KR20230038926A - 염 매개의 핵산 고정화 방법, 상기 방법에 따라 고정화된 포획 핵산을 포함하는 고형 지지체, 상기 고형 지지체를 포함하는 측방 유동 분석 스트립, 및 표적 핵산 검출 방법 - Google Patents
염 매개의 핵산 고정화 방법, 상기 방법에 따라 고정화된 포획 핵산을 포함하는 고형 지지체, 상기 고형 지지체를 포함하는 측방 유동 분석 스트립, 및 표적 핵산 검출 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 염 매개의 핵산 고정화 방법, 상기 방법에 따른 고정화된 핵산 프로브를 포함하는 고형 지지체, 상기 고형 지지체를 포함하는 측방 유동 분석 스트립 및 표적 핵산 검출 방법 에 관한 것이다.
본 발명의 염 매개의 핵산 고정화 방법에 따르면, 스트렙타비딘-비오틴, 자외선 조사, 및 열처리 등이 요구되는 종래의 방법에 비해 원심분리기, 자외선 조사 장치, 및 가열장치와 같은 값비싼 시약 또는 장비가 필요하지 않아 자원이 제한된 환경에서도 적용이 가능하고 생산 비용을 줄일 수 있다. 또한, 본 발명의 염 매개의 핵산 고정화 방법은 공정이 간소화되어 단시간 내에 공정을 완료될 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 신호 강도가 현저히 개선되고, 장기 보관 안정성이 우수한, 고정화된 포획 핵산을 포함하는 고형 지지체를 제조할 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 고정화된 포획 핵산을 포함하는 고형 지지체는 측방 유동 분석 스트립을 포함한 다양한 진단 키트 또는 검출 키트에 적용이 가능하므로, 국내외 진단 키트 분야 및 산업의 발전에 큰 기여를 할 수 있을 것으로 기대된다.
또한, 본 발명의 표적 핵산 검출 방법에 따르면 표적 핵산을 높은 민감도 및 특이도로 검출할 수 있다.
본 발명의 염 매개의 핵산 고정화 방법에 따르면, 스트렙타비딘-비오틴, 자외선 조사, 및 열처리 등이 요구되는 종래의 방법에 비해 원심분리기, 자외선 조사 장치, 및 가열장치와 같은 값비싼 시약 또는 장비가 필요하지 않아 자원이 제한된 환경에서도 적용이 가능하고 생산 비용을 줄일 수 있다. 또한, 본 발명의 염 매개의 핵산 고정화 방법은 공정이 간소화되어 단시간 내에 공정을 완료될 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 신호 강도가 현저히 개선되고, 장기 보관 안정성이 우수한, 고정화된 포획 핵산을 포함하는 고형 지지체를 제조할 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 고정화된 포획 핵산을 포함하는 고형 지지체는 측방 유동 분석 스트립을 포함한 다양한 진단 키트 또는 검출 키트에 적용이 가능하므로, 국내외 진단 키트 분야 및 산업의 발전에 큰 기여를 할 수 있을 것으로 기대된다.
또한, 본 발명의 표적 핵산 검출 방법에 따르면 표적 핵산을 높은 민감도 및 특이도로 검출할 수 있다.
Description
본 발명은 염 매개의 핵산 고정화 방법, 상기 방법에 따라 고정화된 포획 핵산을 포함하는 고형 지지체, 상기 고형 지지체를 포함하는 측방 유동 분석 스트립, 및 표적 핵산 검출 방법에 관한 것이다.
분자 진단은 DNA 또는 RNA 등 질병의 근본을 진단하는 것으로 감염 질환 진단, 암 진단, 유전 질환 진단, 및 맞춤 진단 등 다양한 분야에서 사용되고 있다. 대표적인 분자 진단 기술로는 단시간 내에 DNA를 증폭시키는 PCR 기술이 있다 (Saiki, R., et. al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, 487-91. 1998). 그러나, 일반적인 PCR 기술은 증폭된 DNA를 확인하기 위해서 전기영동 방법을 사용하여야 한다. 이러한 전기영동을 수행하기 위해서는 아가로즈 젤 (Agarose gel)을 만들고 DNA를 EtBr 등으로 염색하여 확인해야 하는 번거로움이 있다. 이러한 이유 때문에 현장진료(point of care; POC)에 적용하기에는 적합하지 않다.
최근에 사용되고 있는 real-time PCR 방법은 형광을 사용하기 때문에 전기영동이 불필요하나, 고가의 사용 기기와 고가의 형광 시약을 사용해야 한다 (Higuchi, R., et. al., Kinetic PCR Analysis: Real-time Monitoring of DNA Amplification Reactions. Nature Biotechnology 11, 1026 - 1030, 1993)는 문제점이 있다. 또한, 사용해야 하는 형광 파장수가 제한되어 있기 때문에 현실적으로 5개 이상의 다중 PCR (multiplex PCR)을 실시하기에는 어려운 한계점을 지니고 있다. 이러한 이유로, 검사실에서는 PCR 기술을 이용한 검사를 하기에 어려움이 많아 일반적으로 대학병원과 같은 대형병원에서만 주로 사용하고 있는 실정이다.
또한, 최근에 현장 진단 개념의 PCR 제품인 Cepheid 사의 GeneXprt system과 시약이 개발되어 판매되고 있으나, 장비와 시약이 매우 고가이므로 일반적인 검사에서 사용하는 데는 어려움이 있다 (Helb, D., et. al., Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis and Rifampin Resistance by Use of On-Demand, Near-Patient Technology. J. Clin. Microbiol. 48, 229-237, 2010).
이에 따라, 최근 PCR 후에 젤 전기영동 대신 멤브레인을 사용하여 확인하는 핵산 측방 유동 분석 (Nucleic Acid Lateral Flow Assay; NALFA) 방법이 주목을 받고 있다 (Aveyard, J., et. al., One step visual detection of PCR products with gold nanoparticles and a nucleic acid lateral flow (NALF) device. Chem. Commun., 41, 4251-4253, 2007).
상기 NALFA 방법은 PCR(중합효소 연쇄 반응), RPA(재조합 중합효소 증폭), LAMP(루프 매개 등온 증폭) 등의 표적 핵산 증폭 방법과 결합하여 이용할 수 있고, 충분한 검출 민감도 및 사용 용이성이 있기 때문이다. 최근 많은 연구에서, 핵산 증폭 방법과 측방 유동 분석 방법을 함께 사용하여 표적 핵산을 높은 민감도로 검출할 수 있다는 보고가 있었다. 예를 들어, LAMP와 결합하여 SARS-CoV-2 유전자의 세 영역(RdRp, ORF3a 및 뉴클레오캡시드(N)-단백질 유전자)을 동시에 검출할 수 있는 최초의 NALFA 방법이 Yu 등에 의해 개발되었다. 상기 방법은 각 유전자를 충분한 검출한계(LOD)로 SARS-CoV-2를 검출하여 RT-PCR에 근접하는 결과를 나타내도록 한다.
한편, 상기 NALFA를 수행하려면 표적 핵산을 특이적으로 인식하는 포획 핵산이 고형 지지체(예: 니트로셀룰로오스(NC) 멤브레인)에 고정되어야 한다.
따라서, 포획 핵산을 고정시키기 위해 비오틴-결합된 포획 핵산과 스트렙타비딘을 이용하는 방법이 널리 이용되고 있다. 그러나 포획 핵산과 스트렙타비딘-비오틴의 복합체를 제조하려면 포획 핵산을 비오틴으로 결합시키는 과정, 및 스트렙타비딘과 비오틴이 결합된 포획 핵산 사이의 사전 배양 과정, 및 결합되지 않은 스트렙타비딘 분자의 분리 과정 등이 필요하므로 NALFA의 준비를 복잡하게 한다(도 1A 참조). 또한, 포획 핵산의 고정화를 위해 스트렙타비딘-비오틴 상호작용이 이용되기 때문에, 비색 신호의 생성을 위해 다른 분자(예: digoxigenin) 및 그 항체(예: anti-digoxigenin 항체)가 필요하므로 전체 분석 비용이 증가하게 된다.
또한, 포획 핵산을 자외선 조사(도 1B 참조), 또는 열처리(도 1C 참조)하여 NC 멤브레인에 직접 고정시키는 방법이 있다. 포획 핵산을 직접 고정시키는 방법이므로 매우 유리하지만 자외선 조사 장치 또는 가열 장치와 같은 값비싼 특수 장비가 필요하고, 가혹한 조건(예: 자외선 여기, 60 ℃에서 가열)으로 인해 포획 핵산이 손상될 수 있는 문제점이 있다.
이에 따라, 특수 장비가 없는 제한된 환경에서도 이용이 가능하고, 생산 비용 및 작업 시간을 줄일 수 있는 핵산 고정화 방법이 필요한 실정이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 목적은 원심분리기, 자외선 조사 장치, 가열장치 등의 특별한 장비가 필요하지 않아 자원이 제한된 환경에서도 적용이 가능하고, 생산 비용과 작업 시간을 줄일 수 있는 핵산 고정화 방법을 제공하는 데 있다. 또한, 본 발명의 목적은 장기 보관 안정성이 증가하고, 고정화 성능 및 재현성이 우수한 핵산 고정화 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 제조 단가가 낮고, 장기 보관 안정성이 우수하며, 고정화 성능 및 재현성이 우수하고, 다양한 핵산 검출 장치에 적용이 가능한, 고정화된 포획 핵산을 포함하는 고형 지지체를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 제조 단가가 낮고, 장기 보관 안정성이 우수하며, 고정화 성능 및 재현성이 우수한 측방 유동 분석 스트립을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 높은 민감도 및 특이도로 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 고형 지지체를 금속염 및 포획 핵산으로 처리하는 단계;를 포함하는 염 매개의 핵산 고정화 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 고형 지지체는 니트로셀룰로오스 멤브레인 또는 나일론 멤브레인일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 금속염은 금속 염화물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 금속염은 1가 또는 2가 금속염일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 금속염은 NaCl, KCl, MgCl2 및 CaCl2 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 금속염의 처리는 0.2 내지 2.5 M 농도의 금속염을 함유하는 용액으로 처리하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 포획 핵산은 카본 링커(carbon linker)를 이용하여 5’ 말단 및 3’ 말단 중 어느 하나 이상에 아민기를 추가한 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 포획 핵산은 5’ 말단에 형광 물질인 FAM을 부착한 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 포획 핵산은 단일 가닥일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 포획 핵산은 DNA, RNA, PNA, CNA, HNA, LNA 또는 ANA일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 방법은 고형 지지체에 금속염 용액을 처리한 후 포획 핵산 용액으로 처리하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 방법은 고형 지지체에 금속염 및 포획 핵산을 포함하는 혼합 용액으로 처리하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 방법 이후에 상기 포획 핵산이 고정된 지지체에 자외선을 조사하는 단계;를 추가하여 수행할 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명은 상기한 방법에 따라 고정화된 포획 핵산을 포함하는 고형 지지체를 제공한다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명은 상기 고형 지지체를 포함하는 측방 유동 분석 스트립을 제공한다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명은 (1) 고형 지지체를 금속염 및 포획 핵산으로 처리하는 단계; (2) 표적 핵산에 표지체를 도입하는 단계; (3) 상기 고정화시킨 포획 핵산과 표적 핵산을 하이브리다이징시켜 이중가닥 핵산을 형성하는 단계; 및 (4) 상기 이중가닥 핵산에 도입된 상기 표지체를 검출하는 단계;를 포함하는 표적 핵산의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 염 매개의 핵산 고정화 방법에 따르면, 스트렙타비딘-비오틴, 자외선 조사, 및 열처리 등이 요구되는 종래의 방법에 비해 원심분리기, 자외선 조사 장치, 및 가열장치와 같은 값비싼 시약 또는 장비가 필요하지 않아 자원이 제한된 환경에서도 적용이 가능하고 생산 비용을 줄일 수 있다. 또한, 본 발명의 염 매개의 핵산 고정화 방법은 공정이 간소화되어 단시간 내에 공정을 완료될 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 신호 강도가 현저히 개선되고, 장기 보관 안정성이 우수한, 고정화된 포획 핵산을 포함하는 고형 지지체를 제조할 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 고정화된 포획 핵산을 포함하는 고형 지지체는 측방 유동 분석 스트립을 포함한 다양한 진단 키트 또는 검출 키트에 적용이 가능하므로, 국내외 진단 키트 분야 및 산업의 발전에 큰 기여를 할 수 있을 것으로 기대된다.
또한, 본 발명의 표적 핵산 검출 방법에 따르면 표적 핵산을 높은 민감도 및 특이도로 검출할 수 있다.
도 1은 기존의 핵산 고정화 방법을 간단히 나타내는 개요도로서, 도 1A는 비오틴-스트렙타비딘 매개 핵산 고정화 방법을 간단히 나타내는 것이고, 도 1B는 자외선 매개 핵산 고정화 방법을 간단히 나타내는 것이며, 도 1C는 열 매개 핵산 고정화 방법을 간단히 나타내는 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 염 매개 핵산 고정화 방법을 간단히 나타낸 개요도이다.
도 3A는 본 발명의 일 실시예에서, 다양한 핵산 고정화 조건 간의 신호 강도를 비교하여 나타낸 LFA 스트립 이미지이다.
도 3B는 본 발명의 일 실시예에 따른 염(KCl) 매개 핵산 고정화 방법에 기존의 다양한 핵산 고정화 방법을 병용한 경우의 신호 강도를 나타낸 LFA 스트립 이미지, 및 상기 신호 강도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법의 최적화 조건을 확인하기 위해, 다양한 조건으로 LFA 스트립을 제조한 후 신호 강도를 나타낸 것으로, 도 4A는 포획 핵산의 농도에 따른 신호 강도의 변화를 나타내는 것이고, 도 4B는 포획 핵산의 변형에 따른 신호 강도의 변화를 나타내는 것이며, 도 4C는 금속염의 종류에 따른 신호 강도의 변화를 나타내는 것이고, 도 4D는 금속염의 농도에 따른 신호 강도의 변화를 나타내는 것이다.
도 5는 포획 핵산의 변형에 따른 신호 강도의 변화를 나타내는 것으로, 포획 핵산에 다양한 탄소수의 카본 링커를 이용하여 5’ 말단 및 3’ 말단 중 어느 하나 이상에 아민기를 추가한 것과 포획 핵산의 5’말단에 FAM을 부착한 것의 신호 강도를 측정하여 나타낸 LFA 스트립 이미지이다.
도 6은 본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법에 따라 금속염 및 포획 핵산을 포함하는 혼합 용액을 NC 멤브레인에 떨어뜨린 후 실온에서 건조하되, 건조 조건에 따른 신호 강도의 변화를 나타내는 것으로, 도 6A는 건조 시간 경과에 따른 신호 강도 변화를 나타낸 것이고, 도 6B는 건조 온도 증가에 따른 신호 강도 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법을 적용하여 LFA 스트립을 제조한 후 다양한 조건으로 보관하면서 보관 시간 경과에 따른 신호 강도를 확인한 것으로, 도 7A은 상기 제조한 LFA 스트립을 실온에서 보관한 것이고, 도 7B는 4 ℃에서 보관한 것이다. 또한, 도 7C는 상기 제조한 LFA 스트립을 5분 동안 자외선을 조사한 후 실온에서 보관한 것이고, 도 7D는 5분 동안 자외선을 조사한 후 4 ℃에서 보관한 것이다.
도 8A는 본 발명의 일 실시예에 따른 염(CaCl2) 매개 핵산 고정화 방법(Salt mediated immobilization of nucleic acids; SAIoNs)에 기존의 다양한 핵산 고정화 방법(Heat, 또는 자외선 처리)을 병용한 경우의 신호 강도를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 8B 및 도 8C는 본 발명의 방법과 자외선 처리를 병용한 실험군(SAIoNs+UV), 본 발명의 방법만을 적용한 실험군(SAIoNs), 및 기존의 자외선 처리만을 적용한 실험군(Conventional UV) 각각의 합성 DNA 생성물의 농도에 따른 비색 신호 강도를 비교하고자 하는 것으로, 도 8B는 각 실험군의 합성 DNA 생성물의 농도에 따른 신호 강도를 나타내는 그래프이고, 도 8C는 각 실험군의 합성 DNA 생성물의 농도에 따른 LFA 스트립 이미지를 나타내는 것이다. 도 8C에서 검은색 화살표는 각 사례의 시각적 LOD(검출 한계)를 표시한 것이다.
도 9는 본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법을 이용하여 SARS-CoV-2 유전자를 검출하는 방법을 간단히 나타낸 개요도이다.
도 10A는 SARS-CoV-2의 Orf1b 및 N 유전자에 대한 본 발명의 각각의 포획 DNA와 각각의 단일 가닥 앰플리콘 간의 서열 특이성을 나타내는 LFA 스트립 이미지 및 상기 스트립의 비색 신호 강도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 10B는 SARS-CoV-2의 Orf1b 유전자에 대한 검출 민감도를 확인하는 LFA 스트립 이미지, 및 이의 신호 강도를 정량화하여 나타낸 그래프이고, 도 10C는 SARS-CoV-2의 N 유전자에 대한 검출 민감도를 확인하는 LFA 스트립 이미지, 및 이의 신호 강도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 염 매개 핵산 고정화 방법을 간단히 나타낸 개요도이다.
도 3A는 본 발명의 일 실시예에서, 다양한 핵산 고정화 조건 간의 신호 강도를 비교하여 나타낸 LFA 스트립 이미지이다.
도 3B는 본 발명의 일 실시예에 따른 염(KCl) 매개 핵산 고정화 방법에 기존의 다양한 핵산 고정화 방법을 병용한 경우의 신호 강도를 나타낸 LFA 스트립 이미지, 및 상기 신호 강도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법의 최적화 조건을 확인하기 위해, 다양한 조건으로 LFA 스트립을 제조한 후 신호 강도를 나타낸 것으로, 도 4A는 포획 핵산의 농도에 따른 신호 강도의 변화를 나타내는 것이고, 도 4B는 포획 핵산의 변형에 따른 신호 강도의 변화를 나타내는 것이며, 도 4C는 금속염의 종류에 따른 신호 강도의 변화를 나타내는 것이고, 도 4D는 금속염의 농도에 따른 신호 강도의 변화를 나타내는 것이다.
도 5는 포획 핵산의 변형에 따른 신호 강도의 변화를 나타내는 것으로, 포획 핵산에 다양한 탄소수의 카본 링커를 이용하여 5’ 말단 및 3’ 말단 중 어느 하나 이상에 아민기를 추가한 것과 포획 핵산의 5’말단에 FAM을 부착한 것의 신호 강도를 측정하여 나타낸 LFA 스트립 이미지이다.
도 6은 본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법에 따라 금속염 및 포획 핵산을 포함하는 혼합 용액을 NC 멤브레인에 떨어뜨린 후 실온에서 건조하되, 건조 조건에 따른 신호 강도의 변화를 나타내는 것으로, 도 6A는 건조 시간 경과에 따른 신호 강도 변화를 나타낸 것이고, 도 6B는 건조 온도 증가에 따른 신호 강도 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법을 적용하여 LFA 스트립을 제조한 후 다양한 조건으로 보관하면서 보관 시간 경과에 따른 신호 강도를 확인한 것으로, 도 7A은 상기 제조한 LFA 스트립을 실온에서 보관한 것이고, 도 7B는 4 ℃에서 보관한 것이다. 또한, 도 7C는 상기 제조한 LFA 스트립을 5분 동안 자외선을 조사한 후 실온에서 보관한 것이고, 도 7D는 5분 동안 자외선을 조사한 후 4 ℃에서 보관한 것이다.
도 8A는 본 발명의 일 실시예에 따른 염(CaCl2) 매개 핵산 고정화 방법(Salt mediated immobilization of nucleic acids; SAIoNs)에 기존의 다양한 핵산 고정화 방법(Heat, 또는 자외선 처리)을 병용한 경우의 신호 강도를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 8B 및 도 8C는 본 발명의 방법과 자외선 처리를 병용한 실험군(SAIoNs+UV), 본 발명의 방법만을 적용한 실험군(SAIoNs), 및 기존의 자외선 처리만을 적용한 실험군(Conventional UV) 각각의 합성 DNA 생성물의 농도에 따른 비색 신호 강도를 비교하고자 하는 것으로, 도 8B는 각 실험군의 합성 DNA 생성물의 농도에 따른 신호 강도를 나타내는 그래프이고, 도 8C는 각 실험군의 합성 DNA 생성물의 농도에 따른 LFA 스트립 이미지를 나타내는 것이다. 도 8C에서 검은색 화살표는 각 사례의 시각적 LOD(검출 한계)를 표시한 것이다.
도 9는 본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법을 이용하여 SARS-CoV-2 유전자를 검출하는 방법을 간단히 나타낸 개요도이다.
도 10A는 SARS-CoV-2의 Orf1b 및 N 유전자에 대한 본 발명의 각각의 포획 DNA와 각각의 단일 가닥 앰플리콘 간의 서열 특이성을 나타내는 LFA 스트립 이미지 및 상기 스트립의 비색 신호 강도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 10B는 SARS-CoV-2의 Orf1b 유전자에 대한 검출 민감도를 확인하는 LFA 스트립 이미지, 및 이의 신호 강도를 정량화하여 나타낸 그래프이고, 도 10C는 SARS-CoV-2의 N 유전자에 대한 검출 민감도를 확인하는 LFA 스트립 이미지, 및 이의 신호 강도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 고형 지지체에 고형 지지체를 금속염 및 포획 핵산으로 처리하는 단계;를 포함하는 염 매개의 핵산 고정화 방법에 관한 것이다.
상기 고형 지지체는 니트로셀룰로오스(NC), 나일론, 폴리술폰, 폴리에테르술폰 또는 PVDF(Polyvinylidene fluoride)와 같은 멤브레인 재질일 수 있고, 바람직하게는 니트로셀룰로오스 멤브레인 재질일 수 있다.
상기 금속염 및 포획 핵산은 각각 완충액에 용해시킨 용액의 형태로 처리될 수 있다. 상기 완충액은 증류수이거나, 0.2%(v/v) Tween 20 및 20 mM 붕산나트륨(pH 8.0) 중에서 선택된 1종 이상을 함유할 수 있다.
상기 금속염은 금속 염화물일 수 있다. 또한, 상기 금속염은 1가 또는 2가 금속염일 수 있고, 바람직하게는 NaCl, KCl, MgCl2 및 CaCl2 중에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 CaCl2일 수 있다.
상기 금속염은 0.2 내지 2.5 M, 바람직하게는 0.2 내지 1.6 M, 더욱 바람직하게는 0.3 내지 1.5 M, 더욱 바람직하게는 0.4 내지 1.0 M, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 1.0 M, 더욱 바람직하게는 0.6 내지 0.9 M의 농도의 용액으로 처리될 수 있다.
상기 금속염의 농도가 상기 하한치 미만이거나 상기 상한치를 초과하는 경우에는 본 발명의 염 매개 핵산 고정화 반응을 기대하기 어렵게 된다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, 금속염의 농도가 상기 범위를 벗어나는 경우에 LFA 스트립의 신호 강도가 현저히 낮아지는 것을 구체적으로 확인하였다(도 4D 참조).
상기 고형 지지체에 금속염을 처리하는 공정은 금속염을 일정 농도로 포함하는 용액에 고형 지지체를 침지하는 방식, 또는 고형 지지체에 금속염을 일정 농도로 포함하는 용액을 떨어뜨리는 방식으로 수행될 수 있다.
상기 포획 핵산은 카본 링커(carbon linker)를 이용하여 5’ 말단 및 3’ 말단 중 어느 하나 이상에 아민기(-NH2)를 추가한 것일 수 있다. 상기 카본 링커는 탄소수 3 내지 15, 바람직하게는 탄소수 3 내지 12, 더욱 바람직하게는 탄소수 6 내지 12, 더욱 바람직하게는 탄소수 12일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 포획 핵산을 카본 링커를 이용하여 5’ 말단 및 3’ 말단 중 어느 하나 이상에 아민기(-NH2)를 추가하여 변형한 경우에는 포획 핵산을 변형하지 않은 경우에 비해 LFA 스트립의 신호 강도가 현저히 높아지는 것을 구체적으로 확인하였다(도 4A). 또한, 포획 핵산을 탄소수 12개의 카본 링커를 이용하여 아민기(-NH2)를 추가하여 변형한 경우의 LFA 스트립의 신호 강도가 가장 높은 것을 구체적으로 확인하였다(도 4B 참조).
또한, 상기 포획 핵산은 5’ 말단에 형광 물질인 FAM을 부착한 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 포획 핵산에 FAM을 부착한 경우에는 FAM을 부착하지 않은 경우에 비해 LFA 스트립의 신호 강도가 현저히 높아지는 것을 구체적으로 확인하였다(도 5).
상기 포획 핵산은 단일 가닥일 수 있고, DNA, RNA, PNA, CNA, HNA, LNA 또는 ANA일 수 있다.
상기 포획 핵산은 30 내지 800 μM, 30 내지 300 μM, 30 내지 150 μM, 바람직하게는 60 내지 120 μM, 더욱 바람직하게는 60 내지 100 μM, 더욱 바람직하게는 70 내지 90 μM 농도의 용액으로 처리될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 금속염 및 포획 핵산의 농도는 10000 : 0.5 내지 5, 바람직하게는 10000 : 0.5 내지 2, 더욱 바람직하게는 10000 : 0.5 내지 1.5, 더욱 바람직하게는 10000 : 0.8 내지 1.2, 더욱 바람직하게는 10000 : 1의 비율일 수 있다.
상기 금속염 및 포획 핵산의 농도비가 상기 범위일 때 본 발명의 염 매개 핵산 고정화 반응이 잘 일어나고, 상기 범위를 벗어나는 경우에는 본 발명의 염 매개 핵산 고정화 반응을 기대하기 어렵다.
본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법은 고형 지지체에 금속염 용액을 처리한 후 포획 핵산 용액으로 처리하는 방법, 또는 고형 지지체에 금속염 및 포획 핵산을 포함하는 혼합 용액으로 처리하는 방법으로 수행될 수 있다. 공정 단순화, 생산 비용 절감 및 생산 시간 단축 측면에서는 고형 지지체에 금속염 및 포획 핵산을 포함하는 혼합 용액으로 처리하는 방법이 바람직하다.
상기 고형 지지체에 금속염 및 포획 핵산을 처리한 이후에는 상기 고형 지지체를 4 내지 45 ℃, 바람직하게는 16 내지 45 ℃, 더욱 바람직하게는 20 내지 30 ℃, 더욱 바람직하게는 23 내지 27 ℃에서 10 내지 60분 동안, 바람직하게는 20 내지 40분 동안, 더욱 바람직하게는 25 내지 35분 동안 건조시킬 수 있다.
한편, 고형 지지체에 금속염 및 포획 핵산을 처리한 이후에는 상기 포획 핵산이 고정된 지지체에 자외선을 조사하는 단계;를 추가하여 수행할 수 있다.
상기 자외선의 조사는 자외선 조사 장치를 이용하여 자외선을 총에너지 1 내지 10,000 mJ/cm2로 1 내지 30분 동안, 바람직하게는 2 내지 10분 동안, 더욱 바람직하게는 4 내지 6분 동안 조사하는 것일 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법에 자외선을 적용하는 경우 자외선을 적용하지 않는 경우에 비해 핵산 고정화 효율이 현저히 증가하게 된다. 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법을 적용한 후 자외선을 조사하여 제조한 LFA 스트립(SAIoNs+UV)의 경우 본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법만을 적용하여 제조한 LFA 스트립(SAIoNs)에 비해 비색 신호 강도가 현저히 높은 것을 구체적으로 확인하였다(도 8 참조).
또한, 본 발명은 상기한 방법에 따라 고정화된 포획 핵산을 포함하는 고형 지지체에 관한 것이다.
본 발명의 “염 매개의 핵산 고정화 방법”, “지지체”, “금속염”, 및“포획 핵산”에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명은 상기 고형 지지체를 포함하는 측방 유동 분석(LFA; Lateral flow assay) 스트립에 관한 것이다.
본 발명의 “염 매개의 핵산 고정화 방법”, “지지체”, “금속염”, 및“포획 핵산”에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
일 구현예에서, 본 발명의 측방 유동 분석 스트립은 스트립의 길이를 기준으로 하여 일단에서부터 타단 방향으로, (ⅰ) 검체 패드, (ⅱ) 접합 패드(conjugation pad), (ⅲ) 테스트 영역이 형성되어 있는 멤브레인을 포함하는 검출 영역, 및 (ⅳ) 흡수 패드가 순차적으로 배열되어 있다. 이러한 측방 유동 분석 스트립을 구성하는 4개의 영역은 전형적으로 플라스틱 접착제에 의하여 백킹 카드 또는 백킹 시트 상에 적층되어 있다. 또한, 각각의 패드는 상호 간에 접촉되거나 중첩(overlapped) 형태로 배치될 수 있는 바, 이는 분석 과정에서 액상 시료가 측방 유동 분석-기반 바이오센서를 따라 이동할 수 있도록 하기 위함이다. 전형적으로, 중첩된 영역의 폭은, 예를 들면 약 0.3 내지 5 mm, 구체적으로 약 0.5 내지 4 mm 범위일 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구체예에 있어서, 액상 시료(또는 분석 시료)는 검체 패드를 거쳐 접합 패드를 통과하고, 또한 멤브레인 형태의 검출 영역을 거치면서 테스트 영역을 거쳐 흡수 패드에 도달할 때까지 흐르게 된다. 이처럼, 검체 패드, 접합 패드, 멤브레인 형태의 검출 영역 및 흡수 패드는 모두 유체 연통되어 있다.
예시적 구체예에 있어서, 액상 시료 내 표적 핵산(타겟 검체)의 최소량(즉, 검출 한계; 검출 시 액상 시료에 존재해야 하는 표적 핵산의 최소량)은, 예를 들면 1 nM 이하, 바람직하게는 0.5 nM 이하일 수 있으나, 이는 예시적인 것으로서 표적 핵산의 종류, 특성 등에 따라 변화 가능하다.
상기 검체 패드는 액상 시료(또는 분석 시료)를 흡수하고, 액상 시료가 균일하게 유동할 수 있게 한다. 상기 액상 시료로는 전혈, 혈장, 혈청, 눈물, 침, 소변, 콧물, 체액 등이 사용될 수 있다.
검체 패드는 액상 시료에 포함될 수 있는 간섭물질에 의한 영향을 최소화하기 위해 필터링 기능을 추가로 가질 수 있다. 예를 들면, 전혈을 액상 시료로 사용할 경우 적혈구를 걸러주는 역할을 할 수 있는 좀 더 조밀한 패드를 쓰거나, 이들을 걸러주는 역할을 돕는 보조물질을 추가로 함유할 수 있다. 필요한 경우, 검체 패드의 업스트림에 액상 시료 내의 표적 핵산과 포획 핵산 사이의 반응을 증가시키거나 또는 간섭물질에 의해 영향을 배제할 수 있는 물질을 함유하는 보조 패드를 추가로 구비할 수 있다. 검체 패드는 액상 시료를 흡수할 수 있는 재료라면 그 종류가 제한되지 않으나, 바람직하게는 셀룰로오스, 폴리에스테르, 폴리프로필렌 또는 유리 섬유와 같은 재질로 이루어지는 것이 좋다.
상기 접합 패드는 신호를 검출하기 위한 금 나노입자가 존재할 수 있다.
상기 금 나노입자는 매우 강한 흡광 특성을 나타내며, 마이크로 또는 나노 사이즈에서 각각 다른 색상을 나타내는 광학 특성을 갖는데, 측방 유동 분석 기반의 바이오센서는 금 나노입자의 축적으로부터 생성되는 색상 시그널의 변화를 기반으로 한다. 특히, 바이오센서의 감도는, 예를 들면 샌드위치-타입의 면역 반응을 통하여 항체-고정 사이트 상에 포획된 금 나노입자의 축적량에 의존한다.
상기 검출 영역은 본 발명의 방법에 따라 고정화된 포획 핵산을 포함하고, 통상 테스트 영역(test zone)과 대조 영역(control zone)을 포함하여 이루어진다. 테스트 영역은 액상 시료에 표적 핵산이 존재하는지의 여부를 확인하기 위한 영역이며, 대조 영역은 액상 시료가 테스트 영역을 정상적으로 통과하였는지의 여부를 확인하기 위한 영역이다. 상기 검출 영역은 생물학적 반응 결과를 확인할 수 있는 수평 흐름이 가능한 멤브레인 형태일 수 있다. 상기 검출 영역은 니트로셀룰로오스, 나일론, 폴리술폰, 폴리에테르술폰 및 PVDF(Polyvinylidene fluoride) 중에서 선택된 재질의 멤브레인 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 액상 시료의 수평 흐름이 가능한 재질 중에서 적절히 선택될 수 있다.
상기 흡수 패드는 스트립 형태의 측방 유동 분석-기반 바이오센서의 단부에 부착되어 과량의 액상 시료를 흡수하여 액체의 역흐름(backflow)을 방지하고, 처리된 액상 시료를 수집하는 기능을 한다. 예시적 구체예에 있어서, 흡수 패드는 셀룰로오스 필터 등의 재질일 수 있다.
정리하면, 본 발명의 분석 스트립은 백킹 카드(예를 들면, 접착성 플라스틱 지지체)에 검출 영역, 접합 패드, 흡수 패드 및 검체 패드 순서로 부착하여, 액상 시료를 검체 패드로부터 검출 영역을 경유해, 흡수 패드까지 이동시키고, 검출 영역에서의 신호검출을 통해 분석을 수행한다.
변형된 다른 방법으로는 접합 패드와 검출 영역을 하나의 다공성 패드에 통합하거나, 검체 패드, 접합 패드 및 검출 영역을 하나의 다공성 패드에 통합하기도 한다. 그리고, 검체 패드, 접합 패드, 검출 영역 및 흡수 패드는 서로 중첩되어 배치되거나 또는 일정한 간격을 두고 백킹 카드에 배열되기로 한다. 후자의 경우, 액상 시료가 다른 매개체를 이용하여 모세관 현상으로 검체 패드, 접합 패드, 검출 영역으로 순차적으로 이동할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법에 따라 포획 핵산을 고정화시킨 고형 지지체를 적용한 FLA 스트립은 제조 후 적어도 56일(8주)까지는 형광 신호의 감소 없이 보관할 수 있어, 보관 안정성이 우수한 것을 구체적으로 확인하였다(도 7 참조).
또한, 본 발명은 (1) 고형 지지체를 금속염 및 포획 핵산(capture nucleic acid)으로 처리하는 단계; (2) 표적 핵산에 표지체를 도입하는 단계; (3) 상기 고정화시킨 포획 핵산과 표적 핵산을 하이브리다이징시켜 이중가닥 핵산을 형성하는 단계; 및 (4) 상기 이중가닥 핵산에 도입된 상기 표지체를 검출하는 단계;를 포함하는 표적 핵산의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 “염 매개의 핵산 고정화 방법”, “지지체”, “금속염”, 및“포획 핵산”에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
<실시예>
<재료 및 방법>
시약 및 재료
본 발명에 사용된 올리고뉴클레오티드(아래 표 1 참조)는 IDT(Integrated DNA Technologies; 일리노이주, 미국) 및 바이오닉스(서울, 한국)에서 구입하였다. HAuCl₄, Tween 20 및 아지드화 나트륨은 시그마 알드리치(미주리, 미국)에서 구입했으며, 자외선-vis 분광 광도계(Spectramax iD5 다중 모드 마이크로플레이트 판독기)는 Molecular Devices(캘리포니아주, 미국)에서 구입하였다. 탄산나트륨, 자당, NaCl, MgCl2, KCl 및 CaCl2는 대정화금(경기도, 한국)에서, 소혈청알부민(BSA) 및 PCR premix(RT500S)는 엔지노믹스(대전, 한국)에서, 스트렙타비딘은 바이오레전드(캘리포니아주, 미국)에서 구입하였다. 또한, 백킹 카드 및 흡수 패드는 투핸즈(경기도, 한국)에서 구입했으며, 니트로셀룰로오스(NC) 멤브레인은 와트만(메이드스톤, 영국)에서 구입하였다.
| 서열번호 | Name | DNA sequence(5’->3’) |
| 서열번호 1 | Bare capture DNA | TAG ATC AGT TGG ACT CGA TG |
| 서열번호 2 | 5’-C6 NH2 modified capture DNA | NH 2 C6-TAG ATC AGT TGG ACT CGA TG |
| 서열번호 3 | 5’-C12 NH2 modified capture DNA | NH 2 C12-TAG ATC AGT TGG ACT CGA TG |
| 서열번호 4 | 3’-C3 NH2 modified capture DNA | TAG ATC AGT TGG ACT CGA TG-C3 NH 2 |
| 서열번호 5 | 5’-C6 NH2, 3’-C3 NH2 modified capture DNA | NH 2 C6-TAG ATC AGT TGG ACT CGA TG-C3 NH 2 |
| 서열번호 6 | Synthetic DNA product | Biotin-TCA TGC TGC TAA CGG AGC ATC GAG TCC AAC TGA TCT AAC GAT AGC GGT ACA TCT CGG |
| 서열번호 7 | RPP capture DNA | NH 2 C12-AAA TCT AGG CTT GCT GTT TG |
| 서열번호 8 | Orflb capture DNA | NH 2 C12-AAC GTC TTA CTA AAT ACA CA |
| 서열번호 9 | N capture DNA | NH 2 C12-GGA AGT CAC ACC TTC GGG AA |
| 서열번호 10 | RPP synthetic cDNA | CAG CCT TGG CGT CAC TTT CAG AGA GCC CAA ACA GCA AGC CTA GAT TTG CCA CGT CAT ATG GCC CT |
| 서열번호 11 | Orflb synthetic cDNA | GCA TAG ACG AGG TCT GCC ATT GTG TAT TTA GTA AGA CGT TGA CGT GAT ATA TGT GGT ACC ATG TCA CCG T |
| 서열번호 12 | N synthetic cDNA | ACC TGT GTA GGT CAA CCA CGT TCC CGA AGG TGT GAC TTC CAT GCC AAT GCG CGA CAT TCC GAA GAA CGC TGA AGC GCT G |
| 서열번호 13 | RPP FP | AGG GCC ATA TGA CGT GGC |
| 서열번호 14 | RPP RP | Biotin-CAG CCT TGG CGT CAC TTT |
| 서열번호 15 | Orflb FP | ACG GTG ACA TGG TAC CAC A |
| 서열번호 16 | Orflb RP | Biotin-GCA TAG ACG AGG TCT GCC AT |
| 서열번호 17 | N FP | CAG CGC TTC AGC GTT CTT CG |
| 서열번호 18 | N RP | Biotin-ACC TGT GTA GGT CAA CCA CG |
금 나노입자(AUNPs)의 합성
AuNPs는 0.04 g의 금 전구체, HAuCl₄을 400 mL의 증류수에 첨가한 후 3.2 mL의 1% trisodium citrate를 첨가하여 합성하였다. 상기 혼합물을 교반하면서 15분 동안 끓인 후, 실온으로 냉각시켜 AuNPs를 수득하였다. 합성된 AuNPs는 4 ℃에서 보관되었고, UV-VIS 분광 광도계를 사용하여 특성화하였다.
스트렙타비딘 코팅 금 나노입자의 제조
이전 단계에서 합성된 금 나노입자를 1400 g에서 60분간 원심분리하고, 534 nm(A534)에서의 흡광도 값이 5.0이 되도록 하였다. 이 용액에 탄산나트륨과 스트렙타비딘(streptavidin)을 각각 최종 농도 6.4 mM 및 40 μg/mL로 첨가하고, 이를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, BSA를 최종 농도 0.1 mg/mL로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 마지막으로, 미반응의 스트렙타비딘과 BSA를 제거하기 위해 상기 혼합물을 1400 g에서 30분 동안 원심분리하고, 10 mM Tris-HCl(pH 8)에 재현탁하여 534 nm(A534)에서의 흡광도 값이 5.0이 되도록 하였다. 제조된 스트렙타비딘-코팅 금 나노입자를 이후의 실험에서 사용할 때까지 4 ℃에서 보관하였다.
측방 유동 분석(LFA) 스트립의 제조
본 실험에서는 백킹 카드(backing card), 포획 핵산을 포함하는 니트로셀룰로오스(NC) 멤브레인(검출 영역), 및 흡수 패드로 구성된 단순한 구조의 LFA 스트립을 제조하였다. 백킹 카드를 골격 구조(back-bone structure)로 사용하여 각각의 구성 요소들을 조립하였다.
상기 NC 멤브레인 및 흡수 패드는 연속적인 모세관 유동을 위해 상기 백킹 카드 상에서 서로 연결되도록 하였다.
구체적으로, 상기 백킹 카드 상에 NC 멤브레인을 부착한 후, 상기 NC 멤브레인의 다운스트림 측에 20 × 300 mm 크기의 흡수 패드가 약 2 mm 정도 중첩되도록 부착하였다. 이후, 상기 백킹 카드를 3 × 43 mm의 크기로 절단하여 FLA 스트립을 제조하였다.
측방 유동 분석(LFA) 방법
달리 언급되지 않는 한, 각각의 LFA 스트립은 0.8 M CaCl2를 함유하는 80 μM 5'-C12 NH2 변형된 포획 DNA(서열번호 3) 0.4μL을 NC 멤브레인에 떨어뜨린 후 실온에서 30분 동안 건조하였다.
이후, 다양한 농도(달리 언급되지 않으면 10 nM)의 합성 DNA 산물(서열번호 6)을 0.3 μL, 스트렙타비딘 코팅 금 나노입자(AuNP) 3 μL, 및 20 mM의 붕산나트륨(pH 8.0), 2%(w/v), 수크로스, 0.6 M NaCl, 0.2%(v/v) Tween 20 및 0.1%(w/v) 아지드화 나트륨을 포함하는 런닝 버퍼 26.7 μL을 혼합한 혼합물을 제조하였다.
이후, 각각의 FLA 스트립을 상기 혼합물에 담그고 10분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, Image J 소프트웨어를 사용하여 각각의 스트립의 배경 신호를 제외한 정규화된 신호 강도를 측정하였다.
시험예 1: 금속염 처리로 인한 포획 핵산의 고정화 효과
본 발명의 금속염 처리로 인한 포획 핵산의 고정화 효과를 확인하고자 하였다.
이를 위하여, 상기 제조한 LFA 스트립의 NC 멤브레인 상에 포획 핵산(서열번호 1)을 다양한 조건으로 고정화시킨 후 신호 강도를 측정하였다(도 2 및 도 3 참조). 이때, 모든 LFA 스트립은 자외선 조사 장치(UV Crosslinker; Korea Ace Science, Seoul, Korea)를 사용하여 254 nm의 자외선을 5분 동안, 총에너지 90 mJ/cm2로 조사한 후 신호 강도를 측정하였다.
도 3A는 본 발명의 일 실시예에서, 다양한 핵산 고정화 조건 간의 신호 강도를 비교하여 나타낸 LFA 스트립 이미지이다.
도 3A의 각각의 실험군을 아래 표 2에 간단히 정리하여 나타내었다.
| 실험군 | 금속염 | 금속염 투입 시점 |
포획 핵산 | 처리 형태 |
| 실험군 1 | - | - | + | - |
| 실험군 2 | + | 핵산 투입 후 | + | 금속염 함유 용액 및 포획 DNA 각각 처리 |
| 실험군 3 | + | 핵산 투입 전 | + | 금속염 함유 용액 및 포획 DNA 각각 처리 |
| 실험군 4 | + | 핵산과 함께 | + | 혼합 용액 (포획 DNA + 금속염) 처리 |
상기 실험을 위한 금속염 함유 용액은 0.8 M KCl(금속염), 및 0.2%(v/v) Tween 20을 포함하는 20 mM 붕산나트륨(pH 8.0)을 혼합하여 제조하였다.
상기 실험군 1은 NC 멤브레인 상에 300 μM의 포획 DNA(서열번호 1) 0.3 ㎕을 떨어뜨린 후 실온에서 10분 동안 건조하여 준비하였다.
상기 실험군 2는 실험군 1과 같이 포획 DNA를 처리한 NC 멤브레인을 상기 준비한 금속염 함유 용액에 완전히 침지한 후 10분 동안 건조하여 준비하였다.
상기 실험군 3은 상기 금속염 함유 용액에 완전히 침지한 후 10분 동안 건조한 NC 멤브레인 상에 300 μM의 포획 DNA(서열번호 1) 0.3 ㎕을 떨어뜨린 후 실온에서 10분 동안 건조하여 준비하였다.
상기 실험군 4는 300 μM의 포획 DNA(서열번호 1)를 상기 금속염 함유 용액과 혼합한 혼합 용액 0.3 ㎕을 NC 멤브레인 상에 떨어뜨린 후 실온에서 10분 동안 건조하여 준비하였다.
그 결과, 금속염 함유 용액 처리 후 포획 DNA를 처리한 실험군 3, 및 금속염 및 포획 DNA를 혼합 용액으로 처리한 실험군 4의 경우 금속염 함유 용액을 처리하지 않은 실험군 1, 및 포획 DNA 투입 후에 금속염 함유 용액을 처리한 실험군 2에 비해 LFA 비색 신호 강도가 현저히 증가한 것을 확인할 수 있다(도 3A 참조).
다만, NC 멤브레인 상에 포획 DNA를 처리하기 전에 금속염 함유 용액을 별도로 처리하는 공정을 수행하는 것은 금속염 함유 용액의 제조 공정, 상기 용액을 NC 멤브레인 상에 처리하는 공정 및 상기 멤브레인을 건조하는 공정 등을 수행하는 시간 및 비용 등을 증가시키기 때문에 경제성 및 생산성 향상 측면에서는 이 공정을 생략하는 것이 더욱 바람직할 것이다.
흥미롭게도, NC 멤브레인에 상기 금속염과 포획 DNA를 혼합 용액으로 처리한 실험군 4의 신호 강도가, NC 멤브레인에 금속염 함유 용액을 처리한 후 포획 DNA 용액을 처리한 실험군 3과 비슷한 수준인 것을 확인할 수 있었다(도 3A 참조). 즉, NC 멤브레인에 금속염과 포획 DNA를 혼합 용액으로 처리하면, 값비싼 특수 장비 없이 간단한 공정 및 짧은 작업 시간으로 포획 DNA의 고정화 성능 및 재현성을 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.
시험예 2: 염 매개 핵산 고정화 방법에 기존의 다양한 핵산 고정화 방법을 병용한 경우의 효과
본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법에 기존의 다양한 핵산 고정화 방법을 병용한 경우의 효과를 확인하고자 하였다.
이를 위하여, 0.8 M KCl이 있거나 없는 300 μM 포획 DNA 0.3 μl를 LFA 스트립 상의 NC 멤브레인에 처리하고, 실온에서 10분 동안 건조하였다. 그 후 상기 LFA 스트립을 다음과 같은 방법으로 처리하였다.
- UV 실험군 - 자외선 조사 장치(UV Crosslinker; Korea Ace Science, Seoul, Korea)를 사용하여 254 nm의 자외선을 5분 동안 조사하되, 총에너지 90 mJ/cm2를 조사하였다.
- Heat 실험군 - 가열 장치(Heating block; DAIHAN Scientific, Seoul, Korea)를 사용하여 60 ℃에서 10분 동안 열처리하였다.
- No treatment 실험군 - 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
도 3B는 본 발명의 일 실시예에 따른 염(KCl) 매개 핵산 고정화 방법에 기존의 다양한 핵산 고정화 방법을 병용한 경우의 신호 강도를 나타낸 LFA 스트립 이미지, 및 상기 신호 강도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 3B를 살펴보면, UV 실험군, Heat 실험군, No treatment 실험군 모두 금속염인 KCl를 처리한 경우 KCl을 처리하지 않은 경우에 비해 비색 신호가 최소 3배 이상 증가한 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 3B를 살펴보면, KCl을 처리한 No treatment 실험군의 경우 KCl을 처리하지 않은 기존의 UV 실험군 및 Heat 실험군에 비해서도 비색 신호가 더욱 높으므로 고가의 장비가 필요 없는 DNA 고정화에 대한 가능성을 확인하였다.
시험예 3: 염 매개 핵산 고정화 방법(SAIoNs)의 최적화
본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법의 최적화 조건을 확인하기 위해, 다양한 조건으로 LFA 스트립을 제조한 후 신호 강도를 확인하였다.
3-1: 포획 DNA의 최적 농도
본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법에서, 포획 DNA의 최적 농도를 확인하기 위한 실험을 수행하여 도 4A에 나타내었다.
구체적으로, 0.8 M KCl이 있는 다양한 농도(0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 μM)의 포획 DNA(5’ 말단에 탄소수 6개의 카본 링커를 포함한 아민기를 추가하여 변형한 포획 DNA, 또는 변형하지 않은 포획 DNA) 0.3 μl를 각각 LFA 스트립 상의 NC 멤브레인에 처리하고, 실온에서 10분 동안 건조하여 LFA 스트립을 제조하였다.
도 4A를 살펴보면, 5’ 말단에 탄소수 6의 카본 링커를 포함한 아민기를 추가하여 변형한 포획 DNA(5’-C6 NH2-modified capture DNA)를 사용한 경우 변형하지 않은 포획 DNA(bare capture DNA)을 사용한 경우에 비해 모든 농도에서 신호 강도가 높은 것을 확인할 수 있다.
한편, 도 4A에서 신호 강도가 가장 높게 나타난 농도는 300 μM이었지만, 포획 DNA의 양을 최소화하기 위해 80 μM를 후속 최적화 실험을 위한 최적 농도로 선정하였다.
3-2: 포획 DNA의 최적 변형
포획 DNA에서 최적의 NH2 변형을 확인하기 위한 실험을 수행하여 도 4B에 나타내었다.
구체적으로, 0.8 M KCl이 있는 80 μM의 포획 DNA(변형하지 않은 포획 DNA(no), 5’ 말단에 탄소수 6개의 카본 링커를 포함한 아민기를 추가하여 변형한 포획 DNA(5’-C6), 탄소수 12개의 카본 링커를 포함한 아민기를 추가하여 변형한 포획 DNA(5’-C12), 3' 말단에 탄소수 3개의 카본 링커를 포함한 아민기를 추가하여 변형한 포획 DNA(3’-C3), 5’ 말단에 탄소수 6개의 카본 링커를 포함한 아민기, 및 3’ 말단에 탄소수 3개의 카본 링커를 포함한 아민기를 추가하여 변형한 포획 DNA(5’-C6, 3’-C3)) 0.3 μl를 각각 LFA 스트립 상의 NC 멤브레인에 처리하고, 실온에서 10분 동안 건조하여 LFA 스트립을 제조하였다.
도 4B를 살펴보면, 포획 DNA의 NH2 변형은 모든 경우에서 신호 강도를 개선하였지만, 탄소수 12개의 카본 링커를 이용하여 5’ 말단에 아민기를 추가한 포획 DNA(5’-C12 포획 DNA)를 사용할 때 신호 강도가 가장 강한 것을 확인할 수 있다.
따라서, 5’-C12 포획 DNA를 후속 최적화 실험을 위한 최적 변형으로 선정하였다.
3-3: 금속염의 종류
본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법에 다양한 금속염을 적용하여 최적의 금속염을 확인하기 위한 실험을 수행하여 도 4C에 나타내었다.
구체적으로, 0.8 M의 NaCl, MgCl2, KCl 또는 CaCl2가 있는 80 μM의 포획 DNA(5’ 말단에 탄소수 12개의 카본 링커를 포함한 아민기를 추가하여 변형한 포획 DNA) 0.3 μl를 각각 LFA 스트립 상의 NC 멤브레인에 처리하고, 실온에서 10분 동안 건조하여 LFA 스트립을 제조하였다.
도 4C를 살펴보면, 금속염을 적용하였을 때 금속염을 적용하지 않은 경우에 비해 신호 강도가 현저히 증가하고, 특히 CaCl2를 적용할 때 신호 강도가 가장 강한 것을 확인할 수 있다.
3-4: 금속염의 최적 농도
본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법에 금속염으로써 CaCl2을 다양한 농도로 적용하여 금속염의 최적 농도를 확인하기 위한 실험을 수행하여 도 4D에 나타내었다.
구체적으로, 0 내지 3000 mM의 CaCl2가 있는 80 μM의 포획 DNA(5’ 말단에 탄소수 12개의 카본 링커를 포함한 아민기를 추가하여 변형한 포획 DNA) 0.3 μl를 각각 LFA 스트립 상의 NC 멤브레인에 처리하고, 실온에서 10분 동안 건조하여 LFA 스트립을 제조하였다.
도 4D를 살펴보면, CaCl2을 0.8 M의 농도로 적용하였을 때 신호 강도가 가장 높은 것을 확인할 수 있다.
3-5: 포획 DNA의 변형
포획 DNA이 아민기 이외의 변형으로도 효율적으로 고정화될 수 있는지 확인하기 위하여 FAM으로 변형된 포획 DNA를 이용한 실험을 수행하여 도 5에 나타내었다.
도 5는 포획 DNA의 변형에 따른 신호 강도의 변화를 나타내는 것으로, 포획 DNA에 다양한 탄소수의 카본 링커를 이용하여 5’ 말단 및 3’ 말단 중 어느 하나 이상에 아민기를 추가한 것과 포획 DNA의 5’말단에 FAM을 부착한 것의 신호 강도를 측정하여 나타낸 LFA 스트립 이미지이다.
도 5를 살펴보면, 포획 DNA의 5’말단에 FAM을 부착한 경우 LFA 스트립의 신호 강도가 매우 강하게 나타난 것을 확인할 수 있다. 다만, 포획 DNA의 5’말단에 FAM을 부착한 경우에도 핵산 고정화 단계에서 금속염이 처리되지 않은 경우에는 신호가 거의 나타나지 않았다.
3-6: 최적의 건조 시간
본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법에서 상기 금속염(0.8 M CaCl2) 및 포획 DNA(80 μM 5’-C12 NH2-modified 포획 DNA) 혼합 용액 0.3 ㎕을 NC 멤브레인에 떨어뜨린 후 실온에서 건조하되, 건조 시간 경과에 따른 신호 강도 변화를 확인하여 도 6A에 나타내었다.
도 6A를 살펴보면, 건조 시간이 경과함에 따라 신호 강도가 증가하고, 건조 시간이 30분 이상인 경우에는 정규화된 신호 강도가 0.1 이상이므로, 충분히 높은 것을 확인할 수 있다. 특히, 건조 시간 0분에서의 정규화된 신호 강도 또한 0.8 이상으로 높은 것을 확인할 수 있다.
3-7: 최적의 건조 온도
본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법에서 상기 금속염(0.8 M CaCl2) 및 포획 DNA(80 μM 5’-C12 NH2-modified 포획 DNA) 혼합 용액 0.3 ㎕을 NC 멤브레인에 떨어뜨린 후 30분 동안 건조하되, 건조 온도 증가에 따른 신호 강도 변화를 확인하여 도 6B에 나타내었다.
도 6B를 살펴보면, 건조 온도가 증가함에 따라 신호 강도가 증가하는 것을 확인할 수 있고, 특히 실온에서도 충분한 신호 강도를 확인할 수 있는 것을 알 수 있다.
이러한 결과는 본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법이 자원이 제한된 환경에서 어떤 온도에서도 잘 작동함을 시사하며, 특히 현장진료(point of care; POC) 관련 기술에 적용하기에 적합하다는 것을 의미하다.
시험예 4: 보관 안정성 테스트
금속염(0.8 M CaCl2) 및 포획 DNA(80 μM 5’-C12 NH2-modified 포획 DNA) 혼합 용액 0.3 ㎕을 NC 멤브레인에 떨어뜨린 다음 실온에서 30분 동안 건조하여 LFA 스트립을 제조한 후 다양한 조건으로 보관하면서 보관 시간 경과에 따른 신호 강도를 확인하여 도 7에 나타내었다.
도 7A은 상기 제조한 LFA 스트립을 실온에서 보관한 것이고, 도 7B는 4 ℃에서 보관한 것이다. 또한, 도 7C는 상기 제조한 LFA 스트립에 5분 동안 자외선을 조사한 후 실온에서 보관한 것이고, 도 7D는 5분 동안 자외선을 조사한 후 4 ℃에서 보관한 것이다.
도 7을 살펴보면, 본 발명에 따라 제조된 LFA 스트립은 실온 또는 4 ℃에서 보관할 때 최대 56일(8주)까지 신호 강도의 감소가 전혀 없이 보관할 수 있는 것을 확인할 수 있다.
시험예 5: 다른 핵산 고정화 방법과의 비교
금속염(0.8 M CaCl2)이 있거나 없는 포획 DNA(80 μM 5’-C12 NH2-modified 포획 DNA) 0.3 ㎕을 NC 멤브레인에 떨어뜨린 다음 실온에서 30분 동안 건조하여 LFA 스트립을 제조한 후 신호 강도를 측정하여, 기존의 핵산 고정화 방법을 적용한 경우의 효과, 및 기존의 핵산 고정화 방법과 병용한 경우의 효과와 비교하고자 하였다.
도 8A는 본 발명의 일 실시예에 따른 염(CaCl2) 매개 핵산 고정화 방법(SAIoN)에 기존의 핵산 고정화 방법(Heat 처리 또는 UV 처리)을 병용한 경우의 신호 강도를 비교하여 나타낸 그래프이다. 각각의 실험군은 다음과 같은 처리를 하여 준비되었다.
- UV 실험군 - 자외선 조사 장치(UV Crosslinker; Korea Ace Science, Seoul, Korea)를 사용하여 254 nm의 자외선을 5분 동안, 총에너지 90 mJ/cm2를 조사하였다.
- Heat 실험군 - 가열 장치(Heating block; DAIHAN Scientific, Seoul, Korea)을 사용하여 60 ℃에서 10분 동안 열처리하였다.
- No treatment 실험군 - 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
도 8A를 살펴보면, UV 실험군, Heat 실험군, No treatment 실험군 모두 금속염인 CaCl2를 처리한 경우 CaCl2을 처리하지 않은 경우에 비해 신호 강도가 현저히 증가한 것을 확인할 수 있다.
또한, 핵산 고정화를 위해 자외선 처리(UV 실험군)를 하는 것이 열처리(Heat 실험군)를 하는 것에 비해 신호 강도를 더욱 증가시키는 것으로 나타나, 본 발명의 열 매개 핵산 고정화 방법이 자외선 처리 방법에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
도 8B 및 도 8C는 본 발명의 방법과 자외선 처리를 병용한 실험군(SAIoNs+UV), 본 발명의 방법만을 적용한 실험군(SAIoNs), 및 기존의 자외선 처리만을 적용한 실험군(Conventional UV) 각각의 합성 DNA의 농도에 따른 신호 강도를 비교하고자 하는 것으로, 도 8B는 각 실험군의 합성 DNA의 농도에 따른 신호 강도를 나타내는 그래프이고, 도 8C는 각 실험군의 합성 DNA의 농도에 따른 LFA 스트립 이미지를 나타내는 것이다. 도 8C에서 검은색 화살표는 각 실험군의 시각적 LOD(검출 한계)를 표시한 것이다.
도 8B 및 도 8C를 살펴보면, 모든 실험군에서 합성 DNA의 농도가 증가함에 따라 신호 강도가 증가하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 자외선 처리를 병용한 실험군(SAIoNs+UV)이 가장 낮은 농도에서 표적 DNA를 검출할 수 있음을 확인할 수 있다.
상기 Conventional UV 실험군, SAIoNs 실험군 및 SAIoNs+UV 실험군의 시각적 검출한계(LOD)는 각각 대략 2 nM, 1 nM 및 0.5 nM인 것으로 나타났다.
중요한 것은, 본 발명의 방법에 따른 실험군(SAIoNs)이 자외선 처리만 적용한 실험군(Conventional UV)에 비해 더 낮은 농도에서 표적 DNA를 검출할 수 있다는 것이다.
이러한 결과는, 본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법(SAIoN)이 고형 지지체에 포획 DNA을 효과적으로 고정시킬 수 있음을 나타낸다.
시험예 6: SARS-CoV-2의 합성 cDNA 검출
본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법을 적용하여 제조된 LFA 스트립이 SARS-CoV-2를 높은 민감도 및 특이도로 검출할 수 있는지를 확인하고자 하였다.
본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법을 이용하여 SARS-CoV-2 유전자를 검출하는 방법을 도 9에 간단히 나타내었다.
본 발명자들은 SARS-CoV-2의 Orf1b 및 N 유전자와 일반적으로 내부 대조군으로 사용되는 인간 RPP 유전자를 각각 표적으로 하는 3개의 서로 다른 포획 DNA를 설계하였다. 이후, 상기 3개의 포획 DNA를 본 발명의 염 매개 핵산 고정화 방법(SAIoN)에 따라 하나의 LFA 스트립의 개별 테스트 영역에 고정하였다. 구체적으로, 상기 RPP, Orflb, 및 N, 각각의 유전자에 대하여, 0.8 M CaCl2를 함유하는 0.4μL의 80 μM 포획 DNA(서열번호 7, 서열번호 8, 또는 서열번호 9)를 각각 NC 멤브레인에 개별적으로 떨어뜨린 후 실온에서 30분 동안 건조하여 3종의 포획 DNA를 고정화시킨 FLA 스트립을 제조하였다.
이후, 각각의 유전자에 대해 특별히 설계된 프라이머를 이용하여 비대칭 PCR을 수행한 후, 3개의 단일 가닥 앰플리콘(Orf1b 유전자, N 유전자 및 인간 RPP 유전자)을 런닝 버퍼와 혼합하였다. 이후, 상기 LFA 스트립을 상기 혼합물에 담갔다. 각 유전자의 역방향 프라이머는 비오틴으로 표지되어 있기 때문에, 상기 단일 가닥 앰플리콘들은 비오틴으로 표지되며, 이는 스트렙타비딘이 코팅된 금 나노입자에 결합하여 각 테스트 영역에서 비색 신호를 생성하게 된다.
구체적으로, 특이도 테스트를 위해, 1 × PCR premix, SARS-CoV-2의 일부 구성 유전자인 RPP, Orflb, 및 N, 각각의 유전자에 대한 0.12 μM forward primer와 1.2 μM reverse primer 세트, 및 다양한 농도의 합성 cDNA를 혼합한 후 비대칭 PCR을 수행하였다.
또한, 민감도 테스트를 위해, 1×PCR premix, 상기 RPP, Orflb, 및 N, 각 유전자에 대한 0.1 μM forward primer와 1 μM reverse primer 세트, 및 다양한 농도의 합성 cDNA를 혼합한 후 비대칭 PCR을 수행하였다.
각각의 비대칭 PCR은 다음과 같이 결정된 조건을 사용하여 CFX Connect(Bio-Rad Laboratories, Inc., USA)에서 수행되었다. 95 ℃에서 10초, 57 ℃에서 15초, 72 ℃에서 30초로 50 사이클 반복하였다.
이후, 상기 3종의 비대칭 PCR 앰플리콘 0.6 μL, 스트렙타비딘 코팅 금 나노입자(AuNP) 3 μL, 및 최대 30 μL의 런닝 버퍼를 혼합한 혼합물을 제조하였다. 그런 다음, 준비된 FLA 스트립을 상기 혼합물에 담그고 10분 동안 인큐베이션하였다. 이후, Image J 소프트웨어를 사용하여 각 스트립의 배경 신호를 제외한 정규화된 색상 강도를 분석하였다.
상기 각 유전자에 대한 포획 DNA, forward primer, reverse primer 및 합성 cDNA, 및 이에 대한 서열번호를 정리하여 하기 표 3에 나타내었다.
| 유전자 | 서열번호 | DNA 서열(5’->3’) | |
| RPP | 포획 DNA | 서열번호 7 | NH 2 C12-AAA TCT AGG CTT GCT GTT TG |
| 합성 DNA | 서열번호 10 | CAG CCT TGG CGT CAC TTT CAG AGA GCC CAA ACA GCA AGC CTA GAT TTG CCA CGT CAT ATG GCC CT | |
| forward primer | 서열번호 13 | AGG GCC ATA TGA CGT GGC | |
| reverse primer | 서열번호 14 | Biotin-CAG CCT TGG CGT CAC TTT | |
| Orflb | 포획 DNA | 서열번호 8 | NH 2 C12-AAC GTC TTA CTA AAT ACA CA |
| 합성 DNA | 서열번호 11 | GCA TAG ACG AGG TCT GCC ATT GTG TAT TTA GTA AGA CGT TGA CGT GAT ATA TGT GGT ACC ATG TCA CCG T | |
| forward primer | 서열번호 15 | ACG GTG ACA TGG TAC CAC A | |
| reverse primer | 서열번호 16 | Biotin-GCA TAG ACG AGG TCT GCC AT | |
| N | 포획 DNA | 서열번호 9 | NH 2 C12-GGA AGT CAC ACC TTC GGG AA |
| 합성 DNA | 서열번호 12 | ACC TGT GTA GGT CAA CCA CGT TCC CGA AGG TGT GAC TTC CAT GCC AAT GCG CGA CAT TCC GAA GAA CGC TGA AGC GCT G | |
| forward primer | 서열번호 17 | CAG CGC TTC AGC GTT CTT CG | |
| reverse primer | 서열번호 18 | Biotin-ACC TGT GTA GGT CAA CCA CG | |
도 10A는 SARS-CoV-2의 Orf1b 및 N 유전자에 대한 본 발명의 각각의 포획 DNA와 교차 반응성이 없는 각각의 단일 가닥 앰플리콘 간의 서열 특이성을 나타내는 LFA 스트립 이미지 및 상기 스트립의 비색 신호 강도를 정량화하여 나타낸 그래프이다. 도 10A에서, “+”는 PCR 단계에서의 표적물질이 존재한다는 의미이다.
도 10A를 살펴보면, Orf1b 및 N 유전자 유전자에 대한 본 발명의 포획 DNA가 교차 반응성이 없는 각각의 단일 가닥 앰플리콘에 대하여 매우 높은 서열 특이성을 나타낸다는 것과, 본 발명에 따른 LFA 스트립의 다중화 분석 능력을 확인할 수 있다.
한편, 본 발명의 Orf1b 및 N 유전자에 대한 각각의 포획 DNA를 본 발명의 방법에 따라 고정화시켜 제조한 LFA 스트립의 검출 민감도를 확인하고자 하였다.
도 10B는 SARS-CoV-2의 Orf1b 유전자에 대한 검출 민감도를 확인하는 LFA 스트립 이미지, 및 이의 신호 강도를 정량화하여 나타낸 그래프이고, 도 10C는 SARS-CoV-2의 N 유전자에 대한 검출 민감도를 확인하는 LFA 스트립 이미지, 및 이의 신호 강도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
구체적으로, 도 10B 및 도 10C는 본 발명의 포획 DNA 및 염 매개 고정화 방법을 이용한 경우의 시각적 LOD를 확인한 결과로서, 도 10B는 Orf1b 유전자를 300 aM까지 검출 가능하고, 도 10C는 N 유전자를 500 aM까지 검출 가능함을 나타낸다. 즉, 본 발명에 따른 염 매개 고정화 방법을 적용한 고형 지지체, 또는 이를 적용한 측방 유동 분석 스트립은 시각적 검출한계가 100 내지 1000 aM로서, 검출 민감도가 현저히 우수함을 알 수 있다.
이러한 결과는, 본 발명에 따른 염 매개 핵산 고정화 방법이 다양한 병원성 박테리아 또는 바이러스에 대한 실제적인 검출 방법에 충분히 적용될 수 있음을 뒷받침한다.
<결과>
본 발명자들은 처음으로 SAIoN이라고 하는 염 매개 핵산 고정화 방법을 개발하였다. 본 발명의 핵산 고정화 방법은 기존의 스트렙타비딘-비오틴, 자외선 조사, 또는 열처리 등의 일반적인 핵산 고정화 방법에 비해 원심분리기, 자외선 조사 장치, 가열장치 등의 특별한 장비가 필요하지 않아 자원이 제한된 환경에서도 적용이 가능하며, 생산 비용과 시간을 감소시킬 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명의 핵산 고정화 방법에 따르면 장기 보관 안정성이 우수하고, 우수한 고정화 성능 및 재현성이 우수한 측방 유동 분석-기반의 바이오센서를 얻을 수 있어 매우 유용하다.
참고로, 본 발명의 SAIoNs 방법과 기존의 방법을 적용한 경우의 포획 DNA 필요량, 포획 DNA 고정화 방법 및 소요 시간, 필요 장비, 필요 장비의 가격, 포획 DNA을 위해 필요한 시약, LFA 스트립 100개 당 생산 비용 등을 정리하여 하기 표 4에 비교하기 쉽게 나타내었다.
상기 표 4를 살펴보면, 본 발명에 의하면 값비싼 장비가 필요하지 않고, 포획 DNA의 필요량이 현저히 적어, 현장진료(point of care; POC) 관련 기술에 적용하기에 매우 유용하다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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tagatcagtt ggactcgatg 20
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acctgtgtag gtcaaccacg ttcccgaagg tgtgacttcc atgccaatgc gcgacattcc 60
gaagaacgct gaagcgctg 79
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cagcgcttca gcgttcttcg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N reverse primer
<400> 18
acctgtgtag gtcaaccacg 20
Claims (16)
- 고형 지지체를 금속염 및 포획 핵산으로 처리하는 단계;를 포함하는 염 매개의 핵산 고정화 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 고형 지지체는 니트로셀룰로오스 멤브레인인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 금속염은 금속 염화물인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 금속염은 1가 또는 2가 금속염인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 금속염은 NaCl, KCl, MgCl2 및 CaCl2 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 금속염의 처리는 0.2 내지 2.5 M 농도의 금속염을 함유하는 용액으로 처리하는 것인 방법. - 제1항에 있어서,
상기 포획 핵산은 5’ 말단 및 3’ 말단 중 어느 하나 이상에 카본 링커(carbon linker)를 포함한 아민기를 추가한 것임을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 포획 핵산은 5’ 말단에 형광 물질인 FAM을 부착한 것임을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 포획 핵산은 단일 가닥인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 포획 핵산은 DNA, RNA, PNA, CNA, HNA, LNA 또는 ANA인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법은 고형 지지체에 금속염 용액을 처리한 후 포획 핵산 용액으로 처리하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법은 고형 지지체에 금속염 및 포획 핵산을 포함하는 혼합 용액으로 처리하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법 이후에 상기 포획 핵산이 고정된 지지체에 자외선을 조사하는 단계;를 추가하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법에 따라 고정화된 포획 핵산을 포함하는 고형 지지체.
- 제14항의 고형 지지체를 포함하는 측방 유동 분석 스트립.
- (1) 고형 지지체를 금속염 및 포획 핵산(capture nucleic acid)으로 처리하는 단계;
(2) 표적 핵산에 표지체를 도입하는 단계;
(3) 상기 고정화시킨 포획 핵산과 표적 핵산을 하이브리다이징시켜 이중가닥 핵산을 형성하는 단계; 및
(4) 상기 이중가닥 핵산에 도입된 상기 표지체를 검출하는 단계;를 포함하는 표적 핵산의 검출 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210121614A KR20230038926A (ko) | 2021-09-13 | 2021-09-13 | 염 매개의 핵산 고정화 방법, 상기 방법에 따라 고정화된 포획 핵산을 포함하는 고형 지지체, 상기 고형 지지체를 포함하는 측방 유동 분석 스트립, 및 표적 핵산 검출 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210121614A KR20230038926A (ko) | 2021-09-13 | 2021-09-13 | 염 매개의 핵산 고정화 방법, 상기 방법에 따라 고정화된 포획 핵산을 포함하는 고형 지지체, 상기 고형 지지체를 포함하는 측방 유동 분석 스트립, 및 표적 핵산 검출 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230038926A true KR20230038926A (ko) | 2023-03-21 |
Family
ID=85801267
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210121614A KR20230038926A (ko) | 2021-09-13 | 2021-09-13 | 염 매개의 핵산 고정화 방법, 상기 방법에 따라 고정화된 포획 핵산을 포함하는 고형 지지체, 상기 고형 지지체를 포함하는 측방 유동 분석 스트립, 및 표적 핵산 검출 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230038926A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200037867A (ko) | 2017-08-25 | 2020-04-09 | 조에티스 서비시즈 엘엘씨 | 핵산 프로브, uv 광을 사용하여 핵산을 고형 지지체에 고정화시키는 방법, 고정화된 핵산 프로브를 포함하는 고형 지지체 및 고형 지지체를 포함하는 시험 장치 |
-
2021
- 2021-09-13 KR KR1020210121614A patent/KR20230038926A/ko unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR20200037867A (ko) | 2017-08-25 | 2020-04-09 | 조에티스 서비시즈 엘엘씨 | 핵산 프로브, uv 광을 사용하여 핵산을 고형 지지체에 고정화시키는 방법, 고정화된 핵산 프로브를 포함하는 고형 지지체 및 고형 지지체를 포함하는 시험 장치 |
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