.
  • the “colored particles” include, but are not limited to, metal (eg, gold, silver, copper, platinum, etc.) particles, metal rods, colored latex particles, silica nanoparticles including a pigment, and the like.
  • the size of the labeling substance is not limited as long as it does not prevent the amplification product from being captured on the solid phase carrier described later.
  • the labeling substance preferably has a good color development upon detection, and can be appropriately selected so as to have a size smaller than the pore diameter of various porous members of a solid phase carrier and a nucleic acid detection device described later.
  • the size of the labeling substance can be about 500 nm or less, preferably about 0.1 nm to 250 nm, more preferably about 1 nm to 100 nm.
  • Fluorescent dyes fluorescein, cyanine, etc.
  • the labeling tag that can be used as the labeling part may be any tag that can bind to the labeling substance and is not double-stranded by extension in the nucleic acid amplification reaction, and can be appropriately selected according to the structure of the labeling substance.
  • polynucleotides DNA, RNA, etc.
  • proteins eg., proteins, peptides, or other compounds (eg, low molecular weight compounds such as biotin, fluorescein isothiocyanate (FITC), digoxigenin (DIG)), or their A combination
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • DIG digoxigenin
  • the tag for labeling it contains a polynucleotide or consists of a polynucleotide.
  • the polynucleotide that can be contained in the labeling tag is not particularly limited as long as it does not substantially interfere with the nucleic acid amplification reaction by the primer set of the present invention, but the number of bases is, for example, 5 to 50, preferably 10 to 35.
  • which are polynucleotides such as Anal. Biochem.
  • a preferable example is a polynucleotide containing the base sequence described in 364 (2007) 78-85.
  • Another preferred form of the labeling tag is a low molecular weight compound such as biotin, FITC, DIG or the like.
  • the labeling substance and the tag for labeling may be directly coupled or indirectly coupled, and the coupling means uses the labeling substance to be used and the labeling tag.
  • a suitable one can be appropriately selected according to the combination with the tag.
  • the labeling tag contains a polynucleotide
  • the labeling substance is bound to a polynucleotide capable of hybridizing to the polynucleotide (for example, a polynucleotide containing a sequence complementary to the base sequence of the polynucleotide), By hybridizing the polynucleotide, the labeling substance and the labeling tag can be indirectly bound.
  • the binding between the labeling substance and the polynucleotide may be performed via a peptide, protein, nucleic acid, or the like, or may be performed via an appropriate functional group.
  • the hybridization conditions are not particularly limited as long as hybridization occurs.
  • the reaction is performed at 20 ° C. to 40 ° C. in a buffer solution (pH 6 to 7) containing 10 mM to 50 mM phosphate. Can be performed.
  • the buffer may further contain a salt such as sodium chloride.
  • the labeling tag When the labeling tag is a low molecular weight compound, it is linked to a binding substance such as a protein that specifically binds to the tag (for example, avidin that binds to biotin, a protein that binds to FITC), an antibody (for example, an anti-DIG antibody), or an aptamer.
  • a binding substance such as a protein that specifically binds to the tag (for example, avidin that binds to biotin, a protein that binds to FITC), an antibody (for example, an anti-DIG antibody), or an aptamer.
  • the labeling substance can be labeled.
  • the labeling tag and the binding substance can be bound using various neutral buffers.
  • the labeling part (tag for labeling or labeling substance) and the polynucleotide contained in the terminal primer A or B can be bound by any means, and can be bound directly or indirectly. However, when at least a portion connected to the polynucleotide in the labeling portion is made of a polynucleotide, the portion has a structure that is not double-stranded by extension in a nucleic acid amplification reaction.
  • a polynucleotide (usually composed of natural nucleotides) that can be used as a template for a reaction by DNA polymerase is used as a polynucleotide that is not double-stranded by a nucleic acid amplification reaction and is included in the labeling portion
  • the polynucleotide included in the labeling portion is used.
  • the polynucleotide and the polynucleotide that functions as a primer in the terminal primer A or B are bound to the polynucleotide and the labeling part via a spacer that inhibits the polymerase reaction.
  • Such a “spacer” is not particularly limited as long as it can suppress or stop the progress of the polymerase reaction in a nucleic acid amplification reaction such as DNA polymerase, and can prevent double-stranding of the labeling portion.
  • the polynucleotide contained in the labeling portion and the polynucleotide functioning as a primer in the terminal primer A or B can be linked in the same direction. That is, the polynucleotide 3 'terminal side contained in the labeling part and the 5' terminal side of the polynucleotide functioning as a primer in the terminal primer A or B can be linked via the spacer.
  • the phosphate group at one 3 ′ end of the divalent group is the number of nucleotides at the 5 ′ end of the one polynucleotide molecule.
  • Examples of the fatty chain spacer include a spacer represented by the following formula (IV). 5′-O—C m H 2m —O-3 ′ Formula (IV) (In the formula, 5 ′ represents an oxygen atom of a 5′-side phosphodiester bond, 3 ′ represents an oxygen atom of a 3′-side phosphodiester bond, and m represents an integer of 1 to 40. H may be substituted with a substituent.) In the formula (IV), m is preferably 2 or more and 36 or less, more preferably 3 or more and 16 or less. H in the formula (IV) may be substituted with a substituent, and typical examples of the substituent include an alkyl group, an alkoxy group, and a hydroxyl group.
  • the alkyl group and alkoxy group as a substituent preferably have 1 to 8 carbon atoms, and more preferably 1 to 4 carbon atoms. Moreover, when it has two or more substituents, the substituents may be the same or different. Furthermore, it is also preferable that it does not have a substituent.
  • Equation (V) 5 ′-(OC n H 2n ) L —O-3 ′
  • equation (V) 5 ′-(OC n H 2n ) L —O-3 ′
  • equation (V) 5 ′-(OC n H 2n ) L —O-3 ′
  • 5 ′ represents an oxygen atom of a phosphodiester bond on the 5 ′ side
  • 3 ′ represents an oxygen atom of a phosphodiester bond on the 3 ′ side
  • n represents an integer of 2 or more and 4 or less.
  • L represents an integer of 1 or more and (n + 1) ⁇ L represents an integer of 40 or less.
  • H may be substituted with a substituent.
  • (n + 1) ⁇ L is preferably 2 or more and 36 or less, and more preferably 3 or more and 16 or less.
  • the same aspect as the substituent in formula (IV) is applied to the substituent of H in formula (V).
  • Examples of other fatty chain spacers include the following divalent groups.
  • the phosphate group at one end of each divalent group is the phosphate of the nucleotide at the 3 ′ end or 5 ′ end of one polynucleotide molecule.
  • the oxygen atom at the other end forms a phosphate ester bond with the phosphate group of the nucleotide at the 5 'end or 3' end of the other polynucleotide molecule.
  • the polynucleotide contained in the labeling part is a template for a reaction by DNA polymerase, such as a polynucleotide containing a modified nucleic acid such as LNA (Locked Nucleic Acid), L-type nucleic acid, or 2′-O-methylated nucleotide.
  • a polynucleotide that is not double-stranded by extension in the nucleic acid amplification reaction the spacer that inhibits the polymerase reaction can be omitted.
  • the binding part is a tag that can be bound to a solid phase carrier to be described later.
  • a tag capable of binding to a solid phase carrier may be referred to as an immobilization tag.
  • the immobilization tag that can be used as the binding part is not particularly limited as long as it can be bound to the solid phase carrier and may be appropriately selected depending on the structure of the solid phase carrier.
  • polynucleotide DNA, RNA Etc.
  • proteins proteins, peptides, or other compounds (eg, low molecular weight compounds as described above), or combinations thereof may be utilized.
  • the immobilization tag preferably contains a polynucleotide or consists of a polynucleotide.
  • the polynucleotide that can be contained in the immobilization tag is not particularly limited as long as it does not substantially interfere with the nucleic acid amplification reaction by the primer set of the present invention, but the number of bases is, for example, 5 to 50, preferably 10 to 35, for example, Anal. Biochem.
  • a preferable example is a polynucleotide containing the base sequence described in 364 (2007) 78-85.
  • the combination with a polynucleotide containing a base sequence that hybridizes with the polynucleotide that is arranged on the solid phase carrier side is easily changed by modifying the base sequence. It is preferable because it is easy to control the binding specificity. For example, when a plurality of nucleic acid amplification products are bound on one solid phase carrier to identify each, a different combination of an immobilization tag and a polynucleotide on the solid phase carrier side is required for each nucleic acid amplification product. .
  • the base sequence of the polynucleotide is easy to change and the hybridization between the polynucleotides has a high binding specificity, by using the polynucleotide as an immobilization tag, an immobilization tag for each nucleic acid amplification product, It is easy to provide different combinations with the polynucleotide on the solid phase carrier side.
  • the solid phase carrier is not particularly limited, but a material made of resin, metal, polysaccharide, mineral or the like can be used, and it can be in the form of membrane, film, nonwoven fabric, plate, gel or the like.
  • the solid phase carrier has a porous structure so that the amplification product and the labeling substance in the solution can be developed.
  • the solid phase carrier usable in the present invention include filter paper, nitrocellulose membrane, polyethersulfone membrane, nylon membrane, various dried gels (silica gel, agarose gel, dextran gel, gelatin gel), silicon, glass, Examples include plastics.
  • the size and form of the solid phase carrier those suitable for various operations and detection can be appropriately selected.
  • the solid phase carrier only needs to be configured such that at least a part of the solid phase carrier can be bound to the immobilization tag, and more preferably, only a part of the solid phase carrier can be bound to the immobilization tag. Yes.
  • the amplification product captured on the solid phase carrier is detected only in the above part, and therefore positive or negative. Discrimination can be facilitated.
  • the binding between the solid phase carrier and the immobilization tag may be direct coupling or indirect coupling, and the coupling means is appropriately determined depending on the combination of the solid phase carrier and the immobilization tag to be used.
  • a suitable one can be selected.
  • the immobilization tag contains a polynucleotide
  • a polynucleotide capable of hybridizing to the polynucleotide for example, a polynucleotide containing a sequence complementary to the base sequence of the polynucleotide
  • the solid phase carrier and the immobilization tag can be indirectly bound.
  • Immobilization of the polynucleotide to the solid phase carrier may be performed via a peptide, protein, nucleic acid or the like, or may be performed via an appropriate functional group. Hybridization can be performed under the conditions described above for the binding between the labeling tag and the labeling substance.
  • the trapped amplification product is detected only on a specific part by immobilizing it on a specific part. Can be easily.
  • the binding part (immobilization tag) and the polynucleotide functioning as a primer contained in the terminal primer A or B can be bound by any means, and can be bound directly or indirectly.
  • the portion of the immobilization tag that is connected to the polynucleotide is made of a polynucleotide that can serve as a template for a reaction by DNA polymerase, the portion functions as a primer by extension in a nucleic acid amplification reaction.
  • the polynucleotide and the immobilization tag are bound via a “spacer” that inhibits the polymerase reaction so that they are not double-stranded together.
  • a specific example of a spacer provided between a binding part containing a polynucleotide that can be a template for a reaction by DNA polymerase and a polynucleotide contained in the terminal primer A or B is between a labeling part containing the polynucleotide and the polynucleotide.
  • a template for reaction by DNA polymerase such as a polynucleotide containing a modified nucleic acid such as LNA (Locked Nucleic Acid), L-type nucleic acid, 2′-O-methylated nucleotide, etc.
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • the spacer that inhibits the polymerase reaction can be omitted.
  • the first target nucleic acid 11 forms a first target nucleic acid (double-stranded first target nucleic acid) 10 in a double-stranded form together with a first target nucleic acid complementary strand 12 that is a complementary strand thereof.
  • a first target nucleic acid complementary strand 12 that is a complementary strand thereof.
  • Either the first target nucleic acid 11 or the first target nucleic acid complementary strand 12 may be used for the purpose of amplification and detection.
  • the second target nucleic acid 21 forms a double-stranded second target nucleic acid 20 together with the second target nucleic acid complementary strand 22 which is a complementary strand thereof.
  • the third target nucleic acid 31 forms a double-stranded third target nucleic acid 30 together with the third target nucleic acid complementary strand 32 which is a complementary strand thereof.
  • the terminal primer A100 is a base that hybridizes to the 3 ′ end portion of the complementary sequence 12 (points to the base sequence of the first target nucleic acid complementary strand 12) of the first target sequence 11 (points to the base sequence of the first target nucleic acid 11).
  • Polynucleotide 101 containing the sequence at the 3 ′ end is included.
  • the terminal primer A100 further includes a terminal primer A addition portion 102 in addition to the polynucleotide 101.
  • the terminal primer A addition portion 102 is either the label portion or the binding portion.
  • the first double-head primer 110 and the second double-head primer 120 are included as the k-th double-head primer.
  • the first double-headed primer 110 includes a first double-headed primer first polynucleotide 111 and a first double-headed primer second polynucleotide 112 which are two polynucleotides linked to each other on the 5 ′ end side.
  • the first double-primed primer first polynucleotide 111 includes a base sequence that hybridizes to the 3 'end of the base sequence of the first target nucleic acid 11 at the 3' end.
  • the first double-ended primer second polynucleotide 112 includes a base sequence that hybridizes to the 3 'end of the base sequence of the complementary strand 22 of the second target nucleic acid 21 at the 3' end.
  • the second double-headed primer 120 includes a second double-headed primer first polynucleotide 121 and a second double-headed primer second polynucleotide 122 which are two polynucleotides linked to each other on the 5 ′ end side.
  • the second double-primed primer first polynucleotide 121 includes a base sequence that hybridizes to the 3 'end of the base sequence of the second target nucleic acid 21 at the 3' end.
  • the second double-primed primer second polynucleotide 122 includes a base sequence that hybridizes to the 3 'end of the base sequence of the complementary strand 32 of the third target nucleic acid 31 at the 3' end.
  • the end primer B130 includes a polynucleotide 131 that includes a base sequence that hybridizes to the 3 'end portion of the base sequence of the third target nucleic acid 31 at the 3' end portion.
  • the end primer B 130 further includes an end primer B addition portion 132.
  • the terminal primer B addition portion 132 is either the label portion or the binding portion.
  • the nucleic acid amplification reaction is performed in the presence of the primer of the first embodiment including the terminal primer A100, the first double-headed primer 110, the second double-headed primer 120, and the terminal primer B130 using the nucleic acid as a template.
  • the polynucleotide 101 of the end primer A100 undergoes denaturation and annealing, hybridizes to the 3 ′ end of the first target nucleic acid complementary strand 12, and is subjected to an extension reaction with a polymerase to add the end primer A addition portion 102 to the 5 ′ end.
  • the amplified fragment 301 of the first target nucleic acid 11 to which is linked is synthesized.
  • the first double-stranded primer first polynucleotide 111 undergoes denaturation and annealing, hybridizes to the 3 ′ end of the first target nucleic acid 11, and an amplified fragment of the first target nucleic acid complementary strand 12 by an extension reaction with a polymerase. Is synthesized.
  • the amplified fragment of the first target nucleic acid complementary strand 12 has, at its 5 ′ end, the 5 ′ end of the amplified fragment of the second target nucleic acid 21 synthesized by extending the first double-headed primer second polynucleotide 112, which will be described later. Are linked together to form one amplified fragment 302.
  • the first double-ended primer second polynucleotide 112 undergoes denaturation and annealing, hybridizes to the 3 ′ end of the second target nucleic acid complementary strand 22, and an extension reaction by polymerase.
  • an amplified fragment of the second target nucleic acid 21 is synthesized, and this amplified fragment constitutes a part of the amplified fragment 302 described above.
  • the second double-ended primer first polynucleotide 121 undergoes denaturation and annealing, hybridizes to the 3 ′ end of the second target nucleic acid 21, and an amplified fragment of the second target nucleic acid complementary strand 22 by an extension reaction with a polymerase.
  • the amplified fragment of the second target nucleic acid complementary strand 22 is, at its 5 ′ end, the 5 ′ end of the amplified fragment of the third target nucleic acid 31 synthesized by extending the second double-headed primer second polynucleotide 122, which will be described later. Are coupled together to form one amplified fragment 303.
  • the second double-primed primer second polynucleotide 122 undergoes denaturation and annealing, hybridizes to the 3 ′ end of the third target nucleic acid complementary strand 32, and is subjected to an extension reaction by polymerase.
  • an amplified fragment of the third target nucleic acid 31 is synthesized, and this amplified fragment constitutes a part of the amplified fragment 303 described above.
  • the polynucleotide 131 of the end primer B130 undergoes denaturation and annealing, hybridizes to the 3 ′ end of the third target nucleic acid 31, and the end primer B addition portion 132 is linked to the 5 ′ end by an extension reaction with a polymerase.
  • the amplified fragment 304 of the complementary third target nucleic acid complementary strand 32 is synthesized.
  • the double-stranded first target nucleic acid 10 containing the first target nucleic acid 11 and the double-stranded first nucleic acid 21 containing the second target nucleic acid 21 are obtained as amplification products.
  • the second target nucleic acid 20 and the double-stranded third target nucleic acid 30 including the third target nucleic acid 31 are connected in series, and the terminal primer A addition portion 102 is connected to the 5 ′ end side of the first target nucleic acid 11;
  • the nucleic acid amplification product 1 in which the end primer B addition portion 132 is linked to the 5 ′ end side of the three target nucleic acid complementary strand 32 is obtained.
  • the nucleic acid amplification product 1 can be fixed to a solid phase carrier via the binding part contained in one of the terminal primer A addition part 102 and the terminal primer B addition part 132, and the label part contained in the other is used as an indicator Can be detected.
  • the nucleic acid amplification product 1 includes the first target nucleic acid 11 (or the first target nucleic acid complementary strand 12), the second target nucleic acid 21 (or the second target nucleic acid complementary strand 22), the third target nucleic acid 31 (or the third target nucleic acid complement). It is amplified only if all three strands 32) are present in the template. When one or two of these are not present in the template, the existing target nucleic acid or its complementary strand is amplified, but no nucleic acid amplification product having both the binding portion and the labeling portion is produced, and the labeling portion is Since the detection as an index is clearly negative, the risk of false positive determination is extremely low.
  • an amplified fragment of the first target nucleic acid As described above, by the nucleic acid amplification reaction using the primer set according to Embodiment 1 of the present invention, An amplified fragment of the first target nucleic acid; An amplified fragment in which a portion of the complementary strand of the kth target nucleic acid and a portion of the (k + 1) th target nucleic acid are linked between the 5 ′ ends of each other; An amplified fragment of the complementary strand of the Nth target nucleic acid, Each of the first target nucleic acid to the Nth target nucleic acid hybridizes with its complementary strand to form a double strand, One of the amplified fragment of the first target nucleic acid and the amplified fragment of the complementary strand of the Nth target nucleic acid has the labeling portion linked to the 5 ′ end, In the other of the amplified fragment of the first target nucleic acid and the amplified fragment of the complementary strand of the Nth target nucleic acid, the binding portion
  • a nucleic acid amplification product is generated.
  • N is an integer of 2 or more
  • k is an integer from 1 to N-1.
  • the structure of the linkage between the double-stranded nucleic acid containing the k-th target nucleic acid and the double-stranded nucleic acid containing the (k + 1) -th target nucleic acid is as follows. It is the same as the structure of connection. (1.2.
  • Embodiment 2 of the primer set of the present invention comprises A terminal primer A comprising a polynucleotide comprising a base sequence that hybridizes to the 3 ′ end portion of the complementary sequence of the base sequence of the first target nucleic acid at the 3 ′ end portion; 'The nucleotide sequence A k that hybridizes to the distal end 3' 3 of the base sequence of the k-th target nucleic acid comprises at the distal end, including further comprising a polynucleotide the nucleotide sequence B k at the 5 'end of the nucleotide sequence A k , K-th reverse primer, The base sequence C k + 1 that hybridizes to the 3 ′ end of the complementary sequence of the base sequence of the (k + 1) th target nucleic acid is included at the 3 ′ end, and the base sequence B k is located at the 5 ′ end of the base sequence C k + 1.
  • a (k + 1) th forward primer comprising a polynucleotide further comprising a base sequence D k + 1 that hybridizes with A terminal primer B comprising a polynucleotide comprising a base sequence that hybridizes to the 3 ′ end of the base sequence of the Nth target nucleic acid at the 3 ′ end, N is an integer greater than or equal to 2, k is an integer from 1 to N ⁇ 1;
  • the k-th reverse primer and the (k + 1) -th forward primer each include a case where k is 1 to a case where k is N ⁇ 1,
  • One of the terminal primer A and the terminal primer B further includes the label part, and the other further includes the binding part. It relates to a primer set.
  • the terminal primer A and terminal primer B, the labeling part and the binding part, and the structure connecting them are the same as those in Embodiment 1, and therefore the description thereof is omitted.
  • each of the base sequence A k and the base sequence B k is not particularly limited in length, and can be, for example, 8 bases or more, 12 bases or more, or 15 bases or more, and 40 bases or less, It can be 30 bases or less, or 25 bases or less.
  • the polynucleotide containing the base sequence A k and the base sequence B k contains the base sequence A k at its 3 ′ end, and contains the base sequence B k at the 5 ′ end side of the 5 ′ end base of the base sequence A k.
  • Other base sequences may be further added between the base sequence A k and the base sequence B k and on the 5 ′ end side of the base sequence B k .
  • the full length of the polynucleotide contained in the k-th reverse primer is not particularly limited, it can be, for example, 80 bases or less, 60 bases or less, or 50 bases or less.
  • the polynucleotide constituting the k-th reverse primer includes the base sequence A k and the base sequence B k (if present, in the same direction as above) so as to be in the same direction, from the 5 ′ end to the 3 ′ end.
  • the entirety up to can be hybridized to a polynucleotide containing a complementary base sequence, and does not include a configuration that inhibits the polymerase reaction. Therefore, the entire polynucleotide constituting the k-th reverse primer can be double-stranded by extension in the nucleic acid amplification reaction.
  • the length of each of the base sequence C k + 1 and the base sequence D k + 1 is not particularly limited, but can be, for example, 8 bases or more, 12 bases or more, or 15 bases or more, and 40 bases Hereinafter, it can be 30 bases or less, or 25 bases or less.
  • the polynucleotide containing the base sequence C k + 1 and the base sequence D k + 1 contains the base sequence C k + 1 at its 3 ′ end, and contains the base sequence D k + 1 at the 5 ′ end side of the 5 ′ end base of the base sequence C k + 1
  • Other base sequences may be further added between the base sequence C k + 1 and the base sequence D k + 1 and on the 5 ′ end side of the base sequence C k + 1 .
  • the total length of the polynucleotide contained in the (k + 1) -th forward primer is not particularly limited, and can be, for example, 80 bases or less, 60 bases or less, or 50 bases or less.
  • the polynucleotide constituting the (k + 1) -th forward primer includes the base sequence C k + 1 and the base sequence D k + 1 (if present, the other base sequences described above) so as to be in the same direction. It can hybridize to a polynucleotide containing a complementary base sequence, and the entire structure up to the end does not contain a constitution that inhibits the polymerase reaction. Therefore, the entire polynucleotide constituting the (k + 1) -th forward primer can be double-stranded by extension in the nucleic acid amplification reaction.
  • the base sequence B k of the k-th reverse primer and the base sequence D k + 1 of the (k + 1) -th forward primer are designed to be hybridizable.
  • the end primer A200 includes a polynucleotide 201 containing a base sequence that hybridizes to the 3 'end of the base sequence of the complementary strand 12 of the first target nucleic acid 11 at the 3' end.
  • the end primer A 200 further includes an end primer A addition portion 202 in addition to the polynucleotide 201.
  • the terminal primer A addition portion 202 is either the label portion or the binding portion.
  • the first reverse primer 210 is included as the k-th reverse primer
  • the second forward primer 220 is included as the (k + 1) -th forward primer.
  • the first reverse primer 210 is a base sequence A 1 211 that hybridizes to the 3 ′ end portion of the base sequence of the first target nucleic acid 11 (part of the polynucleotide contained in the first reverse primer 210 that includes the base sequence A 1 polynucleotide refers to 211) the 3 'includes a distal end, 5 of the base sequence a 1 211' of the polynucleotides contained in the nucleotide sequence B 1 212 (first reverse primer 210 distally, comprising the nucleotide sequence B 1 A polynucleotide further comprising a partial polynucleotide 212).
  • the second forward primer 220 has a base sequence C 2 221 that hybridizes to the 3 ′ end portion of the base sequence of the complementary strand 22 of the second target nucleic acid 21 (the base sequence C of the polynucleotide contained in the second forward primer 220).
  • the end primer B230 includes a polynucleotide 231 that includes a base sequence that hybridizes to the 3 'end portion of the base sequence of the second target nucleic acid 21 at the 3' end portion.
  • the end primer B230 further includes an end primer B addition portion 232 in addition to the polynucleotide 231.
  • the terminal primer B addition portion 232 is one of the label portion and the binding portion.
  • the nucleic acid amplification reaction is performed in the presence of the primer of the second embodiment including the terminal primer A200, the first reverse primer 210, the second forward primer 220, and the terminal primer B230 using the nucleic acid as a template.
  • the polynucleotide 201 of the terminal primer A 200 undergoes denaturation and annealing, hybridizes to the 3 ′ end of the first target nucleic acid complementary strand 12, and is subjected to an extension reaction with a polymerase to the terminal primer A addition portion 202 at the 5 ′ end.
  • An amplified fragment 401 of the first target nucleic acid 11 to which is linked is synthesized.
  • the first reverse primer 210 undergoes denaturation and annealing, hybridizes to the 3 ′ end of the first target nucleic acid 11, and the base sequence B 1 212 is located at the 5 ′ end by an extension reaction with a polymerase.
  • An amplified fragment 402 in which the first target nucleic acid complementary strand 12 is located on the 3 ′ end side is synthesized.
  • the second forward primer 220 undergoes denaturation and annealing, hybridizes to the 3 ′ end of the second target nucleic acid complementary strand 22, and 5 ′
  • An amplified fragment 403 in which the base sequence D 2 222 is located at the end and the second target nucleic acid 21 is located at the 3 ′ end is synthesized.
  • the polynucleotide 231 of the end primer B230 undergoes denaturation and annealing, hybridizes to the 3 ′ end of the second target nucleic acid 21, and 5 ′
  • the amplified fragment 404 of the second target nucleic acid complementary strand 22 having the terminal primer B addition portion 232 linked to the end is synthesized.
  • the portion of the first target nucleic acid 11 of the amplified fragment 401 hybridizes to the portion of the first target nucleic acid complementary strand 12 of the amplified fragment 402 as shown in FIG. 4 (B).
  • the base sequence D 2 222 is located at the 3 ′ end
  • the first target nucleic acid 11 is located at the 5 ′ end
  • the terminal primer A addition portion 202 is linked to the 5 ′ end by the extension reaction with polymerase.
  • Amplified fragment 405 is synthesized.
  • the portion of the second target nucleic acid complementary strand 22 of the amplified fragment 404 is hybridized to the portion of the second target nucleic acid 21 of the amplified fragment 403, and an extension reaction by polymerase.
  • the base sequence D 2 222 at the 3 ′ end of the amplified fragment 405 and the base sequence B 1 212 at the 3 ′ end of the amplified fragment 406 And hybridize.
  • the second target nucleic acid 21 is synthesized starting from the 3 ′ end of the amplified fragment 405 and the first target nucleic acid complementary strand 22 is synthesized starting from the 3 ′ end of the amplified fragment 406 by an extension reaction with a polymerase. .
  • the base sequence of the first target nucleic acid 11, the base sequence D 2 222, and the base sequence of the second target nucleic acid 21 are in this order in the 5 ′ end.
  • the amplified fragment 408 arranged at the 3 ′ end from the “end” is hybridized, the end primer A addition portion 202 is linked to the 5 ′ end of the amplified fragment 407, and the end primer B is connected to the 5 ′ end of the amplified fragment 408.
  • An amplification product 2 to which the additional portion 203 is linked is generated.
  • the nucleic acid amplification product 2 is amplified only when both the first target nucleic acid 11 (or the first target nucleic acid complementary strand 12) and the second target nucleic acid 21 (or the second target nucleic acid complementary strand 22) are present in the template. Is done. When one of these is not present in the template, the existing target nucleic acid or its complementary strand is amplified, but no nucleic acid amplification product having both the binding portion and the labeling portion is generated, and the labeling portion is used as an index. Since the detection is clearly negative, the risk of false positive determination is very low.
  • the hybridization between the amplified fragment 405 and the amplified fragment 406 shown in FIG. 4C is difficult to proceed when the first reverse primer 210 or the second forward primer 220 is excessively present in the reaction system. For this reason, in the primer set of this embodiment, it is preferable to perform nucleic acid amplification reaction on the conditions which raised the molar ratio of the terminal primer A200 and the terminal primer B230 with respect to the 1st reverse primer 210 and the 2nd forward primer 220.
  • N 2 or more.
  • a first amplified fragment comprising, in order from the base sequence of the first target nucleic acid to the base sequence of the Nth target nucleic acid, from the 5 ′ end to the 3 ′ end; From the 5 ′ end toward the 3 ′ end, a second amplified fragment comprising in order from the base sequence of the complementary strand of the Nth target nucleic acid to the base sequence of the complementary strand of the first target nucleic acid,
  • the first amplified fragment and the second amplified fragment hybridize to form a double strand;
  • the labeling portion is linked to the 5 ′ end
  • the binding portion is linked to the 5 ′ end.
  • a nucleic acid amplification product is generated.
  • N is an integer of 2 or more.
  • the first amplified fragment contains the base sequence D k + 1 of the (k + 1) -th forward primer between the base sequence of the k-th target nucleic acid and the base sequence of the (k + 1) -th target nucleic acid.
  • k is an integer from 1 to N-1.
  • Embodiment 3 of the primer set of the present invention comprises A terminal primer A comprising a polynucleotide comprising a base sequence that hybridizes to the 3 ′ end portion of the complementary sequence of the base sequence of the first target nucleic acid at the 3 ′ end portion; A polynucleotide comprising 'the nucleotide sequence E k that hybridizes to the distal end 3' 3 of the base sequence of the k-th target nucleic acid at the distal end, which is linked to the 5 'end of the polynucleotide comprising the nucleotide sequence E k A k-th reverse primer comprising a polynucleotide comprising a base sequence F k that is not double-stranded in a nucleic acid amplification reaction; A polynucleotide comprising a base sequence G k + 1 that hybridizes to the 3 ′ end of the complementary sequence of the base sequence of the (k + 1)
  • the terminal primer A and terminal primer B, the labeling part and the binding part, and the structure connecting them are the same as those in Embodiment 1, and the description thereof is omitted.
  • the length of the base sequence E k is not particularly limited, but can be, for example, 8 bases or more, 12 bases or more, or 15 bases or more, 40 bases or less, 30 bases or less, or 25 It can be below the base.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence E k is 'need only comprise a nucleotide sequence E k to the end, 5 than the base sequence E k' Part 3 further may contain other nucleotide sequence distally.
  • nucleotide sequence the entire length of a polynucleotide comprising a E k is not particularly limited, for example, 40 bases or less, may be less than 30 bases or less, or 25 bases.
  • the length of the base sequence F k is not particularly limited, but may be, for example, 8 bases or more, 12 bases or more, or 15 bases or more, and 40 bases or less, 30 bases or less, or 25 It can be below the base.
  • Nucleotide sequence polynucleotides comprising F k may further comprise other nucleotide sequences at the 3 'end and / or the 5' end side from the base sequence F k.
  • nucleotide sequence the entire length of a polynucleotide comprising a F k is not particularly limited, for example, 40 bases or less, may be less than 30 bases or less, or 25 bases.
  • the polynucleotide containing the base sequence E k and the polynucleotide containing the base sequence F k are configured so that the latter is not double-stranded together with the former by extension in the nucleic acid amplification reaction.
  • Polynucleotides polynucleotide comprising a nucleotide sequence F k can become a template for reaction with DNA polymerase (typically, made of naturally occurring nucleotides) including the case of a polynucleotide comprising a nucleotide sequence E k, the nucleotide sequence F k
  • the polynucleotide is linked via a spacer that inhibits the polymerase reaction.
  • the structure described above is employed as a spacer that inhibits the polymerase reaction between the polynucleotide contained in the terminal primer A or B of Embodiment 1 of the primer set and the labeling part or the binding part. it can.
  • the polynucleotide containing the base sequence E k and the polynucleotide containing the base sequence F k can be linked in one direction.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence F k LNA (Locked Nucleic Acid ), L -type nucleic acid, such as the polynucleotide comprising the modified nucleic acid such as 2'-O- methylated nucleotides
  • the template for reaction with DNA polymerase In the case of using a polynucleotide that is not double-stranded by extension in the nucleic acid amplification reaction, the spacer that inhibits the polymerase reaction can be omitted.
  • the length of the base sequence G k + 1 is not particularly limited, but can be, for example, 8 bases or more, 12 bases or more, or 15 bases or more, 40 bases or less, 30 bases or less, Or it can be 25 bases or less.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence G k + 1, the 'need only comprise a nucleotide sequence G k + 1 to the end, 5 than the base sequence G k + 1' Part 3 further may contain other nucleotide sequence distally.
  • the full length of the polynucleotide containing base sequence Gk + 1 is not specifically limited, For example, it can be 40 bases or less, 30 bases or less, or 25 bases or less.
  • the length of the base sequence H k + 1 is not particularly limited, but can be, for example, 8 bases or more, 12 bases or more, or 15 bases or more, 40 bases or less, 30 bases or less, Or it can be 25 bases or less.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence H k + 1 may further comprise other nucleotide sequences at the 3 'end and / or the 5' end side from the base sequence H k + 1.
  • the full length of the polynucleotide containing base sequence Hk + 1 is not specifically limited, For example, it can be 40 bases or less, 30 bases or less, or 25 bases or less.
  • the polynucleotide containing the base sequence G k + 1 and the polynucleotide containing the base sequence H k + 1 are configured so that the latter is not double-stranded together with the former by extension in the nucleic acid amplification reaction.
  • the polynucleotide containing the base sequence H k + 1 is a polynucleotide that can be a template for a reaction by DNA polymerase (usually, a natural nucleotide)
  • the polynucleotide containing the base sequence G k + 1 and the base sequence H k + 1 The polynucleotide is linked via a spacer that inhibits the polymerase reaction.
  • the structure described above is employed as a spacer that inhibits the polymerase reaction between the polynucleotide contained in the terminal primer A or B of Embodiment 1 of the primer set and the labeling part or the binding part. it can.
  • the polynucleotide containing the base sequence G k + 1 and the polynucleotide containing the base sequence H k + 1 can be linked in one direction.
  • a polynucleotide containing the base sequence H k + 1 it can be used as a template for a reaction by DNA polymerase, such as a polynucleotide containing a modified nucleic acid such as LNA (Locked Nucleic Acid), L-type nucleic acid, and 2′-O-methylated nucleotide.
  • LNA Longed Nucleic Acid
  • L-type nucleic acid L-type nucleic acid
  • 2′-O-methylated nucleotide 2′-O-methylated nucleotide.
  • the end primer A500 includes a polynucleotide 501 that includes a base sequence that hybridizes to the 3 'end portion of the base sequence of the complementary strand 12 of the first target nucleic acid 11 at the 3' end portion.
  • the end primer A 500 further includes an end primer A addition portion 502 in addition to the polynucleotide 501.
  • the terminal primer A addition portion 502 is either the label portion or the binding portion.
  • the first reverse primer 510 is included as the kth reverse primer
  • the second forward primer 520 is included as the (k + 1) th forward primer.
  • the first reverse primer 510 the polynucleotide 511 comprising a polynucleotide 511 comprising 'the nucleotide sequence E 1 which hybridizes to the distal end 3' 3 of the base sequence of the first target nucleic acid at the terminal portion, the base sequence E 1 linked to the 5 'end of a polynucleotide 512 comprising a nucleotide sequence F 1.
  • the second forward primer 520 includes a polynucleotide 521 comprising 'a base sequence G 2 that hybridizes to the distal end 3' 3 complementary sequences 22 of the nucleotide sequence of the second target nucleic acid 21 to the distal end, the base sequence G 2 linked to the 5 'end of a polynucleotide 521 comprising, a polynucleotide 522 comprising the base sequence F 1 that hybridizes to the nucleotide sequence H 2.
  • the terminal primer B530 includes a polynucleotide 531 that includes a base sequence that hybridizes to the 3 'end portion of the base sequence of the second target nucleic acid 21 at the 3' end portion.
  • the end primer B 530 further includes an end primer B addition portion 532 in addition to the polynucleotide 531.
  • the terminal primer B addition portion 532 is either the label portion or the binding portion.
  • the nucleic acid amplification reaction is performed in the presence of the primer of the third embodiment including the terminal primer A500, the first reverse primer 510, the second forward primer 520, and the terminal primer B530 using the nucleic acid as a template.
  • the polynucleotide 501 of the end primer A500 undergoes denaturation and annealing, hybridizes to the 3 ′ end of the first target nucleic acid complementary strand 12, and is subjected to an extension reaction with a polymerase to add an end primer A addition portion 502 to the 5 ′ end.
  • An amplified fragment 551 of the first target nucleic acid 11 to which is linked is synthesized.
  • polynucleotide 511 comprising a nucleotide sequence E 1 of the first reverse primer 510, through the modified and Annie training, hybridizes to the 3 'end of the first target nucleic acid 11, by extension reaction with polymerase, amplified fragment 552 of the first target nucleic acid complementary strand 12 polynucleotide 512 comprising a nucleotide sequence F 1 is coupled to the 5 'end is synthesized.
  • polynucleotide 521 comprising a nucleotide sequence G 2 of the second forward primer 520, through the modified and Annie training, hybridizes to the 3 'end of the second target nucleic acid complementary strands 22 and, by extension reaction with polymerase, amplified fragment 553 of the second target nucleic acid 21 polynucleotide 522 comprising a nucleotide sequence H 2 is coupled to the 5 'end is synthesized.
  • the polynucleotide 531 of the end primer B530 undergoes denaturation and annealing, hybridizes to the 3 ′ end of the second target nucleic acid 21, and 5 ′
  • An amplified fragment 554 of the second target nucleic acid complementary strand 22 having the terminal primer B addition portion 532 linked to the end is synthesized.
  • the first target nucleic acid 11 portion of the amplified fragment 551 and the first target nucleic acid complementary strand 12 portion of the amplified fragment 552 are hybridized. and, wherein the portion of the polynucleotide 512 comprising a nucleotide sequence F 1 of the amplified fragment 552, and portion and the hybridizing polynucleotide 522 comprising a nucleotide sequence of H 2 the amplified fragment 553, a second target of the amplified fragment 553 A nucleic acid amplification product 3 in which the nucleic acid 21 portion and the second target nucleic acid complementary strand 22 portion of the amplified fragment 554 are hybridized is generated.
  • both the first target nucleic acid 11 (or the first target nucleic acid complementary strand 12) and the second target nucleic acid 21 (or the second target nucleic acid complementary strand 22) are present in the template. Only when amplified. When one of these is not present in the template, the existing target nucleic acid or its complementary strand is amplified, but no nucleic acid amplification product having both the binding portion and the labeling portion is generated, and the labeling portion is used as an index. Since the detection is clearly negative, the risk of false positive determination is very low.
  • the hybridization between the amplified fragments 551 to 554 shown in FIG. 5 (B) is difficult to proceed when the first reverse primer 510 or the second forward primer 520 is excessively present in the reaction system. For this reason, in the primer set of this embodiment, it is preferable to perform the nucleic acid amplification reaction under the condition that the molar ratio of the terminal primer A500 and the terminal primer B530 is increased with respect to the first reverse primer 510 and the second forward primer 520.
  • N 2 or more.
  • a single-stranded polypeptide is linked to the 5 ′ end of each of the target nucleic acids from the second target nucleic acid to the N-th target nucleic acid,
  • a single-stranded polypeptide is linked from the first target nucleic acid to the 5 ′ end of each complementary strand of the target nucleic acid of the (N ⁇ 1) -th target nucleic acid,
  • the double-stranded amplified fragment of the k-th target nucleic acid the single-stranded polypeptide linked to the 5 ′ end side of the complementary strand of the k-th target nucleic acid, and the double-stranded amplified fragment of the (k + 1) -th target nucleic acid
  • Embodiment 4 of the primer set of the present invention comprises A terminal primer A comprising a polynucleotide comprising a base sequence that hybridizes to the 3 ′ end portion of the complementary sequence of the base sequence of the first target nucleic acid at the 3 ′ end portion; A polynucleotide comprising 'the nucleotide sequence I k that hybridizes to the distal end 3' 3 of the base sequence of the k-th target nucleic acid at the distal end, which is linked to the 5 'end of the polynucleotide comprising the nucleotide sequence I k , a polynucleotide comprising a nucleotide sequence J k not two stranded in a nucleic acid amplification reaction, and the k reverse primer, A polynucleotide comprising a base sequence L k + 1
  • the terminal primer A and terminal primer B, the labeling part and the binding part, and the structure connecting them are the same as those in Embodiment 1, and therefore the description thereof is omitted.
  • the length of the base sequence I k is not particularly limited, but may be, for example, 8 bases or more, 12 bases or more, or 15 bases or more, 40 bases or less, 30 bases Or less or 25 bases or less.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence I k are 'well if it contains nucleotide sequence I k at the ends, 5 than the base sequence I k' Part 3 further may contain other nucleotide sequence distally.
  • nucleotide sequence the entire length of a polynucleotide comprising a I k is not particularly limited, for example, 40 bases or less, may be less than 30 bases or less, or 25 bases.
  • the length of the base sequence Jk is not particularly limited, and can be, for example, 8 bases or more, 12 bases or more, or 15 bases or more, and 40 bases or less, 30 bases or less, or 25 It can be below the base.
  • Nucleotide sequence polynucleotides comprising J k may further comprise other nucleotide sequences at the 3 'end and / or the 5' end side from the base sequence J k.
  • nucleotide sequence the entire length of a polynucleotide comprising a J k is not particularly limited, for example, 40 bases or less, may be less than 30 bases or less, or 25 bases.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence I k is configured so as not two stranded together former by extension of the latter is a nucleic acid amplification reaction.
  • Polynucleotides polynucleotide comprising a nucleotide sequence J k can become a template for reaction with DNA polymerase (typically, made of naturally occurring nucleotides) including the case of a polynucleotide comprising a nucleotide sequence I k, the nucleotide sequence J k
  • the polynucleotide is linked via a spacer that inhibits the polymerase reaction.
  • a spacer the structure described above is employed as a spacer that inhibits the polymerase reaction between the polynucleotide contained in the terminal primer A or B of Embodiment 1 of the primer set and the labeling part or the binding part. it can.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence I k the polynucleotide comprising a nucleotide sequence J k can be connected in one direction.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence J k LNA (Locked Nucleic Acid ), L -type nucleic acid, such as the polynucleotide comprising the modified nucleic acid such as 2'-O- methylated nucleotides, the template for reaction with DNA polymerase
  • the spacer that inhibits the polymerase reaction can be omitted.
  • the length of the base sequence L k + 1 is not particularly limited, and can be, for example, 8 bases or more, 12 bases or more, or 15 bases or more, 40 bases or less, 30 bases or less, Or it can be 25 bases or less.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence L k + 1 are 'well if it contains nucleotide sequences L k + 1 to the end, 5 than the base sequence L k + 1' Part 3 further may contain other nucleotide sequence distally.
  • the full length of the polynucleotide containing base sequence Lk + 1 is not specifically limited, For example, it can be 40 bases or less, 30 bases or less, or 25 bases or less.
  • the length of the base sequence M k + 1 is not particularly limited, and can be, for example, 8 bases or more, 12 bases or more, or 15 bases or more, 40 bases or less, 30 bases or less, Or it can be 25 bases or less.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence M k + 1 may further comprise other nucleotide sequences at the 3 'end and / or the 5' end side from the base sequence M k + 1.
  • the full length of the polynucleotide containing base sequence Mk + 1 is not specifically limited, For example, it can be 40 bases or less, 30 bases or less, or 25 bases or less.
  • the polynucleotide containing the base sequence L k + 1 and the polynucleotide containing the base sequence M k + 1 are configured so that the latter is not double-stranded together with the former by extension in the nucleic acid amplification reaction. Yes.
  • the polynucleotide containing the base sequence M k + 1 is a polynucleotide that can serve as a template for a reaction by DNA polymerase (usually a natural nucleotide)
  • the polynucleotide containing the base sequence L k + 1 and the base sequence M k + 1 The polynucleotide is linked via a spacer that inhibits the polymerase reaction.
  • Such a “spacer” is the spacer described above as a spacer that inhibits the polymerase reaction between the polynucleotide contained in the terminal primer A or B of Embodiment 1 of the primer set and the labeling part or binding part or binding part.
  • the structure can be adopted.
  • the polynucleotide containing the base sequence L k + 1 and the polynucleotide containing the base sequence M k + 1 can be linked in one direction.
  • a polynucleotide containing the base sequence M k + 1 as a polynucleotide containing a modified nucleic acid such as LNA (Locked Nucleic Acid), L-type nucleic acid, 2′-O-methylated nucleotide, etc.
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • L-type nucleic acid L-type nucleic acid
  • 2′-O-methylated nucleotide etc.
  • the spacer that inhibits the polymerase reaction can be omitted.
  • the polynucleotide comprising a nucleotide sequence J k hybridizing to nucleotide sequences, the nucleotide sequence J k that hybridizes with the base sequence 5 'end and / or 3' end side still other A base sequence may be included.
  • the polynucleotide comprising a nucleotide sequence M k + 1 that hybridizes to nucleotide sequence, the nucleotide sequence M k + 1 that hybridizes to the nucleotide sequence 5 'end and / or 3' end side still other A base sequence may be included.
  • a chemical structure for example, the structure described above can be adopted as the structure between the polynucleotide contained in the terminal primer A or B of Embodiment 1 of the primer set and the labeling part or the binding part.
  • the k-th linking polynucleotide preferably has a structure that does not serve as a template in a reaction by DNA polymerase.
  • a polynucleotide containing a base sequence that hybridizes with the base sequence J k and a polynucleotide containing a base sequence that hybridizes with the base sequence M k + 1 may be linked on the 3 ′ end side.
  • a polynucleotide containing a base sequence that hybridizes with the base sequence J k and a polynucleotide containing a base sequence that hybridizes with the base sequence M k + 1 are LNA (Locked Nucleic Acid), L-type nucleic acid, 2
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • L-type nucleic acid 2
  • a polynucleotide containing a modified nucleic acid such as' -O-methylated nucleotide, it may be composed of a polynucleotide that does not become a template for a reaction by DNA polymerase and is not double-stranded by extension in a nucleic acid amplification reaction.
  • the base sequence J k of the k-th reverse primer, the base sequence M k + 1 of the (k + 1) -th forward primer, and the base sequence that hybridizes with these base sequences contained in the k-th linking polynucleotide are the primers included in the primer set. It can be designed as appropriate so as not to inhibit nucleic acid amplification by.
  • the terminal primer A 600 includes a polynucleotide 601 that includes a base sequence that hybridizes to the 3 'end of the base sequence of the complementary strand 12 of the first target nucleic acid 11 at the 3' end, and a terminal primer A addition portion 602.
  • the first reverse primer 610 is included as the k-th reverse primer
  • the second forward primer 620 is included as the (k + 1) -th forward primer
  • a first linking polynucleotide 640 is included as a nucleotide.
  • the first reverse primer 610 includes 'a polynucleotide 611 comprising a distal end, 5 polynucleotide 611' nucleotide sequence I 1 3 is connected to the terminal side and a polynucleotide 612 comprising a nucleotide sequence J 1.
  • the second forward primer 620 includes 'a polynucleotide 621 comprising a distal end, 5 polynucleotide 621' nucleotide sequence L 2 3 is connected to the terminal side and a polynucleotide 622 comprising a nucleotide sequence M 2.
  • the terminal primer B 630 includes a polynucleotide 631 that includes a base sequence that hybridizes to the 3 ′ end portion of the base sequence of the second target nucleic acid 21 at the 3 ′ end portion, and an end primer B addition portion 632.
  • First connecting polynucleotide 640 a polynucleotide comprising a polynucleotide 641 comprising a polynucleotide 612 hybridizing to the nucleotide sequence comprising a nucleotide sequence J 1, a polynucleotide 622 hybridizing to the nucleotide sequence comprising a nucleotide sequence M 2 642.
  • the nucleic acid amplification reaction is performed in the presence of the primers of the fourth embodiment including the terminal primer 600, the first reverse primer 610, the second forward primer 620, and the terminal primer B630 using the nucleic acid as a template.
  • the amplified fragment 651 of the first target nucleic acid 11 in which the terminal primer A addition portion 602 is linked to the 5 ′ end is synthesized from the terminal primer A600.
  • amplified fragment 652 of the first target nucleic acid complementary strand 12 polynucleotide 612 comprising a nucleotide sequence J 1 is linked to the 5 'end it is synthesized.
  • amplified fragment 653 of the second target nucleic acid 21 polynucleotide 622 comprising a nucleotide sequence M 2 is coupled to the 5 'end it is synthesized.
  • an amplified fragment 654 of the second target nucleic acid complementary strand 22 in which the end primer B addition portion 632 is linked to the 5 'end is synthesized.
  • the first linking polynucleotide 640 is not directly involved in the nucleic acid amplification reaction.
  • the first target nucleic acid 11 portion of the amplified fragment 651 and the first target nucleic acid complementary strand 12 of the amplified fragment 652 Part of the polynucleotide 612 of the amplified fragment 652 and the part of the polypeptide 641 of the first linking polynucleotide 640 are hybridized to form the polypeptide 642 of the first linking polynucleotide 640.
  • the portion and the polynucleotide 622 portion of the amplified fragment 653 are hybridized, and the portion of the second target nucleic acid 21 of the amplified fragment 653 and the portion of the second target nucleic acid complementary strand 22 of the amplified fragment 654 are hybridized. Soybean nucleic acid amplification product 4 is produced.
  • both the first target nucleic acid 11 (or the first target nucleic acid complementary strand 12) and the second target nucleic acid 21 (or the second target nucleic acid complementary strand 22) are present in the template. Only when amplified. When one of these is not present in the template, the existing target nucleic acid or its complementary strand is amplified, but no nucleic acid amplification product having both the binding portion and the labeling portion is generated, and the labeling portion is used as an index. Since the detection is clearly negative, the risk of false positive determination is very low.
  • the first reverse primer 610 or the second forward primer 620 is excessively present in the reaction system. If it is difficult to proceed. For this reason, in the primer set of this embodiment, it is preferable to perform the nucleic acid amplification reaction under the condition in which the molar ratio of the terminal primer A600 and the terminal primer B630 is increased with respect to the first reverse primer 610 and the second forward primer 620.
  • the k-th linking polynucleotide since the k-th linking polynucleotide does not directly participate in the nucleic acid amplification reaction, it may be added to the reaction system after the nucleic acid amplification reaction, and then the reaction system may be denatured and annealed.
  • N 2 or more.
  • the present invention also provides a method for detecting two or more target nucleic acids, Possible to include a detection nucleic acid comprising two or more linked target nucleic acids, a labeling part that is a labeling substance or a tag that can be bound to the labeling substance, and a binding part that is a tag that can be bound to a solid phase carrier A detectable detection sample is brought into contact with a solid phase carrier including at least a portion capable of binding to the binding portion, and the detection nucleic acid in the portion of the solid phase carrier is detected using the labeling portion as an index.
  • the present invention relates to a method including a detecting step.
  • a mixture of two or more target nucleic acids each having a binding portion and a labeling portion bound thereto is brought into contact with one solid phase carrier containing a plurality of binding sites corresponding to each binding portion. In some cases, there is a problem of poor discrimination.
  • a nucleic acid in which two or more target nucleic acids, the labeling portion, and the binding portion are linked is used as a detection nucleic acid, and a detection sample that may contain the detection nucleic acid is defined as the binding portion.
  • the detection nucleic acid in the part of the solid-phase carrier is detected by contacting with a solid-phase carrier including at least a part capable of binding, and using the labeling part as an index.
  • the detection of the detection nucleic acid in the portion of the solid phase carrier can be determined based on the presence or absence of the labeling portion in the portion. As shown in FIG.
  • the detection nucleic acid when the detection nucleic acid is detected in the portion of the solid phase carrier, it can be determined that the detection sample contains two or more predetermined target nucleic acids. it can. Therefore, in comparison with a method in which a mixture of two or more target nucleic acids each having a binding portion and a labeling portion bound to a single solid phase carrier containing a plurality of binding sites corresponding to each binding portion, Discriminability is remarkably high.
  • the detection nucleic acid is preferably two or more target nucleic acids linked in series, the labeling unit linked to one of both ends of the row of the two or more target nucleic acids, and the label linked to the other And a connecting portion.
  • the labeling unit and the binding unit can coexist in one nucleic acid only when all of the predetermined two or more target sequences are included, and as shown in FIGS. 1B1 to B3, When the target nucleic acid is not present, the label by the labeling unit is not detected on the solid phase carrier, so that the risk of false positive can be reduced.
  • the detection method of the present invention comprises: A method for detecting two or more target nucleic acids, A detection sample preparation step of preparing a detection sample that may contain the detection nucleic acid by a nucleic acid amplification reaction using a nucleic acid obtained from an analysis target sample as a template; In the detection step, the product of the nucleic acid amplification reaction obtained in the detection sample preparation step is used as the detection sample.
  • the detection nucleic acid is a nucleic acid amplification product obtained by the nucleic acid amplification reaction.
  • the detection sample preparation step performs nucleic acid amplification reaction using the nucleic acid obtained from the sample to be analyzed as a template and the primer set according to each embodiment of the present invention. Including.
  • the primer set according to each embodiment of the present invention when all of the first target nucleic acid to the Nth target nucleic acid are contained in the nucleic acid as a template, the nucleic acid amplification products are connected in series,
  • the detection nucleic acid comprising: a target nucleic acid from a first target nucleic acid to an Nth target nucleic acid; the labeling part connected to one end of the two or more target nucleic acid rows; and the binding part connected to the other.
  • Nucleic acids can be obtained.
  • the product of the nucleic acid amplification reaction includes not only the nucleic acid for detection but also a nucleic acid species that includes both the labeling part and the binding part. Not included.
  • the label by the labeling unit is not detected on the solid phase carrier. The risk of false positives can be reduced.
  • the sample to be analyzed is not particularly limited, but typically includes a part of a living body such as a food and drink, an animal plant (organ, tissue, cell, blood, body fluid, etc.), feces, microorganisms, viruses, and the like.
  • a sample is mentioned.
  • the nucleic acid obtained from the sample to be analyzed can be used as a template for the nucleic acid amplification reaction.
  • the nucleic acid may be extracted and purified from the sample to be analyzed, or may be extracted from the sample to be analyzed and roughly purified.
  • the sample contains nucleic acid at a relatively high concentration, such as a part of a cell or tissue
  • the sample to be analyzed itself can be included in the nucleic acid amplification reaction as it is.
  • cDNA prepared from the sample to be analyzed can also be used as a template.
  • the nucleic acid used as a template is preferably DNA.
  • the nucleic acid amplification reaction can be performed according to the polymerase chain reaction method (PCR method). That is, when PCR is performed on the template nucleic acid containing the target nucleic acid using the primer set of the present invention, it can be performed under PCR conditions that amplify a desired nucleic acid amplification product. If appropriate, a nucleic acid amplification reaction other than the PCR method may be used.
  • PCR method polymerase chain reaction method
  • the DNA polymerase used for PCR is not particularly limited as long as it is a heat-resistant DNA polymerase.
  • a commercially available DNA polymerase can be used, and for example, TaKaRa Ex Taq (registered trademark) can be preferably used.
  • the temperature, time, buffer composition, etc. can be appropriately selected depending on the DNA polymerase used, the concentration of each primer, and the like.
  • the hot start PCR method is useful because it can be expected to suppress the formation of primer dimers.
  • the hot start PCR method can be performed using a commercially available hot start PCR reagent such as TaKaRa Ex Taq (registered trademark) Hot Start Version (Takara Bio). Further, TaKaRa Taq HS PCR Kit, UNG plus (registered trademark) can be used, and by using this kit, an effect of suppressing carry-over contamination of nucleic acid amplification products can be expected.
  • Conditions such as time, temperature, buffer composition, dNTP concentration, number of cycles, etc. for each step of denaturation, annealing, extension in PCR method are factors such as selected DNA polymerase, primer sequence, number of bases of target nucleic acid, template concentration, etc. Can be set as appropriate.
  • the number of cycles in the PCR method is not particularly limited, but is, for example, in the range of 25 to 60 cycles.
  • the concentration of each primer at the start of the reaction system in the PCR method is not particularly limited, and can be adjusted as appropriate according to the amount of nucleic acid serving as a template.
  • a preferable primer concentration at the start of the reaction in the reaction system is a concentration of 0.05 ⁇ M or more and 1.0 ⁇ M or less for each primer. If it is less than 0.05 ⁇ M, the detection sensitivity may be lowered, and the reference detection sensitivity may be lowered. Further, the upper limit of the primer concentration is not particularly limited, but is preferably 1.0 ⁇ M.
  • the nucleic acid amplification products 1 to 4 are formed as amplification products in the reaction system.
  • a nucleic acid amplification reaction can be performed under the above conditions using a nucleic acid obtained from a sample to be analyzed as a template.
  • the detection sample obtained by the nucleic acid amplification reaction is brought into contact with the solid phase carrier, and each of the two or more detection nucleic acids is detected on the solid phase carrier using the labeling portion as an index.
  • the detection sample such as the product of the nucleic acid amplification reaction in the detection sample preparation step is brought into contact with a solid phase carrier that includes at least a portion that can bind to the binding portion, and is immobilized using the labeling portion as an index. Detecting nucleic acids for detection in the portion of the phase carrier.
  • the product of the nucleic acid amplification reaction refers to a reaction solution of the nucleic acid amplification reaction that may contain the detection nucleic acid as an amplification product, a sample obtained by further increasing the concentration of the amplification product from the reaction solution, and the like.
  • a labeling step for binding the labeling substance to the labeling tag may be further performed.
  • the labeling part is the above-mentioned labeling substance
  • the labeling step is unnecessary.
  • “using the labeling portion as an indicator” means that when the labeling portion is a labeling tag, the detection nucleic acid is detected using the labeling substance bound through the labeling step as an indicator. In the case of a substance, it means detecting the detection nucleic acid using the labeling substance as an index.
  • the solid phase carrier has already been described in detail.
  • the detection nucleic acid is contained in the detection sample according to the combination of the solid phase carrier and the binding portion.
  • the conditions may be adjusted appropriately so that the binding part of the nucleic acid for detection binds to the part (for example, hybridization conditions described in detail for the binding part, or buffer conditions of about pH 5 to 9).
  • the detection nucleic acid can be detected by detecting the labeling substance bound to the detection nucleic acid captured on a solid phase carrier, preferably by visual detection.
  • the detection nucleic acid is present, the labeling substance of the detection nucleic acid captured and bound to the solid phase carrier is detected.
  • the presence or absence of the detection nucleic acid in the detection sample can be determined using the presence or absence of the detection as an index.
  • the detection sample is a product of a nucleic acid amplification reaction in the detection sample preparation step, the presence or absence of two or more target nucleic acids in the sample to be analyzed can be determined using the presence or absence of the detection as an index. it can. (2.3.
  • the labeling step is a step performed when the labeling portion contained in the detection nucleic acid is the above-described labeling tag, and the detection sample and the labeling substance are brought into contact with each other, and the labeling tag is bound to the labeling substance.
  • the labeling step may be performed before the sample for detection is brought into contact with the solid phase carrier, may be performed after the sample is contacted, or may be performed simultaneously with the contact.
  • Kit of the present invention The present invention is also a kit for detecting two or more target nucleic acids in a sample to be analyzed, which comprises at least a part of the primer set of the present invention and a part capable of binding to the binding part.
  • a kit comprising: The kit can be used in the detection method of the present invention.
  • the kit of the present invention can further contain a labeling substance.
  • the solid phase carrier and the labeling substance can be in the form of a nucleic acid detection device described later.
  • the kit of the present invention can further contain a PCR buffer, dNTPs, DNA polymerase, a nucleic acid chromatography developing solution, and the like.
  • Nucleic acid detection device The detection step and the labeling step described above can be performed using a nucleic acid detection device utilizing nucleic acid chromatography. By using the nucleic acid detection device, the presence or absence of the detection nucleic acid in the detection sample can be detected and discriminated without requiring a special device, and the result can be obtained easily and quickly. .
  • nucleic acid detection device a known nucleic acid detection device (WO2012 / 070618) used for detecting the labeled nucleic acid for detection by a nucleic acid chromatography method can be used.
  • FIG. 7 shows a schematic diagram of an embodiment of a nucleic acid detection device that can be used in the present invention, but the nucleic acid detection device is not limited to this embodiment.
  • the reference numerals given to the members correspond to the reference numerals shown in FIG.
  • the nucleic acid detection device 700 of FIG. 7 has a sample pad 73 that is a reaction system receiving part for receiving the detection sample, a conjugate pad 72 that holds a labeling substance, and the detection nucleic acid on a substrate 75.
  • a porous solid phase carrier 71 that includes a portion 76 that can be coupled to the coupling portion that is included, and an absorbent pad 74 are arranged so as to contact each other in this order.
  • the portion 76 of the solid phase carrier 71 is a portion where a means (capturing means) for capturing the nucleic acid for detection (for example, the above-mentioned oligonucleotide or the like) is locally arranged and immobilized.
  • the sample pad 73, the conjugate pad 72, the solid phase carrier 71, and the absorption pad 74 can be configured by a member having a porous structure that can be used as the solid phase carrier. These may be comprised from the same member, and may be comprised from a different member.
  • the base material 75 can support various members disposed thereon and can be any material that facilitates the operation of the nucleic acid detection device. For example, a material made of resin, metal, mineral, or the like can be used. .
  • the conjugate pad 72 can be omitted.
  • a part of the nucleic acid detection device 700 may be covered with a film of polyester or the like in order to prevent contamination and to prevent the liquid from volatilizing from the surface of the solid phase carrier under test.
  • the detection sample such as the reaction system of the nucleic acid amplification reaction obtained by the nucleic acid amplification step is added to the sample pad 73.
  • the reaction system may be added as it is, or may be added together with an appropriate developing solution (for example, phosphate buffer, Tris buffer, Good buffer, SSC buffer).
  • the developing solution can further contain a surfactant, a salt, a protein, a nucleic acid and the like, if necessary.
  • the detection sample added to the sample pad 73 is developed by a capillary phenomenon from upstream to downstream in the direction indicated by the arrow in FIG.
  • a sample pad 73 of the nucleic acid detection device is placed in a container (for example, a PCR tube, an Eppendorf tube, a 96-well plate, etc.) holding the detection sample and / or a developing solution. It can also be developed by a method of immersing in a developing solution.
  • the width of the sample pad 73 is preferably 2.0 to 10.0 mm so that the sample pad 73 is placed in a container holding the detection sample and / or the developing solution. More preferably, it is 0 mm.
  • the sample pad 73 can be omitted from the nucleic acid detection device 700 illustrated in FIG. Furthermore, when a labeling substance is used as the labeling part, the conjugate pad 72 can be omitted if it is not necessary, and the end part of the solid phase carrier 71 on the base 75 on the side where the absorption pad 74 is not disposed. Can be directly immersed in the detection sample and / or the developing solution.
  • the detection nucleic acid contacts the labeling substance when passing through the conjugate pad 72 holding the labeling substance, and is labeled via the labeling tag. Labeled with substance.
  • the detection nucleic acid in the detection sample passes through the solid phase carrier 71, the detection nucleic acid comes into contact with the capture means fixed to the portion 76, and is captured by the solid phase carrier 71 via the immobilization tag. Combined.
  • the labeling substance bound to the detection nucleic acid captured and bound to the portion 76 of the solid phase carrier 71 including the capture means is detected in the portion 76. . If the labeling substance can be visually confirmed, the portion 76 is colored due to the labeling substance.
  • the presence or absence of the nucleic acid for detection can be determined using the presence or absence of detection (coloration) of the labeling substance as an index, and based on this, the presence or absence of the target nucleic acid in the sample to be analyzed can be determined. ⁇ 4.
  • primer set of the present invention > In a further embodiment of the primer set of Embodiment 1 of the present invention, the labeling part that binds to one of the terminal primer A and terminal primer B and the binding part that binds to the other are not necessarily required.
  • a further embodiment of the primer set of the present invention is: The end primer A; The k th double-headed primer; And terminal primer B, N is an integer greater than or equal to 2, k is an integer from 1 to N-1,
  • the present invention relates to a primer set including the k-th double-headed primer from when k is 1 to when k is N-1.
  • This nucleic acid amplification product can be detected by analyzing the product of the nucleic acid amplification reaction.
  • the detection method is not limited to detection by immobilizing on a solid phase carrier, but may be other detection methods.
  • the product of a nucleic acid amplification reaction is used as an indicator of molecular weight or the like by a method such as gel electrophoresis. The method of detecting as may be sufficient.
  • Salmonella is classified into 1 genus, 2 bacterial species, and 6 subspecies based on biochemical properties, DNA homology, and the like.
  • serotype classification based on a combination of bacterial cell antigen (O antigen) and flagellar antigen (H antigen) has been established, and 2,500 or more serotypes have been reported so far.
  • O antigen bacterial cell antigen
  • H antigen flagellar antigen
  • Over 1,500 serotypes that cause infectious diseases in humans and livestock are classified as subspecies I, and their genetic similarity is extremely high, making it difficult to determine serotypes using differences in the base sequences of single genes. Yes.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2011-234739 makes it possible to distinguish serotypes of Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis, Salmonella Infantis, etc., by combining three genes specific to a specific serotype.
  • three serotype-specific genes are amplified by multiplex PCR and then analyzed by gel electrophoresis, and when all three amplification products are confirmed, it is determined as positive.
  • SEQ ID NOs: 1 to 6 are disclosed as primer sets for detecting Salmonella typhimurium.
  • the TMP1F-Mem of this primer set corresponds to the end primer A100 in FIG.
  • the TMP1F DNA chain (SEQ ID NO: 1) corresponds to the polynucleotide 101
  • the underlined tag sequence (SEQ ID NO: 9) in Table 2 corresponds to the terminal primer A addition portion 102.
  • This tag sequence (SEQ ID NO: 9) is a complementary sequence of the solid phase tag sequence (SEQ ID NO: 11) fixed to a membrane as a solid phase carrier, and the binding portion (immobilization tag) in the primer set of Embodiment 1. ).
  • TMP1F-Mem the tag sequence (SEQ ID NO: 9) and TMP1F (SEQ ID NO: 1) are arranged in the same direction from the 5 ′ end to the 3 ′ end, and X shown in Table 2 stops the extension by the polymerase reaction.
  • An azobenzene-modified nucleic acid specifically, a divalent group represented by the above formula I.
  • the TMP1R-2F in this primer set corresponds to the first double-headed primer 110 in FIG.
  • the TMP1R DNA strand (SEQ ID NO: 2) corresponds to the first double-headed primer first polynucleotide 111
  • the TMP2F DNA strand (SEQ ID NO: 3) corresponds to the first double-headed primer second polynucleotide 112.
  • the DNA strand of TMP1R (SEQ ID NO: 2) and the DNA strand of TMP2F (SEQ ID NO: 3) are arranged in opposite directions, and the 5′-positions of the sugars of the respective 5′-terminal nucleotides are linked via a phosphate group. They are linked by 5'-5 'linkages.
  • the DNA strand of TMP1R (SEQ ID NO: 2) and the DNA strand of TMP2F (SEQ ID NO: 3) are linked to each other on the 5 ′ end side, the 3 ′ end is released, and the presence of the template from each 3 ′ end It can be extended by a DNA polymerase reaction under.
  • the TMP2R-3R in this primer set corresponds to the second double-headed primer 120 in FIG.
  • the TMP2R DNA strand (SEQ ID NO: 4) corresponds to the second double-headed primer first polynucleotide 121
  • the TMP3R DNA strand (SEQ ID NO: 6) corresponds to the second double-headed primer second polynucleotide 122.
  • the TMP2R DNA strand (SEQ ID NO: 4) and the TMP3R DNA strand (SEQ ID NO: 6) are arranged in opposite directions, and the 5′-positions of the sugars of each 5 ′ terminal nucleotide are linked via a phosphate group. They are linked by 5'-5 'linkages.
  • the TMP2R DNA strand (SEQ ID NO: 4) and the TMP3R DNA strand (SEQ ID NO: 6) are linked to each other at the 5 ′ end, the 3 ′ end is released, and the presence of the template from each 3 ′ end It can be extended by a DNA polymerase reaction under.
  • the TMP3F-Au of this primer set corresponds to the end primer B130 in FIG.
  • the TMP3F DNA chain (SEQ ID NO: 5) corresponds to the polynucleotide 131
  • the underlined tag sequence (SEQ ID NO: 10) in Table 2 corresponds to the terminal primer B addition portion 132.
  • This tag sequence (SEQ ID NO: 10) is a complementary sequence of the labeling substance side tag sequence (SEQ ID NO: 12) fixed to the colloidal gold colloid, and is a labeling part (labeling tag) in the primer set of Embodiment 1. It corresponds to.
  • TMP3F-Au the tag sequence (SEQ ID NO: 10) and TMP3F (SEQ ID NO: 5) are arranged in the same direction from the 5 ′ end to the 3 ′ end, and X shown in Table 2 stops the extension by the polymerase reaction.
  • An azobenzene-modified nucleic acid specifically, a divalent group represented by the above formula I.
  • An oligonucleotide-bound gold colloid used as a labeling substance was prepared by the following procedure.
  • Gold Colloid 40 nm, 9.0 ⁇ 10 10 (number of particles / ml), manufactured by British Biocell International) and a thiol group-containing oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 12 below were mixed and incubated at 50 ° C. for 16 hours. . Centrifugation was performed at 6000 rpm for 15 minutes, the supernatant was removed, 0.05 M sodium chloride, 5 mM phosphate buffer (pH 7) was added and mixed, and then incubated again at 50 ° C. for 40 hours.
  • the prepared gold colloid solution was uniformly added to the glass fiber pad and then dried in a vacuum dryer to obtain a conjugate pad.
  • the thiol group-containing oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 12 comprises a phosphate group at the 3 ′ position of a cytosine nucleotide at the 3 ′ end and a hydroxyl group of a compound represented by HO— (CH 2 ) m —SH (m is 6). Are bonded by a phosphate ester bond.
  • a solid phase carrier (membrane) on which a tag capturing means that binds to the immobilizing tag sequence (SEQ ID NO: 9) was immobilized was prepared by the following procedure.
  • a solution containing the oligonucleotide probe represented by SEQ ID NO: 11 below is applied to a nitrocellulose membrane (Hi-Flow 180) manufactured by Merck Millipore, using a dispenser, in a line shape having a width of 1 mm perpendicular to the developing direction. It was applied to. Thereafter, the membrane was dried at 40 ° C. for 30 minutes to obtain a membrane equipped with tag capturing means.
  • a nitrocellulose membrane Hi-Flow 180 manufactured by Merck Millipore
  • a lateral flow type nucleic acid detection device was prepared by the following procedure.
  • the manufactured lateral flow type nucleic acid detection device was prepared in accordance with the detection device shown in the schematic diagram of FIG.
  • a membrane equipped with an oligonucleotide probe (SEQ ID NO: 11) as a tag capturing means, a glass fiber sample pad as a sample pad 73, and a cellulose absorbent pad as an absorbent pad 74 are overlapped with each other as shown in FIG.
  • the lateral flow type nucleic acid detection device 700 was manufactured. ⁇ 2. Nucleic acid amplification by PCR> Using the primers shown in Table 2 as a primer set and Salmonella Typhimurium genomic DNA as a template, PCR reaction solutions in Test Groups 1 to 6 were prepared according to Table 3 below.
  • the PCR reaction solution of each test section was set in a thermal cycler (Bior, LifeEco), reacted at 95 ° C. for 2 minutes, and then cycled at 98 ° C.-10 seconds / 60 ° C.-30 seconds / 72 ° C.-30 seconds. Was performed 30 times.
  • the PCR product was confirmed by gel electrophoresis and nucleic acid chromatography.
  • test group 6 For analysis by nucleic acid chromatography, 5 ⁇ l of the reaction solution is added to the sample pad 73 of the lateral flow type nucleic acid detection device 700 having the structure shown in FIG. After 5 minutes, line coloring at the portion 6 of the membrane 1 was confirmed. ⁇ 3. Result> The result of gel electrophoresis is shown in FIG. Under the conditions (test group 6) in which all the primer sets of Embodiment 1 were used, it was possible to confirm the amplification product to which the target nucleic acids 1 to 3 were linked. In test group 6, in addition to the amplification product to which target nucleic acids 1 to 3 were linked, one amplification product and two amplification products to which target nucleic acids 1 to 3 were linked were also confirmed. In test groups 1 to 5, it was confirmed that an amplification product corresponding to the combination of primers was generated.
  • FIG. 9 shows the results of subjecting each PCR reaction solution in test sections 1 to 6 to nucleic acid chromatography using the lateral flow type nucleic acid detection device 700. Only 6 with three kinds of amplification products linked showed line coloring.
  • FIG. 1 The result of nucleic acid chromatography using the lateral flow type nucleic acid detection device 700 is shown in FIG.
  • This method using the primer set and nucleic acid chromatography of Embodiment 1 of the present invention showed line coloration only when Salmonella Typhimurium was used as a template, indicating that it had sufficient specificity.
  • Nucleic acid chromatography can be detected simply by adding a PCR reaction solution and a development buffer onto the chip and is easy to operate. In addition, it does not require preparation of gels or treatment of dangerous reagents such as ethidium bromide. There are advantages. Also. The detection time can be shortened to about 5 minutes compared to about 60 minutes for gel electrophoresis.
  • a comparative example As a comparative example, the same operation as in 4 above was performed except that the primers of SEQ ID NOs: 1 to 6 were used.
  • PCR was performed using the primer set according to Embodiment 2 using a nucleic acid sample containing two target DNAs as a template, and amplification products contained in the PCR reaction solution were confirmed by nucleic acid chromatography and gel electrophoresis.
  • the region of 208 bases included in the DNA of the pathogenic microorganism was used as the first target region, and the region of 131 bases was used as the second target region.
  • One DNA strand of each target region was used as a target nucleic acid.
  • the same base sequence 201 as the 24 base region at the 5 ′ end of the first target nucleic acid, and the 5 ′ end side of the base sequence 201 via the divalent group represented by the above formula I A DNA comprising a tag sequence for labeling (SEQ ID NO: 10) to which the 3 ′ end was bound was used.
  • the tag sequence for labeling (SEQ ID NO: 10) is a complementary sequence of the tag sequence on the labeling substance side (SEQ ID NO: 12) fixed to the colloidal gold that is the labeling substance.
  • the same base sequence 211 as the 5'-end region of the 5 'end of the complementary strand of the first target nucleic acid, and the base having the 3' end bound to the 5 'end of the base sequence 211 DNA containing several 20 nucleotide sequences B 1 212 was used.
  • the second forward primer 220 has the same base sequence 221 as the 20 base region at the 5 ′ end of the second target nucleic acid, and 20 bases having the 3 ′ end bound to the 5 ′ end side of the base sequence 221.
  • DNA containing the base sequence D 2 222 was used.
  • the base sequence B 1 212 and the base sequence D 2 222 are complementary to each other.
  • a tag sequence for immobilization SEQ ID NO: 9 to which the 3 ′ end was bound via a nucleoside.
  • the tag sequence for immobilization is a complementary sequence to the solid-phase tag sequence (SEQ ID NO: 11) immobilized on a membrane that is a solid phase carrier.
  • a test group using DNA containing the first target region but not the second target region (template 1), and a test group using DNA containing the second target region but not the first target region (template 1) Template 2), a test group (template 1 + 2) using DNA containing the first target region and the second target region, and a test group (N) containing no template DNA were prepared.
  • PCR reaction solution shown in Table 2 above the above-described end primer A200, first reverse primer 210, second forward primer 220, and end primer B230 are used as primer components, and a template corresponding to each of the above test sections is used as a template DNA.
  • PCR reaction solutions similar to those in Table 2 were prepared except that DNA was used and sterile distilled water was used so that the final volume was 20.0 ⁇ L.
  • PCR reaction solution in which the molar ratio of terminal primer A200: first reverse primer 210: second forward primer 220: terminal primer B230 was 1: 1: 1: 1, and 1: 0.1: 0.
  • a 1: 1 PCR reaction solution was prepared.
  • the primer setting method and kit of the present invention are useful for detecting nucleic acids.

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Abstract

本発明は、２以上の標的核酸を検出するための改善された手段を提供する。　本発明のプライマーセットは、第１標的核酸配列の相補配列の３'末端部にハイブリダイズする塩基配列を３'末端部に含むポリヌクレオチドを含む末端プライマーＡと；５'末端側で連結された２つのポリヌクレオチドを含み、前記２つのポリヌクレオチドの一方が、第ｋ標的核酸の塩基配列の３'末端部にハイブリダイズする塩基配列を３'末端部に含み、前記２つのポリヌクレオチドの他方が、第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３'末端部にハイブリダイズする塩基配列を３'末端部に含む第ｋ双頭プライマーと；第Ｎ標的核酸の塩基配列の３'末端部にハイブリダイズする塩基配列を３'末端部に含むポリヌクレオチドを含む末端プライマーＢとを備える。

Description

２以上の標的核酸を検出するためのプライマーセット、キット及び方法
　本発明は、２以上の標的核酸を、連結された１つの増幅産物として増幅するためのプライマーセットに関する。
　本発明はまた、２以上の標的核酸を検出する方法に関する。
　本発明はまた、２以上の標的核酸を検出するためのキットに関する。
　分子生物学の研究分野、遺伝子検査等の臨床応用分野、食品や環境衛生を検査する分野において、標的核酸を特異的に増幅する方法は非常に重要な技術となっている。核酸増幅法により得られた増幅産物を特異的に検出する方法の一つとして、標的核酸を含む増幅産物を固相に固定して検出する方法がある。この方法では、標的核酸を特異的に固相に捕捉することで、洗浄等により非特異的な核酸配列を容易に除去し、検出特異性を上げることが可能である。
　この際、標的核酸を固相に捕捉する方法としては、標的核酸を含む増幅産物の一端に一本鎖化されたタグ領域を導入し、タグ領域と相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブを固相上に固定化し、タグ領域とプローブとのハイブリダイゼーションを介して、標的核酸を固相に間接的に固定化する方法がある。
　固相に固定された標的核酸を検出する方法として、特許文献１には、標的核酸に更に標識物質を結合させ目視検出する技術が開示されている。
特開２０１６－７３３１２号公報
　標的核酸を特異的に増幅し検査する技術分野では、検査対象によっては、単一の標的核酸の増幅を確認するだけではなく、複数の標的核酸の増幅のパターンの確認が必要な場合がある。
　複数の標的核酸の増幅産物を固相に固定し標識物質を指標に解析する場合の一例を図２に示す。例えば標的核酸Ａ、Ｂ、Ｃを全て含む核酸試料を鋳型とする所謂マルチプレックスＰＣＲによる増幅産物を固相担体上に展開し標識すると、図２Ａに示すように、固相担体上の３箇所に標識される。これに対して核酸試料が標的核酸Ｂを含まない場合（図２Ｂ１）、標的核酸Ａを含まない場合（図２Ｂ２）、標的核酸Ｂ及びＣを含まない場合（図２Ｂ３）はそれぞれ異なる標識結果となる。しかしながら、このように標識される領域の位置や数を指標にする解析方法は、対象となる標的核酸が多数の場合や、複数の標的核酸の個々の増幅産物が固相担体上で分離され難い場合などに判別性が低い場合がある。
　また、複数の標的核酸の増幅産物をゲル電気泳動により展開し、バンドの数や移動度に基づき複数の標的核酸を検出する場合にも、同様に判別性が低い場合がある。
　そこで本発明は、２以上の標的核酸を検出するための改善された手段を提供する。
　本発明は、上記課題を解決する手段として以下の発明を開示する。
（１）固相担体上での検出が可能な核酸増幅産物を調製するためのプライマーセットであって、
　第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
　５’末端側で連結された２つのポリヌクレオチドを含み、前記２つのポリヌクレオチドの一方が、第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含み、前記２つのポリヌクレオチドの他方が、第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含む、第ｋ双頭プライマーと、
　第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと、
を含み、
　Ｎは２以上の整数であり、
　ｋは１からＮ－１までの整数であり、
　前記第ｋ双頭プライマーとして、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
　前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、
プライマーセット。
（２）固相担体上での検出が可能な核酸増幅産物を調製するためのプライマーセットであって、
　第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
　第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ａｋを３’末端部に含み、前記塩基配列Ａｋの５’末端側に塩基配列Ｂｋを更に含むポリヌクレオチドを含む、第ｋリバースプライマーと、
　第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｃｋ＋１を３’末端部に含み、前記塩基配列Ｃｋ＋１の５’末端側に、前記塩基配列Ｂｋとハイブリダイズする塩基配列Ｄｋ＋１を更に含むポリヌクレオチドを含む、第（ｋ＋１）フォワードプライマーと、
　第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと
を含み、
　Ｎは２以上の整数であり、
　ｋは１からＮ－１までの整数であり、
　前記第ｋリバースプライマー及び前記第（ｋ＋１）フォワードプライマーとして、それぞれ、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
　前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、
プライマーセット。
（３）固相担体上での検出が可能な核酸増幅産物を調製するためのプライマーセットであって、
　第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
　第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｅｋを３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｅｋを含む前記ポリヌクレオチドの５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない塩基配列Ｆｋを含むポリヌクレオチドとを含む、第ｋリバースプライマーと、
　第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｇｋ＋１を３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｇｋ＋１を含む前記ポリヌクレオチドの５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない、前記塩基配列Ｆｋとハイブリダイズする塩基配列Ｈｋ＋１を含むポリヌクレオチドとを含む、第（ｋ＋１）フォワードプライマーと、
　第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと
を含み、
　Ｎは２以上の整数であり、
　ｋは１からＮ－１までの整数であり、
　前記第ｋリバースプライマー及び前記第（ｋ＋１）フォワードプライマーとして、それぞれ、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
　前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、
プライマーセット。
（４）固相担体上での検出が可能な核酸増幅産物を調製するためのプライマーセットであって、
　第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
　第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｉｋを３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｉｋを含む前記ポリヌクレオチドの５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない塩基配列Ｊｋを含むポリヌクレオチドとを含む、第ｋリバースプライマーと、
　第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｌｋ＋１を３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｌｋ＋１の５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない塩基配列Ｍｋ＋１を更に含むポリヌクレオチドとを含む、第（ｋ＋１）フォワードプライマーと、
　前記塩基配列Ｊｋとハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｍｋ＋１とハイブリダイズする塩基配列とを含むポリヌクレオチドとを含む、第ｋ連結用ポリヌクレオチドと、
　第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと
を含み、
　Ｎは２以上の整数であり、
　ｋは１からＮ－１までの整数であり、
　前記第ｋリバースプライマー、前記第（ｋ＋１）フォワードプライマー及び前記第ｋ連結用ポリヌクレオチドとして、それぞれ、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
　前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、
プライマーセット。
（５）前記結合部が、前記固相担体と結合可能なポリヌクレオチドを含むタグである、（１）～（４）のいずれかに記載のプライマーセット。
（６）２以上の標的核酸を検出する方法であって、
　連結された、２以上の標的核酸と、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部と、固相担体と結合可能なタグである結合部とを含む検出用核酸、を含む可能性のある検出用試料を、前記結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体に接触させ、前記標識部を指標として前記固相担体の前記部分での前記検出用核酸を検出する検出工程
を含む方法。
（７）分析対象試料から取得された核酸を鋳型とし、（１）～（５）のいずれかに記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うことを含む検出用試料調製工程を更に含み、
　前記検出工程において、前記検出用試料調製工程で得られた核酸増幅反応の生成物を前記検出用試料として用いる、
（６）に記載の方法。
（８）前記検出用試料調製工程が、含まれる２以上の標的核酸の組み合わせが異なり、且つ、前記固相担体の異なる位置に結合可能な前記結合部を備えた２以上の前記検出用核酸を調製できるよう設計された２セット以上の、（１）～（５）のいずれかに記載のプライマーセットを用い、分析対象試料から取得された核酸を鋳型として核酸増幅反応を行うことを含み、
　前記検出工程が、前記検出用試料調製工程で得られた前記検出用試料を前記固相担体に接触させ、前記標識部を指標として前記固相担体において前記２以上の検出用核酸の各々を検出することを含む
（７）に記載の方法。
（９）分析対象試料中での２以上の標的核酸を検出するためのキットであって、
　（１）～（５）のいずれかに記載のプライマーセットと、
　前記結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体と
を含むキット。
（１０）前記固相担体を、前記固相担体と、核酸増幅反応の生成物を受容するための反応系受容部とを備える、核酸検出デバイスとして含む、（９）に記載のキット。
（１１）前記標識部が、標識物質と結合可能なタグであり、
　前記標識部の前記タグと結合可能な標識物質を更に含む、（９）又は（１０）に記載のキット。
（１２）前記標識物質及び前記固相担体を、前記固相担体と、前記標識物質を保持する標識物質保持部と、核酸増幅反応の生成物を受容するための反応系受容部とを備える核酸検出デバイスとして含む、（１１）に記載のキット。
（１３）核酸増幅産物を調製するためのプライマーセットであって、
　第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
　５’末端側で連結された２つのポリヌクレオチドを含み、前記２つのポリヌクレオチドの一方が、第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含み、前記２つのポリヌクレオチドの他方が、第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含む、第ｋ双頭プライマーと、
　第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと、
を含み、
　Ｎは２以上の整数であり、
　ｋは１からＮ－１までの整数であり、
　前記第ｋ双頭プライマーとして、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含む、
プライマーセット。
（１４）２以上の標的核酸を検出する方法であって、
　分析対象試料から取得された核酸を鋳型とし、（１３）に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行う核酸増幅工程と、
　前記核酸増幅工程での核酸増幅反応の生成物中の前記核酸増幅産物を検出する検出工程と
を含む方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１６－１３２０６６号の開示内容を包含する。
　本発明のプライマーセットを用いることにより、２以上の標的核酸が直列に連結した増幅産物を得ることができる。このような増幅産物の検出は、２以上の標的核酸を個別に検出することと比較して容易である。
本発明の方法により３つの標的核酸が直列に連結した増幅産物を標識し、固相担体上に結合させて検出する場合、固相担体上に標識が検出されれば陽性と判断でき（Ａ）、固相担体上に標識が検出されなければ陰性と判断できる（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３）。このため判別性が高い。 ３つの標的核酸を個別に増幅した増幅産物を標識し、固相担体上に結合させて検出する場合、固相担体上の３箇所に標識が検出されれば陽性と判断し（Ａ）、固相担体上に標識が検出されない、或いは、１又は２か所に標識が検出されれば陰性と判断する（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３）。標識の数や位置によっては判別が容易でない場合がある。 本発明の実施形態１のプライマーセットの働きを説明するための図である（Ｎ＝３）。 本発明の実施形態２のプライマーセットの働きを説明するための図である（Ｎ＝２）。 本発明の実施形態３のプライマーセットの働きを説明するための図である（Ｎ＝２）。 本発明の実施形態４のプライマーセットの働きを説明するための図である（Ｎ＝２）。 図７はラテラルフロー型核酸検出デバイス７００の模式図を示す。７１：固相担体、７２：コンジュゲートパッド（標識物質保持部）、７３：サンプルパッド（反応系受容部）、７４：吸収パッド、７５：基材、７６：固相担体７１の、タグ捕捉手段を含む部分。 実施例１の増幅産物のゲル電気泳動の結果を示す。 実施例１の増幅産物の核酸クロマトグラフィーの結果を示す。 実施例１の増幅産物の核酸クロマトグラフィーの結果を示す。 ３つの標的核酸を個別に増幅する従来法による増幅産物のゲル電気泳動の結果を示す。 上段は、実施例２の増幅産物の核酸クロマトグラフィーの結果を示す。下段は、実施例２の増幅産物のゲル電気泳動の結果を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明において核酸及びポリヌクレオチドという用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを指し、典型的にはＤＮＡである。また核酸及びポリヌクレオチドという用語は、塩基数は特に限定するものではなくオリゴヌクレオチドも包含する。本発明において、核酸増幅反応の鋳型となる標的核酸又は標的核酸の相補鎖とハイブリダイズして伸長するオリゴヌクレオチドは、特に限定しない限り、核酸増幅反応において二本鎖化され得るオリゴヌクレオチドを指し、典型的には、天然のヌクレオチドの重合体である。天然のヌクレオチドとは、天然のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシルの塩基、および、デオキシリボース、リボースの糖部、および、リン酸基から構成されるヌクレオチドのことであり、各部分が人工的な修飾を受けていないヌクレオチドのことである。天然のヌクレオチドは通常はＤ型ヌクレオチドである。Ｄ型ヌクレオチドとは、糖部分がＤ型のデオキシリボースもしくはリボースからなるヌクレオチドを示す。
　本発明において「標的核酸」とは、検出及び／又は増幅しようとする塩基配列を有する核酸そのものだけでなく、これに相補的な塩基配列を有する核酸も包含する。このため本発明において「標的核酸を検出する」又は「標的核酸を増幅する」とは、標的核酸自体を目的として行う検出又は増幅だけでなく、標的核酸の検出又は増幅を通じて、標的核酸の相補鎖や、標的核酸の二本鎖核酸を検出又は増幅することも包含する。
　本発明において「標的核酸の塩基配列」又は「標的配列」とは、検出及び／又は増幅しようとする塩基配列だけでなく、これに相補的な塩基配列も包含する。
　標的核酸が二本鎖の形態である場合、「標的核酸の塩基配列」又は「標的配列」とは、どちらか一方の鎖に含まれる塩基配列を指す。また、二本鎖の標的核酸の一方の鎖を指して「標的核酸」と言う場合がある。
　本発明における標的核酸の全長は特に限定されず、通常は２０塩基以上、４０塩基以上、又は１００塩基以上の長さである。標的核酸の全長の上限は特に限定されないが通常は１０００塩基以下、５００塩基以下又は４００塩基以下の長さである。
　本発明において核酸増幅反応の鋳型となる核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。また、二本鎖核酸であってもよく、一本鎖核酸であってもよい。二本鎖核酸である場合には、変性処理により一本鎖化することができる。
　鋳型となる核酸は、天然のものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。例えば、生体試料から抽出された天然の核酸であってもよく、ＰＣＲ等により増幅されたものや、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡ等であってもよい。
　本発明において、塩基配列Ｘが塩基配列Ｙに「ハイブリダイズする」とは、塩基配列Ｘを含むポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）が、ストリンジェント条件で、塩基配列Ｙを含むポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）にハイブリダイズし、塩基配列Ｙを含まないポリヌクレオチドにはハイブリダイズしないことを意味する。すなわちハイブリダイズするとは、特異的にハイブリダイズすることを指す。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェントな条件を設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーション工程では、ナトリウム濃度が２５～５００ｍＭ、好ましくは２５～３００ｍＭであり、温度が４０～６８℃、好ましくは４０～６５℃である。より具体的には、ハイブリダイゼーションは、１～７×ＳＳＣ、０．０２～３％ＳＤＳ、温度４０℃～６０℃で行うことができる。また、ハイブリダイゼーションの後に洗浄工程を行っても良く、洗浄工程は、例えば０．１～２×ＳＳＣ、０．１～０．３％ＳＤＳ、温度５０～６５℃で行うことができる。ただし、後述する標識用タグと、ポリヌクレオチドが付加された標識物質とのハイブリダイゼーション、及び、後述する固定化用タグと、ポリヌクレオチドが付加された固相担体とのハイブリダイゼーションは、ここで挙げたストリンジェントな条件で行う必要はなく、後述する条件で行うことができる。
　塩基配列Ｘが塩基配列Ｙにハイブリダイズする場合、塩基配列Ｘを含むポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）と塩基配列Ｙを含むポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）とが、核酸増幅反応のアニーリング条件においてハイブリダイズして安定な二本鎖を形成するのに十分な水素結合を形成することができる組み合わせであればよく、相互に完全な相補塩基配列である必要はない。例えば、塩基配列Ｘを含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｙを含むポリヌクレオチドとが、１０ヌクレオチド中に１ミスマッチ、２０ヌクレオチド中に１ミスマッチ、または３０ヌクレオチド中に１ミスマッチなど、いくつかのミスマッチが存在していてもよい。
　塩基配列Ｘが塩基配列Ｙにハイブリダイズする場合、通常は以下の（Ａ）～（Ｃ）の１以上の関係を満たす。
　（Ａ）塩基配列Ｘの相補配列と塩基配列Ｙとが同一である。なお、塩基配列Ｘの相補配列と塩基配列Ｙの一方がＤＮＡの塩基配列であり、他方がＲＮＡの塩基配列である場合、一方におけるチミンと他方におけるウラシルとは同一の塩基であるとみなす。
　（Ｂ）塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘの相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された塩基配列である。
　（Ｃ）塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘの相補配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列である。
　前記（Ｂ）において「１若しくは数個」とは好ましくは１～５個、より好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、特に好ましくは１個又は２個を指し、最も好ましくは１個である。
　前記（Ｃ）において、同一性の値は、複数の塩基配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。塩基配列の同一性の値は、一致度が最大となるように一対の塩基配列をアライメントした際に一致する塩基の数を算出し、当該一致する塩基の数の、比較した塩基配列の全塩基数に対する割合として算出される。ここで、ギャップがある場合、上記の全塩基数は、１つのギャップを１つの塩基として数えた塩基数である。同一性の決定方法の詳細については、例えばAltschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977及びAltschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990を参照されたい。
　前記（Ｃ）において、同一性はより好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性である。
　本発明においてプライマーセットを構成するポリヌクレオチド、並びに、ポリヌクレオチドを含むプライマー類及び連結用ポリヌクレオチドの製造方法は特に限定されず、ポリヌクレオチド合成装置を利用して製造してもよいし、受託合成サービスを利用して製造してもよい。
　本発明においてある塩基配列又はポリヌクレオチドの「３’末端部」とは、該塩基配列又はポリヌクレオチドの３’末端の塩基を含む、連続した複数の塩基からなる部分塩基配列又は該部分塩基配列を含むポリヌクレオチドの領域を指す。
＜１．本発明のプライマーセット＞
　本発明のプライマーセットは、分析対象試料が、所定の２以上の標的核酸を含んでいる場合に、分析対象試料から取得した核酸を鋳型とする核酸増幅反応により、前記所定の２以上の標的核酸と、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部と、固相担体と結合可能なタグである結合部とを、連結された形態で含む検出用核酸を生成することができるプライマーセットである。
　このような機能を実現するためのプライマーセットとして、本明細書では、４つの実施形態を開示する。
　以下の説明では、２以上の標的核酸を、第１標的核酸から第Ｎ標的核酸までのＮ個の標的核酸とする。ここでＮは２以上の整数である。Ｎの上限は特に限定されず、３、４、５、６、７、８、９、１０又はより大きい数であることができる。
　各プライマーセットを構成する各成分に含まれるポリヌクレオチドの塩基配列は、他の成分に含まれるポリヌクレオチドによる目的とする核酸増幅反応を阻害しないように設計することができる。
（１．１．プライマーセットの実施形態１）
　本発明のプライマーセットの実施形態１は、
　第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
　５’末端側で連結された２つのポリヌクレオチドを含み、前記２つのポリヌクレオチドの一方が、第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含み、前記２つのポリヌクレオチドの他方が、第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含む、第ｋ双頭プライマーと、
　第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと、
を含み、
　Ｎは２以上の整数であり、
　ｋは１からＮ－１までの整数であり、
　前記第ｋ双頭プライマーとして、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
　前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、プライマーセットに関する。
　末端プライマーＡにおいて、「第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列」は、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。末端プライマーＡに含まれるポリヌクレオチド（末端プライマーＡが、後述する標識部又は結合部としてポリヌクレオチドを含む場合には、標識部又は結合部以外のポリヌクレオチド）は、第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列をその３’末端部に含んでいればよく、その５’末端側には更に他の塩基配列が付加されたものであってもよい。末端プライマーＡに含まれるポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。
　第ｋ双頭プライマーにおいて「５’末端側で連結された２つのポリヌクレオチド」とは、２つのポリヌクレオチドの各ポリヌクレオチドの３’末端が解放された形態であり、それぞれの５’末端側で連結されていることを指す。２つのポリヌクレオチドがそれぞれの５’末端同士で連結されている場合、５’末端同士を連結する構造は特に限定されず、適当な二価基により構成することができる。最も簡単な構造としては、２つのポリヌクレオチドのそれぞれの５’末端ヌクレオチドの糖の５’位同士がリン酸基を介して結合している５’－５’結合が挙げられるが、これには限定されない。二価基は長鎖の構造であってもよい。
　第ｋ双頭プライマーにおいて２つのポリヌクレオチドの５’末端同士を連結する他の構造としては、以下の脂肪鎖のスペーサーが例示できる。
　脂肪鎖のスペーサーとしては、例えば、以下の式（ＩＩ）で表されるスペーサーが挙げられる。
５’－Ｏ－ＣｍＨ２ｍ－Ｏ－５’　式（ＩＩ）
（式中、５’は、各ポリヌクレオチドの５’末端のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、ｍは１以上４０以下の整数を表す。Ｈは、置換基により置換されていてもよい。）
　式（ＩＩ）においてｍは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（ＩＩ）中のＨは、置換基により置換されていてもよく、置換基としては、典型的には、アルキル基、アルコキシ基、水酸基等が挙げられる。置換基としてのアルキル基及びアルコキシ基の炭素数は１～８であることが好ましく、より好ましくは１～４である。また、２以上の置換基を有する場合には、置換基は同一であっても異なっていてもよい。さらに、置換基を有していないことも好ましい。
　また、他のスペーサーとしては、以下の式（ＩＩＩ）で表されるスペーサーが挙げられる。
５’－（ＯＣｎＨ２ｎ）Ｌ－Ｏ－５’　式（ＩＩＩ）
（式中、５’は、各ポリヌクレオチドの５’ 末端のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、ｎは２以上４以下の整数を表し、Ｌは、１以上の整数であって、（ｎ＋１）×Ｌが４０以下となる整数を表す。Ｈは、置換基により置換されていてもよい。）
　式（ＩＩＩ）において（ｎ＋１）×Ｌは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（ＩＩＩ）中のＨの置換基は、式（ＩＩ）中の置換基と同様の態様が適用される。
　他の脂肪鎖のスペーサーとしては、例えば、以下の二価基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　これらの二価基を介して２つのポリヌクレオチド分子を５’末端同士で接続する場合、各二価基の一方の端のリン酸基は、一方のポリヌクレオチド分子の５’末端のヌクレオチドのリン酸基を指し、他方の端の酸素原子は、他方のポリヌクレオチド分子の５’末端のヌクレオチドのリン酸基とリン酸エステル結合を形成する。
　第ｋ双頭プライマーに含まれる２つのポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば、それぞれが、８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。
　第ｋ双頭プライマーに含まれる２つのポリヌクレオチドの一方が、第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端に含む。ここで「第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列」は、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。「第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列」を３’末端に含むポヌクレオチドは、当該塩基配列をその３’末端部に含んでいればよく、その５’末端側には更に他の塩基配列が付加されたものであってもよい。
　第ｋ双頭プライマーに含まれる２つのポリヌクレオチドの他方が、第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端に含む。ここで「第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列」は、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。「第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列」を３’末端に含むポヌクレオチドは、当該塩基配列をその３’末端部に含んでいればよく、その５’末端側には更に他の塩基配列が付加されたものであってもよい。
　末端プライマーＢにおいて、「第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列」は、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。末端プライマーＢに含まれるポリヌクレオチド（末端プライマーＡが、後述する標識部又は結合部としてポリヌクレオチドを含む場合には、標識部又は結合部以外のポリヌクレオチド）は、第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列をその３’末端部に含んでいればよく、その５’末端側には更に他の塩基配列が付加されたものであってもよい。末端プライマーＢに含まれるポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。
　上記のポリヌクレオチドに加えて、末端プライマーＡ及び末端プライマーＢの一方は、前記標識部を更に含み、他方は、前記結合部を更に含む。
　末端プライマーＡ及び末端プライマーＢは、それぞれ、前記標識部及び前記結合部の一方を有し、前記標識部及び前記結合部の一方は、前記ポリヌクレオチドと、必要に応じて後述する適当なスペーサーを介して化学的に連結されている。末端プライマーＡ及び末端プライマーＢにおいて、前記標識部及び前記結合部の一方が前記ポリヌクレオチドに連結される位置は、前記ポリヌクレオチドと標的核酸との又は標的核酸に相補的な核酸とのアニーリング及びポリメラーゼ反応による伸長を阻害しない位置であれば特に限定されないが、好ましくは、前記ポリヌクレオチドの５’末端である。
　以下、本発明で用いる標識部と結合部について詳述する。
　標識部は、標識物質と結合可能なタグ又は標識物質のいずれかであり、好ましくは標識物質と結合可能なタグである。本明細書では、標識物質と結合可能なタグを標識用タグと呼ぶ場合がある。標識部が標識用タグである場合、核酸増幅反応の増幅産物と標識物質とを接触させることにより増幅産物の一端に含まれるタグを標識することができる。標識部が標識物質である場合、核酸増幅反応の増幅産物として標識物質を一端に含む増幅産物を得ることができる。
　標識物質は増幅産物の検出を可能とするものであればよく特に限定はされないが、好ましくは増幅産物の目視検出を可能とするものである。このような標識物質としては、着色粒子、色素、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ等）等が挙げられるが、好ましくは着色粒子である。「着色粒子」とは、金属（例えば、金、銀、銅、白金等）粒子、金属ロッド、着色されたラテックス粒子、色素を包含するシリカナノ粒子等が挙げられるが、これらに限定はされない。標識物質の大きさは増幅産物を後述する固相担体に捕捉するのを妨げるものでなければよい。標識物質は検出の際に発色の良いものであることが好ましく、後述する固相担体や核酸検出デバイスの各種多孔質部材の孔径よりも小さなサイズとなるように、適宜選択することができる。例えば、標識物質の大きさはおよそ５００ｎｍ以下、好ましくはおよそ０．１ｎｍ～２５０ｎｍ、より好ましくはおよそ１ｎｍ～１００ｎｍの粒径とすることができる。色素として、蛍光色素（フルオロセイン、シアニン等）等も使用可能であるが、その場合は各蛍光色素の励起波長光を照射し、検出することが好ましい。
　標識部として利用可能な標識用タグは、標識物質と結合可能であり、且つ、核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されないものであればよく、標識物質の構造に応じて適宜選択すればよく特に限定されないが、例えばポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、タンパク質、ペプチド、もしくは他の化合物（例えば、ビオチン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）等の低分子化合物）、またはそれらの組合せからなるものを利用することができる。
　標識用タグの一つの好ましい形態としては、ポリヌクレオチドを含むか、ポリヌクレオチドからなるものである。標識用タグに含まれ得る該ポリヌクレオチドは、本発明のプライマーセットによる核酸増幅反応の実質的な支障とならないものであれば特に限定されないが、塩基数が例えば５～５０、好ましくは１０～３５であるポリヌクレオチドであり、例えば、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６４（２００７）７８－８５に記載されている塩基配列を含むポリヌクレオチドが好ましいものとして例示できる。標識用タグのもう一つの好ましい形態としては、ビオチン、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ等の低分子化合物からなるものである。
　標識部が上記の標識用タグである場合、標識物質と標識用タグとの結合は、直接的結合であっても、間接的結合であってもよく、結合手段は利用する標識物質と標識用タグとの組合せに応じて適宜好適なものを選択することができる。例えば、標識用タグがポリヌクレオチドを含む場合、標識物質を当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド（例えば、当該ポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な配列を含むポリヌクレオチド）に結合させ、両者のポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせることによって、標識物質と標識用タグとを間接的に結合することができる。標識物質とポリヌクレオチドとの結合はペプチド、タンパク質、核酸などを介して行ってもよいし、適当な官能基を介して行ってもよい。ハイブリダイゼーションの条件は、ハイブリダイゼーションが生じる条件であればよく特に限定はされないが、例えば２０℃～４０℃にて、１０ｍＭ～５０ｍＭのリン酸を含む緩衝液（ｐＨ６～７）中で反応させることにより行うことができる。ハイブリダイゼーション効率を高めるべく、緩衝液にはさらに塩化ナトリウム等の塩を含めることができる。
　また、標識用タグが低分子化合物の場合、それと特異的に結合するタンパク質（例えばビオチンに結合するアビジン、ＦＩＴＣに結合するタンパク質）、抗体（例えば抗ＤＩＧ抗体）、アプタマー等の結合性物質と連結した標識物質により標識することができる。この場合、標識用タグと結合性物質とは、各種中性付近の緩衝液を用いて結合させることができる。
　標識部（標識用タグ又は標識物質）と、末端プライマーＡ又はＢに含まれるポリヌクレオチドとは任意の手段により結合することができ、直接的に、又は間接的に結合することができる。ただし、標識部のうち少なくとも前記ポリヌクレオチドと接続する部分がポリヌクレオチドよりなる場合、当該部分は、核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されない構造とする。
　核酸増幅反応により二本鎖化されない、標識部に含まれるポリヌクレオチドとして、ＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型となり得るポリヌクレオチド（通常は、天然のヌクレオチドからなるもの）を用いる場合、標識部に含まれるポリヌクレオチドと、末端プライマーＡ又はＢにおいてプライマーとして機能するポリヌクレオチドとは、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーを介して、前記ポリヌクレオチドと標識部とが結合される。このような「スペーサー」としては、ＤＮＡポリメラーゼ等の核酸増幅反応におけるポリメラーゼ反応の進行を抑制または停止することができ、標識部の二本鎖化を防ぐものであればよく、例えば、強固なヘアピン構造やシュードノット構造を有する核酸配列、Ｌ型核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋化核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（ＢＮＡ）もしくはＬｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（ＬＮＡ））、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、下記式Ｉで表されるアゾベンゼン構造を含む二価基、脂肪鎖（アルキレン鎖又はポリオキシアルキレン鎖）、５’－５’結合、３’－３’結合のような逆位配列構造を含む二価基等が挙げられるがこれらに限定はされない。上記のスペーサーにより連結されている場合、標識部に含まれるポリヌクレオチドと、末端プライマーＡ又はＢにおいてプライマーとして機能するポリヌクレオチドとは、同一方向に連結することができる。すなわち、標識部に含まれるポリヌクレオチド３’末端側と、末端プライマーＡ又はＢにおいてプライマーとして機能するポリヌクレオチドの５’末端側とを上記スペーサーを介して連結できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　式Ｉで表される二価基を介して２つのポリヌクレオチド分子を接続する場合、該二価基の一方の３’端のリン酸基は、一方のポリヌクレオチド分子の５’末端のヌクレオチドのリン酸基を指し、他方の５’端の酸素原子は、他方のポリヌクレオチド分子の３’末端のヌクレオチドのリン酸基とリン酸エステル結合を形成する。
　脂肪鎖のスペーサーとしては、例えば、以下の式（ＩＶ）で表されるスペーサーが挙げられる。
５’－Ｏ－ＣｍＨ２ｍ－Ｏ－３’　式（ＩＶ）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、ｍは１以上４０以下の整数を表す。Ｈは、置換基により置換されていてもよい。）
　式（ＩＶ）においてｍは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（ＩＶ）中のＨは、置換基により置換されていてもよく、置換基としては、典型的には、アルキル基、アルコキシ基、水酸基等が挙げられる。置換基としてのアルキル基及びアルコキシ基の炭素数は１～８であることが好ましく、より好ましくは１～４である。また、２以上の置換基を有する場合には、置換基は同一であっても異なっていてもよい。さらに、置換基を有していないことも好ましい。
　また、他のスペーサーとしては、以下の式（Ｖ）で表されるスペーサーが挙げられる。
５’－（ＯＣｎＨ２ｎ）Ｌ－Ｏ－３’　式（Ｖ）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、ｎは２以上４以下の整数を表し、Ｌは、１以上の整数であって、（ｎ＋１）×Ｌが４０以下となる整数を表す。Ｈは、置換基により置換されていてもよい。）
　式（Ｖ）において（ｎ＋１）×Ｌは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（Ｖ）中のＨの置換基は、式（ＩＶ）中の置換基と同様の態様が適用される。
　また、２つのポリヌクレオチド分子が５’－５’結合される場合は上記の式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される脂肪鎖のスペーサーを用いることができる。
　他の脂肪鎖のスペーサーとしては、例えば、以下の二価基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　これらの二価基を介して２つのポリヌクレオチド分子を接続する場合、各二価基の一方の端のリン酸基は、一方のポリヌクレオチド分子の３’末端又は５’末端のヌクレオチドのリン酸基を指し、他方の端の酸素原子は、他方のポリヌクレオチド分子の５’末端又は３’末端のヌクレオチドのリン酸基とリン酸エステル結合を形成する。
　一方、標識部に含まれるポリヌクレオチドとして、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、Ｌ型核酸、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオチドなどの修飾核酸を含むポリヌクレオチドのように、ＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型にならず核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されないポリヌクレオチドを用いる場合には、上記の、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーは省略することも可能である。
　次に、本発明で用いる結合部について説明する。
　結合部は、後述する固相担体と結合可能なタグである。本明細書では、固相担体と結合可能なタグを固定化用タグと呼ぶ場合がある。
　結合部として利用可能な固定化用タグは、固相担体と結合可能なものであればよく、固相担体の構造に応じて適宜選択すればよく特に限定されないが、例えばポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、タンパク質、ペプチド、もしくは他の化合物（例えば上記のような低分子化合物）、またはそれらの組合せからなるものを利用することができる。固定化用タグは、好ましくは、ポリヌクレオチドを含むか、ポリヌクレオチドからなるものである。固定化用タグに含まれ得る該ポリヌクレオチドは、本発明のプライマーセットによる核酸増幅反応の実質的な支障とならないものであれば特に限定されないが、塩基数が例えば５～５０、好ましくは１０～３５であるポリヌクレオチドであり、例えば、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６４（２００７）７８－８５に記載されている塩基配列を含むポリヌクレオチドが好ましいものとして例示できる。
　固定化用タグとしてポリヌクレオチドを用いる場合、固相担体の側に配置される、該ポリヌクレオチドとハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドとの組み合わせを、塩基配列を改変することにより容易に変更することができ、結合特異性を制御することが容易であるため好ましい。例えば、１つの固相担体上で複数の核酸増幅産物を結合させそれぞれを識別する場合、核酸増幅産物毎に、固定化用タグと、固相担体側のポリヌクレオチドとの異なる組み合わせが必要である。ポリヌクレオチドの塩基配列は変更が容易であり、ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションは高い結合特異性を有するため、固定化用タグとしてポリヌクレオチドを用いることで、核酸増幅産物毎に固定化用タグと、固相担体側のポリヌクレオチドとの異なる組み合わせを設けることが容易である。
　固相担体は特に限定はされないが、樹脂、金属、多糖類、鉱物等からなるものを利用することができ、メンブレン、フィルム、不織布、プレート、ゲル等の形状とすることができる。好ましくは固相担体は、溶液中の増幅産物や標識物質が展開できるように多孔質構造を有するものである。本発明において利用可能な固相担体としては、例えば、ろ紙、ニトロセルロースメンブレン、ポリエーテルスルフォンメンブレン、ナイロンメンブレン、乾燥させた各種ゲル（シリカゲル、アガロースゲル、デキストランゲル、ゼラチンゲル）、シリコン、ガラス、プラスチック等が挙げられる。固相担体の大きさ及び形態は、各種操作や検出に適切なものを適宜選択することができる。
　固相担体は、少なくとも一部の部分が固定化用タグと結合可能なように構成されていればよく、より好ましくは一部の部分のみが固定化用タグと結合可能なように構成されている。固相担体の特定の部分のみを固定化用タグと結合可能なように構成することによって、固相担体に捕捉された増幅産物は前記部分のみに限局して検出されるため、陽性又は陰性の判別を容易にすることができる。
　固相担体と固定化用タグとの結合は、直接的結合であっても、間接的結合であってもよく、結合手段は利用する固相担体と固定化用タグとの組合せに応じて適宜好適なものを選択することができる。例えば、固定化用タグがポリヌクレオチドを含む場合、当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド（例えば、当該ポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な配列を含むポリヌクレオチド）を固相担体に固定化してタグ捕捉手段とし、両者のポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせることによって、固相担体と固定化用タグとを間接的に結合することができる。固相担体へのポリヌクレオチドの固定化はペプチド、タンパク質、核酸などを介して行ってもよいし、適当な官能基を介して行ってもよい。ハイブリダイゼーションの条件は、標識用タグと標識物質との結合に関して上記した条件により行うことができる。ポリヌクレオチドを固相担体に固定化する場合、特定の部分に限局して固定化することによって、捕捉された増幅産物は所定の部分のみに限局して検出されるため、陽性又は陰性の判別を容易にすることができる。
　結合部（固定化用タグ）と、末端プライマーＡ又はＢに含まれるプライマーとして機能するポリヌクレオチドとは任意の手段により結合することができ、直接的に、又は間接的に結合することができる。ただし、固定化用タグのうち少なくとも前記ポリヌクレオチドと接続する部分が、ＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型となり得るポリヌクレオチドよりなる場合、核酸増幅反応での伸長により当該部分が、プライマーとして機能する前記ポリヌクレオチドと共に二本鎖化されないように、ポリメラーゼ反応を阻害する「スペーサー」を介して、前記ポリヌクレオチドと固定化用タグとが結合される。ＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型となり得るポリヌクレオチドを含む結合部と、末端プライマーＡ又はＢに含まれるポリヌクレオチドとの間に設けるスペーサーの具体例は、ポリヌクレオチドを含む標識部とポリヌクレオチドとの間に設けるスペーサーに関して上述したものと同様である。一方、固定化用タグに含まれるポリヌクレオチドとして、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、Ｌ型核酸、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオチドなどの修飾核酸を含むポリヌクレオチドのように、ＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型にならず核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されないポリヌクレオチドを用いる場合には、上記の、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーは省略することも可能である。
　第１標的核酸１１、第２標的核酸２１、第３標的核酸３１の３つを標的核酸とする場合（すなわちＮ＝３）を例に挙げ、実施形態１のプライマーセットの働きを図３を参照して説明する。
　図３に示す例では第１標的核酸１１はその相補鎖である第１標的核酸相補鎖１２とともに二本鎖の形態の第１標的核酸（二本鎖第１標的核酸）１０を形成する。第１標的核酸１１と第１標的核酸相補鎖１２のどちらを増幅及び検出の目的としてもよい。
　同様に、第２標的核酸２１はその相補鎖である第２標的核酸相補鎖２２とともに二本鎖第２標的核酸２０を形成する。
　同様に、第３標的核酸３１はその相補鎖である第３標的核酸相補鎖３２とともに二本鎖第３標的核酸３０を形成する。
　末端プライマーＡ１００は、第１標的配列１１（第１標的核酸１１の塩基配列を指す）の相補配列１２（第１標的核酸相補鎖１２の塩基配列を指す）の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチド１０１を含む。末端プライマーＡ１００は、ポリヌクレオチド１０１に加えて、更に末端プライマーＡ付加部分１０２を備える。末端プライマーＡ付加部分１０２は、前記標識部又は結合部のいずれか一方である。
　図３の例では、Ｎ＝３であるため、第ｋ双頭プライマーとして、第１双頭プライマー１１０と、第２双頭プライマー１２０を含む。
　第１双頭プライマー１１０は、互いの５’末端側で連結された２つのポリヌクレオチドである第１双頭プライマー第１ポリヌクレオチド１１１と、第１双頭プライマー第２ポリヌクレオチド１１２とを含む。第１双頭プライマー第１ポリヌクレオチド１１１は、第１標的核酸１１の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含む。第１双頭プライマー第２ポリヌクレオチド１１２は、第２標的核酸２１の相補鎖２２の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含む。
　第２双頭プライマー１２０は、互いの５’末端側で連結された２つのポリヌクレオチドである第２双頭プライマー第１ポリヌクレオチド１２１と、第２双頭プライマー第２ポリヌクレオチド１２２とを含む。第２双頭プライマー第１ポリヌクレオチド１２１は、第２標的核酸２１の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含む。第２双頭プライマー第２ポリヌクレオチド１２２は、第３標的核酸３１の相補鎖３２の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含む。
　末端プライマーＢ１３０は、第３標的核酸３１の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチド１３１を含む。末端プライマーＢ１３０は、ポリヌクレオチド１３１に加えて、更に末端プライマーＢ付加部分１３２を備える。末端プライマーＢ付加部分１３２は、前記標識部又は結合部のいずれか一方である。
　図３（Ｂ）に示す通り、前記核酸を鋳型として末端プライマーＡ１００、第１双頭プライマー１１０、第２双頭プライマー１２０及び末端プライマーＢ１３０を含む第１実施形態のプライマーの存在下で核酸増幅反応を行うとき、末端プライマーＡ１００のポリヌクレオチド１０１は、変性とアニーニングを経て、第１標的核酸相補鎖１２の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、５’末端に末端プライマーＡ付加部分１０２が連結された第１標的核酸１１の増幅断片３０１が合成される。また、第１双頭プライマー第１ポリヌクレオチド１１１は、変性とアニーニングを経て、第１標的核酸１１の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、第１標的核酸相補鎖１２の増幅断片が合成される。この第１標的核酸相補鎖１２の増幅断片は、その５’末端に、後述する、第１双頭プライマー第２ポリヌクレオチド１１２が伸長して合成される第２標的核酸２１の増幅断片の５’末端が連結されており、一体となって１つの増幅断片３０２を構成する。
　同様に、図３（Ｂ）に示す通り、第１双頭プライマー第２ポリヌクレオチド１１２は、変性とアニーニングを経て、第２標的核酸相補鎖２２の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、第２標的核酸２１の増幅断片が合成され、この増幅断片が上記の増幅断片３０２の一部を構成する。また、第２双頭プライマー第１ポリヌクレオチド１２１は、変性とアニーニングを経て、第２標的核酸２１の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、第２標的核酸相補鎖２２の増幅断片が合成される。この第２標的核酸相補鎖２２の増幅断片は、その５’末端に、後述する、第２双頭プライマー第２ポリヌクレオチド１２２が伸長して合成される第３標的核酸３１の増幅断片の５’末端が連結されており、一体となって１つの増幅断片３０３を構成する。
　同様に、図３（Ｂ）に示す通り、第２双頭プライマー第２ポリヌクレオチド１２２は、変性とアニーニングを経て、第３標的核酸相補鎖３２の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、第３標的核酸３１の増幅断片が合成され、この増幅断片が上記の増幅断片３０３の一部を構成する。また、末端プライマーＢ１３０のポリヌクレオチド１３１は、変性とアニーニングを経て、第３標的核酸３１の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、５’末端に末端プライマーＢ付加部分１３２が連結された第３標的核酸相補鎖３２の増幅断片３０４が合成される。
　更に変性とアニーリングを行うと、増幅産物として、図３（Ｃ）に示すように、第１標的核酸１１を含む二本鎖第１標的核酸１０と、第２標的核酸２１を含む二本鎖第２標的核酸２０と、第３標的核酸３１を含む二本鎖第３標的核酸３０とが直列に連結され、第１標的核酸１１の５’末端側に末端プライマーＡ付加部分１０２が連結され、第３標的核酸相補鎖３２の５’末端側に末端プライマーＢ付加部分１３２が連結された核酸増幅産物１が得られる。核酸増幅産物１は、末端プライマーＡ付加部分１０２と末端プライマーＢ付加部分１３２との一方に含まれる前記結合部を介して固相担体に固定することができ、他方に含まれる前記標識部を指標として検出することが可能である。
　核酸増幅産物１は、第１標的核酸１１（または第１標的核酸相補鎖１２）、第２標的核酸２１（または第２標的核酸相補鎖２２）、第３標的核酸３１（または第３標的核酸相補鎖３２）が３つとも鋳型中に存在する場合にのみ増幅される。鋳型中にこれらのうち１つまたは２つが存在しない場合、存在する標的核酸又はその相補鎖は増幅されるが、前記結合部と前記標識部とを併せ持つ核酸増幅産物は生じず、前記標識部を指標とした検出では陰性であることが明らかであるため、偽陽性判定のリスクが極めて低い。
　上記の説明は、Ｎ＝３の場合には限定されずＮが２以上の全ての場合に妥当する。
　以上の通り、本発明の実施形態１に係るプライマーセットを用いた核酸増幅反応により、
　第１標的核酸の増幅断片と、
　第ｋ標的核酸の相補鎖の部分と第（ｋ＋１）標的核酸の部分とが、互いの５’末端の間で連結された増幅断片と、
　第Ｎ標的核酸の相補鎖の増幅断片とを含み、
　第１標的核酸から第Ｎ標的核酸までのそれぞれがその相補鎖とハイブリダイズして二本鎖を形成し、
　第１標的核酸の増幅断片及び第Ｎ標的核酸の相補鎖の増幅断片の一方では、５’末端に前記標識部が連結されており、
　第１標的核酸の増幅断片及び第Ｎ標的核酸の相補鎖の増幅断片の他方では、５’末端に前記結合部が連結されている、
核酸増幅産物が生成される。ここでＮは２以上の整数であり、ｋは１からＮ－１までの整数である。この核酸増幅産物において、第ｋ標的核酸を含む二本鎖核酸と、第（ｋ＋１）標的核酸を含む二本鎖核酸との前記の連結の構造は、第ｋ双頭プライマーにおける２つのポリヌクレオチド間の連結の構造と同様である。
（１．２．プライマーセットの実施形態２）
　本発明のプライマーセットの実施形態２は、
　第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
　第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ａｋを３’末端部に含み、前記塩基配列Ａｋの５’末端側に塩基配列Ｂｋを更に含むポリヌクレオチドを含む、第ｋリバースプライマーと、
　第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｃｋ＋１を３’末端部に含み、前記塩基配列Ｃｋ＋１の５’末端側に、前記塩基配列Ｂｋとハイブリダイズする塩基配列Ｄｋ＋１を更に含むポリヌクレオチドを含む、第（ｋ＋１）フォワードプライマーと、
　第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと
を含み、
　Ｎは２以上の整数であり、
　ｋは１からＮ－１までの整数であり、
　前記第ｋリバースプライマー及び前記第（ｋ＋１）フォワードプライマーとして、それぞれ、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
　前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、前記標識部を更に含み、他方が、前記結合部を更に含む、
プライマーセットに関する。
　実施形態２のプライマーセットにおいて、末端プライマーＡ及び末端プライマーＢ、前記標識部及び前記結合部、並びにそれらを連結する構造は、実施形態１と同じであるため説明を省略する。
　第ｋリバースプライマーにおいて、塩基配列Ａｋ及び塩基配列Ｂｋはそれぞれ、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。塩基配列Ａｋと塩基配列Ｂｋを含むポリヌクレオチドは、その３’末端部に塩基配列Ａｋを含み、塩基配列Ａｋの５’末端塩基よりも５’末端側に塩基配列Ｂｋを含んでいればよく、塩基配列Ａｋと塩基配列Ｂｋとの間、及び、塩基配列Ｂｋよりも５’末端側には、それぞれ、更に他の塩基配列が付加されていてもよい。第ｋリバースプライマーに含まれるポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば８０塩基以下、６０塩基以下、又は５０塩基以下とすることができる。
　第ｋリバースプライマーを構成するポリヌクレオチドは、塩基配列Ａｋと塩基配列Ｂｋと（存在する場合は上記の他の塩基配列と）を同一方向となるように含み、５’末端から３’末端までの全体が、相補塩基配列を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能であり、ポリメラーゼ反応を阻害する構成を含んでいない。このため第ｋリバースプライマーを構成するポリヌクレオチドはその全体が、核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されることができる。
　第（ｋ＋１）フォワードプライマーにおいて、塩基配列Ｃｋ＋１及び塩基配列Ｄｋ＋１はそれぞれ、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。塩基配列Ｃｋ＋１と塩基配列Ｄｋ＋１を含むポリヌクレオチドは、その３’末端部に塩基配列Ｃｋ＋１を含み、塩基配列Ｃｋ＋１の５’末端塩基よりも５’末端側に塩基配列Ｄｋ＋１を含んでいればよく、塩基配列Ｃｋ＋１と塩基配列Ｄｋ＋１との間、及び、塩基配列Ｃｋ＋１よりも５’末端側には、それぞれ、更に他の塩基配列が付加されていてもよい。第（ｋ＋１）フォワードプライマーに含まれるポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば８０塩基以下、６０塩基以下、又は５０塩基以下とすることができる。
　第（ｋ＋１）フォワードプライマーを構成するポリヌクレオチドは、塩基配列Ｃｋ＋１と塩基配列Ｄｋ＋１と（存在する場合は上記の他の塩基配列と）を同一方向となるように含み、５’末端から３’末端までの全体が、相補塩基配列を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能であり、ポリメラーゼ反応を阻害する構成を含んでいない。このため第（ｋ＋１）フォワードプライマーを構成するポリヌクレオチドはその全体が、核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されることができる。
　第ｋリバースプライマーの塩基配列Ｂｋと第（ｋ＋１）フォワードプライマーの塩基配列Ｄｋ＋１はハイブリダイズ可能なように設計されている。
　第１標的核酸１１、第２標的核酸２１の２つを標的核酸とする場合（すなわちＮ＝２）を例に挙げ、実施形態２のプライマーセットの働きを図４を参照して説明する。
　末端プライマーＡ２００は、第１標的核酸１１の相補鎖１２の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチド２０１を含む。末端プライマーＡ２００は、ポリヌクレオチド２０１に加えて、更に末端プライマーＡ付加部分２０２を備える。末端プライマーＡ付加部分２０２は、前記標識部又は結合部のいずれか一方である。
　図４の例では、Ｎ＝２であるため、第ｋリバースプライマーとして、第１リバースプライマー２１０が含まれ、第（ｋ＋１）フォワードプライマーとして、第２フォワードプライマー２２０が含まれる。
　第１リバースプライマー２１０は、第１標的核酸１１の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ａ１２１１（第１リバースプライマー２１０に含まれるポリヌクレオチドのうち、塩基配列Ａ１を含む部分ポリヌクレオチド２１１を指す）を３’末端部に含み、塩基配列Ａ１２１１の５’末端側に塩基配列Ｂ１２１２（第１リバースプライマー２１０に含まれるポリヌクレオチドのうち、塩基配列Ｂ１を含む部分ポリヌクレオチド２１２を指す）を更に含むポリヌクレオチドを含む。
　第２フォワードプライマー２２０は、第２標的核酸２１の相補鎖２２の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｃ２２２１（第２フォワードプライマー２２０に含まれるポリヌクレオチドのうち、塩基配列Ｃ２を含む部分ポリヌクレオチド２２１を指す）を３’末端部に含み、前記塩基配列Ｃ２２２１の５’末端側に、塩基配列Ｂ１２１１とハイブリダイズする塩基配列Ｄ２２２２（第２フォワードプライマー２２０に含まれるポリヌクレオチドのうち、塩基配列Ｄ２を含む部分ポリヌクレオチド２２２を指す）を更に含むポリヌクレオチドを含む。
　末端プライマーＢ２３０は、第２標的核酸２１の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチド２３１を含む。末端プライマーＢ２３０は、ポリヌクレオチド２３１に加えて、更に末端プライマーＢ付加部分２３２を備える。末端プライマーＢ付加部分２３２は、前記標識部又は結合部のいずれか一方である。
　図４（Ａ）に示す通り、前記核酸を鋳型として末端プライマーＡ２００、第１リバースプライマー２１０、第２フォワードプライマー２２０及び末端プライマーＢ２３０を含む第２実施形態のプライマーの存在下で核酸増幅反応を行うとき、末端プライマーＡ２００のポリヌクレオチド２０１は、変性とアニーニングを経て、第１標的核酸相補鎖１２の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、５’末端に末端プライマーＡ付加部分２０２が連結された第１標的核酸１１の増幅断片４０１が合成される。また、第１リバースプライマー２１０は、変性とアニーニングを経て、第１標的核酸１１の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、５’末端部に塩基配列Ｂ１２１２が位置しその３’末端側に第１標的核酸相補鎖１２が位置する増幅断片４０２が合成される。
　同様に、図４（Ａ）に示す通り、第２フォワードプライマー２２０は、変性とアニーニングを経て、第２標的核酸相補鎖２２の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、５’末端部に塩基配列Ｄ２２２２が位置しその３’末端側に第２標的核酸２１が位置する増幅断片４０３が合成される。
　同様に、図４（Ａ）に示す通り、末端プライマーＢ２３０のポリヌクレオチド２３１は、変性とアニーニングを経て、第２標的核酸２１の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、５’末端に末端プライマーＢ付加部分２３２が連結された第２標的核酸相補鎖２２の増幅断片４０４が合成される。
　更に変性とアニーリングを行うと、図４（Ｂ）に示すように、前記増幅断片４０１の第１標的核酸１１の部分が、前記増幅断片４０２の第１標的核酸相補鎖１２の部分にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、３’末端部に塩基配列Ｄ２２２２が位置し、その５’末端側に第１標的核酸１１が位置し、５’末端に末端プライマーＡ付加部分２０２が連結された増幅断片４０５が合成される。
　同様に、図４（Ｂ）に示すように、前記増幅断片４０４の第２標的核酸相補鎖２２の部分が、前記増幅断片４０３の第２標的核酸２１の部分にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、３’末端部に塩基配列Ｂ１２１２が位置し、その５’末端側に第２標的核酸相補鎖２２が位置し、５’末端に末端プライマーＢ付加部分２３２が連結された増幅断片４０６が合成される。
　更に変性とアニーリングを行うと、図４（Ｃ）に示すように、前記増幅断片４０５の３’末端部の塩基配列Ｄ２２２２と、前記増幅断片４０６の３’末端部の塩基配列Ｂ１２１２とがハイブリダイズする。次いで、ポリメラーゼによる伸長反応により、前記増幅断片４０５の３’末端を起点に第２標的核酸２１が合成され、前記増幅断片４０６の３’末端を起点に第１標的核酸相補鎖２２が合成される。
　上記反応の結果、増幅産物として、図４（Ｄ）に示すように、第１標的核酸１１の塩基配列と塩基配列Ｄ２２２２と第２標的核酸２１の塩基配列とがこの順で５’末端から３’末端に配置された増幅断片４０７と、第２標的核酸２１の相補鎖２２の塩基配列と塩基配列Ｂ１２１２と第１標的核酸１１の相補鎖１２の塩基配列とがこの順で５’末端から３’末端に配置された増幅断片４０８とがハイブリダイズし、前記増幅断片４０７の５’末端に末端プライマーＡ付加部分２０２が連結し、前記増幅断片４０８の５’末端に末端プライマーＢ付加部分２０３が連結している、増幅産物２が生成される。
　核酸増幅産物２は、第１標的核酸１１（または第１標的核酸相補鎖１２）、第２標的核酸２１（または第２標的核酸相補鎖２２）が２つとも鋳型中に存在する場合にのみ増幅される。鋳型中にこれらのうち１つが存在しない場合、存在する標的核酸又はその相補鎖は増幅されるが、前記結合部と前記標識部とを併せ持つ核酸増幅産物は生じず、前記標識部を指標とした検出では陰性であることが明らかであるため、偽陽性判定のリスクが極めて低い。
　なお、図４（Ｃ）に示す前記増幅断片４０５と前記増幅断片４０６とのハイブリダイズは、反応系中に第１リバースプライマー２１０又は第２フォワードプライマー２２０が過剰に存在する場合は進みにくい。このため、本実施形態のプライマーセットでは、第１リバースプライマー２１０及び第２フォワードプライマー２２０に対して、末端プライマーＡ２００及び末端プライマーＢ２３０のモル比を高めた条件で核酸増幅反応を行うことが好ましい。
　上記の説明は、Ｎ＝２の場合には限定されずＮが２以上の全ての場合に妥当する。
　以上の通り、本発明の実施形態２に係るプライマーセットを用いた核酸増幅反応により、
　５’末端から３’末端に向けて、第１標的核酸の塩基配列から、第Ｎ標的核酸の塩基配列までを順に含む第１の増幅断片と、
　５’末端から３’末端に向けて、第Ｎ標的核酸の相補鎖の塩基配列から、第１標的核酸の相補鎖の塩基配列までを順に含む第２の増幅断片とを含み、
　前記第１の増幅断片と前記第２の増幅断片がハイブリダイズして二本鎖を形成し、
　前記第１の増幅断片と前記第２の増幅断片の一方では、５’末端に前記標識部が連結されており、
　前記第１の増幅断片と前記第２の増幅断片の他方では、５’末端に前記結合部が連結されている、
核酸増幅産物が生成される。ここでＮは２以上の整数である。この核酸増幅産物において、前記第１の増幅断片は、第ｋ標的核酸の塩基配列と第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列との間には、第（ｋ＋１）フォワードプライマーの塩基配列Ｄｋ＋１を含む。前記第２の増幅断片は、第ｋ標的核酸の相補鎖の塩基配列と第（ｋ＋１）標的核酸の相補鎖の塩基配列との間には、第ｋリバースプライマーの塩基配列Ｂｋを含む。ｋは１からＮ－１までの整数である。
（１．３．プライマーセットの実施形態３）
　本発明のプライマーセットの実施形態３は、
　第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
　第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｅｋを３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｅｋを含む前記ポリヌクレオチドの５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない塩基配列Ｆｋを含むポリヌクレオチドを含む、第ｋリバースプライマーと、
　第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｇｋ＋１を３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｇｋ＋１を含む前記ポリヌクレオチドの５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない、前記塩基配列Ｆｋとハイブリダイズする塩基配列Ｈｋ＋１を含むポリヌクレオチドとを含む、第（ｋ＋１）フォワードプライマーと、
　第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと
を含み、
　Ｎは２以上の整数であり、
　ｋは１からＮ－１までの整数であり、
　前記第ｋリバースプライマー及び前記第（ｋ＋１）フォワードプライマーとして、それぞれ、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
　前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、前記標識部を更に含み、他方が、前記結合部を更に含む、
プライマーセットに関する。
　実施形態３のプライマーセットにおいて、末端プライマーＡ及び末端プライマーＢ、前記標識部及び前記結合部、並びにそれらを連結する構造は、実施形態１と同じであるため説明を省略する。
　第ｋリバースプライマーにおいて、塩基配列Ｅｋは、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。塩基配列Ｅｋを含むポリヌクレオチドは、その３’末端部に塩基配列Ｅｋを含んでいればよく、塩基配列Ｅｋよりも５’末端側に他の塩基配列を更に含んでいてもよい。塩基配列Ｅｋを含むポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば４０塩基以下、３０塩基以下又は２５塩基以下とすることができる。
　第ｋリバースプライマーにおいて、塩基配列Ｆｋは、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。塩基配列Ｆｋを含むポリヌクレオチドは、塩基配列Ｆｋよりも３’末端側及び／又は５’末端側に他の塩基配列を更に含んでいてもよい。塩基配列Ｆｋを含むポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば４０塩基以下、３０塩基以下又は２５塩基以下とすることができる。
　第ｋリバースプライマーにおいて、塩基配列Ｅｋを含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｆｋを含むポリヌクレオチドとは、後者が核酸増幅反応での伸長により前者と共に二本鎖化されないよう構成されている。塩基配列Ｆｋを含むポリヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型となり得るポリヌクレオチド（通常は、天然のヌクレオチドからなるもの）である場合、塩基配列Ｅｋを含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｆｋを含むポリヌクレオチドとはポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーを介して連結される。このような「スペーサー」としては、プライマーセットの実施形態１の末端プライマーＡ又はＢに含まれるポリヌクレオチドと標識部又は結合部との間の、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーとして既述の構造が採用できる。この場合、塩基配列Ｅｋを含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｆｋを含むポリヌクレオチドとは一方向に連結することができる。一方、塩基配列Ｆｋを含むポリヌクレオチドとして、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、Ｌ型核酸、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオチドなどの修飾核酸を含むポリヌクレオチドのように、ＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型にならず核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されないポリヌクレオチドを用いる場合には、上記の、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーは省略することも可能である。
　第（ｋ＋１）フォワードプライマーにおいて、塩基配列Ｇｋ＋１は、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。塩基配列Ｇｋ＋１を含むポリヌクレオチドは、その３’末端部に塩基配列Ｇｋ＋１を含んでいればよく、塩基配列Ｇｋ＋１よりも５’末端側に他の塩基配列を更に含んでいてもよい。塩基配列Ｇｋ＋１を含むポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば４０塩基以下、３０塩基以下又は２５塩基以下とすることができる。
　第（ｋ＋１）フォワードプライマーにおいて、塩基配列Ｈｋ＋１は、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。塩基配列Ｈｋ＋１を含むポリヌクレオチドは、塩基配列Ｈｋ＋１よりも３’末端側及び／又は５’末端側に他の塩基配列を更に含んでいてもよい。塩基配列Ｈｋ＋１を含むポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば４０塩基以下、３０塩基以下又は２５塩基以下とすることができる。
　第（ｋ＋１）フォワードプライマーにおいて、塩基配列Ｇｋ＋１を含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｈｋ＋１を含むポリヌクレオチドとは、後者が核酸増幅反応での伸長により前者と共に二本鎖化されないよう構成されている。塩基配列Ｈｋ＋１を含むポリヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型となり得るポリヌクレオチド（通常は、天然のヌクレオチドからなるもの）である場合、塩基配列Ｇｋ＋１を含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｈｋ＋１を含むポリヌクレオチドとはポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーを介して連結される。このような「スペーサー」としては、プライマーセットの実施形態１の末端プライマーＡ又はＢに含まれるポリヌクレオチドと標識部又は結合部との間の、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーとして既述の構造が採用できる。この場合、塩基配列Ｇｋ＋１を含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｈｋ＋１を含むポリヌクレオチドとは一方向に連結することができる。一方、塩基配列Ｈｋ＋１を含むポリヌクレオチドとして、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、Ｌ型核酸、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオチドなどの修飾核酸を含むポリヌクレオチドのように、ＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型にならず核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されないポリヌクレオチドを用いる場合には、上記の、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーは省略することも可能である。
　第ｋリバースプライマーの塩基配列Ｆｋと、第（ｋ＋１）フォワードプライマーの塩基配列Ｈｋ＋１とは、相互にハイブリダイズし、プライマーセットに含まれる各プライマーによる核酸増幅を阻害しないように適宜設計することができる。
　第１標的核酸１１、第２標的核酸２１の２つを標的核酸とする場合（すなわちＮ＝２）を例に挙げ、実施形態３のプライマーセットの働きを図５を参照して説明する。
　末端プライマーＡ５００は、第１標的核酸１１の相補鎖１２の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチド５０１を含む。末端プライマーＡ５００は、ポリヌクレオチド５０１に加えて、更に末端プライマーＡ付加部分５０２を備える。末端プライマーＡ付加部分５０２は、前記標識部又は結合部のいずれか一方である。
　図５の例では、Ｎ＝２であるため、第ｋリバースプライマーとして、第１リバースプライマー５１０が含まれ、第（ｋ＋１）フォワードプライマーとして、第２フォワードプライマー５２０が含まれる。
　第１リバースプライマー５１０は、第１標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｅ１を３’末端部に含むポリヌクレオチド５１１と、前記塩基配列Ｅ１を含む前記ポリヌクレオチド５１１の５’末端側に連結された、塩基配列Ｆ１を含むポリヌクレオチド５１２とを含む。
　第２フォワードプライマー５２０は、第２標的核酸２１の塩基配列の相補配列２２の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｇ２を３’末端部に含むポリヌクレオチド５２１と、前記塩基配列Ｇ２を含むポリヌクレオチド５２１の５’末端側に連結された、前記塩基配列Ｆ１とハイブリダイズする塩基配列Ｈ２を含むポリヌクレオチド５２２とを含む。
　末端プライマーＢ５３０は、第２標的核酸２１の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチド５３１を含む。末端プライマーＢ５３０は、ポリヌクレオチド５３１に加えて、更に末端プライマーＢ付加部分５３２を備える。末端プライマーＢ付加部分５３２は、前記標識部又は結合部のいずれか一方である。
　図５（Ａ）に示す通り、前記核酸を鋳型として末端プライマーＡ５００、第１リバースプライマー５１０、第２フォワードプライマー５２０及び末端プライマーＢ５３０を含む第３実施形態のプライマーの存在下で核酸増幅反応を行うとき、末端プライマーＡ５００のポリヌクレオチド５０１は、変性とアニーニングを経て、第１標的核酸相補鎖１２の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、５’末端に末端プライマーＡ付加部分５０２が連結された第１標的核酸１１の増幅断片５５１が合成される。
　同様に、図５（Ａ）に示す通り、第１リバースプライマー５１０の塩基配列Ｅ１を含むポリヌクレオチド５１１は、変性とアニーニングを経て、第１標的核酸１１の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、塩基配列Ｆ１を含むポリヌクレオチド５１２が５’末端側に連結された第１標的核酸相補鎖１２の増幅断片５５２が合成される。
　同様に、図５（Ａ）に示す通り、第２フォワードプライマー５２０の塩基配列Ｇ２を含むポリヌクレオチド５２１は、変性とアニーニングを経て、第２標的核酸相補鎖２２の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、塩基配列Ｈ２を含むポリヌクレオチド５２２が５’末端側に連結された第２標的核酸２１の増幅断片５５３が合成される。
　同様に、図５（Ａ）に示す通り、末端プライマーＢ５３０のポリヌクレオチド５３１は、変性とアニーニングを経て、第２標的核酸２１の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、５’末端に末端プライマーＢ付加部分５３２が連結された第２標的核酸相補鎖２２の増幅断片５５４が合成される。
　更に変性とアニーリングを行うと、図５（Ｂ）に示すように、前記増幅断片５５１の第１標的核酸１１の部分と、前記増幅断片５５２の第１標的核酸相補鎖１２の部分とがハイブリダイズし、前記増幅断片５５２の塩基配列Ｆ１を含むポリヌクレオチド５１２の部分と、前記増幅断片５５３の塩基配列Ｈ２を含むポリヌクレオチド５２２の部分とがハイブリダイズし、前記増幅断片５５３の第２標的核酸２１の部分と、前記増幅断片５５４の第２標的核酸相補鎖２２の部分とがハイブリダイズした、核酸増幅産物３が生成される。
　核酸増幅産物３は、鋳型中に、第１標的核酸１１（または第１標的核酸相補鎖１２）、第２標的核酸２１（または第２標的核酸相補鎖２２）が２つとも鋳型中に存在する場合にのみ増幅される。鋳型中にこれらのうち１つが存在しない場合、存在する標的核酸又はその相補鎖は増幅されるが、前記結合部と前記標識部とを併せ持つ核酸増幅産物は生じず、前記標識部を指標とした検出では陰性であることが明らかであるため、偽陽性判定のリスクが極めて低い。
　なお、図５（Ｂ）に示す前記増幅断片５５１～５５４の間のハイブリダイズは、反応系中に第１リバースプライマー５１０又は第２フォワードプライマー５２０が過剰に存在する場合は進みにくい。このため、本実施形態のプライマーセットでは、第１リバースプライマー５１０及び第２フォワードプライマー５２０に対して、末端プライマーＡ５００及び末端プライマーＢ５３０のモル比を高めた条件で核酸増幅反応を行うことが好ましい。
　上記の説明は、Ｎ＝２の場合には限定されずＮが２以上の全ての場合に妥当する。
　以上の通り、本発明の実施形態３に係るプライマーセットを用いた核酸増幅反応により、
　第１標的核酸から第Ｎ標的核酸までの標的核酸のそれぞれとその相補鎖とがハイブリダイズした二本鎖増幅断片と、
　第２標的核酸から第Ｎ標的核酸の標的核酸のそれぞれの５’末端側に一本鎖ポリペプチドが連結されており、
　第１標的核酸から第（Ｎ－１）標的核酸の標的核酸のそれぞれの相補鎖の５’末端側に一本鎖ポリペプチドが連結されており、
　第ｋ標的核酸の二本鎖増幅断片における、第ｋ標的核酸の相補鎖の５’末端側に連結した一本鎖ポリペプチドと、第（ｋ＋１）標的核酸の二本鎖増幅断片における、第（ｋ＋１）標的核酸の５’末端側に連結した一本鎖ポリペプチドとが、相互にハイブリダイズしており、
　第１標的核酸の増幅断片と第Ｎ標的核酸の相補鎖の増幅断片の一方では、５’末端に前記標識部が連結されており、
　第１標的核酸の増幅断片と第Ｎ標的核酸の相補鎖の増幅断片の他方では、５’末端に前記結合部が連結されている、
核酸増幅産物が生成される。ここでＮは２以上の整数であり、ｋが１～Ｎ－１の整数である。
（１．４．実施形態４）
　本発明のプライマーセットの実施形態４は、
　第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
　第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｉｋを３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｉｋを含む前記ポリヌクレオチドの５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない塩基配列Ｊｋを含むポリヌクレオチドとを含む、第ｋリバースプライマーと、
　第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｌｋ＋１を３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｌｋ＋１の５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない塩基配列Ｍｋ＋１を更に含むポリヌクレオチドとを含む、第（ｋ＋１）フォワードプライマーと、
　前記塩基配列Ｊｋとハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｍｋ＋１とハイブリダイズする塩基配列とを含むポリヌクレオチドとを含む、第ｋ連結用ポリヌクレオチドと、
　第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと
を含み、
　Ｎは２以上の整数であり、
　ｋは１からＮ－１までの整数であり、
　前記第ｋリバースプライマー、前記第（ｋ＋１）フォワードプライマー及び前記第ｋ連結用ポリヌクレオチドとして、それぞれ、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
　前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、前記標識部を更に含み、他方が、前記結合部を更に含む、
プライマーセットに関する。
　実施形態４のプライマーセットにおいて、末端プライマーＡ及び末端プライマーＢ、前記標識部及び前記結合部、並びにそれらを連結する構造は、実施形態１と同じであるため説明を省略する。
　実施形態４の第ｋリバースプライマーにおいて、塩基配列Ｉｋは、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。塩基配列Ｉｋを含むポリヌクレオチドは、その３’末端部に塩基配列Ｉｋを含んでいればよく、塩基配列Ｉｋよりも５’末端側に他の塩基配列を更に含んでいてもよい。塩基配列Ｉｋを含むポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば４０塩基以下、３０塩基以下又は２５塩基以下とすることができる。
　第ｋリバースプライマーにおいて、塩基配列Ｊｋは、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。塩基配列Ｊｋを含むポリヌクレオチドは、塩基配列Ｊｋよりも３’末端側及び／又は５’末端側に他の塩基配列を更に含んでいてもよい。塩基配列Ｊｋを含むポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば４０塩基以下、３０塩基以下又は２５塩基以下とすることができる。
　第ｋリバースプライマーにおいて、塩基配列Ｉｋを含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｊｋを含むポリヌクレオチドとは、後者が核酸増幅反応での伸長により前者と共に二本鎖化されないように構成されている。塩基配列Ｊｋを含むポリヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型となり得るポリヌクレオチド（通常は、天然のヌクレオチドからなるもの）である場合、塩基配列Ｉｋを含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｊｋを含むポリヌクレオチドとは、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーを介して連結される。このような「スペーサー」としては、プライマーセットの実施形態１の末端プライマーＡ又はＢに含まれるポリヌクレオチドと標識部又は結合部との間の、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーとして既述の構造が採用できる。この場合、塩基配列Ｉｋを含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｊｋを含むポリヌクレオチドとは一方向に連結することができる。一方、塩基配列Ｊｋを含むポリヌクレオチドとして、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、Ｌ型核酸、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオチドなどの修飾核酸を含むポリヌクレオチドのように、ＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型にならず核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されないポリヌクレオチドを用いる場合には、上記の、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーは省略することも可能である。
　第（ｋ＋１）フォワードプライマーにおいて、塩基配列Ｌｋ＋１は、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。塩基配列Ｌｋ＋１を含むポリヌクレオチドは、その３’末端部に塩基配列Ｌｋ＋１を含んでいればよく、塩基配列Ｌｋ＋１よりも５’末端側に他の塩基配列を更に含んでいてもよい。塩基配列Ｌｋ＋１を含むポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば４０塩基以下、３０塩基以下又は２５塩基以下とすることができる。
　第（ｋ＋１）フォワードプライマーにおいて、塩基配列Ｍｋ＋１は、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。塩基配列Ｍｋ＋１を含むポリヌクレオチドは、塩基配列Ｍｋ＋１よりも３’末端側及び／又は５’末端側に他の塩基配列を更に含んでいてもよい。塩基配列Ｍｋ＋１を含むポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば４０塩基以下、３０塩基以下又は２５塩基以下とすることができる。
　第（ｋ＋１）フォワードプライマーにおいて、塩基配列Ｌｋ＋１を含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｍｋ＋１を含むポリヌクレオチドとは、後者が核酸増幅反応での伸長により前者と共に二本鎖化されないように構成されている。塩基配列Ｍｋ＋１を含むポリヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型となり得るポリヌクレオチド（通常は、天然のヌクレオチドからなるもの）である場合、塩基配列Ｌｋ＋１を含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｍｋ＋１を含むポリヌクレオチドとはポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーを介して連結される。このような「スペーサー」としては、プライマーセットの実施形態１の末端プライマーＡ又はＢに含まれるポリヌクレオチドと標識部又は結合部又は結合部との間の、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーとして既述の構造が採用できる。この場合、塩基配列Ｌｋ＋１を含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｍｋ＋１を含むポリヌクレオチドとは一方向に連結することができる。一方、塩基配列Ｍｋ＋１を含むポリヌクレオチドとして、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、Ｌ型核酸、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオチドなどの修飾核酸を含むポリヌクレオチドのように、ＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型にならず核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されないポリヌクレオチドを用いる場合には、上記の、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーは省略することも可能である。
　第ｋ連結用ポリヌクレオチドにおいて、塩基配列Ｊｋとハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、塩基配列Ｊｋとハイブリダイズする塩基配列の５’末端側及び／又は３’末端側に更に他の塩基配列を含んでもよい。
　第ｋ連結用ポリヌクレオチドにおいて、塩基配列Ｍｋ＋１とハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、塩基配列Ｍｋ＋１とハイブリダイズする塩基配列の５’末端側及び／又は３’末端側に更に他の塩基配列を含んでもよい。
　第ｋ連結用ポリヌクレオチドに含まれる、塩基配列Ｊｋとハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｍｋ＋１とハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドとは、１つながりのポリヌクレオチド分子であってもよいし、間に適当な化学構造を介して連結されたものであってもよい。このような化学構造としては、例えば、プライマーセットの実施形態１の末端プライマーＡ又はＢに含まれるポリヌクレオチドと標識部又は結合部との間の構造として既述の構造が採用できる。第ｋ連結用ポリヌクレオチドは、好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼによる反応において鋳型とならない構造を有する。例えば、塩基配列Ｊｋとハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｍｋ＋１とハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドとが、それぞれ３’末端側で連結されたものであってもよいし、塩基配列Ｊｋとハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｍｋ＋１とハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドの一方又は両方が、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、Ｌ型核酸、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオチドなどの修飾核酸を含むポリヌクレオチドのように、ＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型にならず核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されないポリヌクレオチドにより構成されていてもよい。
　第ｋリバースプライマーの塩基配列Ｊｋ、第（ｋ＋１）フォワードプライマーの塩基配列Ｍｋ＋１、第ｋ連結用ポリヌクレオチドに含まれるこれらの塩基配列とハイブリダイズする塩基配列は、プライマーセットに含まれる各プライマーによる核酸増幅を阻害しないように適宜設計することができる。
　第１標的核酸１１、第２標的核酸２１の２つを標的核酸とする場合（すなわちＮ＝２）を例に挙げ、実施形態４のプライマーセットの働きを図６を参照して説明する。
　末端プライマーＡ６００は、第１標的核酸１１の相補鎖１２の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチド６０１と、末端プライマーＡ付加部分６０２とを備える。
　図６の例では、Ｎ＝２であるため、第ｋリバースプライマーとして、第１リバースプライマー６１０が含まれ、第（ｋ＋１）フォワードプライマーとして、第２フォワードプライマー６２０が含まれ、第ｋ連結用ポリヌクレオチドとして、第１連結用ポリヌクレオチド６４０が含まれる。
　第１リバースプライマー６１０は、塩基配列Ｉ１を３’末端部に含むポリヌクレオチド６１１と、ポリヌクレオチド６１１の５’末端側に連結された、塩基配列Ｊ１を含むポリヌクレオチド６１２とを含む。
　第２フォワードプライマー６２０は、塩基配列Ｌ２を３’末端部に含むポリヌクレオチド６２１と、ポリヌクレオチド６２１の５’末端側に連結された、塩基配列Ｍ２を含むポリヌクレオチド６２２とを含む。
　末端プライマーＢ６３０は、第２標的核酸２１の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチド６３１と、末端プライマーＢ付加部分６３２を備える。
　第１連結用ポリヌクレオチド６４０は、塩基配列Ｊ１を含むポリヌクレオチド６１２とハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチド６４１と、塩基配列Ｍ２を含むポリヌクレオチド６２２とハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチド６４２を含む。
　図６（Ａ）に示す通り、前記核酸を鋳型として末端プライマー６００、第１リバースプライマー６１０、第２フォワードプライマー６２０及び末端プライマーＢ６３０を含む第４実施形態のプライマーの存在下で核酸増幅反応を行うとき、末端プライマーＡ６００からは、５’末端に末端プライマーＡ付加部分６０２が連結された第１標的核酸１１の増幅断片６５１が合成される。
　第１リバースプライマー６１０からは、塩基配列Ｊ１を含むポリヌクレオチド６１２が５’末端側に連結された第１標的核酸相補鎖１２の増幅断片６５２が合成される。
　第２フォワードプライマー６２０からは、塩基配列Ｍ２を含むポリヌクレオチド６２２が５’末端側に連結された第２標的核酸２１の増幅断片６５３が合成される。
　末端プライマーＢ６３０からは、５’末端に末端プライマーＢ付加部分６３２が連結された第２標的核酸相補鎖２２の増幅断片６５４が合成される。
　第１連結用ポリヌクレオチド６４０は核酸増幅反応には直接関与しない。
　核酸増幅反応後の増幅産物を変性しアニーリングすると、図５（Ｂ）に示すように、前記増幅断片６５１の第１標的核酸１１の部分と、前記増幅断片６５２の第１標的核酸相補鎖１２の部分とがハイブリダイズし、前記増幅断片６５２のポリヌクレオチド６１２の部分と、第１連結用ポリヌクレオチド６４０のポリペプチド６４１の部分とがハイブリダイズし、第１連結用ポリヌクレオチド６４０のポリペプチド６４２の部分と、前記増幅断片６５３のポリヌクレオチド６２２の部分とがハイブリダイズし、前記増幅断片６５３の第２標的核酸２１の部分と、前記増幅断片６５４の第２標的核酸相補鎖２２の部分とがハイブリダイズした、核酸増幅産物４が生成される。
　核酸増幅産物４は、鋳型中に、第１標的核酸１１（または第１標的核酸相補鎖１２）、第２標的核酸２１（または第２標的核酸相補鎖２２）が２つとも鋳型中に存在する場合にのみ増幅される。鋳型中にこれらのうち１つが存在しない場合、存在する標的核酸又はその相補鎖は増幅されるが、前記結合部と前記標識部とを併せ持つ核酸増幅産物は生じず、前記標識部を指標とした検出では陰性であることが明らかであるため、偽陽性判定のリスクが極めて低い。
　なお、図６（Ｂ）に示す前記増幅断片６５１～６５４及び第１連結用ポリヌクレオチド６４０の間のハイブリダイズは、反応系中に第１リバースプライマー６１０又は第２フォワードプライマー６２０が過剰に存在する場合は進みにくい。このため、本実施形態のプライマーセットでは、第１リバースプライマー６１０及び第２フォワードプライマー６２０に対して、末端プライマーＡ６００及び末端プライマーＢ６３０のモル比を高めた条件で核酸増幅反応を行うことが好ましい。
　なお、第ｋ連結用ポリヌクレオチドは核酸増幅反応には直接関与しないため、核酸増幅反応後に反応系中に添加し、その後に、反応系を変性しアニーリングしてもよい。
　上記の説明は、Ｎ＝２の場合には限定されずＮが２以上の全ての場合に妥当する。
　以上の通り、本発明の実施形態４に係るプライマーセットを用いた核酸増幅反応により、
　第１標的核酸から第Ｎ標的核酸までの標的核酸のそれぞれとその相補鎖とがハイブリダイズした二本鎖増幅断片と、
　第１連結用ポリヌクレオチドから第（Ｎ－１）連結用ポリヌクレオチドまでのＮ－１個の連結用ポリヌクレオチドを含み
　第２標的核酸から第Ｎ標的核酸の標的核酸のそれぞれの５’末端側に一本鎖ポリペプチドが連結されており、
　第１標的核酸から第（Ｎ－１）標的核酸の標的核酸のそれぞれの相補鎖の５’末端側に一本鎖ポリペプチドが連結されており、
　第ｋ標的核酸の相補鎖の５’末端側に連結した一本鎖ポリペプチドと、第ｋ連結用ポリヌクレオチドの一部とが、相互にハイブリダイズしており、
　第（ｋ＋１）標的核酸の５’末端側に連結した一本鎖ポリペプチドと、第ｋ連結用ポリヌクレオチドの他の一部とが、相互にハイブリダイズしており、
　第１標的核酸の増幅断片と第Ｎ標的核酸の相補鎖の増幅断片の一方では、５’末端に前記標識部が連結されており、
　第１標的核酸の増幅断片と第Ｎ標的核酸の相補鎖の増幅断片の他方では、５’末端に前記結合部が連結されている、
核酸増幅産物が生成される。ここでＮは２以上の整数であり、ｋが１～Ｎ－１の整数である。
＜２．本発明の検出方法＞
　本発明はまた、２以上の標的核酸を検出する方法であって、
　連結された、２以上の標的核酸と、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部と、固相担体と結合可能なタグである結合部とを含む検出用核酸を含む可能性のある検出用試料を、前記結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体に接触させ、前記標識部を指標として前記固相担体の前記部分での前記検出用核酸を検出する検出工程
を含む方法に関する。
　図２に基づいて説明した通り、各々に結合部と標識部とを結合させた２以上の標的核酸の混合物を、各結合部に応じた複数の結合部位を含む１つの固相担体に接触させる場合は判別性が悪いという問題がある。
　本発明では、２以上の標的核酸と、前記標識部と、前記結合部とが連結された核酸を検出用核酸とし、該検出用核酸を含む可能性のある検出用試料を、前記結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体に接触させ、前記標識部を指標として前記固相担体の前記部分での前記検出用核酸を検出する。前記固相担体の前記部分での前記検出用核酸の検出は、前記部分での前記標識部の有無に基づいて判断することができる。図１Ａに示すように、前記固相担体の前記部分で前記検出用核酸が検出された場合に、前記検出用試料には、所定の２以上の標的核酸が含まれていると判断することができる。このため、各々に結合部と標識部とを結合させた２以上の標的核酸の混合物を、各結合部に応じた複数の結合部位を含む１つの固相担体に接触させる方法と比較して、判別性が顕著に高い。
　本発明では、２以上の標的核酸を１つの検出用核酸とすることができるため、固相担体上には、前記結合部と結合する部位を１つ設ければよく、固相担体の構成が単純化できることも利点の一つである。
　ここで前記検出用核酸は、好ましくは、直列に連結された２以上の標的核酸と、該２以上の標的核酸の列の両端の一方に連結された前記標識部と、他方に連結された前記結合部とを含む。この場合、前記標識部と前記結合部は、所定の２以上の標的配列が全て含まれる場合にのみ１つの核酸中に共存することができ、図１Ｂ１～Ｂ３に示すように、前記２以上の標的核酸が存在しない場合には、固相担体上に前記標識部による標識は検出されないため、偽陽性のリスクを低減することができる。
　本発明の検出方法はより好ましくは、
　２以上の標的核酸を検出する方法であって、
　分析対象試料から取得された核酸を鋳型とする核酸増幅反応によって前記検出用核酸を含む可能性のある検出用試料を調製する検出用試料調製工程を更に含み、
　前記検出工程において、前記検出用試料調製工程で得られた核酸増幅反応の生成物を前記検出用試料として用いる。
　前記検出工程において、前記検出用核酸が、前記核酸増幅反応による核酸増幅産物である。
　本発明の検出方法はより好ましくは、前記検出用試料調製工程が、分析対象試料から取得された核酸を鋳型とし、本発明の各実施形態に係るプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うことを含む。本発明の各実施形態に係るプライマーセットを用いることで、鋳型となる核酸中に第１標的核酸から第Ｎ標的核酸までが全て含まれている場合、核酸増幅産物として、直列に連結された、第１標的核酸から第Ｎ標的核酸までの標的核酸と、該２以上の標的核酸の列の両端の一方に連結された前記標識部と、他方に連結された前記結合部とを含む前記検出用核酸を得ることができる。一方、標的核酸のうち一部が存在しない場合は、核酸増幅反応の生成物には、前記検出用核酸が含まれないだけでなく、前記標識部と前記結合部とが共に含まれる核酸種が含まれない。例えば、図１Ｂ１～Ｂ３に示すように、標的核酸Ａと標的核酸Ｂと標的核酸Ｃのうち１つまたは２つが存在しない場合には、固相担体上に前記標識部による標識は検出されないため、偽陽性のリスクを低減することができる。
　本発明において、分析対象試料は特に限定されないが、典型的には、飲食品、動物植物等の生体の一部（器官、組織、細胞、血液、体液等）、糞便、微生物、ウイルス等を含む試料が挙げられる。
　分析対象試料から取得された核酸を核酸増幅反応に鋳型として利用することができる。該核酸は、分析対象試料から抽出され精製された形態であってもよいし、分析対象試料から抽出され粗精製された形態であってもよい。あるいは、細胞や組織の一部等の比較的高濃度で核酸を含む試料であれば、分析対象試料自体をそのまま核酸増幅反応に含めることもできる。また分析対象試料から調製されたｃＤＮＡも鋳型として利用可能である。鋳型として用いる核酸は好ましくはＤＮＡである。
　以下、検出用試料調製工程、検出工程、標識工程の好ましい実施形態について説明する。
（２．１．検出用試料調製工程）
　検出用試料調製工程として、分析対象試料から取得された核酸を鋳型とし、上述した本発明のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行う場合の好ましい態様を以下に説明する。
　核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）に従って行うことができる。すなわち、標的核酸を含む鋳型核酸に対し本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合に、所望の核酸増幅産物が増幅されるＰＣＲ条件にて行うことができる。また、適切な場合は、ＰＣＲ法以外の核酸増幅反応を用いてもよい。
　ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼであればよく、特に限定はされない。本発明においては、市販のＤＮＡポリメラーゼを利用することが可能であり、例えばＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（登録商標）等を好適に利用することができる。また、温度、時間、緩衝液の組成等は、用いるＤＮＡポリメラーゼや、各プライマーの濃度等に応じて、適宜選択することができる。
　ホットスタートＰＣＲ法は、プライマーダイマーの形成を抑制する効果が期待できることから有用である。ホットスタートＰＣＲ法は、ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（登録商標）Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ）等の市販のホットスタートＰＣＲ用試薬を用いて行うことができる。また、ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ　ＨＳ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ，　ＵＮＧ　ｐｌｕｓ（登録商標）を使用することもでき、このキットを用いることで核酸増幅産物のキャリーオーバーコンタミネーションを抑制する効果も期待できる。
　ＰＣＲ法での変性、アニーリング、伸長の各工程の時間、温度、緩衝液組成、ｄＮＴＰ濃度、サイクル数等の各条件は選択したＤＮＡポリメラーゼ、プライマー配列、標的核酸の塩基数、鋳型濃度等の要素を考慮して適宜設定することができる。
　ＰＣＲ法でのサイクル数は特に限定されないが、例えば２５～６０サイクルの範囲内である。
　ＰＣＲ法での反応系中の開始時の各プライマー濃度は特に限定されず、鋳型となる核酸量等に応じて適宜調整することができる。反応系中の反応開始時の好ましいプライマー濃度としては、各プライマーが各々０．０５μＭ以上、１．０μＭ以下という濃度が挙げられる。０．０５μＭ未満の場合、検出感度が低下して基準となる検出感度の低下が生じる可能性がある。また、プライマー濃度の上限は特に限定されないが、好ましくは１.０μＭである。
　本発明の実施形態１～４のプライマーセットを用いる核酸増幅反応では、鋳型核酸中に標的核酸が含まれている場合、増幅産物として、前記の核酸増幅産物１～４が反応系中に形成される。
　２以上の標的核酸の組み合わせを２組以上検出する場合には、含まれる２以上の標的核酸の組み合わせが異なり、且つ、固相担体の異なる位置に結合可能な前記結合部を備えた２以上の検出用核酸を調製できるよう設計された２セット以上の、本発明のプライマーセットを用い、分析対象試料から取得された核酸を鋳型として、上記の条件において核酸増幅反応を行うことができる。この場合、下記の検出工程では、核酸増幅反応で得られた検出用試料を前記固相担体に接触させ、前記標識部を指標として前記固相担体において前記２以上の検出用核酸の各々を検出する。
（２．２．検出工程）
　検出工程は、前記検出用試料調製工程における核酸増幅反応の生成物等の検出用試料を、結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体に接触させ、標識部を指標として固相担体の前記部分での検出用核酸を検出する工程である。
　核酸増幅反応の生成物とは、増幅産物として前記検出用核酸を含んでいる可能性のある核酸増幅反応の反応液や、該反応液から増幅産物を更に高濃度化した試料等を指す。
　標識部が上述の標識用タグである場合には、標識物質を標識用タグに結合させる標識工程を更に行えばよい。標識部が上述の標識物質である場合には標識工程は不要である。検出工程において「標識部を指標として」とは、標識部が標識用タグである場合には標識工程を経て結合した標識物質を指標として前記検出用核酸を検出することを指し、標識部が標識物質である場合には該標識物質を指標として前記検出用核酸を検出することを指す。
　固相担体は既に詳述した通りである。
　固相担体の、結合部と結合可能な部分への検出用試料の接触は、固相担体と結合部との組合せに応じて、前記検出用試料中に前記検出用核酸が含まれていた場合に前記部分に前記検出用核酸の結合部が結合するように適宜調節された条件（例えば結合部に関して詳述したハイブリダイゼーションの条件、もしくはｐＨ５～９程度の緩衝液条件）で行えばよい。
　前記検出用核酸の検出は、固相担体に捕捉された前記検出用核酸に結合した前記標識物質を検出、好ましくは目視検出することにより行うことができる。前記検出用核酸が存在する場合には、固相担体に捕捉・結合された前記検出用核酸の標識物質が検出される。当該検出の有無を指標にして、検出用試料中の前記検出用核酸の有無を判別することができる。検出用試料が、前記検出用試料調製工程における核酸増幅反応の生成物である場合には、当該検出の有無を指標にして、分析対象試料中の２以上の標的核酸の有無を判別することができる。
（２．３．標識工程）
　標識工程は、前記検出用核酸に含まれる前記標識部が上述の標識用タグである場合に行う工程であり、前記検出用試料と標識物質とを接触させ、標識用タグに標識物質に結合させることにより行う。標識工程は、前記検出用試料を固相担体に接触させる前に行ってもよいし、接触させた後に行ってもよいし、接触させると同時に行ってもよい。
　標識物質と前記検出用試料との接触は、標識物質と標識用タグとの組合せに応じて、前記検出用試料中に前記標的核酸が含まれていた場合に標識物質と前記検出用試料の標識用タグとが結合するように適宜調節された条件（例えば結合部に関して説明したハイブリダイゼーションの条件、もしくはｐＨ５～９程度の緩衝液条件）で行えばよい。
＜３．本発明のキット＞
　本発明はまた、分析対象試料中での２以上の標的核酸を検出するためのキットであって、本発明のプライマーセットと、前記結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体とを含むキットを提供する。該キットは本発明の検出方法において利用することができる。
　本発明のプライマーセットにおける標識部が標識用タグである場合には、本発明のキットは、標識物質を更に含むことができる。
　固相担体及び標識物質は、後述する核酸検出デバイスの形態とすることができる。
　本発明のキットにはさらに、ＰＣＲ用緩衝液、ｄＮＴＰｓ、ＤＮＡポリメラーゼ、核酸クロマトグラフィー展開溶液等を含めることができる。
＜４．核酸検出デバイス＞
　上述の検出工程及び標識工程は、核酸クロマトグラフィーを利用する核酸検出デバイスを用いて行うことができる。当該核酸検出デバイスを利用することにより、検出用試料中の前記検出用核酸の有無を、特殊な装置を必要とすることなく検出・判別することができ、簡便かつ迅速に結果を得ることができる。
　核酸検出デバイスは、核酸クロマトグラフィー法により、標識された前記検出用核酸を検出するために利用される公知の核酸検出デバイス（ＷＯ２０１２／０７０６１８）を利用することができる。
　本発明にて利用可能な核酸検出デバイスの一実施形態の模式図を図７に示すが、核酸検出デバイスは本実施形態に限定されるものではない。なお、以下の説明において、各部材に付された符号は、図７中に示される符号に対応する。
　図７の核酸検出デバイス７００は、基材７５の上に、前記検出用試料を受容するための反応系受容部であるサンプルパッド７３、標識物質を保持するコンジュゲートパッド７２、前記検出用核酸に含まれる結合部と結合可能な部分７６を一部に含む多孔質固相担体７１、及び吸収パッド７４を互いがこの順に接触するように配置して形成される。固相担体７１の部分７６は、前記検出用核酸を捕捉するための手段（捕捉手段）（例えば、上記オリゴヌクレオチド等）が限局して配置・固定化された部分である。サンプルパッド７３、コンジュゲートパッド７２、固相担体７１及び吸収パッド７４は上記固相担体として利用可能な多孔質構造を有する部材により構成することができる。これらは同一の部材より構成されていてもよいし、異なる部材より構成されていてもよい。基材７５はその上に配置された各種部材を支持することができ、核酸検出デバイスの操作を容易にするものであればよく、例えば樹脂、金属、鉱物等からなるものを利用することができる。標識物質を展開溶液中に混合する場合や、標識部が標識物質である場合には、コンジュゲートパッド７２は省略することができる。核酸検出デバイス７００一部はコンタミネーションの予防や試験中の固相担体表面からの液体の揮発を防止するため、ポリエステルなどのフィルムで覆われていてもよい。
　核酸増幅工程により得られた核酸増幅反応の反応系等の前記検出用試料をサンプルパッド７３に添加する。前記検出用試料としては前記反応系をそのまま添加してもよいし、適当な展開溶液（例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液、ＳＳＣ緩衝液）と共に添加してもよい。展開溶液には必要に応じて、界面活性剤、塩、タンパク質、核酸等をさらに含めることができる。サンプルパッド７３に添加された前記検出用試料は、図７中の矢印で示す方向に上流から下流に向かってキャピラリー現象により展開する。
　また別の態様としては、前記検出用試料及び／又は展開溶液を保持した容器（例えば、ＰＣＲチューブ、エッペンチューブ、９６穴プレート等）に、当該核酸検出デバイスのサンプルパッド７３を前記検出用試料及び／又は展開溶液に浸漬させる方法で展開することもできる。その場合、前記検出用試料及び／又は展開溶液を保持した容器にサンプルパッド７３が入るように、サンプルパッド７３の幅は２.０～１０．０ｍｍにすることが好ましく、２.０～５．０ｍｍにすることがより好ましい。
　また、前記検出用試料及び／又は展開溶液を保持した容器に浸漬して用いられる核酸検出デバイスでは、図７に図示する核酸検出デバイス７００からサンプルパッド７３を省略することができる。更に、標識部として標識物質を用いる場合等で不要な場合は、コンジュゲートパッド７２も省略することができ、基材７５上の固相担体７１の吸収パッド７４が配置されていない側の端部が前記検出用試料及び／又は展開溶液に直接浸漬される形態とすることができる。
　前記標識部が標識用タグである実施形態の１つでは、前記検出用核酸は標識物質が保持されたコンジュゲートパッド７２を通過する際に、標識物質と接触し、標識用タグを介して標識物質により標識される。
　次いで、前記検出用試料中の前記検出用核酸は、固相担体７１を通過する際に、部分７６に固定された捕捉手段と接触し、固定化用タグを介して固相担体７１に捕捉・結合される。
　前記検出用試料中の前記検出用核酸が存在する場合には、捕捉手段を含む固相担体７１の部分７６に捕捉・結合された前記検出用核酸に結合した標識物質が部分７６に検出される。標識物質が目視確認できるものであれば、標識物質に起因して部分７６が呈色する。当該標識物質の検出（呈色）の有無を指標にして、前記検出用核酸の有無を判別することができ、それに基づいて、分析対象試料中の標的核酸の有無を判別することができる。
＜４．本発明のプライマーセットの更なる実施形態＞
　本発明の上記の実施形態１のプライマーセットの更なる実施形態では、末端プライマーＡ及び末端プライマーＢの一方に結合する前記標識部及び他方に結合する前記結合部は必ずしも必要ではない。
　すなわち本発明のプライマーセットの更なる実施形態は、
　前記末端プライマーＡと、
　前記第ｋ双頭プライマーと、
　末端プライマーＢとを含み、
　Ｎは２以上の整数であり、ｋは１からＮ－１までの整数であり、
　前記第ｋ双頭プライマーとして、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含むプライマーセットに関する。
　このプライマーセットを用いた核酸増幅反応では、鋳型核酸中に第１標的核酸から第Ｎ標的核酸までが含まれる場合、
　第１標的核酸の増幅断片と、
　第ｋ標的核酸の相補鎖の部分と第（ｋ＋１）標的核酸の部分とが、互いの５’末端の間で連結された増幅断片と、
　第Ｎ標的核酸の相補鎖の増幅断片とを含み、
　第１標的核酸から第Ｎ標的核酸までのそれぞれがその相補鎖とハイブリダイズして二本鎖を形成している核酸増幅産物が生成される。
　この核酸増幅産物は、核酸増幅反応の生成物を分析することにより検出することができる。検出の方法は固相担体上へ固定化して検出する方法だけでなく、他の検出方法であってもよく、例えば,、核酸増幅反応の生成物をゲル電気泳動等の方法で分子量等を指標として検出する方法であってもよい。
　本発明を以下の実験結果に基づき具体的に説明するが本発明はこれらによって限定されるものではない。
［実施例１］
＜１．Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ検出用プライマーセットの設計＞
　実施形態１に係るプライマーセットの一例（標的核酸数Ｎ＝３）として、３つの標的核酸の存在を指標としてＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを検出するためのプライマーセットを設計した。
　サルモネラは生化学的性状、ＤＮＡの相同性等から１属２菌種６亜種に分類されている。また、この分類とは別に、菌体抗原（Ｏ抗原）と鞭毛抗原（Ｈ抗原）の組み合せによる血清型分類が確立しており、現在までに２，５００以上の血清型が報告されている。人や家畜に感染症を引き起こす１，５００以上の血清型が亜種Ｉに分類され、互いに遺伝的類似度が極めて高く、単一遺伝子の塩基配列の違いを利用した血清型判定を困難にしている。
　これに対し、特開２０１１－２３４７３９号公報では、特定の血清型に対して特異的な３つの遺伝子の組み合わせにより、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　Ｉｎｆａｎｔｉｓなどの血清型判別を可能にしている。この方法では、３つの血清型特異的な遺伝子をマルチプレックスＰＣＲで増幅後、ゲル電気泳動で分析し、３つ全ての増幅産物が確認できた場合に陽性と判定する。
　例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを検出するためのプライマーセットとして以下（配列番号１～６）が開示されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本実施例では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　Ｔｙｐｉｍｕｒｉｕｍを検出するための、本発明の実施形態１のプライマーセット（Ｎ＝３）として、配列番号１～６をベースに下記の各プライマーの組み合わせを設計した。
　表２に示すこのプライマーセットは、図３に示すＮ＝３の本発明の実施形態１のプライマーセットの例において、第１標的核酸１１がＴＭＰ１のセンス鎖であり、第２標的核酸２１がＴＭＰ２のセンス鎖であり、第３標的核酸３１がＴＭＰ３のアンチセンス鎖である場合に該当する。
　本プライマーセットのＴＭＰ１Ｆ－Ｍｅｍが図３の末端プライマーＡ１００に相当する。ＴＭＰ１Ｆ－Ｍｅｍでは、ＴＭＰ１ＦのＤＮＡ鎖（配列番号１）がポリヌクレオチド１０１に相当し、表２で下線で示すタグ配列（配列番号９）が、末端プライマーＡ付加部分１０２に相当する。このタグ配列（配列番号９）は、固相担体であるメンブレンに固定された固相側タグ配列（配列番号１１）の相補配列であり、実施形態１のプライマーセットにおける結合部（固定化用タグ）に相当する。ＴＭＰ１Ｆ－Ｍｅｍにおいて、タグ配列（配列番号９）とＴＭＰ１Ｆ（配列番号１）とは５’末端から３’末端へ同一方向に配置されており、表２に示すＸは、ポリメラーゼ反応による伸長を停止するアゾベンゼン修飾核酸を表し、具体的には、上記の式Ｉで表される二価基である。
　本プライマーセットのＴＭＰ１Ｒ－２Ｆが図３の第１双頭プライマー１１０に相当する。ＴＭＰ１Ｒ－２Ｆでは、ＴＭＰ１ＲのＤＮＡ鎖（配列番号２）が第１双頭プライマー第１ポリヌクレオチド１１１に相当し、ＴＭＰ２ＦのＤＮＡ鎖（配列番号３）が第１双頭プライマー第２ポリヌクレオチド１１２に相当する。ＴＭＰ１ＲのＤＮＡ鎖（配列番号２）と、ＴＭＰ２ＦのＤＮＡ鎖（配列番号３）とは、互いに逆方向に配置され、それぞれの５’末端ヌクレオチドの糖の５’位同士がリン酸基を介して結合している５’－５’結合により連結されている。ＴＭＰ１ＲのＤＮＡ鎖（配列番号２）と、ＴＭＰ２ＦのＤＮＡ鎖（配列番号３）は、互いの５’末端側で結合されており、３’末端が解放され、それぞれの３’末端から鋳型の存在下でＤＮＡポリメラーゼ反応により伸長可能である。
　本プライマーセットのＴＭＰ２Ｒ－３Ｒが図３の第２双頭プライマー１２０に相当する。ＴＭＰ２Ｒ－３Ｒでは、ＴＭＰ２ＲのＤＮＡ鎖（配列番号４）が第２双頭プライマー第１ポリヌクレオチド１２１に相当し、ＴＭＰ３ＲのＤＮＡ鎖（配列番号６）が第２双頭プライマー第２ポリヌクレオチド１２２に相当する。ＴＭＰ２ＲのＤＮＡ鎖（配列番号４）と、ＴＭＰ３ＲのＤＮＡ鎖（配列番号６）とは、互いに逆方向に配置され、それぞれの５’末端ヌクレオチドの糖の５’位同士がリン酸基を介して結合している５’－５’結合により連結されている。ＴＭＰ２ＲのＤＮＡ鎖（配列番号４）と、ＴＭＰ３ＲのＤＮＡ鎖（配列番号６）は、互いの５’末端側で結合されており、３’末端が解放され、それぞれの３’末端から鋳型の存在下でＤＮＡポリメラーゼ反応により伸長可能である。
　本プライマーセットのＴＭＰ３Ｆ－Ａｕが図３の末端プライマーＢ１３０に相当する。ＴＭＰ３Ｆ－Ａｕでは、ＴＭＰ３ＦのＤＮＡ鎖（配列番号５）がポリヌクレオチド１３１に相当し、表２で下線で示すタグ配列（配列番号１０）が、末端プライマーＢ付加部分１３２に相当する。このタグ配列（配列番号１０）は、標識物質である金コロイドに固定された標識物質側タグ配列（配列番号１２）の相補配列であり、実施形態１のプライマーセットにおける標識部（標識用タグ）に相当する。ＴＭＰ３Ｆ－Ａｕにおいて、タグ配列（配列番号１０）とＴＭＰ３Ｆ（配列番号５）とは５’末端から３’末端へ同一方向に配置されており、表２に示すＸは、ポリメラーゼ反応による伸長を停止するアゾベンゼン修飾核酸を表し、具体的には、上記の式Ｉで表される二価基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　標識物質として用いるオリゴヌクレオチド結合金コロイドを次の手順で調製した。
　Ｇｏｌｄ　Ｃｏｌｌｏｉｄ（４０ｎｍ，９．０×１０１０（粒子数／ｍｌ）、Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｂｉｏｃｅｌｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）と下記の配列番号１２で表されるチオール基含有オリゴヌクレオチドを混合し、５０℃で１６時間インキュベートした。６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去し、０．０５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加し混和後、再度５０℃で４０時間インキュベートした。
　インキュベート後、遠心（６０００ｒｐｍ、１５分間）を行い、上清を除去し、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加した。このバッファー置換を再度行った。
　調製した金コロイド溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲートパッドとした。
　（チオール基含有オリゴヌクレオチド）：５’－ＴＴＧＧＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＧＴＴＧＴＣ－ＳＨ－３’（配列番号１２）
　配列番号１２で示すチオール基含有オリゴヌクレオチドは、３’末端のシトシンヌクレオチドの３’位のリン酸基と、ＨＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＳＨ（ｍは６）で表される化合物の水酸基とがリン酸エステル結合により結合したものである。
　また、前記固定化用タグ配列（配列番号９）と結合するタグ捕捉手段を固定化した固相担体（メンブレン）を次の手順で作製した。
　タグ捕捉手段として、下記配列番号１１で表されるオリゴヌクレオチドプローブを含む溶液を、メルクミリポア社製ニトロセルロースメンブレン（Ｈｉ－Ｆｌｏｗ１８０）に、ディスペンサーを用いて、展開方向と直交する幅１ｍｍのライン状に塗布した。その後４０℃で３０分間乾燥させることでタグ捕捉手段を備えたメンブレンとした。
　（オリゴヌクレオチドプローブ）：５’－ＣＡＣＴＧＧＧＣＡＴＡＣＧＧＴＡＧＣＡＴ－３’（配列番号１１）
　核酸クロマトグラフィーによる検出のために、以下の手順でラテラルフロー型核酸検出デバイスを作製した。
　作製したラテラルフロー型核酸検出デバイスは、図７の模式図の検出デバイスに準拠して作製した。
　すなわち、基材７５としてポリプロピレン製バッキングシート（Ｌｏｈｍａｎｎ社）、コンジュゲートパッド７２として上記で作製したオリゴヌクレオチド結合金コロイド保持コンジュゲートパッド、部分７６を備えるメンブレン（固相担体）７１として、上記で作製した、タグ捕捉手段としてオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１１）を備えるメンブレン、サンプルパッド７３としてグラスファイバー製のサンプルパッド、吸収パッド７４としてセルロース製の吸収パッドを、それぞれ図７に示すように互いに重なり合わせて貼り合わせ、ラテラルフロー型核酸検出デバイス７００を作製した。
＜２．ＰＣＲによる核酸増幅＞
　プライマーセットとして表２に示すプライマー、鋳型にＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのゲノムＤＮＡを用いて、下記表３に従い、試験区１～６のＰＣＲ反応液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　上記の各試験区のＰＣＲ反応液を、サーマルサイクラー（Ｂｉｏｒ社、ＬｉｆｅＥｃｏ）にセットし、９５℃で２分間反応後、９８℃－１０秒／６０℃－３０秒／７２℃－３０秒のサイクルを３０回行なった。
　ＰＣＲ産物の確認は、ゲル電気泳動および核酸クロマトグラフィーで行なった。
　ゲル電気泳動による解析は、５μｌの反応液を２％アガロースゲルで分離後、エチジウムブロマイドで染色し、バンドを検出することで行なった。
　核酸クロマトによる解析は、５μｌの反応液を、上記の手順で作製した図７に示す構造を有するラテラルフロー型核酸検出デバイス７００のサンプルパッド７３に添加後、６０μｌの展開バッファーをサンプルパッド７３に添加して展開し、５分後に、メンブレン１の部分６でのライン着色を確認した。
＜３．結果＞
　ゲル電気泳動の結果を図８に示す。実施形態１のプライマーセットを全て用いた条件（試験区６）では、標的核酸１～３が連結した増幅産物を確認することができた。試験区６では、標的核酸１～３が連結した増幅産物に加えて、標的核酸１～３のうちの１つの増幅産物及び２つが連結した増幅産物も確認された。試験区１～５では、プライマーの組み合わせに応じた増幅産物が生成したことが確認された。
　試験区１～６の各ＰＣＲ反応液を、ラテラルフロー型核酸検出デバイス７００による核酸クロマトに供した結果を図９に示す。３種の増幅産物が連結した６のみライン着色を示した。
　以上の結果から、標的核酸１～３を全て含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのゲノムＤＮＡを鋳型とし、実施形態１のプライマーセットを用いた試験区６で得られたＰＣＲ反応液では、図３（Ｃ）に示す核酸増幅産物１が得られたことが確認された。
＜４．特異性の確認＞
　ＴＭＰ１Ｆ－Ｍｅｍ、ＴＭＰ１Ｒ－２Ｆ、ＴＭＰ２Ｒ－３Ｒ及びＴＭＰ３Ｆ－Ａｕからなる本発明の実施形態１のプライマーセットを用いたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの判別方法の特異性を評価するため、複数のサルモネラ属菌を用いて検出評価を行なった。鋳型として複数のサルモネラ属菌から抽出したゲノムＤＮＡを使用した以外は、上記試験区６の条件で評価した。
　ラテラルフロー型核酸検出デバイス７００を用いた核酸クロマトグラフィーの結果を図１０に示す。本発明の実施形態１のプライマーセットと核酸クロマトグラフィーを用いた本法は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを鋳型にした場合にのみライン着色を示し、十分な特異性を有していることが示された。
　核酸クロマトグラフィーは、ＰＣＲ反応液と展開バッファーをチップ上に加えるだけで検出可能であり操作が簡便であることに加え、ゲルの準備やエチジウムブロマイドなどの危険な試薬の処理が不要であるなどの利点がある。また。検出時間もゲル電気泳動の約６０分と比較して約５分と検査時間の短縮が可能である。
＜比較例＞
　比較例として、配列番号１～６のプライマーを使用した以外は、上記４と同様の操作を行なった。
　ＰＣＲ反応後にゲル電気泳動を行い、バンドパターンの解析を行なった。
　結果を図１１に示す。鋳型にＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのゲノムＤＮＡを用いた場合のみ、３種類のバンドが検出された特異的な検出が可能であった。
　本発明の実施形態１のプライマーセットと核酸クロマトグラフィーを用いたタンデム増幅産物の検出では、図１０に示すように、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの場合にのみライン着色を示したのに対し、図１１に示すゲル電気泳動による解析では１または２本のバンドが検出されるものがあり、解析が困難になる場合が考えられた。
［実施例２］
　実施形態２に係るプライマーセットを用いて、２つの標的ＤＮＡを含む核酸試料を鋳型としＰＣＲを行い、ＰＣＲ反応液に含まれる増幅産物を核酸クロマトグラフィー及びゲル電気泳動により確認した。
　病原性微生物のＤＮＡに含まれる、塩基数２０８の領域を第１標的領域とし、塩基数１３１の領域を第２標的領域とした。各標的領域の一方のＤＮＡ鎖を標的核酸とした。
　以下、図４に示す符号を参照して説明する。
　末端プライマーＡ２００として、第１標的核酸の５’末端の２４塩基の領域と同一の塩基配列２０１と、塩基配列２０１の５’末端側に、上記の式Ｉで表される二価基を介してその３’末端が結合された標識用タグ配列（配列番号１０）とからなるＤＮＡを用いた。標識用タグ配列（配列番号１０）は、標識物質である金コロイドに固定された標識物質側タグ配列（配列番号１２）の相補配列である。
　第１リバースプライマー２１０として、第１標的核酸の相補鎖の５’末端の２５塩基の領域と同一の塩基配列２１１と、塩基配列２１１の５’末端側に、その３’末端が結合された塩基数２０の塩基配列Ｂ１２１２とを含むＤＮＡを用いた。
　第２フォワードプライマー２２０として、第２標的核酸の５’末端の２０塩基の領域と同一の塩基配列２２１と、塩基配列２２１の５’末端側に、その３’末端が結合された塩基数２０の塩基配列Ｄ２２２２とを含むＤＮＡを用いた。塩基配列Ｂ１２１２と塩基配列Ｄ２２２２とは互いに相補配列である。
　末端プライマーＢ２３０として、第２標的核酸の相補鎖の５’末端の２０塩基の領域と同一の塩基配列２３１と、塩基配列２３１の５’末端側に、上記の式Ｉで表される二価基を介してその３’末端が結合された固定化用タグ配列（配列番号９）とからなるものを用いた。固定化用タグ配列（配列番号９）は、固相担体であるメンブレンに固定された固相側タグ配列（配列番号１１）の相補配列である。
　鋳型ＤＮＡとして、第１標的領域を含むが第２標的領域を含まないＤＮＡを用いた試験区（鋳型１）、第２標的領域を含むが第１標的領域を含まないＤＮＡを用いた試験区（鋳型２）、第１標的領域と第２標的領域を含むＤＮＡを用いた試験区（鋳型１＋２）、鋳型ＤＮＡを含まない試験区（Ｎ）を用意した。
　上記表２に示すＰＣＲ反応液において、プライマー成分として、上記の末端プライマーＡ２００、第１リバースプライマー２１０、第２フォワードプライマー２２０、末端プライマーＢ２３０を用い、鋳型ＤＮＡとして上記の各試験区に応じた鋳型ＤＮＡを用い、最終容量が２０．０μＬとなるよう滅菌蒸留水を用いた以外は、表２と同様のＰＣＲ反応液を調製した。
　各試験区について、末端プライマーＡ２００：第１リバースプライマー２１０：第２フォワードプライマー２２０：末端プライマーＢ２３０のモル比を１：１：１：１としたＰＣＲ反応液と、１：０．１：０．１：１としたＰＣＲ反応液を調製した。
　ＰＣＲ、核酸クロマトグラフィー、ゲル電気泳動は実施例１と同様の条件で行った。
　核酸クロマトグラフィーの結果を図１２上段に、ゲル電気泳動の結果を図１２下段に示す。
　鋳型１＋２試験区において、末端プライマーＡ２００：第１リバースプライマー２１０：第２フォワードプライマー２２０：末端プライマーＢ２３０のモル比を１：０．１：０．１：１としたＰＣＲ反応液を用いた場合、第１標的核酸と第２標的核酸とが連結した増幅産物が十分量生成し、核酸クロマトグラフィーにおいて一つの着色バンドとして検出することができた。
　本発明のプライマーセット方法及びキットは核酸の検出に有用である。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (14)

  1. 　固相担体上での検出が可能な核酸増幅産物を調製するためのプライマーセットであって、
    　第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
    　５’末端側で連結された２つのポリヌクレオチドを含み、前記２つのポリヌクレオチドの一方が、第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含み、前記２つのポリヌクレオチドの他方が、第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含む、第ｋ双頭プライマーと、
    　第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと、
    を含み、
    　Ｎは２以上の整数であり、
    　ｋは１からＮ－１までの整数であり、
    　前記第ｋ双頭プライマーとして、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
    　前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、
    プライマーセット。
  2. 　固相担体上での検出が可能な核酸増幅産物を調製するためのプライマーセットであって、
    　第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
    　第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ａｋを３’末端部に含み、前記塩基配列Ａｋの５’末端側に塩基配列Ｂｋを更に含むポリヌクレオチドを含む、第ｋリバースプライマーと、
    　第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｃｋ＋１を３’末端部に含み、前記塩基配列Ｃｋ＋１の５’末端側に、前記塩基配列Ｂｋとハイブリダイズする塩基配列Ｄｋ＋１を更に含むポリヌクレオチドを含む、第（ｋ＋１）フォワードプライマーと、
    　第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと
    を含み、
    　Ｎは２以上の整数であり、
    　ｋは１からＮ－１までの整数であり、
    　前記第ｋリバースプライマー及び前記第（ｋ＋１）フォワードプライマーとして、それぞれ、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
    　前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、
    プライマーセット。
  3. 　固相担体上での検出が可能な核酸増幅産物を調製するためのプライマーセットであって、
    　第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
    　第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｅｋを３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｅｋを含む前記ポリヌクレオチドの５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない塩基配列Ｆｋを含むポリヌクレオチドとを含む、第ｋリバースプライマーと、
    　第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｇｋ＋１を３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｇｋ＋１を含む前記ポリヌクレオチドの５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない、前記塩基配列Ｆｋとハイブリダイズする塩基配列Ｈｋ＋１を含むポリヌクレオチドとを含む、第（ｋ＋１）フォワードプライマーと、
    　第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと
    を含み、
    　Ｎは２以上の整数であり、
    　ｋは１からＮ－１までの整数であり、
    　前記第ｋリバースプライマー及び前記第（ｋ＋１）フォワードプライマーとして、それぞれ、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
    　前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、
    プライマーセット。
  4. 　固相担体上での検出が可能な核酸増幅産物を調製するためのプライマーセットであって、
    　第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
    　第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｉｋを３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｉｋを含む前記ポリヌクレオチドの５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない塩基配列Ｊｋを含むポリヌクレオチドとを含む、第ｋリバースプライマーと、
    　第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｌｋ＋１を３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｌｋ＋１の５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない塩基配列Ｍｋ＋１を更に含むポリヌクレオチドとを含む、第（ｋ＋１）フォワードプライマーと、
    　前記塩基配列Ｊｋとハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｍｋ＋１とハイブリダイズする塩基配列とを含むポリヌクレオチドとを含む、第ｋ連結用ポリヌクレオチドと、
    　第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと
    を含み、
    　Ｎは２以上の整数であり、
    　ｋは１からＮ－１までの整数であり、
    　前記第ｋリバースプライマー、前記第（ｋ＋１）フォワードプライマー及び前記第ｋ連結用ポリヌクレオチドとして、それぞれ、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
    　前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、
    プライマーセット。
  5. 　前記結合部が、前記固相担体と結合可能なポリヌクレオチドを含むタグである、請求項１～４のいずれか１項に記載のプライマーセット。
  6. 　２以上の標的核酸を検出する方法であって、
    　連結された、２以上の標的核酸と、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部と、固相担体と結合可能なタグである結合部とを含む検出用核酸、を含む可能性のある検出用試料を、前記結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体に接触させ、前記標識部を指標として前記固相担体の前記部分での前記検出用核酸を検出する検出工程
    を含む方法。
  7. 　分析対象試料から取得された核酸を鋳型とし、請求項１～５のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うことを含む検出用試料調製工程を更に含み、　前記検出工程において、前記検出用試料調製工程で得られた核酸増幅反応の生成物を前記検出用試料として用いる、
    請求項６に記載の方法。
  8. 　前記検出用試料調製工程が、含まれる２以上の標的核酸の組み合わせが異なり、且つ、前記固相担体の異なる位置に結合可能な前記結合部を備えた２以上の前記検出用核酸を調製できるよう設計された２セット以上の、請求項１～５のいずれか１項に記載のプライマーセットを用い、分析対象試料から取得された核酸を鋳型として核酸増幅反応を行うことを含み、
    　前記検出工程が、前記検出用試料調製工程で得られた前記検出用試料を前記固相担体に接触させ、前記標識部を指標として前記固相担体において前記２以上の検出用核酸の各々を検出することを含む
    請求項７に記載の方法。
  9. 　分析対象試料中での２以上の標的核酸を検出するためのキットであって、
    　請求項１～５のいずれか１項に記載のプライマーセットと、
    　前記結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体と
    を含むキット。
  10. 　前記固相担体を、前記固相担体と、核酸増幅反応の生成物を受容するための反応系受容部とを備える、核酸検出デバイスとして含む、請求項９に記載のキット。
  11. 　前記標識部が、標識物質と結合可能なタグであり、
    　前記標識部の前記タグと結合可能な標識物質を更に含む、請求項９又は１０に記載のキット。
  12. 　前記標識物質及び前記固相担体を、前記固相担体と、前記標識物質を保持する標識物質保持部と、核酸増幅反応の生成物を受容するための反応系受容部とを備える核酸検出デバイスとして含む、請求項１１に記載のキット。
  13. 　核酸増幅産物を調製するためのプライマーセットであって、
    　第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
    　５’末端側で連結された２つのポリヌクレオチドを含み、前記２つのポリヌクレオチドの一方が、第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含み、前記２つのポリヌクレオチドの他方が、第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含む、第ｋ双頭プライマーと、
    　第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと、
    を含み、
    　Ｎは２以上の整数であり、
    　ｋは１からＮ－１までの整数であり、
    　前記第ｋ双頭プライマーとして、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含む、
    プライマーセット。
  14. 　２以上の標的核酸を検出する方法であって、
    　分析対象試料から取得された核酸を鋳型とし、請求項１３に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行う核酸増幅工程と、
    　前記核酸増幅工程での核酸増幅反応の生成物中の前記核酸増幅産物を検出する検出工程と
    を含む方法。
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