CN109415721B - 用于检测2个以上的目标核酸的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于检测2个以上的目标核酸的经改善的方法。本发明的引物组包含：末端引物A，其包含在3’末端部含有与第1目标核酸序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸；第k双头引物，其包含在5’末端侧连接的2个多核苷酸，所述2个多核苷酸中的一个在3’末端部含有与第k目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列，所述2个多核苷酸中的另一个在3’末端部含有与第(k+1)目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列，和末端引物B，其包含在3’末端含有与第N目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸。

Description

用于检测2个以上的目标核酸的引物组、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及用于将2个以上的目标核酸扩增成连接的1个扩增产物的引物组。
本发明还涉及检测2个以上的目标核酸的方法。
本发明还涉及用于检测2个以上的目标核酸的试剂盒。
背景技术
在分子生物学研究领域、基因检查等临床应用领域、检查食品、环境卫生的领域中，将目标核酸特异性地扩增的方法是非常重要的技术。作为特异性地检测通过核酸扩增法得到的扩增产物的方法之一，有将含有目标核酸的扩增产物固定于固相进行检测的方法。该方法中，通过将目标核酸特异性地捕获到固相上，能够通过洗涤等容易地除去非特异性的核酸序列，提高检测特异性。
此时，作为将目标核酸捕获到固相上的方法，有如下方法：在含有目标核酸的扩增产物的一端导入经单链化的标签区域，将由具有与标签区域互补的序列的多核苷酸构成的探针固定于固相，通过标签区域与探针的杂交，将目标核酸间接地固定于固相。
作为检测固定于固相的目标核酸的方法，专利文献1中公开了使标记物质进一步与目标核酸结合而进行目视检测的技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2016-73312号公报
发明内容
发明所要解决的课题
在将目标核酸特异性地扩增进行检查的技术领域中，根据检查对象的不同，不仅确认单一的目标核酸的扩增，有时还需要确认多个目标核酸的扩增的模式(pattern)的情况。
将把多个目标核酸的扩增产物固定于固相并以标记物质为指标进行分析的情况的一个例子示于图2。例如，当将通过以含有全部目标核酸A、B、C的核酸试样为模板的所谓的多重PCR得到的扩增产物在固相载体上展开进行标记时，如图2A所示，被标记在固相载体上的3个部位。与此相对，核酸试样不含目标核酸B时(图2B1)、不含目标核酸A时(图2B2)、不含目标核酸B和C时(图2B3)分别是不同的标记结果。但是，以这样被标记的区域的位置、数量为指标的分析方法在作为对象的目标核酸为多个的情况下、或多个目标核酸的各个扩增产物难以在固相载体上分离等的情况下，有时判别性会较低。
另外，在通过凝胶电泳将多个目标核酸的扩增产物展开、根据条带的数量、迁移率检测多个目标核酸的情况下，有时判别性也同样会较低。
因此，本发明提供一种用于检测2个以上的目标核酸的经改善的方法。
用于解决课题的手段
本发明作为解决上述课题的手段，公开以下的发明。
(1)一种引物组，其是用于制备能够在固相载体上检测的核酸扩增产物的引物组，其包含：
末端引物A，其包含在3’末端部含有与第1目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸，
第k双头引物，其包含在5’末端侧连接的2个多核苷酸，所述2个多核苷酸中的一个在3’末端部含有与第k目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列，所述2个多核苷酸中的另一个在3’末端部含有与第(k+1)目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列，和
末端引物B，其包含在3’末端部含有与第N目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸；
其中，N为2以上的整数，
k为从1到N-1的整数，
作为所述第k双头引物，包含k为1的情况至k为N-1的情况，
所述末端引物A和所述末端引物B中的一个还包含标记部，所述标记部为标记物质或能够与标记物质结合的标签；另一个还包含结合部，所述结合部为能够与固相载体结合的标签。
(2)一种引物组，其是用于制备能够在固相载体上检测的核酸扩增产物的引物组，其包含：
末端引物A，其包含在3’末端部含有与第1目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸，
第k反向引物，其包含在3’末端部含有与第k目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列Ak、且在所述碱基序列Ak的5’末端侧还含有碱基序列Bk的多核苷酸，
第(k+1)正向引物，其包含在3’末端部含有与第(k+1)目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列Ck+1、且在所述碱基序列Ck+1的5’末端侧还含有与所述碱基序列Bk杂交的碱基序列Dk+1的多核苷酸，和
末端引物B，其包含在3’末端含有与第N目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸；
其中，N为2以上的整数，
k为从1到N-1的整数，
作为所述第k反向引物以及所述第(k+1)正向引物，分别包含从k为1的情况至k为N-1的情况，
所述末端引物A和所述末端引物B中的一个还包含标记部，所述标记部为标记物质或能够与标记物质结合的标签；另一个还包含结合部，所述结合部为能够与固相载体结合的标签。
(3)一种引物组，其是用于制备能够在固相载体上检测的核酸扩增产物的引物组，其包含：
末端引物A，其包含在3’末端部含有与第1目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸，
第k反向引物，其包含在3’末端部含有与第k目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列Ek的多核苷酸、和含有与含有所述碱基序列Ek的所述多核苷酸的5’末端侧连接的在核酸扩增反应中不会被双链化的碱基序列Fk的多核苷酸，
第(k+1)正向引物，其包含在3’末端部含有与第(k+1)目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列Gk+1的多核苷酸、和含有与含有所述碱基序列Gk+1的所述多核苷酸的5’末端侧连接的、在核酸扩增反应中不会被双链化的与所述碱基序列Fk杂交的碱基序列Hk+1的多核苷酸，和
末端引物B，其包含在3’末端含有与第N目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸；
其中，N为2以上的整数，
k为从1到N-1的整数，
作为所述第k反向引物以及所述第(k+1)正向引物，分别包含从k为1的情况至k为N-1的情况，
所述末端引物A和所述末端引物B中的一个还包含标记部，所述标记部为标记物质或能够与标记物质结合的标签；另一个还包含结合部，所述结合部为能够与固相载体结合的标记。
(4)一种引物组，其是用于制备能够在固相载体上检测的核酸扩增产物的引物组，其包含：
末端引物A，其包含在3’末端部含有与第1目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸，
第k反向引物，其包含在3’末端部含有与第k目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列Ik的多核苷酸、和含有与含有所述碱基序列Ik的所述多核苷酸的5’末端侧连接的在核酸扩增反应中不会被双链化的碱基序列Jk的多核苷酸，
第(k+1)正向引物，其包含在3’末端部含有与第(k+1)目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列Lk+1的多核苷酸、和还含有与所述碱基序列Lk+1的5’末端侧连接的在核酸扩增反应中不会被双链化的碱基序列Mk+1的多核苷酸，
第k连接用多核苷酸，其包含含有与所述碱基序列Jk杂交的碱基序列的多核苷酸、和含有与所述碱基序列Mk+1杂交的碱基序列的多核苷酸，和
末端引物B，其包含在3’末端含有与第N目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸；
其中，N为2以上的整数，
k为从1到N-1的整数，
作为所述第k反向引物、所述第(k+1)正向引物以及所述第k连接用多核苷酸，分别包含从k为1的情况至k为N-1的情况，
所述末端引物A和所述末端引物B中的一个还包含标记部，所述标记部为标记物质或能够与标记物质结合的标签；另一个还包含结合部，所述结合部为能够与固相载体结合的标签。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的引物组，其中，所述结合部为含有能够与所述固相载体结合的多核苷酸的标签。
(6)一种检测2个以上的目标核酸的方法，其包含下述检测工序：
使有可能含有检测用核酸的检测用试样与固相载体接触，所述检测用核酸含有连接的2个以上的目标核酸、标记部和结合部，所述标记部为标记物质或能够与标记物质结合的标签，所述结合部为能够与固相载体结合的标签，所述固相载体的至少一部分包含能够与所述结合部结合的部分，以所述标记部为指标，对所述固相载体的所述部分中的所述检测用核酸进行检测。
(7)根据(6)所述的方法，其进一步包含下述检测用试样制备工序：
将从分析对象试样获得的核酸作为模板，使用(1)～(5)中任一项所述的引物组进行核酸扩增反应，其中，
所述检测工序中，将在所述检测用试样制备工序中得到的核酸扩增反应的产物用作所述检测用试样。
(8)根据(7)所述的方法，其中，
所述检测用试样制备工序包含：使用2组以上的(1)～(5)中任一项所述的引物组，将从分析对象试样获得的核酸作为模板进行核酸扩增反应，所述2组以上的所述引物组设计为能够制备2个以上的所述检测用核酸，所述2个以上的所述检测用核酸所含的2个以上的目标核酸的组合不同、且具备能够结合在所述固相载体的不同位置的所述结合部；
所述检测工序包含：使所述检测用试样制备工序中得到的所述检测用试样与所述固相载体接触，将所述标记部作为指标，在所述固相载体中分别检测所述2个以上的检测用核酸中的每一个。
(9)一种试剂盒，其是用于检测分析对象试样中的2个以上的目标核酸的试剂盒，其包含：
(1)～(5)中任一项所述的引物组，和
至少一部分含有能够与所述结合部结合的部分的固相载体。
(10)根据(9)所述的试剂盒，其中，其含有所述固相载体作为核酸检测装置，所述核酸检测装置具备所述固相载体和用于收纳核酸扩增反应的产物的反应体系收纳部。
(11)根据(9)或(10)所述的试剂盒，其中，所述标记部为能够与标记物质结合的标签，
所述试剂盒还包含能够与所述标记部的所述标签结合的标记物质。
(12)根据(11)所述的试剂盒，其中，其包含所述标记物质和所述固相载体作为核酸检测装置，所述核酸检测装置具备所述固相载体、保持所述标记物质的标记物质保持部、和用于收纳核酸扩增反应的产物的反应体系收纳部。
(13)一种引物组，其为用于制备核酸扩增产物的引物组，其包含：
末端引物A，其包含在3’末端部含有与第1目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸，
第k双头引物，其包含在5’末端侧连接的2个多核苷酸，所述2个多核苷酸中的一个在3’末端部含有与第k目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列，所述2个多核苷酸中的另一个在3’末端部含有与第(k+1)目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列，和
末端引物B，其包含在3’末端含有与第N目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸，
其中，N为2以上的整数，
k为从1到N-1的整数，
作为所述第k双头引物，包含从k为1的情况至k为N-1的情况。
(14)一种检测2个以上的目标核酸的方法，其包含下述工序：
核酸扩增工序：以从分析对象试样获得的核酸为模板，使用(13)所述的引物组进行核酸扩增反应，和
检测工序：检测所述核酸扩增工序中的核酸扩增反应的产物中的所述核酸扩增产物。
本说明书包含作为本申请优先权的基础的日本专利申请号2016-132066号的公开内容。
发明效果
通过使用本发明的引物组，可以得到2个以上的目标核酸串联连接而成的扩增产物。这样的扩增产物的检测与分别地检测2个以上的目标核酸相比更容易。
附图说明
图1：通过本发明的方法，对3个目标核酸串联连接而成的扩增产物进行标记、使其结合在固相载体上进行检测时，若在固相载体上检测到标记，则可以判断为阳性(A)，若在固相载体上未检测到标记，则可以判断为阴性(B1、B2、B3)。因此，判别性高。
图2：对将3个目标核酸分别扩增得到的扩增产物进行标记、使其结合在固相载体上进行检测时，若在固相载体上的3个位置检测到标记，则判断为阳性(A)，若在固相载体上未检测到标记，或者在1个或2个位置检测到标记，则判断为阴性(B1、B2、B3)。根据标记的数量和位置的不同，有时会不容易判别。
图3是用于说明本发明的实施方式1的引物组的作用的图(N＝3)。
图4是用于说明本发明的实施方式2的引物组的作用的图(N＝2)。
图5是用于说明本发明的实施方式3的引物组的作用的图(N＝2)。
图6是用于说明本发明的实施方式4的引物组的作用的图(N＝2)。
图7表示横向流动型核酸检测装置700的示意图。71：固相载体，72：结合垫(标记物质保持部)，73：样品垫(反应体系收纳部)，74：吸收垫，75：基材，76：固相载体71的包含标签捕获机构的部分。
图8表示实施例1的扩增产物的凝胶电泳的结果。
图9表示实施例1的扩增产物的核酸色谱法的结果。
图10表示实施例1的扩增产物的核酸色谱法的结果。
图11表示通过分别对3个目标核酸进行扩增的现有方法得到的扩增产物的凝胶电泳的结果。
图12上半部分表示实施例2的扩增产物的核酸色谱法的结果。下半部分表示实施例2的扩增产物的凝胶电泳的结果。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
本发明中，“核酸和多核苷酸”这一用语是指DNA或RNA，典型地是DNA。另外，核酸和多核苷酸这一用语的碱基数没有特别限定，也包含寡核苷酸。本发明中，与作为核酸扩增反应的模板的目标核酸或目标核酸的互补链杂交而伸长的寡核苷酸只要没有特别限定，是指在核酸扩增反应中能够被双链化的寡核苷酸，典型的是天然的核苷酸的聚合物。天然的核苷酸是指天然的腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶的碱基，以及由脱氧核糖、核糖的糖部及磷酸基构成的核苷酸，是各部分未受到人工修饰的核苷酸。天然的核苷酸通常为D型核苷酸。D型核苷酸表示糖部分由D型脱氧核糖或核糖构成的核苷酸。
本发明中，“目标核酸”不仅包含具有待检测和/或待扩增的碱基序列的核酸本身，还包含具有与其互补的碱基序列的核酸。因此，本发明中，“对目标核酸进行检测”或“对目标核酸进行扩增”不仅包含以目标核酸本身为目标进行的检测或扩增，还包含通过目标核酸的检测或扩增来对目标核酸的互补链、目标核酸的双链核酸进行检测或扩增。
本发明中，“目标核酸的碱基序列”或“目标序列”不仅包含待检测和/或待扩增的碱基序列，还包含与其互补的碱基序列。
目标核酸为双链的形态时，“目标核酸的碱基序列”或“目标序列”是指任一条链中所含的碱基序列。另外，有时是指双链的目标核酸中的一条链，并称为“目标核酸”。
本发明中的目标核酸的全长没有特别限定，通常为20个碱基以上、40个碱基以上、或100个碱基以上的长度。目标核酸的全长的上限没有特别限定，通常为1000个碱基以下、500个碱基以下或400个碱基以下的长度。
本发明中成为核酸扩增反应的模板的核酸可以是DNA，也可以是RNA。另外，可以是双链核酸，也可以是单链核酸。为双链核酸时，可以通过改性处理进行单链化。
作为模板的核酸可以是天然的核酸，也可以是人工合成的核酸。例如，可以是从生物试样中提取的天然核酸，也可以是通过PCR等扩增得到的核酸、或通过逆转录反应合成的cDNA等。
本发明中，碱基序列X与碱基序列Y“杂交”是指，含有碱基序列X的多核苷酸(特别是DNA)在严格条件下与含有碱基序列Y的多核苷酸(特别是DNA)杂交、而不与不含碱基序列Y的多核苷酸杂交。即杂交是指特异性杂交。这里，“严格条件”是指形成所谓特异性的杂交体、而不形成非特异性的杂交体的条件，例如可以参照Green and Sambrook,MolecularCloning,4th Ed(2012),Cold Spring Harbor Laboratory Press来适当确定。具体而言，可以根据Southern杂交时的温度、溶液中所含的盐浓度、以及Southern杂交的洗涤工序时的温度或溶液中所含的盐浓度来设定严格条件。更详细而言，作为严格条件，例如，在杂交工序中，钠浓度为25～500mM、优选为25～300mM，温度为40～68℃、优选为40～65℃。更具体而言，杂交可以在1～7×SSC、0.02～3％SDS、温度为40～60℃下进行。另外，可以在杂交后进行洗涤工序，洗涤工序例如可以在0.1～2×SSC、0.1～0.3％SDS、温度为50～65℃下进行。但是，后述的标记用标签与附加有多核苷酸的标记物质的杂交、以及后述的固定化用标签与附加有多核苷酸的固相载体的杂交不需要在这里举出的严格条件下进行，可以在后述的条件下进行。
碱基序列X与碱基序列Y杂交时，含有碱基序列X的多核苷酸(特别是DNA)和含有碱基序列Y的多核苷酸(特别是DNA)只要是能够形成在核酸扩增反应的退火条件下杂交而形成稳定的双链所需的足够的氢键的组合即可，无需是相互完全互补的碱基序列。例如，含有碱基序列X的多核苷酸和含有碱基序列Y的多核苷酸可以是在10个核苷酸中存在1个错配、在20个核苷酸中存在1错配、或在30个核苷酸中存在1个错配等的几个错配。
碱基序列X与碱基序列Y杂交时，通常满足以下的(A)～(C)中的1个以上的关系。
(A)碱基序列X的互补序列与碱基序列Y相同。其中，当碱基序列X的互补序列和碱基序列Y中的一个为DNA的碱基序列、另一个为RNA的碱基序列时，将一个中的胸腺嘧啶与另一个中的尿嘧啶视为相同的碱基。
(B)碱基序列Y是在碱基序列X的互补序列中有1个或多个碱基缺失、替换、附加和/或插入的碱基序列。
(C)碱基序列Y是与碱基序列X的互补序列具有70％以上的同源性的碱基序列。
上述(B)中，“1个或多个”优选为1～5个、更优选为1～4个、更优选为1～3个、特别优选为1个或2个、最优选为1个。
上述(C)中，同源性的值表示使用运算多个碱基序列间的同源性的软件(例如FASTA、DANASYS、以及BLAST)通过缺省的设定计算出的值。算出将按照一致度达到最大的方式将一对碱基序列对准时一致的碱基的数量，然后算出该一致的碱基的数量与比较的碱基序列的全部碱基数的比例，作为碱基序列的同源性的值。这里，在存在间隙的情况下，上述的总碱基数为将1个间隙计数为1个碱基的碱基数。关于同源性的确定方法的详细内容，例如参照Altschul et al,Nuc.Acids.Res.25,3389-3402,1977以及Altschul et al,J.Mol.Biol.215,403-410,1990。
在上述(C)中，同源性更优选为80％以上、更优选为90％以上、更优选为95％以上、更优选为96％以上、更优选为97％以上、更优选为98％以上、更优选为99％以上的同源性。
本发明中，构成引物组的多核苷酸、以及含有多核苷酸的引物类和连接用多核苷酸的制造方法没有特别限定，可以利用多核苷酸合成装置进行制造，也可以利用委托合成服务来制造。
本发明中，某一碱基序列或多核苷酸的“3’末端部”是指包含该碱基序列或多核苷酸的3’末端的碱基的由连续的多个碱基构成的部分碱基序列、或包含该部分碱基序列的多核苷酸的区域。
<1.本发明的引物组>
本发明的引物组是如下的引物组：当分析对象试样含有规定的2个以上的目标核酸时，能够通过以从分析对象试样获得的核酸为模板的核酸扩增反应，生成以连接的形态含有所述规定的2个以上的目标核酸、标记部和结合部的检测用核酸，所述标记部为标记物质或能够与标记物质结合的标签，所述结合部为能够与固相载体结合的标签。
作为用于实现这样的功能的引物组，本说明书中公开了4个实施方式。
在以下的说明中，将2个以上的目标核酸记为从第1目标核酸至第N目标核酸的N个目标核酸。这里，N为2以上的整数。N的上限没有特别限定，可以是3、4、5、6、7、8、9、10或更大的数。
构成各引物组的各成分中所含的多核苷酸的碱基序列可以设计成不阻碍基于其他成分中所含的多核苷酸的目标核酸扩增反应。
(1.1.引物组的实施方式1)
本发明的引物组的实施方式1涉及一种引物组，其包含：
末端引物A，其包含在3’末端部含有与第1目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸，
第k双头引物，其包含在5’末端侧连接的2个多核苷酸，所述2个多核苷酸中的一个在3’末端部含有与第k目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列，所述2个多核苷酸中的另一个在3’末端部含有与第(k+1)目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列，和
末端引物B，其包含在3’末端部含有与第N目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸；
其中，N为2以上的整数，
k为从1到N-1的整数，
作为所述第k双头引物，包含k为1的情况至k为N-1的情况，
所述末端引物A和所述末端引物B中的一个还包含标记部，所述标记部为标记物质或能够与标记物质结合的标签；另一个还包含结合部，所述结合部为能够与固相载体结合的标签。
末端引物A中，“与第1目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列”的长度没有特别限定，例如可以为8个碱基以上、12个碱基以上或15个碱基以上，可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。末端引物A中所含的多核苷酸(末端引物A含有作为后述的标记部或结合部的多核苷酸时，为除标记部或结合部以外的多核苷酸)只要在其3’末端部含有与第1目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列即可，在其5’末端侧还可以附加其他碱基序列。末端引物A中所含的多核苷酸的全长没有特别限定，例如可以为8个碱基以上、12个碱基以上或15个碱基以上，可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。
第k双头引物中，“在5’末端侧连接的2个多核苷酸”是指2个多核苷酸的各多核苷酸的3’末端为开放的形态而在各自的5’末端侧连接。2个多核苷酸在各自的5’末端彼此连接时，连接5’末端彼此的结构没有特别限定，可以由适当的二价基团构成。作为最简单的结构，可以举出2个多核苷酸各自的5’末端核苷酸的糖的5’位彼此通过磷酸基键合的5’-5’键，但并不限定于此。二价基团可以是长链的结构。
第k双头引物中，作为将2个多核苷酸的5’末端彼此连接的其他结构，可以例示以下的脂肪链的间隔物。
作为脂肪链的间隔物，例如可以举出以下的式(II)所示的间隔物。
5’-O-CmH2m-O-5’ 式(II)
(式中，5’表示各多核苷酸的5’末端的磷酸二酯键的氧原子，m表示1～40的整数。H可以被取代基取代。)
式(II)中，m优选为2～36、更优选为3～16。式(II)中的H可以被取代基取代，作为取代基，典型地可以举出烷基、烷氧基、羟基等。作为取代基的烷基和烷氧基的碳原子数优选为1～8、更优选为1～4。另外，具有2个以上的取代基时，取代基可以相同也可以不同。此外，也优选不具有取代基。
另外，作为其他间隔物，可以举出以下的式(III)所示的间隔物。
5’-(OCnH2n)L-O-5’ 式(III)
(式中，5’表示各多核苷酸的5’末端的磷酸二酯键的氧原子，n表示2～4的整数，L为1以上的整数，表示(n+1)×L达到40以下的整数。H可以被取代基取代。)
式(III)中，(n+1)×L优选为2～36、更优选为3～16。式(III)中的H的取代基适用与式(II)中的取代基同样的方式。
作为其他的脂肪链的间隔物，例如可以举出以下的二价基团。
[化学式编号1]
Figure BDA0001929916700000131
Figure BDA0001929916700000141
在通过这些二价基团将2个多核苷酸分子在5’末端彼此连接的情况下，各二价基团的一端的磷酸基是指一个多核苷酸分子的5’末端的核苷酸的磷酸基，另一端的氧原子与另一个多核苷酸分子的5’末端的核苷酸的磷酸基形成磷酸酯键。
第k双头引物中所含的2个多核苷酸的全长没有特别限定，例如可以分别为8个碱基以上、12个碱基以上或15个碱基以上，可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。
第k双头引物中所含的2个多核苷酸中的一个在3’末端含有与第k目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列。这里，“与第k目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列”的长度没有特别限定，例如可以为8个碱基以上、12个碱基以上或15个碱基以上，可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。在3’末端含有“与第k目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列”的碱基序列只要在其3’末端部含有该碱基序列即可，在其5’末端侧还可以附加其他碱基序列。
第k双头引物中所含的2个多核苷酸中的另一个在3’末端含有与第(k+1)目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列。这里，“与第(k+1)目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列”的长度没有特别限定，例如可以为8个碱基以上、12个碱基以上或15个碱基以上，可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。在3’末端含有“与第(k+1)目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列”的多核苷酸只要在其3’末端部含有该碱基序列即可，在其5’末端侧还可以附加其他碱基序列。
末端引物B中，“与第N目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列”的长度没有特别限定，例如可以为8个碱基以上、12个碱基以上或15个碱基以上，可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。末端引物B中所含的多核苷酸(末端引物A含有作为后述的标记部或结合部的多核苷酸时，为除标记部或结合部以外的多核苷酸)只要在其3’末端部含有与第N目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列即可，也可以在其5’末端侧进一步附加其他的碱基序列。末端引物B中所含的多核苷酸的全长没有特别限定，例如可以为8个碱基以上、12个碱基以上或15个碱基以上，可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。
除了上述多核苷酸以外，末端引物A和末端引物B中的一个还包含所述标记部，另一个还包括所述结合部。
末端引物A和末端引物B分别具有所述标记部和所述结合部中的一个，所述标记部和所述结合部中的一个根据需要通过后述适当的间隔物与所述多核苷酸化学连接。末端引物A和末端引物B中，所述标记部和所述结合部中的一个与所述多核苷酸连接的位置只要是不阻碍所述多核苷酸与目标核酸或与和目标核酸互补的核酸的退火和通过聚合酶反应的伸长的位置则没有特别限定，优选为所述多核苷酸的5’末端。
以下，对本发明中使用的标记部和结合部进行详细说明。
标记部是能够与标记物质结合的标签或标记物质中的任意一种，优选是能够与标记物质结合的标签。本说明书中，有时将能够与标记物质结合的标签称为标记用标签。标记部为标记用标签时，通过使核酸扩增反应的扩增产物与标记物质接触，能够将扩增产物的一端所含的标签标记。当标记部为标记物质时，作为核酸扩增反应的扩增产物，能够得到一端含有标记物质的扩增产物。
标记物质只要是能够检测扩增产物的物质即可，没有特别限定，优选是能够进行扩增产物的目视检测的物质。作为这样的标记物质，可以举出着色粒子、色素、酶(过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶等)等，优选为着色粒子。作为“着色粒子”，可以举出金属(例如金、银、铜、铂等)粒子、金属棒(metal rod)、经着色的胶乳粒子、包含色素的二氧化硅纳米粒子等，但并不限定于这些。标记物质的大小只要不妨碍将扩增产物捕获到后述的固相载体上即可。标记物质优选为检测时显色良好的物质，可以按照成为比后述的固相载体或核酸检测装置的各种多孔质部件的孔径小的尺寸的方式进行适当选择。例如，标记物质的大小为约500nm以下、优选为约0.1nm～250nm、更优选为约1nm～100nm的粒径。作为色素，也可以使用荧光色素(荧光素、花青等)等，此时，优选照射各荧光色素的激发波长光来进行检测。
能够用作标记部的标记用标签能够与标记物质结合，并且只要不会因核酸扩增反应中的伸长而被双链化即可，可以根据标记物质的结构适当选择，没有特别限定，例如可以使用多核苷酸(DNA、RNA等)、蛋白、肽或其他化合物(例如生物素、异硫氰酸荧光素(FITC)、地高辛(DIG)等低分子化合物)，或者由它们的组合构成的物质。
作为标记用标签的一个优选方式，包含多核苷酸，或由多核苷酸构成。作为标记用标签中可含有的该多核苷酸，只要是不会成为由本发明的引物组引起的核酸扩增反应的实质性障碍的多核苷酸，就没有特别限定，可以例示出碱基数为例如5～50、优选为10～35的多核苷酸，例如优选含有Anal.Biochem.364(2007)78-85中记载的碱基序列的多核苷酸。作为标记用标签的另一个优选方式，是由生物素、FITC、DIG等低分子化合物构成的多核苷酸。
当标记部是上述标记用标签时，标记物质与标记用标签的结合可以是直接结合，也可以是间接结合，结合方法可以根据所利用的标记物质和标记用标签的组合适当选择适当的方法。例如，当标记用标签含有多核苷酸时，通过使标记物质与能够与该多核苷酸杂交的多核苷酸(例如含有与该多核苷酸的碱基序列互补的序列的多核苷酸)结合，使两者的多核苷酸杂交，可以间接地将标记物质和标记用标签结合。标记物质与多核苷酸的结合可以通过肽、蛋白、核酸等进行，也可以通过适当的官能团进行。杂交的条件只要是产生杂交的条件就没有特别限定，例如可以通过使其在20～40℃、在含有10mM～50mM的磷酸的缓冲液(pH为6～7)中反应来进行。为了提高杂交效率，缓冲液中还可以含有氯化钠等盐。
另外，当标记用标签为低分子化合物时，可以利用与其特异性结合的蛋白(例如与生物素结合的亲和素、与FITC结合的蛋白)、抗体(例如抗DIG抗体)、与适体等结合性物质连接的标记物质进行标记。此时，标记用标签和结合性物质可以使用各种中性附近的缓冲液结合。
标记部(标记用标签或标记物质)与末端引物A或B中所含的多核苷酸可以通过任意方法结合，可以直接或间接地结合。其中，当标记部中的至少与所述多核苷酸连接的部分由多核苷酸构成时，该部分为不会因核酸扩增反应中的伸长而被双链化的结构。
作为不会因核酸扩增反应而被双链化的标记部中所含的多核苷酸，当使用可成为通过DNA聚合酶进行的反应的模板的多核苷酸(通常为由天然的核苷酸构成的多核苷酸)时，标记部中所含的多核苷酸、和末端引物A或B中作为引物发挥功能的多核苷酸介由阻碍聚合酶反应的间隔物，上述多核苷酸与标记部结合。作为这样的“间隔物”，只要是能够抑制或停止DNA聚合酶等核酸扩增反应中的聚合酶反应的进行、防止标记部双链化的物质即可，例如可列举出具有牢固的发夹结构或假结结构的核酸序列、L型核酸、肽核酸(PNA)、交联化核酸(桥核酸(Bridged Nucleic Acid，BNA)或锁核酸(Locked Nucleic Acid，LNA))、荧光素、Cy3、Cy5、含有下述式I所示的偶氮苯结构的二价基团、脂肪链(亚烷基链或聚氧亚烷基链)、含有5’-5’键、3’-3’键那样的反向序列结构的二价基团等，但并不限定于这些。在通过上述间隔物连接的情况下，标记部中所含的多核苷酸和在末端引物A或B中作为引物发挥功能的多核苷酸可以在同一方向上连接。即，可以将标记部中所含的多核苷酸3’末端侧与在末端引物A或B中作为引物发挥功能的多核苷酸的5’末端侧通过上述间隔物连接。
[化学式编号2]
Figure BDA0001929916700000171
当通过式I所示的二价基团连接2个多核苷酸分子时，该二价基团中的一个的3’端的磷酸基是指一个多核苷酸分子的5’末端的核苷酸的磷酸基，另一个的5’端的氧原子与另一个多核苷酸分子的3’末端的核苷酸的磷酸基形成磷酸酯键。
作为脂肪链的间隔物，例如可以举出以下的式(IV)所示的间隔物。
5’-O-CmH2m-O-3’ 式(IV)
(式中，5’表示5’侧的磷酸二酯键的氧原子，3’表示3’侧的磷酸二酯键的氧原子，m表示1～40的整数。H可以被取代基取代。)
式(IV)中，m优选为2～36、更优选为3～16。式(IV)中的H可以被取代基取代，作为取代基，典型地可以举出烷基、烷氧基、羟基等。作为取代基的烷基和烷氧基的碳原子数优选为1～8、更优选为1～4。另外，当具有2个以上的取代基时，取代基可以相同也可以不同。此外，也优选不具有取代基。
另外，作为其他间隔物，可以举出以下的式(V)所示的间隔物。
5’-(OCnH2n)L-O-3’ 式(V)
(式中，5’表示5’侧的磷酸二酯键的氧原子，3’表示3’侧的磷酸二酯键的氧原子，n表示2～4的整数，L为1以上的整数，表示(n+1)×L达到40以下的整数。H可以被取代基取代。)
式(V)中，(n+1)×L优选为2～36、更优选为3～16。式(V)中的H的取代基适用与式(IV)中的取代基同样的方式。
另外，2个多核苷酸分子5’-5’键合时，可以使用上述式(II)或式(III)所示的脂肪链的间隔物。
作为其他的脂肪链的间隔物，例如可以举出以下的二价基团。
[化学式编号3]
Figure BDA0001929916700000181
Figure BDA0001929916700000191
当通过这些二价基团连接2个多核苷酸分子时，各二价基团中的一个端部的磷酸基是指一个多核苷酸分子的3’末端或5’末端的核苷酸的磷酸基，另一个的端部的氧原子与另一个多核苷酸分子的5’末端或3’末端的核苷酸的磷酸基形成磷酸酯键。
另一方面，作为标记部中所含的多核苷酸，当使用如LNA(锁核酸)、L型核酸、2’-O-甲基化核苷酸等含有修饰核酸的多核苷酸那样、不成为通过DNA聚合酶进行的反应的模板、不会因核酸扩增反应中的伸长而被双链化的多核苷酸时，也可以省略上述阻碍聚合酶反应的间隔物。
接着，对本发明中使用的结合部进行说明。
结合部是能够与后述的固相载体结合的标签。本说明书中，有时将可与固相载体结合的标签称为固定化用标签。
可用作结合部的固定化用标签只要能够与固相载体结合、可根据固相载体的结构适当选择就没有特别限定，例如可以利用多核苷酸(DNA、RNA等)、蛋白、肽或其他化合物(例如上述的低分子化合物)或由它们的组合构成的物质。固定化用标签优选含有多核苷酸，或由多核苷酸构成。固定化用标签中可含有的该多核苷酸只要是不会成为通过本发明的引物组进行的核酸扩增反应的实质性障碍的多核苷酸，就没有特别限定，可例示出碱基数例如为5～50、优选为10～35的多核苷酸、例如优选含有Anal.Biochem.364(2007)78-85中记载的碱基序列的多核苷酸。
当使用作为固定化用标签的多核苷酸时，可以通过改变碱基序列来容易地变更配置在固相载体侧的、与包含和该多核苷酸杂交的碱基序列的多核苷酸的组合，容易控制结合特异性，因此优选。例如，当在一个固相载体上使多个核酸扩增产物结合、分别进行识别时，对于每个核酸扩增产物，需要固定化用标签与固相载体侧的多核苷酸不同的组合。由于多核苷酸的碱基序列容易变更，多核苷酸间的杂交具有高的结合特异性，因此通过使用作为固定化用标签的多核苷酸，容易对每个核酸扩增产物设计固定化用标签与固相载体侧的多核苷酸不同的组合。
对固相载体没有特别限定，可以利用由树脂、金属、多糖类、矿物等构成的物质，可以制成膜(membrane)、薄膜(film)、无纺布、板、凝胶等形状。优选固相载体具有多孔结构，使得溶液中的扩增产物、标记物质能够展开。作为本发明中可利用的固相载体，例如可以举出滤纸、硝酸纤维素膜、聚醚砜膜、尼龙膜、干燥后的各种凝胶(二氧化硅凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、明胶凝胶)、有机硅、玻璃、塑料等。对于固相载体的大小和形态，可以适当选择适合各种操作、检测者。
固相载体只要构成为至少一部分部分能够与固定化用标签结合即可，更优选构成为仅一部分部分能够与固定化用标签结合。通过按照仅固相载体的特定部分能够与固定化用标签结合的方式构成，被固相载体捕获的扩增产物只限于上述部分被检测出，因此能够容易地进行阳性或阴性的判别。
固相载体与固定化用标签的结合可以是直接结合，也可以是间接结合，结合方法可以根据所利用的固相载体与固定化用标签的组合来适当选择合适的方法。例如，当固定化用标签含有多核苷酸时，将能够与该多核苷酸杂交的多核苷酸(例如含有与该多核苷酸的碱基序列互补的序列的多核苷酸)固定化在固相载体上，作为标签捕获机构，通过使两者的多核苷酸杂交，可以将固相载体与固定化用标签间接结合。多核苷酸在固相载体上的固定化可以通过肽、蛋白、核酸等进行，也可以通过适当的官能团进行。杂交的条件可以通过与标记用标签与标记物质的结合相关的上述条件进行。当将多核苷酸固定化于固相载体时，通过局限于特定部分进行固定化，所捕获的扩增产物仅限于规定的部分被检测出，因此能够容易地进行阳性或阴性的判别。
结合部(固定化用标签)和末端引物A或B中所含的作为引物发挥功能的多核苷酸可以通过任意方法结合，可以直接或间接地结合。但是，当固定化用标签中至少与上述多核苷酸连接的部分由能够成为通过DNA聚合酶进行的反应的模板的多核苷酸构成时，通过核酸扩增反应中的伸长，该部分按照不会与作为引物发挥功能的上述多核苷酸一起被双链化的方式，通过阻碍聚合酶反应的“间隔物”，上述多核苷酸与固定化用标签结合。在含有可成为通过DNA聚合酶进行的反应的模板的多核苷酸的结合部与末端引物A或B中所含的多核苷酸之间设置的间隔物的具体例与在有关含有多核苷酸的标记部与多核苷酸之间设置的间隔物中所述的相同。另一方面，作为固定化用标签中所含的多核苷酸，当使用如LNA(锁核酸)、L型核酸、2’-O-甲基化核苷酸等含有修饰核酸的多核苷酸那样、不成为通过DNA聚合酶进行的反应的模板、不会因核酸扩增反应中的伸长而被双链化的多核苷酸时，也可以省略上述阻碍聚合酶反应的间隔物。
以将第1目标核酸11、第2目标核酸21、第3目标核酸31这3个作为目标核酸的情况(即N＝3)为例，参照图3对实施方式1的引物组的作用进行说明。
图3所示的例子中，第1目标核酸11与作为其互补链的第1目标核酸互补链12一起形成双链形态的第1目标核酸(双链第1目标核酸)10。也可以将第1目标核酸11和第1目标核酸互补链12中的任一个作为扩增和检测的目标。
同样地，第2目标核酸21与作为其互补链的第2目标核酸互补链22一起形成双链第2目标核酸20。
同样地，第3目标核酸31与作为其互补链的第3目标核酸互补链32一起形成双链第3目标核酸30。
末端引物A100包含在3’末端部含有与第1目标序列11(指第1目标核酸11的碱基序列)的互补序列12(指第1目标核酸互补链12的碱基序列)的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸101。末端引物A100在多核苷酸101之外还具备末端引物A附加部分102。末端引物A附加部分102是上述标记部或结合部中的任一个。
图3的例子中，由于N＝3，因此作为第k双头引物，包含第1双头引物110和第2双头引物120。
第1双头引物110包含第1双头引物第1多核苷酸111和第1双核引物第2多核苷酸112，所述第1双头引物第1多核苷酸111为在彼此的5’末端侧连接的2个多核苷酸。第1双头引物第1多核苷酸111在3’末端部含有与第1目标核酸11的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列。第1双头引物第2多核苷酸112在3’末端部含有与第2目标核酸21的互补链22的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列。
第2双头引物120包含第2双头引物第1多核苷酸121和第2双头引物第2多核苷酸122，所述第2双头引物第1多核苷酸121为在彼此的5’末端侧连接的2个多核苷酸。第2双头引物第1多核苷酸121在3’末端部含有与第2目标核酸21的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列。第2双头引物第2多核苷酸122在3’末端部含有与第3目标核酸31的互补链32的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列。
末端引物B130包含在3’末端部含有与第3目标核酸31的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸131。末端引物B130除了多核苷酸131之外，还具备末端引物B附加部分132。末端引物B附加部分132是所述标记部或结合部中的任一个。
如图3(B)所示，以所述核酸为模板在含有末端引物A100、第1双头引物110、第2双头引物120和末端引物B130的第1实施方式的引物的存在下进行核酸扩增反应时，末端引物A100的多核苷酸101经过改性和退火，与第1目标核酸互补链12的3’末端杂交，通过利用聚合酶的伸长反应，合成在5’末端连接有末端引物A附加部分102的第1目标核酸11的扩增片段301。另外，第1双头引物第1多核苷酸111经过改性和退火，与第1目标核酸11的3’末端杂交，通过利用聚合酶的伸长反应，合成第1目标核酸互补链12的扩增片段。该第1目标核酸互补链12的扩增片段在其5’末端连接有后述的第1双头引物第2多核苷酸112伸长而合成的第2目标核酸21的扩增片段的5’末端，成为一体而构成1个扩增片段302。
同样地，如图3(B)所示，第1双头引物第2多核苷酸112经过改性和退火，与第2目标核酸互补链22的3’末端杂交，通过利用聚合酶的伸长反应，合成第2目标核酸21的扩增片段，该扩增片段构成上述的扩增片段302的一部分。另外，第2双头引物第1多核苷酸121经过改性和退火，与第2目标核酸21的3’末端杂交，通过利用聚合酶的伸长反应，合成第2目标核酸互补链22的扩增片段。该第2目标核酸互补链22的扩增片段在其5’末端连接有后述的第2双头引物第2多核苷酸122伸长而合成的第3目标核酸31的扩增片段的5’末端，成为一体而构成1个扩增片段303。
同样地，如图3(B)所示，第2双头引物第2多核苷酸122经过改性和退火，与第3目标核酸互补链32的3’末端杂交，通过利用聚合酶的伸长反应，合成第3目标核酸31的扩增片段，该扩增片段构成上述的扩增片段303的一部分。另外，末端引物B130的多核苷酸131经过改性和退火，与第3目标核酸31的3’末端杂交，通过利用聚合酶的伸长反应，合成在5’末端连接有末端引物B附加部分132的第3目标核酸互补链32的扩增片段304。
当进一步进行改性和退火时，作为扩增产物，如图3(C)所示，得到含有第1目标核酸11的双链第1目标核酸10、含有第2目标核酸21的双链第2目标核酸20和含有第3目标核酸31的双链第3目标核酸30串联连接、第1目标核酸11的5’末端侧连接有末端引物A附加部分102、第3目标核酸互补链32的5’末端侧连接有末端引物B附加部分132的核酸扩增产物1。核酸扩增产物1可以通过末端引物A附加部分102和末端引物B附加部分132中的一个所含的所述结合部固定在固相载体上，可以将另一方所含的所述标记部作为指标进行检测。
核酸扩增产物1仅在第1目标核酸11(或第1目标核酸互补链12)、第2目标核酸21(或第2目标核酸互补链22)、第3目标核酸31(或第3目标核酸互补链32)3个一起存在于模板中时被扩增。当模板中不存在这些中的1个或2个时，虽然存在的目标核酸或其互补链被扩增，但显然不生成同时具有所述结合部和所述标记部的核酸扩增产物，在以所述标记部为指标的检测中为阴性，因此假阳性判定的风险极低。
上述说明并不限于N＝3的情况，在N为2以上的全部情况下也是适用的。
如上所述，通过使用了本发明实施方式1的引物组的核酸扩增反应，生成下述核酸扩增产物，其含有：
第1目标核酸的扩增片段，
第k目标核酸的互补链的部分和第(k+1)目标核酸的部分在彼此的5’末端之间连接的扩增片段，和
第N目标核酸的互补链的扩增片段；
从第1目标核酸至第N目标核酸的各目标核酸与其互补链杂交而形成双链，
第1目标核酸的扩增片段和第N目标核酸的互补链的扩增片段中的任一个在5’末端连接有上述标记部，
第1目标核酸的扩增片段和第N目标核酸的互补链的扩增片段中的另一个在5’末端连接有上述结合部。
这里，N为2以上的整数，k为1至N-1的整数。在该核酸扩增产物中，含有第k目标核酸的双链核酸与含有第(k+1)目标核酸的双链核酸的上述连接的结构与第k双头引物中的2个多核苷酸间的连接的结构相同。
(1.2.引物组的实施方式2)
本发明的引物组的实施方式2涉及一种引物组，其包含：
末端引物A，其包含在3’末端部含有与第1目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸，
第k反向引物，其包含在3’末端部含有与第k目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列Ak、且在所述碱基序列Ak的5’末端侧还含有碱基序列Bk的多核苷酸，
第(k+1)正向引物，其包含在3’末端部含有与第(k+1)目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列Ck+1、且在所述碱基序列Ck+1的5’末端侧还含有与所述碱基序列Bk杂交的碱基序列Dk+1的多核苷酸，和
末端引物B，其包含在3’末端含有与第N目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸，
其中，N为2以上的整数，
k为从1到N-1的整数，
作为所述第k反向引物以及所述第(k+1)正向引物，分别包含从k为1的情况至k为N-1的情况，
所述末端引物A和所述末端引物B中的一个还包含所述标记部，另一个还包含所述结合部。
实施方式2的引物组中，末端引物A和末端引物B、所述标记部和所述结合部以及将它们连接的结构与实施方式1相同，因此省略说明。
第k反向引物中，碱基序列Ak和碱基序列Bk各自的长度没有特别限定，例如可以为8个碱基以上、12个碱基以上或15个碱基以上，可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。含有碱基序列Ak和碱基序列Bk的多核苷酸只要在其3’末端部含有碱基序列Ak、在比碱基序列Ak的5’末端碱基更靠5’末端的一侧含有碱基序列Bk即可，碱基序列Ak与碱基序列Bk之间、以及在比碱基序列Bk更靠5’末端的一侧可以分别附加其他碱基序列。第k反向引物中所含的多核苷酸的全长没有特别限定，例如可以为80个碱基以下、60个碱基以下、或50个碱基以下。
构成第k反向引物的多核苷酸按照成为同一方向的方式含有碱基序列Ak和碱基序列Bk(存在时，和上述的其他碱基序列一起)，5’末端至3’末端的整体可以与含有互补碱基序列的多核苷酸杂交，不包含阻碍聚合酶反应的构成。因此，构成第k反向引物的多核苷酸其整体可以通过核酸扩增反应中的伸长而被双链化。
第(k+1)正向引物中，碱基序列Ck+1和碱基序列Dk+1各自的长度没有特别限定，例如可以为8个碱基以上、12个碱基以上或15个碱基以上，可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。含有碱基序列Ck+1和碱基序列Dk+1的多核苷酸只要在其3’末端部含有碱基序列Ck+1、在比碱基序列Ck+1的5’末端碱基更靠5’末端的一侧含有碱基序列Dk+1即可，可以在碱基序列Ck+1与碱基序列Dk+1之间以及比碱基序列Ck+1更靠5’末端的一侧分别附加其他碱基序列。第(k+1)正向引物中所含的多核苷酸的全长没有特别限定，例如可以为80个碱基以下、60个碱基以下、或50个碱基以下。
构成第(k+1)正向引物的多核苷酸按照成为同一方向的方式含有碱基序列Ck+1和碱基序列Dk+1(存在时，和上述的其他碱基序列一起)，从5’末端至3’末端的整体可以与含有互补碱基序列的多核苷酸杂交，不包含阻碍聚合酶反应的构成。因此，构成第(k+1)正向引物的多核苷酸的整体可以通过核酸扩增反应中的伸长而被双链化。
第k反向引物的碱基序列Bk和第(k+1)正向引物的碱基序列Dk+1被设计成能够杂交。
以第1目标核酸11、第2目标核酸21这2个为目标核酸的情况(即N＝2)为例，参照图4对实施方式2的引物组的作用进行说明。
末端引物A200包含在3’末端部含有与第1目标核酸11的互补链12的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸201。末端引物A200在多核苷酸201之外，还具备末端引物A附加部分202。末端引物A附加部分202是上述标记部或结合部中的任一个。
图4的例子中，由于N＝2，因此作为第k反向引物，包含第1反向引物210，作为第(k+1)正向引物，包含第2正向引物220。
第1反向引物210包含在3’末端部含有与第1目标核酸11的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列A1211(指第1反向引物210中所含的多核苷酸中含有碱基序列A1的部分多核苷酸211)、在碱基序列A1211的5’末端侧还含有碱基序列B1212(指第1反向引物210中所含的多核苷酸中含有碱基序列B1的部分多核苷酸212)的多核苷酸。
第2正向引物220包含在3’末端部含有与第2目标核酸21的互补链22的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列C2221(第2正向引物220中所含的多核苷酸中含有碱基序列C2的部分多核苷酸221)、在所述碱基序列C2221的5’末端侧还含有与碱基序列B1211杂交的碱基序列D2222(指第2正向引物220中所含的多核苷酸中含有碱基序列D2的部分多核苷酸222)的多核苷酸。
末端引物B230包含在3’末端部含有与第2目标核酸21的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸231。末端引物B230除了多核苷酸231之外，还具备末端引物B附加部分232。末端引物B附加部分232是所述标记部或结合部中的任一个。
如图4(A)所示，以所述核酸为模板，在含有末端引物A200、第1反向引物210、第2正向引物220和末端引物B230的第2实施方式的引物的存在下进行核酸扩增反应时，末端引物A200的多核苷酸201经过改性和退火，与第1目标核酸互补链12的3’末端杂交，通过利用聚合酶的伸长反应，合成在5’末端连接有末端引物A附加部分202的第1目标核酸11的扩增片段401。另外，第1反向引物210经过改性和退火，与第1目标核酸11的3’末端杂交，通过利用聚合酶的伸长反应，合成碱基序列B1212位于5’末端部、且第1目标核酸互补链12位于其3’末端侧的扩增片段402。
同样地，如图4(A)所示，第2正向引物220经过改性和退火，与第2目标核酸互补链22的3’末端杂交，通过利用聚合酶的伸长反应，合成碱基序列D2222位于5’末端部、且第2目标核酸21位于其3’末端侧的扩增片段403。
同样地，如图4(A)所示，末端引物B230的多核苷酸231经过改性和退火，与第2目标核酸21的3’末端杂交，通过利用聚合酶的伸长反应，合成在5’末端连接有末端引物B附加部分232的第2目标核酸互补链22的扩增片段404。
当进一步进行改性和退火时，如图4(B)所示，上述扩增片段401的第1目标核酸11的部分与上述扩增片段402的第1目标核酸互补链12的部分杂交，通过利用聚合酶的伸长反应，合成碱基序列D2222位于3’末端部、第1目标核酸11位于其5’末端侧、且在5’末端连接有末端引物A附加部分202的扩增片段405。
同样地，如图4(B)所示，上述扩增片段404的第2目标核酸互补链22的部分与上述扩增片段403的第2目标核酸21的部分杂交，通过利用聚合酶的伸长反应，合成碱基序列B1212位于3’末端部、第2目标核酸互补链22位于其5’末端侧、且在5’末端连接有末端引物B附加部分232的扩增片段406。
当进一步进行改性和退火时，如图4(C)所示，上述扩增片段405的3’末端部的碱基序列D2222与上述扩增片段406的3’末端部的碱基序列B1212杂交。接着，通过利用聚合酶的伸长反应，以上述扩增片段405的3’末端为起点合成第2目标核酸21，以上述扩增片段406的3’末端为起点合成第1目标核酸互补链22。
上述反应的结果是，作为扩增产物，如图4(D)所示，扩增片段407与扩增片段408杂交，生成所述扩增片段407的5’末端连接有末端引物A附加部分202、所述扩增片段408的5’末端连接有末端引物B附加部分203的扩增产物2，所述扩增片段407从5’末端至3’末端按顺序配置有第1目标核酸11的碱基序列、碱基序列D2222和第2目标核酸21的碱基序列，所述扩增片段408从5’末端至3’末端按顺序配置有第2目标核酸21的互补链22的碱基序列、碱基序列D1212和第1目标核酸11的互补链12的碱基序列。
核酸扩增产物2仅在第1目标核酸11(或第1目标核酸互补链12)、第2目标核酸21(或第2目标核酸互补链22)2个一起存在于模板时被扩增。当模板中不存在这些中的1个时，虽然存在的目标核酸或其互补链被扩增，但显然不生成同时具有上述结合部和上述标记部的核酸扩增产物，在以上述标记部为指标的检测中为阴性，因此假阳性判定的风险极低。
需要说明的是，图4(C)所示的上述扩增片段405与上述扩增片段406的杂交在反应体系中过量存在第1反向引物210或第2正向引物220的情况下难以进行。因此，本实施方式的引物组中，优选在提高了末端引物A200和末端引物B230与第1反向引物210和第2正向引物220的摩尔比的条件下进行核酸扩增反应。
上述说明并不限于N＝2的情况，在N为2以上的全部情况下也是适用的。
如上所述，通过使用了本发明的实施方式2的引物组的核酸扩增反应，生成下述核酸扩增产物，其含有：
从5’末端朝向3’末端依次包含从第1目标核酸的碱基序列至第N目标核酸的碱基序列的第1扩增片段，和
从5’末端朝向3’末端依次包含从第N目标核酸的互补链的碱基序列至第1目标核酸的互补链的碱基序列的第2扩增片段；
所述第1扩增片段与所述第2扩增片段杂交而形成双链，
所述第1扩增片段和所述第2扩增片段中的一个在5’末端连接有所述标记部，
所述第1扩增片段和所述第2扩增片段中的另一个在5’末端连接有所述结合部。
这里，N为2以上的整数。在该核酸扩增产物中，所述第1扩增片段在第k目标核酸的碱基序列与第(k+1)目标核酸的碱基序列之间包含第(k+1)正向引物的碱基序列Dk+1。所述第2扩增片段在第k目标核酸的互补链的碱基序列与第(k+1)目标核酸的互补链的碱基序列之间包含第k反向引物的碱基序列Bk。k为从1至N-1的整数。
(1.3.引物组的实施方式3)
本发明引物组的实施方式3涉及一种引物组，其包含：
末端引物A，其包含在3’末端部含有与第1目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸，
第k反向引物，其包含在3’末端部含有与第k目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列Ek的多核苷酸、和含有与含有所述碱基序列Ek的所述多核苷酸的5’末端侧连接的在核酸扩增反应中不会被双链化的碱基序列Fk的多核苷酸，
第(k+1)正向引物，其包含在3’末端部含有与第(k+1)目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列Gk+1的多核苷酸、和含有与含有所述碱基序列Gk+1的所述多核苷酸的5’末端侧连接的、在核酸扩增反应中不会被双链化的与所述碱基序列Fk杂交的碱基序列Hk+1的多核苷酸，和
末端引物B，其包含在3’末端含有与第N目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸；
其中，N为2以上的整数，
k为从1到N-1的整数，
作为所述第k反向引物以及所述第(k+1)正向引物，分别包含从k为1的情况至k为N-1的情况，
所述末端引物A和所述末端引物B中的一个还包含标记部，另一个还包含所述结合部。
实施方式3的引物组中，末端引物A和末端引物B、所述标记部和所述结合部以及将它们连接的结构与实施方式1相同，因此省略说明。
第k反向引物中，碱基序列Ek的长度没有特别限定，例如可以为8个碱基以上、12个碱基以上或15个碱基以上，可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。含有碱基序列Ek的多核苷酸只要在其3’末端部含有碱基序列Ek即可，可以在比碱基序列Ek更靠5’末端的一侧还含有其他碱基序列。含有碱基序列Ek的多核苷酸的全长没有特别限定，例如可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。
第k反向引物中，碱基序列Fk的长度没有特别限定，例如可以为8个碱基以上、12个碱基以上或15个碱基以上，可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。含有碱基序列Fk的多核苷酸可以在比碱基序列Fk的3’末端侧和/或5’末端侧还含有其他碱基序列。含有碱基序列Fk的多核苷酸的全长没有特别限定，例如可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。
第k反向引物中，含有碱基序列Ek的多核苷酸和含有碱基序列Fk的多核苷酸构成为后者不会通过核酸扩增反应中的伸长而与前者一起被双链化。当含有碱基序列Fk的多核苷酸为可成为通过DNA聚合酶进行的反应的模板的多核苷酸(通常是由天然的核苷酸构成的多核苷酸)时，含有碱基序列Ek的多核苷酸和含有碱基序列Fk的多核苷酸通过阻碍聚合酶反应的间隔物连接。作为这样的“间隔物”，作为引物组的实施方式1的末端引物A或B中所含的多核苷酸与标记部或结合部之间的阻碍聚合酶反应的间隔物，可以采用已述的结构。此时，含有碱基序列Ek的多核苷酸和含有碱基序列Fk的多核苷酸可以在一个方向上连接。另一方面，作为含有碱基序列Fk的多核苷酸，当使用如LNA(锁核酸)、L型核酸、2’-O-甲基化核苷酸等含有修饰核酸的多核苷酸那样、不成为通过DNA聚合酶进行的反应的模板、不会因核酸扩增反应中的伸长而被双链化的多核苷酸时，也可以省略上述阻碍聚合酶反应的间隔物。
第(k+1)正向引物中，碱基序列Gk+1的长度没有特别限定，例如可以为8个碱基以上、12个碱基以上或15个碱基以上，可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。含有碱基序列Gk+1的多核苷酸只要在其3’末端部含有碱基序列Gk+1即可，可以在比碱基序列Gk+1更靠5’末端的一侧还含有其他碱基序列。含有碱基序列Gk+1的多核苷酸的全长没有特别限定，例如可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。
第(k+1)正向引物中，碱基序列Hk+1的长度没有特别限定，例如可以为8个碱基以上、12个碱基以上或15个碱基以上，可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。含有碱基序列Hk+1的多核苷酸可以在比碱基序列Hk+1更靠3’末端的一侧和/或更靠5’末端的一侧还含有其他碱基序列。含有碱基序列Hk+1的多核苷酸的全长没有特别限定，例如可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。
第(k+1)正向引物中，含有碱基序列Gk+1的多核苷酸和含有碱基序列Hk+1的多核苷酸构成为后者不会通过核酸扩增反应中的伸长而与前者一起被双链化。在含有碱基序列Hk+1的多核苷酸为可成为通过DNA聚合酶进行的反应的模板的多核苷酸(通常是由天然的核苷酸构成的多核苷酸)时，含有碱基序列Gk+1的多核苷酸和含有碱基序列Hk+1的多核苷酸通过阻碍聚合酶反应的间隔物连接。作为这样的“间隔物”，可以采用作为引物组的实施方式1的末端引物A或B中所含的多核苷酸与标记部或结合部之间的阻碍聚合酶反应的间隔物已述的结构。此时，含有碱基序列Gk+1的多核苷酸和含有碱基序列Hk+1的多核苷酸可以在一个方向上连接。另一方面，作为含有碱基序列Hk+1的多核苷酸，当使用如LNA(锁核酸)、L型核酸、2’-O-甲基化核苷酸等含有修饰核酸的多核苷酸那样、不成为通过DNA聚合酶进行的反应的模板、不会因核酸扩增反应中的伸长而被双链化的多核苷酸时，也可以省略上述阻碍聚合酶反应的间隔物。
第k反向引物的碱基序列Fk和第(k+1)正向引物的碱基序列Hk+1可以适当设计成相互杂交、不阻碍通过引物组中包含的各引物进行的核酸扩增。
以第1目标核酸11、第2目标核酸21这2个为目标核酸的情况(即N＝2)为例，参照图5说明实施方式3的引物组的作用。
末端引物A500包含在3’末端部含有与第1目标核酸11的互补链12的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸501。末端引物A500除了多核苷酸501之外，还具备末端引物A附加部分502。末端引物A附加部分502是上述标记部或结合部中的任一个。
图5的例子中，由于N＝2，因此作为第k反向引物，包含第1反向引物510，作为第(k+1)正向引物，包含第2正向引物520。
第1反向引物510包含在3’末端部含有与第1目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列E1的多核苷酸511、和与含有上述碱基序列E1的上述多核苷酸511的5’末端侧连接的含有碱基序列F1的多核苷酸512。
第2正向引物520包含在3’末端部含有与第2目标核酸21的碱基序列的互补序列22的3’末端部杂交的碱基序列G2的多核苷酸521、和与含有上述碱基序列G2的多核苷酸521的5’末端侧连接的、与上述碱基序列F1杂交的碱基序列H2的多核苷酸522。
末端引物B530包含在3’末端部含有与第2目标核酸21的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸531。末端引物B530除了多核苷酸531之外，还具备末端引物B附加部分532。末端引物B附加部分532是所述标记部或结合部中的任一个。
如图5(A)所示，以所述核酸为模板，在含有末端引物A500、第1反向引物510、第2正向引物520和末端引物B530的第3实施方式的引物的存在下进行核酸扩增反应时，末端引物A500的多核苷酸501经过改性和退火，与第1目标核酸互补链12的3’末端杂交，通过利用聚合酶的伸长反应，合成在5’末端连接有末端引物A附加部分502的第1目标核酸11的扩增片段551。
同样地，如图5(A)所示，含有第1反向引物510的碱基序列E1的多核苷酸511经过改性和退火，与第1目标核酸11的3’末端杂交，通过利用聚合酶的伸长反应，合成在5’末端侧连接有含有碱基序列F1的多核苷酸512的第1目标核酸互补链12的扩增片段552。
同样地，如图5(A)所示，包含第2正向引物520的碱基序列G2的多核苷酸521经过改性和退火，与第2目标核酸互补链22的3’末端杂交，通过利用聚合酶的伸长反应，合成在5’末端侧连接有含有碱基序列H2的多核苷酸522的第2目标核酸21的扩增片段553。
同样地，如图5(A)所示，末端引物B530的多核苷酸531经过改性和退火，与第2目标核酸21的3’末端杂交，通过利用聚合酶的伸长反应，合成在5’末端连接有末端引物B附加部分532的第2目标核酸互补链22的扩增片段554。
当进一步进行改性和退火时，如图5(B)所示，生成上述扩增片段551的第1目标核酸11的部分与上述扩增片段552的第1目标核酸互补链12的部分杂交、含有上述扩增片段552的碱基序列F1的多核苷酸512的部分与含有上述扩增片段553的碱基序列H2的多核苷酸522的部分杂交、上述扩增片段553的第2目标核酸21的部分与上述扩增片段554的第2目标核酸互补链22的部分杂交而成的核酸扩增产物3。
核酸扩增产物3仅在第1目标核酸11(或第1目标核酸互补链12)、第2目标核酸21(或第2目标核酸互补链22)2个一起存在于模板中时在模板中被扩增。当模板中不存在这些中的1个时，虽然存在的目标核酸或其互补链被扩增，但显然不产生同时具有上述结合部和上述标记部的核酸扩增产物，在以上述标记部为指标的检测中为阴性，因此假阳性判定的风险极低。
需要说明的是，图5(B)所示的上述扩增片段551～554之间的杂交在反应体系中过量存在第1反向引物510或第2正向引物520的情况下难以进行。因此，本实施方式的引物组中，优选在提高了末端引物A500和末端引物B530与第1反向引物510和第2正向引物520的摩尔比的条件下进行核酸扩增反应。
上述说明并不限于N＝2的情况，在N为2以上的全部情况下也是适用的。
如上所述，通过使用了本发明的实施方式3的引物组的核酸扩增反应，生成下述核酸扩增产物，其含有：
与从第1目标核酸至第N目标核酸的各目标核酸与其互补链杂交而成的双链扩增片段，
在从第2目标核酸至第N目标核酸的各目标核酸的5’末端侧连接有单链多肽，
从第1目标核酸至第(N-1)目标核酸的各目标核酸的互补链的5’末端侧连接有单链多肽，
与第k目标核酸的双链扩增片段中的第k目标核酸的互补链的5’末端侧连接的单链多肽和与第(k+1)目标核酸的双链扩增片段中的第(k+1)目标核酸的5’末端侧连接的单链多肽相互杂交，
第1目标核酸的扩增片段和第N目标核酸的互补链的扩增片段中的一个在5’末端连接有上述标记部，
第1目标核酸的扩增片段与第N目标核酸的互补链的扩增片段中的另一个在5’末端连接有上述结合部。
这里，N为2以上的整数，k为1～N-1的整数。
(1.4.实施方式4)
本发明的引物组的实施方式4涉及一种引物组，其包含：
末端引物A，其包含在3’末端部含有与第1目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸，
第k反向引物，其包含在3’末端部含有与第k目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列Ik的多核苷酸、和含有与含有所述碱基序列Ik的所述多核苷酸的5’末端侧连接的在核酸扩增反应中不会被双链化的碱基序列Jk的多核苷酸，
第(k+1)正向引物，其包含在3’末端部含有与第(k+1)目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列Lk+1的多核苷酸、和还含有与所述碱基序列Lk+1的5’末端侧连接的在核酸扩增反应中不会被双链化的碱基序列Mk+1的多核苷酸，
第k连接用多核苷酸，其包含含有与所述碱基序列Jk杂交的碱基序列的多核苷酸、和含有与所述碱基序列Mk+1杂交的碱基序列的多核苷酸，和
末端引物B，其包含在3’末端含有与第N目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸；
其中，N为2以上的整数，
k为从1到N-1的整数，
作为所述第k反向引物、所述第(k+1)正向引物以及所述第k连接用多核苷酸，分别包含从k为1的情况至k为N-1的情况，
所述末端引物A和所述末端引物B中的一个还包含标记部，另一个还包含所述结合部。
实施方式4的引物组中，末端引物A和末端引物B、所述标记部和所述结合部以及将它们连接的结构与实施方式1相同，因此省略说明。
实施方式4的第k反向引物中，碱基序列Ik的长度没有特别限定，例如可以为8个碱基以上、12个碱基以上或15个碱基以上，可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。含有碱基序列Ik的多核苷酸只要在其3’末端部含有碱基序列Ik即可，可以在比碱基序列Ik更靠5’末端的一侧还含有其他碱基序列。含有碱基序列Ik的多核苷酸的全长没有特别限定，例如可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。
第k反向引物中，碱基序列Jk的长度没有特别限定，例如可以为8个碱基以上、12个碱基以上或15个碱基以上，可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。含有碱基序列Jk的多核苷酸可以在比碱基序列Jk更靠的3’末端的一侧和/或更靠5’末端的一侧还含有其他碱基序列。含有碱基序列Jk的多核苷酸的全长没有特别限定，例如可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。
第k反向引物中，含有碱基序列Ik的多核苷酸和含有碱基序列Jk的多核苷酸构成为后者不会通过核酸扩增反应中的伸长而与前者一起被双链化。当含有碱基序列Jk的多核苷酸为可成为通过DNA聚合酶进行的反应的模板的多核苷酸(通常为由天然的核苷酸构成的多核苷酸)时，含有碱基序列Ik的多核苷酸和含有碱基序列Jk的多核苷酸通过阻碍聚合酶反应的间隔物连接。作为这样的“间隔物”，可以采用作为引物组的实施方式1的末端引物A或B中所含的多核苷酸与标记部或结合部之间的阻碍聚合酶反应的间隔物已述的结构。此时，含有碱基序列Ik的多核苷酸和含有碱基序列Jk的多核苷酸可以在一个方向上连接。另一方面，作为含有碱基序列Jk的多核苷酸，当使用如LNA(锁核酸)、L型核酸、2’-O-甲基化核苷酸等含有修饰核酸的多核苷酸那样、不成为通过DNA聚合酶进行的反应的模板、不会因核酸扩增反应中的伸长而被双链化的多核苷酸时，也可以省略上述阻碍聚合酶反应的间隔物。
第(k+1)正向引物中，碱基序列Lk+1的长度没有特别限定，例如可以为8个碱基以上、12个碱基以上或15个碱基以上，可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。含有碱基序列Lk+1的多核苷酸只要在其3’末端部含有碱基序列Lk+1即可，可以在比碱基序列Lk+1更靠5’末端的一侧还含有其他碱基序列。含有碱基序列Lk+1的多核苷酸的全长没有特别限定，例如可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。
第(k+1)正向引物中，碱基序列Mk+1的长度没有特别限定，例如可以为8个碱基以上、12个碱基以上或15个碱基以上，可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。含有碱基序列Mk+1的多核苷酸可以在比碱基序列Mk+1更靠3’末端的一侧和/或更靠5’末端的一侧还含有其他碱基序列。含有碱基序列Mk+1的多核苷酸的全长没有特别限定，例如可以为40个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下。
第(k+1)正向引物中，含有碱基序列Lk+1的多核苷酸和含有碱基序列Mk+1的多核苷酸构成为后者不会通过核酸扩增反应中的伸长而与前者一起被双链化。当含有碱基序列Mk+1的多核苷酸为可成为通过DNA聚合酶进行的反应的模板的多核苷酸(通常为由天然的核苷酸构成的多核苷酸)时，含有碱基序列Lk+1的多核苷酸和含有碱基序列Mk+1的多核苷酸通过阻碍聚合酶反应的间隔物连接。作为这样的“间隔物”，可以采用作为引物组的实施方式1的末端引物A或B中所含的多核苷酸与标记部或结合部之间的阻碍聚合酶反应的间隔物已述的结构。此时，含有碱基序列Lk+1的多核苷酸和含有碱基序列Mk+1的多核苷酸可以在一个方向上连接。另一方面，作为含有碱基序列Mk+1的多核苷酸，当使用如LNA(锁核酸)、L型核酸、2’-O-甲基化核苷酸等含有修饰核酸的多核苷酸那样、不成为通过DNA聚合酶进行的反应的模板、不会因核酸扩增反应中的伸长而被双链化的多核苷酸时，也可以省略上述阻碍聚合酶反应的间隔物。
第k连接用多核苷酸中，含有与碱基序列Jk杂交的碱基序列的多核苷酸可以在与碱基序列Jk杂交的碱基序列的5’末端侧和/或3’末端侧还含有其他碱基序列。
第k连接用多核苷酸中，含有与碱基序列Mk+1杂交的碱基序列的多核苷酸可以在与碱基序列Mk+1杂交的碱基序列的5’末端侧和/或3’末端侧还含有其他碱基序列。
第k连接用多核苷酸中所含的、含有与碱基序列Jk杂交的碱基序列的多核苷酸、和含有与碱基序列Mk+1杂交的碱基序列的多核苷酸可以是1个连接的多核苷酸分子，也可以是在其间通过适当的化学结构连接而成的分子。作为这样的化学结构，例如可以采用作为引物组的实施方式1的末端引物A或B中所含的多核苷酸与标记部或结合部之间的结构已述的结构。第k连接用多核苷酸优选具有在通过DNA聚合酶进行的反应中不成为模板的结构。例如，含有与碱基序列Jk杂交的碱基序列的多核苷酸和含有与碱基序列Mk+1杂交的碱基序列的多核苷酸可以分别在3’末端侧连接，含有与碱基序列Jk杂交的碱基序列的多核苷酸、和含有与碱基序列Mk+1杂交的碱基序列的多核苷酸中的1个或二者可以由如LNA(锁核酸)、L型核酸、2’-O-甲基化核苷酸等含有修饰核酸的多核苷酸那样、不成为通过DNA聚合酶进行的反应的模板、不会因核酸扩增反应中的伸长而被双链化的多核苷酸构成。
与第k反向引物的碱基序列Jk、第(k+1)正向引物的碱基序列Mk+1、第k连接用多核苷酸中所含的这些碱基序列杂交的碱基序列可以适当设计成不阻碍通过引物组中包含的各引物进行的核酸扩增。
以第1目标核酸11、第2目标核酸21这2个为目标核酸的情况(即N＝2)为例，参照图6对实施方式4的引物组的作用进行说明。
末端引物A600具备在3’末端部含有与第1目标核酸11的互补链12的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸601、和末端引物A附加部分602。
图6的例子中，由于N＝2，因此作为第k反向引物，包含第1反向引物610，作为第(k+1)正向引物，包含第2正向引物620，作为第k连接用多核苷酸，包含第1连接用多核苷酸640。
第1反向引物610含有在3’末端部含有碱基序列I1的多核苷酸611、和与多核苷酸611的5’末端侧连接的含有碱基序列J1的多核苷酸612。
第2正向引物620包含在3’末端部含有碱基序列L2的多核苷酸621、和与多核苷酸621的5’末端侧连接的含有碱基序列M2的多核苷酸622。
末端引物B630具有在3’末端部含有与第2目标核酸21的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸631、和末端引物B附加部分632。
第1连接用多核苷酸640包含：含有与含有碱基序列J1的多核苷酸612杂交的碱基序列的多核苷酸641、和含有与含有碱基序列M2的多核苷酸622杂交的碱基序列的多核苷酸642。
如图6(A)所示，以所述核酸为模板，在含有末端引物600、第1反向引物610、第2正向引物620和末端引物B630的第4实施方式的引物的存在下进行核酸扩增反应时，从末端引物A600合成在5’末端连接有末端引物A附加部分602的第1目标核酸11的扩增片段651。
从第1反向引物610合成在5’末端侧连接有含有碱基序列J1的多核苷酸612的第1目标核酸互补链12的扩增片段652。
从第2正向引物620合成在5’末端侧连接有含有碱基序列M2的多核苷酸622的第2目标核酸21的扩增片段653。
从末端引物B630合成在5’末端连接有末端引物B附加部分632的第2目标核酸互补链22的扩增片段654。
第1连接用多核苷酸640不直接参与核酸扩增反应。
当对核酸扩增反应后的扩增产物进行改性并退火时，如图5(B)所示，生成上述扩增片段651的第1目标核酸11的部分与上述扩增片段652的第1目标核酸互补链12的部分杂交、上述扩增片段652的多核苷酸612的部分与第1连接用多核苷酸640的多肽641的部分杂交、第1连接用多核苷酸640的多肽642的部分与上述扩增片段653的多核苷酸622的部分杂交、上述扩增片段653的第2目标核酸21的部分与上述扩增片段654的第2目标核酸互补链22的部分杂交而成的核酸扩增产物4。
核酸扩增产物4仅在第1目标核酸11(或第1目标核酸互补链12)、第2目标核酸21(或第2目标核酸互补链22)2个一起存在于模板时在模板中被扩增。当模板中不存在这些中的1个时，虽然存在的目标核酸或其互补链被扩增，但显然不产生同时具有上述结合部和上述标记部的核酸扩增产物，在以上述标记部为指标的检测中为阴性，因此假阳性判定的风险极低。
另外，图6(B)所示的上述扩增片段651～654和第1连接用多核苷酸640之间的杂交在反应体系中过量存在第1反向引物610或第2正向引物620的情况下难以进行。因此，本实施方式的引物组中，优选在提高了末端引物A600和末端引物B630与第1反向引物610和第2正向引物620的摩尔比的条件下进行核酸扩增反应。
另外，第k连接用多核苷酸不直接参与核酸扩增反应，因此也可以在核酸扩增反应后添加到反应体系中，然后将反应体系改性并退火。
上述说明并不限于N＝2的情况下，在N为2以上的全部情况下也是适用的。
如上所述，通过使用了本发明的实施方式4的引物组的核酸扩增反应，生成下述核酸扩增产物，其含有：
从第1目标核酸至第N目标核酸的各目标核酸与其互补链杂交而成的双链扩增片段，和
从第1连接用多核苷酸至第(N-1)连接用多核苷酸的N-1个连接用多核苷酸；
在从第2目标核酸至第N目标核酸的各目标核酸的5’末端侧连接有单链多肽，
从第1目标核酸至第(N-1)目标核酸的各目标核酸的互补链的5’末端侧连接有单链多肽，
与第k目标核酸的互补链的5’末端侧连接的单链多肽与第k连接用多核苷酸的一部分相互杂交，
与第(k+1)目标核酸的5’末端侧连接的单链多肽与第k连接用多核苷酸的另一部分相互杂交，
第1目标核酸的扩增片段和第N目标核酸的互补链的扩增片段中的一个在5’末端连接有上述标记部，
第1目标核酸的扩增片段与第N目标核酸的互补链的扩增片段中的另一个在5’末端连接有上述结合部。
这里，N为2以上的整数，k为1～N-1的整数。
<2.本发明的检测方法>
本发明还涉及一种检测2个以上的目标核酸的方法，其包含下述检测工序：
使有可能含有检测用核酸的检测用试样与固相载体接触，所述检测用核酸含有连接的2个以上的目标核酸、标记部和结合部，所述标记部为标记物质或能够与标记物质结合的标签，所述结合部为能够与固相载体结合的标签，所述固相载体的至少一部分包含能够与所述结合部结合的部分，以所述标记部为指标，对所述固相载体的所述部分中的所述检测用核酸进行检测。
如基于图2所说明的那样，在使分别结合有结合部和标记部的2个以上的目标核酸的混合物与含有与各结合部对应的多个结合部位的1个固相载体接触的情况下，存在判别性差的问题。
本发明中，将2个以上的目标核酸、所述标记部和所述结合部连接而成的核酸作为检测用核酸，使有可能含有该检测用核酸的检测用试样与至少一部分含有能够与所述结合部结合的部分的固相载体接触，以所述标记部为指标，检测所述固相载体的所述部分中的所述检测用核酸。所述固相载体的所述部分中的所述检测用核酸的检测可以基于所述部分中有无所述标记部来判断。如图1A所示，当所述固相载体的所述部分中检测到所述检测用核酸时，可以判断为所述检测用试样中含有规定的2个以上的目标核酸。因此，与使分别结合有结合部和标记部的2个以上的目标核酸的混合物与包含与各结合部对应的多个结合部位的1个固相载体接触的方法相比，判别性显著地高。
本发明中，由于能够将2个以上的目标核酸制成1个检测用核酸，因此只要在固相载体上设置一个与上述结合部结合的部位即可，能够使固相载体的构成简单化也是优点之一。
这里，所述检测用核酸优选包含串联连接的2个以上的目标核酸、与该2个以上的目标核酸的列的两端中的一个连接的所述标记部、以及与另一个连接的所述结合部。该情况下，上述标记部和上述结合部仅在全部含有规定的2个以上的目标序列的情况下能够共存于1个核酸中，如图1B1～B3所示，当不存在上述2个以上的目标核酸时，由于在固相载体上不会检测到由上述标记部产生的标记，因此能够降低假阳性的风险。
本发明的检测方法更优选为下述的检测2个以上的目标核酸的方法，其进一步包含下述检测用试样制备工序：
将从分析对象试样获得的核酸作为模板，通过核酸扩增反应制备有可能含有所述检测用核酸的检测用试样；
所述检测工序中，将在所述检测用试样制备工序中得到的核酸扩增反应的产物用作所述检测用试样。
所述检测工序中，所述检测用核酸是通过所述核酸扩增反应得到的核酸扩增产物。
本发明的检测方法更优选的是，所述检测用试样制备工序包含将从分析对象试样获得的核酸作为模板，使用本发明的各实施方式的引物组进行核酸扩增反应。通过使用本发明的各实施方式的引物组，在作为模板的核酸中含有全部从第1目标核酸至第N目标核酸的情况下，作为核酸扩增产物，可以得到含有串联连接的、从第1目标核酸至第N目标核酸的目标核酸、与该2个以上的目标核酸的列的两端中一个连接的上述标记部、以及与另一个连接的上述结合部的上述检测用核酸。另一方面，当不存在目标核酸中的一部分时，核酸扩增反应的产物中不仅不包含上述检测用核酸，还不包含同时含有上述标记部和上述结合部的核酸种。例如，如图1B1～B3所示，当不存在目标核酸A、目标核酸B和目标核酸C中的1个或2个时，由于在固相载体上不会检测到由上述标记部产生的标记，因此能够降低假阳性的风险。
本发明中，分析对象试样没有特别限定，典型地可以举出含有饮食品、动物植物等生物体的一部分(器官、组织、细胞、血液、体液等)、粪便、微生物、病毒等的试样。
可以将从分析对象试样获得的核酸作为模板用于核酸扩增反应。该核酸可以是从分析对象试样中提取并精制的形态，也可以是从分析对象试样中提取并粗精制的形态。或者，若是细胞、组织的一部分等以较高浓度含有核酸的试样，则也可以将分析对象试样本身直接包含在核酸扩增反应中。另外，从分析对象试样制备的cDNA也可以作为模板使用。作为模板使用的核酸优选为DNA。
以下，对检测用试样制备工序、检测工序、标记工序的优选实施方式进行说明。
(2.1.检测用试样制备工序)
作为检测用试样制备工序，以下说明将从分析对象试样获得的核酸作为模板，使用上述本发明的引物组进行核酸扩增反应时的优选方式。
核酸扩增反应可以按照聚合酶链反应法(PCR法)进行。即，当对含有目标核酸的模板核酸使用本发明的引物组进行PCR时，可以在所期望的核酸扩增产物得到扩增的PCR条件下进行。另外，在适当的情况下，也可以使用除PCR法以外的核酸扩增反应。
PCR中使用的DNA聚合酶只要是耐热性的DNA聚合酶即可，没有特别限定。本发明中，可以利用市售的DNA聚合酶，例如可以优选使用TaKaRa Ex Taq(注册商标)等。另外，温度、时间、缓冲液的组成等可以根据所使用的DNA聚合酶、各引物的浓度等适当选择。
热启动PCR法可以期待抑制引物二聚物形成的效果，因此是有用的。热启动PCR法可以使用TaKaRa Ex Taq(注册商标)Hot Start Version(Takara Bio)等市售的热启动PCR用试剂来进行。另外，也可以使用TaKaRa Taq HS PCR试剂盒、UNG plus(注册商标)，通过使用该试剂盒，还可以期待抑制核酸扩增产物的携带污染(carryover contamination)的效果。
PCR法中的变性、退火、伸长的各工序的时间、温度、缓冲液组成、dNTP浓度、循环数等各条件可以考虑所选择的DNA聚合酶、引物序列、目标核酸的碱基数、模板浓度等因素来适当设定。
PCR法中的循环数没有特别限定，例如在25～60个循环的范围内。
PCR法中的反应体系中的开始时的各引物浓度没有特别限定，可以根据作为模板的核酸量等适当调整。作为反应体系中的反应开始时的优选的引物浓度，可以举出各引物分别为0.05μM～1.0μM这样的浓度。当小于0.05μM时，检测灵敏度降低，有可能发生作为基准的检测灵敏度降低。另外，引物浓度的上限没有特别限定，优选为1.0μM。
在使用本发明的实施方式1～4的引物组的核酸扩增反应中，当模板核酸中含有目标核酸时，作为扩增产物，在反应体系中形成上述的核酸扩增产物1～4。
当检测2组以上的2个以上的目标核酸的组合时，可以使用设计成能够制备所含的2个以上的目标核酸的组合不同、且具备能够结合在固相载体的不同位置的上述结合部的2个以上的检测用核酸的2组以上的本发明的引物组，将从分析对象试样获得的核酸作为模板，在上述的条件下进行核酸扩增反应。在该情况下，下述的检测工序中，使通过核酸扩增反应得到的检测用试样与所述固相载体接触，以所述标记部为指标，在所述固相载体中检测所述2个以上的检测用核酸中的每一个。
(2.2.检测工序)
检测工序是如下的工序：使上述检测用试样制备工序中的核酸扩增反应的产物等检测用试样与至少一部分含有能够与结合部结合的部分的固相载体接触，将标记部作为指标，检测固相载体的上述部分中的检测用核酸。
核酸扩增反应的产物是指，有可能含有作为扩增产物的上述检测用核酸的核酸扩增反应的反应液、或将扩增产物从该反应液中进一步高浓度化而得到的试样等。
当标记部为上述标记用标签时，可以进一步进行使标记物质与标记用标签结合的标记工序。当标记部为上述标记物质时，不需要标记工序。检测工序中，“将标记部作为指标”是指，当标记部为标记用标签时，将经过标记工序而结合的标记物质作为指标来检测上述检测用核酸，当标记部为标记物质时，将该标记物质作为标记来检测上述检测用核酸。
固相载体如已经详述的那样。
检测用试样与固相载体的能够与结合部结合的部分的接触可以根据固相载体与结合部的组合，当上述检测用试样中含有上述检测用核酸时，在适当调节以使上述检测用核酸的结合部与所述部分结合的条件(例如关于结合部所详述的杂交条件、或pH为5～9左右的缓冲液条件)下进行。
所述检测用核酸的检测可以通过检测、优选目视检测与捕获到固相载体上的所述检测用核酸结合了的所述标记物质来进行。当上述检测用核酸存在时，检测到捕获、结合在固相载体上的上述检测用核酸的标记物质。以有无检测到为指标，能够判别检测用试样中有无上述检测用核酸。当检测用试样为上述检测用试样制备工序中的核酸扩增反应的产物时，以有无检测到为指标，能够判别分析对象试样中有无2个以上的目标核酸。
(2.3.标记工序)
标记工序是在所述检测用核酸所含的所述标记部为所述标记用标签的情况下进行的工序，通过使所述检测用试样与标记物质接触，使标记用标签与标记物质结合来进行。标记工序可以在使所述检测用试样与固相载体接触之前进行，也可以在接触后进行，也可以在接触的同时进行。
标记物质与所述检测用试样的接触可以根据标记物质与标记用标签的组合，当所述检测用试样中含有所述目标核酸时，在适当调节以使标记物质与所述检测用试样的标记用标签结合的条件(例如关于结合部所说明的杂交条件、或pH为5～9左右的缓冲液条件)下进行。
<3.本发明的试剂盒>
本发明还提供一种试剂盒，其用于检测分析对象试样中的2个以上的目标核酸，其包含：本发明的引物组和至少一部分含有能够与所述结合部结合的部分的固相载体。该试剂盒可以在本发明的检测方法中使用。
当本发明的引物组中的标记部为标记用标签时，本发明的试剂盒还可以含有标记物质。
固相载体和标记物质可以是后述的核酸检测装置的形态。
本发明的试剂盒中还可以含有PCR用缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、核酸色谱法展开溶液等。
<4.核酸检测装置>
上述的检测工序和标记工序可以使用利用核酸色谱法的核酸检测装置来进行。通过利用该核酸检测装置，能够不需要特殊装置地检测/判别检测用试样中有无上述检测用核酸，能够简便且迅速地得到结果。
核酸检测装置可以利用用于通过核酸色谱法检测被标记的上述检测用核酸的公知的核酸检测装置(WO2012/070618)。
将本发明中能够利用的核酸检测装置的一个实施方式的示意图示于图7，但核酸检测装置并不限于本实施方式。另外，在以下的说明中，对各部件标注的符号与图7中所示的符号对应。
图7的核酸检测装置700在基材75上，以相互依次接触的方式配置作为用于收纳上述检测用试样的反应体系收纳部的样品垫73、保持标记物质的结合垫72、一部分含有能够与上述检测用核酸中所含的结合部结合的部分76的多孔固相载体71、和吸收垫74而形成。固相载体71的部分76是用于捕获上述检测用核酸的机构(捕获机构)(例如上述寡核苷酸等)被局限地配置、固定化的部分。样品垫73、结合垫72、固相载体71及吸收垫74可由可用作上述固相载体的具有多孔结构的部件构成。它们可以由相同的部件构成，也可以由不同的部件构成。基材75能够支承配置于其上的各种部件，只要能够使核酸检测装置的操作变得容易即可，例如可以利用由树脂、金属、矿物等构成的部件。当将标记物质混合到展开溶液中时，或当标记部是标记物质时，可以省略结合垫72。为了预防污染、防止试验中液体从固相载体表面挥发，核酸检测装置700的一部分可以被聚酯等薄膜覆盖。
将通过核酸扩增工序得到的核酸扩增反应的反应体系等的上述检测用试样添加到样品垫73中。作为上述检测用试样，可以直接添加上述反应体系，也可以与适当的展开溶液(例如磷酸缓冲液、Tris缓冲液、Good缓冲液、SSC缓冲液)一起添加。展开溶液中根据需要还可以含有表面活性剂、盐、蛋白、核酸等。添加到样品垫73的所述检测用试样在图7中的箭头所示的方向上从上游向下游通过毛细管现象展开。
另外，作为另一方式，也可以在保持上述检测用试样和/或展开溶液的容器(例如PCR管、微量管、96孔板等)中，通过将该核酸检测装置的样品垫73浸渍于上述检测用试样和/或展开溶液的方法进行展开。此时，优选按照样品垫73进入保持有所述检测用试样和/或展开溶液的容器中的方式，使样品垫73的宽度为2.0～10.0mm、更优选为2.0～5.0mm。
另外，对于浸渍在保持有所述检测用试样和/或展开溶液的容器中使用的核酸检测装置，可以从图7所图示的核酸检测装置700中省略样品垫73。此外，在作为标记部使用标记物质时等不需要的情况下，也可以省略结合垫72，可以采用将基材75上的固相载体71的未配置有吸收垫74的一侧的端部直接浸渍于上述检测用试样和/或展开溶液的方式。
所述标记部为标记用标签的实施方式之一中，所述检测用核酸在从保持有标记物质的结合垫72中通过时，与标记物质接触，通过标记用标签被标记物质标记。
接着，上述检测用试样中的上述检测用核酸在从固相载体71中通过时，与固定于部分76的捕获机构接触，通过固定化用标签被捕获-结合于固相载体71。
当上述检测用试样中存在上述检测用核酸时，在部分76上检测到与捕获-结合到含有捕获机构的固相载体71的部分76上的上述检测用核酸结合的标记物质。如果标记物质能够目视确认，则部分76因标记物质而显色。以有无检测到该标记物质(显色)为指标，能够判别有无上述检测用核酸，据此，能够判别分析对象试样中有无目标核酸。
<4.本发明引物组的又一实施方式>
本发明的上述实施方式1的引物组的又一实施方式中，与末端引物A和末端引物B中的一个结合的上述标记部和与另一个结合的上述结合部不一定是必需的。
即，本发明引物组的又一实施方式涉及一种引物组，其包含：
所述末端引物A，
所述第k双头引物，和
末端引物B；
其中，N为2以上的整数，k为从1至N-1的整数，
作为所述第k双头引物，包含从k为1的情况至k为N-1的情况。
在使用了该引物组的核酸扩增反应中，当模板核酸中含有从第1目标核酸至第N目标核酸时，生成下述核酸扩增产物，其包含：
第1目标核酸的扩增片段，
第k目标核酸的互补链的部分和第(k+1)目标核酸的部分在彼此的5’末端之间连接的扩增片段，和
第N目标核酸的互补链的扩增片段；
从第1目标核酸至第N目标核酸的各目标核酸与其互补链杂交而形成双链。
该核酸扩增产物可以通过分析核酸扩增反应的产物来检测。检测的方法不仅可以是固定化在固相载体上进行检测的方法，也可以是其他检测方法，例如可以是通过凝胶电泳等方法以分子量等为指标检测核酸扩增反应的产物的方法。
实施例
基于以下的实验结果对本发明进行具体说明，但本发明并不限于这些。
[实施例1]
<1.鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)检测用引物组的设计>
作为实施方式1的引物组的一例(目标核酸数N＝3)，以3个目标核酸的存在为指标，设计用于检测鼠伤寒沙门氏菌的引物组。
沙门氏菌根据生化性状、DNA的同源性等被分类为1属2菌种6亚种。另外，与该分类不同，确立了基于菌体抗原(O抗原)和鞭毛抗原(H抗原)的组合的血清型分类，到目前为止报告了2500个以上的血清型。在人或家畜中引起感染症的1500个以上的血清型被分类为亚种I，彼此的遗传相似度极高，利用单一基因的碱基序列的差异难以进行血清型判定。
与此相对，日本特开2011-234739号公报中，通过对特定血清型特异性的3个基因的组合，能够进行鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、肠炎沙门氏菌(SalmonellaEnteritidis)、婴儿沙门氏菌(Salmonella Infantis)等的血清型判别。该方法中，用多重PCR将3个血清型特异性的基因扩增后，用凝胶电泳进行分析，当确认到全部3个扩增产物时判定为阳性。
例如，作为用于检测鼠伤寒沙门氏菌的引物组，公开了以下序列(序列号1～6)。
表1
Figure BDA0001929916700000471
本实施例中，作为用于检测鼠伤寒沙门氏菌的本发明的实施方式1的引物组(N＝3)，以序列号1～6为基础，设计下述各引物的组合。
表2所示的该引物组相当于在图3所示的N＝3的本发明的实施方式1的引物组的例子中，第1目标核酸11为TMP1的正义链、第2目标核酸31为TMP2的正义链、第3目标核酸31为TMP3的反义链的情况。
本引物组的TMP1F-Mem相当于图3的末端引物A100。TMP1F-Mem中，TMP1F的DNA链(序列号1)相当于多核苷酸101，表2中用下划线表示的标签序列(序列号9)相当于末端引物A附加部分102。该标签序列(序列号9)是固定在作为固相载体的膜上的固相侧标签序列(序列号11)的互补序列，相当于实施方式1的引物组中的结合部(固定化用标签)。TMP1F-Mem中，标签序列(序列号9)和TMP1F(序列号1)从5’末端向3’末端沿同一方向配置，表2所示的X表示停止通过聚合酶反应进行的伸长的偶氮苯修饰核酸，具体而言，是由上述的式I所示的二价基团。
本引物组的TMP1R-2F相当于图3的第1双头引物110。TMP1R-2F中，TMP1R的DNA链(序列号2)相当于第1双头引物第1多核苷酸111，TMP2F的DNA链(序列号3)相当于第1双头引物第2多核苷酸112。TMP1R的DNA链(序列号2)和TMP2F的DNA链(序列号3)相互反向地配置，各自的5’末端核苷酸的糖的5’位彼此由通过磷酸基键合的5’-5’键连接。TMP1R的DNA链(序列号2)和TMP2F的DNA链(序列号3)在彼此的5’末端侧结合，3’末端开放，在模板存在下能够通过DNA聚合酶反应从各自的3’末端伸长。
本引物组的TMP2R-3R相当于图3的第2双头引物120。TMP2R-3R中，TMP2R的DNA链(序列号4)相当于第2双头引物第1多核苷酸121，TMP3R的DNA链(序列号6)相当于第2双头引物第2多核苷酸122。TMP2R的DNA链(序列号4)和TMP3R的DNA链(序列号6)相互反向地配置，各自的5’末端核苷酸的糖的5’位彼此由通过磷酸基键合的5’-5’键连接。TMP2R的DNA链(序列号4)和TMP3R的DNA链(序列号6)在彼此的5’末端侧结合，3’末端开放，在模板存在下能够通过DNA聚合酶反应从各自的3’末端伸长。
本引物组的TMP3F-Au相当于图3的末端引物B130。TMP3F-Au中，TMP3F的DNA链(序列号5)相当于多核苷酸131，表2中用下划线表示的标签序列(序列号10)相当于末端引物B附加部分132。该标签序列(序列号10)是固定于作为标记物质的金胶体的标记物质侧标签序列(序列号12)的互补序列，相当于实施方式1的引物组中的标记部(标记用标签)。TMP3F-Au中，标签序列(序列号10)和TMP3F(序列号5)从5’末端向3’末端沿同一方向配置，表2所示的X表示停止通过聚合酶反应进行的伸长的偶氮苯修饰核酸，具体而言，是由上述的式I表示的二价基团。
表2
Figure BDA0001929916700000491
按照以下顺序制备作为标记物质使用的寡核苷酸结合金胶体。
混合Gold Colloid(40nm、9.0×1010(粒子数/ml)、British BiocellInternational公司制)和下述序列号12所示的含巯基的寡核苷酸，在50℃下孵育16小时。以6000rpm离心分离15分钟，除去上清，添加0.05M氯化钠、5mM磷酸缓冲液(pH为7)并混合后，再次在50℃下孵育40小时。
孵育后，进行离心(6000rpm、15分钟)，除去上清，添加5mM磷酸缓冲液(pH为7)。再次进行该缓冲液置换。
将制备的金胶体溶液以均匀的方式添加到玻璃纤维制垫中后，用真空干燥机干燥，制成结合垫。
(含巯基的寡核苷酸)：5’-TTGGCTCTGTCTCCGTTGTC-SH-3’(序列号12)
序列号12所示的含巯基寡核苷酸为3’末端的胞嘧啶核苷酸的3’位的磷酸基与HO-(CH2)m-SH(m为6)表示的化合物的羟基通过磷酸酯键结合的寡核苷酸。
另外，按照以下顺序制作固定化有与上述固定化用标签序列(序列号9)结合的标签捕获机构的固相载体(膜)。
作为标签捕获机构，使用分配器将含有下述序列号11所示的寡核苷酸探针的溶液涂布到Merck Millipore公司制造的硝基纤维素膜(Hi-Flow180)上，涂布成与展开方向正交的宽度为1mm的线状。然后，通过在40℃下干燥30分钟，制成具备标签捕获机构的膜。
(寡核苷酸探针)：5’-CACTGGGCATACGGTAGCAT-3’(序列号11)
为了通过核酸色谱法进行检测，按照以下的顺序制作横向流动型核酸检测装置。
所制作的横向流动型核酸检测装置按照图7的示意图的检测装置制作。
即，作为具备作为基材75的聚丙烯制背板(Lohmann公司)，作为结合垫72的上述制作的寡核苷酸结合金胶体保持结合垫、部分76的膜(固相载体)71，将如上制作的具备作为标签捕获机构的寡核苷酸探针(序列号11)的膜、作为样品垫73的玻璃纤维制的样品垫、作为吸收垫74的纤维素制的吸收垫分别如图7所示地重叠贴合，制作横向流动型核酸检测装置700。
<2.利用PCR进行的核酸扩增>
作为引物组使用表2所示的引物，作为模板使用鼠伤寒沙门氏菌的基因组DNA，按照下述表3制备试验区1～6的PCR反应液。
表3
成分 1 2 3 4 5 6
10μM TMP 1F-Mem溶液 0.5 0 0 0.5 0 0.5
10μM TMP 1R-2F溶液 0.5 0.5 0 0.5 0.5 0.5
10μM TMP 2R-3R溶液 0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
10μM TMP 3F-Au溶液 0 0 0.5 0 0.5 0.5
各2.5 mM dNTP混合液 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6
10×Taq缓冲液(配合20mM Mg<sup>2+</sup>) 2 2 2 2 2 2
5 U/μl Takara TaqHS 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA(1ng/μl) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
灭菌蒸馏水 14.7 14.7 14.7 14.2 14.2 13.7
(表中的单位：μl)
将上述各试验区的PCR反应液置于热循环仪(Bior公司、LifeEco)中，在95℃下反应2分钟后，进行30次98℃—10秒/60℃—30秒/72℃—30秒的循环。
PCR产物的确认通过凝胶电泳和核酸色谱法进行。
利用凝胶电泳进行的分析是通过将5μl的反应液在2％的琼脂糖凝胶中分离后、用溴化乙锭染色、检测条带来进行的。
通过核酸色谱法进行的分析是将5μl的反应液添加到具有按照上述顺序制作的图7所示的结构的横向流动型核酸检测装置700的样品垫73上后，将60μl的展开缓冲液添加到样品垫73上进行展开，5分钟后，确认膜1的部分6中的线着色。
<3.结果>
凝胶电泳的结果如图8所示。在使用了实施方式1的全部引物组的条件(试验区6)下，可以确认到目标核酸1～3连接而成的扩增产物。试验区6中，除了目标核酸1～3连接而成的扩增产物以外，还确认到目标核酸1～3中的1个的扩增产物和2个连接而成的扩增产物。试验区1～5中，确认到生成了与引物的组合对应的扩增产物。
试验区1～6的各PCR反应液供至通过横向流动型核酸检测装置700进行的核酸色谱的结果如图9所示。仅显示3种扩增产物连接而成的6条线着色。
由以上的结果确认，将含有全部目标核酸1～3的鼠伤寒沙门氏菌的基因组DNA作为模板，在使用了实施方式1的引物组的试验区6中得到的PCR反应液中得到了图3(C)所示的核酸扩增产物1。
<4.特异性的确认>
为了评价使用了由TMP1F-Mem、TMP1R-2F、TMP2R-3R及TMP3F-Au构成的本发明的实施方式1的引物组的鼠伤寒沙门氏菌的判别方法的特异性，使用多个沙门属菌进行检测评价。使用从多个沙门属菌中提取的基因组DNA作为模板，除此以外，在上述试验区6的条件下进行评价。
使用了横向流动型核酸检测装置700的核酸色谱法的结果如图10所示。使用了本发明的实施方式1的引物组和核酸色谱法的本方法显示：仅在将鼠伤寒沙门氏菌作为模板的情况下显示线着色，具有充分的特异性。
核酸色谱法中仅将PCR反应液和展开缓冲液加入到芯片上时就能够进行检测，除了操作简便以外，还具有不需要准备凝胶、处理溴化乙锭等危险试剂等优点。另外。检测时间也与凝胶电泳的约60分钟相比，能够缩短约5分钟的检查时间。
<比较例>
作为比较例，除了使用序列号1～6的引物以外，进行与上述4同样的操作。
PCR反应后进行凝胶电泳，进行条带模式的分析。
将结果示于图11。仅在使用鼠伤寒沙门氏菌的基因组DNA作为模板的情况下，能够进行检测出3种条带的特异性检测。
使用了本发明的实施方式1的引物组和核酸色谱法的随机扩增产物的检测中，如图10所示，仅在鼠伤寒沙门氏菌的情况下显示出线着色，与此相对，在图11所示的通过凝胶电泳进行的分析中，存在检测出1条或2条条带的情况，考虑难以进行分析。
[实施例2]
使用实施方式2的引物组，以含有2个目标DNA的核酸试样为模板进行PCR，通过核酸色谱法和凝胶电泳确认PCR反应液中所含的扩增产物。
将病原性微生物的DNA中所含的碱基数为208的区域作为第1目标区域，将碱基数为131的区域作为第2目标区域。将各目标区域中的一个DNA链作为目标核酸。
以下，参照图4所示的符号进行说明。
作为末端引物A200，使用了由与第1目标核酸的5’末端的24个碱基的区域相同的碱基序列201、和在碱基序列201的5’末端侧通过上述式I所示的二价基团与其3’末端结合的标记用标签序列(序列号10)构成的DNA。标记用标签序列(序列号10)是固定于作为标记物质的金胶体的标记物质侧标签序列(序列号12)的互补序列。
作为第1反向引物210，使用了含有与第1目标核酸的互补链的5’末端的25个碱基的区域相同的碱基序列211、和在碱基序列211的5’末端侧与其3’末端结合的碱基数为20的碱基序列B1212的DNA。
作为第2正向引物220，使用了含有与第2目标核酸的5’末端的20个碱基的区域相同的碱基序列221、和在碱基序列221的5’末端侧与其3’末端结合的碱基数为20的碱基序列D2222的DNA。碱基序列B1212和碱基序列D2222彼此为互补序列。
作为末端引物B230，使用了由与第2目标核酸的互补链的5’末端的20个碱基的区域相同的碱基序列231、和在碱基序列231的5’末端侧通过上述式I所示的二价基团与其3’末端结合的固定化用标签序列(序列号9)构成者。固定标签序列(序列号9)是固定在作为固相载体的膜上的固相侧标签序列(序列号11)的互补序列。
作为模板DNA，准备：使用了含有第1目标区域但不含第2目标区域的DNA的试验区(模板1)、使用了含有第2目标区域但不含第1目标区域的DNA的试验区(模板2)、使用了含有第1目标区域和第2目标区域的DNA的试验区(模板1+2)、不含模板DNA的试验区(N)。
在上述表2所示的PCR反应液中，作为引物成分，使用上述的末端引物A200、第1反向引物210、第2正向引物220、末端引物B230，作为模板DNA，使用与上述各试验区对应的模板DNA，使用灭菌蒸馏水使最终容量达到20.0μl，除此以外，制备与表2同样的PCR反应液。
对于各试验区，制备末端引物A200：第1反向引物210：第2正向引物220：末端引物B230的摩尔比为1：1：1：1的PCR反应液和为1：0.1：0.1：1的PCR反应液。
PCR、核酸色谱法、凝胶电泳在与实施例1同样的条件下进行。
将核酸色谱法的结果示于图12的上半部分，将凝胶电泳的结果示于图12的下半部分。
在模板1+2试验区中，在使用了末端引物A200：第1反向引物210：第2正向引物220：末端引物B230的摩尔比为1：0.1：0.1：1的PCR反应液的情况下，能够以充分量生成第1目标核酸与第2目标核酸连接而成的扩增产物，在核酸色谱法中检测为一个着色带。
产业上的可利用性
本发明的引物组、方法和试剂盒对核酸的检测是有用的。
本说明书中引用的全部刊物、专利及专利申请通过引用直接纳入本说明书中。
序 列 表
<110> 株式会社钟化
<120> 用于检测2个以上的目标核酸的引物组、试剂盒及方法
<130> B160691
<150> JP 2016-132066
<151> 2016-07-01
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> TMP1F引物
<400> 1
atgcgggtat gacaaaccct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> TMP1R引物
<400> 2
ttagccccat ttggaccttt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> TMP2F引物
<400> 3
cagaccaggt aagtttctgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> TMP2R引物
<400> 4
cgcatatttg gtgcagaaat 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> TMP3F引物
<400> 5
tttacctcaa tggcggaacc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> TMP3R引物
<400> 6
cccaaaagct gggttagcaa 20
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> TMP1F-Mem引物
<220>
<223> 第20位的鸟嘌呤核苷酸和第21位的腺嘌呤核苷酸通过式I的二价基团连接。
<400> 7
atgctaccgt atgcccagtg atgcgggtat gacaaaccct 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> TMP3F-Au引物
<220>
<223> 第20位的鸟嘌呤核苷酸和第21位的胸腺嘧啶核苷酸通过式I的二价基团连接。
<400> 8
gacaacggag acagagccaa tttacctcaa tggcggaacc 40
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> tag序列
<400> 9
atgctaccgt atgcccagtg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> tag序列
<400> 10
gacaacggag acagagccaa 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> tag序列
<400> 11
cactgggcat acggtagcat 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> tag序列
<400> 12
ttggctctgt ctccgttgtc 20

Claims (10)

1.一种引物组，其是用于制备能够在固相载体上检测的核酸扩增产物的引物组，其包含：
末端引物A，其包含在3’末端部含有与第1目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸，
第k双头引物，其包含在5’末端侧连接的2个多核苷酸，所述2个多核苷酸中的一个在3’末端部含有与第k目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列，所述2个多核苷酸中的另一个在3’末端部含有与第(k+1)目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列，和
末端引物B，其包含在3’末端部含有与第N目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸；
其中，N为2以上的整数，
k为从1到N-1的整数，
作为所述第k双头引物，包含k为1的情况至k为N-1的情况，
所述末端引物A和所述末端引物B中的一个还包含标记部，所述标记部为标记物质或能够与标记物质结合的标签；另一个还包含结合部，所述结合部为能够与固相载体结合的标签。
2.根据权利要求1所述的引物组，其中，
所述结合部为含有能够与所述固相载体结合的多核苷酸的标签。
3.一种检测2个以上的目标核酸的方法，其包含：
检测用试样制备工序：包含将从分析对象试样获得的核酸作为模板，使用权利要求1或2所述的引物组进行核酸扩增反应，和
检测工序：将在所述检测用试样制备工序中得到的核酸扩增反应的产物用作检测用试样，使有可能含有检测用核酸的所述检测用试样与固相载体接触，所述检测用核酸含有连接的2个以上的目标核酸、标记部和结合部，所述标记部为标记物质或能够与标记物质结合的标签，所述结合部为能够与固相载体结合的标签，所述固相载体的至少一部分包含能够与所述结合部结合的部分，以所述标记部为指标，对所述固相载体的所述部分中的所述检测用核酸进行检测。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，
所述检测用试样制备工序包含：使用2组以上的权利要求1或2所述的引物组，将从分析对象试样获得的核酸作为模板进行核酸扩增反应，所述2组以上的所述引物组设计为能够制备2个以上的所述检测用核酸，所述2个以上的所述检测用核酸所含的2个以上的目标核酸的组合不同、且具备能够结合在所述固相载体的不同位置的所述结合部；
所述检测工序包含：使所述检测用试样制备工序中得到的所述检测用试样与所述固相载体接触，将所述标记部作为指标，在所述固相载体中分别检测所述2个以上的检测用核酸中的每一个。
5.一种试剂盒，其是用于检测分析对象试样中的2个以上的目标核酸的试剂盒，其包含：
权利要求1或2所述的引物组，和
至少一部分含有能够与所述结合部结合的部分的固相载体。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，其含有所述固相载体作为核酸检测装置，所述核酸检测装置具备所述固相载体和用于收纳核酸扩增反应的产物的反应体系收纳部。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其中，
所述标记部为能够与标记物质结合的标签，
所述试剂盒还包含能够与所述标记部的所述标签结合的标记物质。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，
其包含所述标记物质和所述固相载体作为核酸检测装置，所述核酸检测装置具备所述固相载体、保持所述标记物质的标记物质保持部、和用于收纳核酸扩增反应的产物的反应体系收纳部。
9.一种引物组，其为用于制备核酸扩增产物的引物组，其包含：
末端引物A，其包含在3’末端部含有与第1目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸，
第k双头引物，其包含在5’末端侧连接的2个多核苷酸，所述2个多核苷酸中的一个在3’末端部含有与第k目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列，所述2个多核苷酸中的另一个在3’末端部含有与第(k+1)目标核酸的碱基序列的互补序列的3’末端部杂交的碱基序列，和
末端引物B，其包含在3’末端含有与第N目标核酸的碱基序列的3’末端部杂交的碱基序列的多核苷酸，
其中，N为2以上的整数，
k为从1到N-1的整数，
作为所述第k双头引物，包含从k为1的情况至k为N-1的情况。
10.一种检测2个以上的目标核酸的方法，其包含下述工序：
核酸扩增工序：以从分析对象试样获得的核酸为模板，使用权利要求9所述的引物组进行核酸扩增反应，和
检测工序：检测所述核酸扩增工序中的核酸扩增反应的产物中的所述核酸扩增产物。
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