KR102437064B1 - 측방 유동성의 일체형 시스템에 기반으로 정제 및 검출이 동시에 이루어지는핵산 검출용 랩-온-페이퍼 플랫폼 - Google Patents

측방 유동성의 일체형 시스템에 기반으로 정제 및 검출이 동시에 이루어지는핵산 검출용 랩-온-페이퍼 플랫폼 Download PDF

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Abstract

본 발명은 측방 유동성의 일체형 시스템에 기반으로 정제 및 검출이 동시에 이루어지는핵산 검출용 랩-온-페이퍼 플랫폼에 관한 것으로, 본 발명에서 제시하는 플랫폼은 시료를 곧바로 적용하여 핵산의 정제와 검출이 동시에 가능한 구조물을 포함한다. 랩온페이퍼(Lab-on-paper) 기술을 적용하여 시료의 전처리, 등온증폭, 검출 및 분석 단계를 하나의 칩 위에서 수행할 수 있고, 측방 유동식으로 시료를 이동시켜 최종적으로 질병 및 균주 감염과 관련된 유전자 빅 데이터와 연결되어 곧바로 상기 질병 및 균주 감염 여부를 판단할 수 있는 구조인 것을 특징으로 한다.

Description

측방 유동성의 일체형 시스템에 기반으로 정제 및 검출이 동시에 이루어지는핵산 검출용 랩-온-페이퍼 플랫폼{LAB-ON-PAPER PLATFORM FOR NUCLEIC ACID DETECTION WITH SIMULTANEOUS PURIFICATION AND DETECTION BASED ON AN INTEGRATED SYSTEM WITH LATERAL FLUIDITY}
본 발명은 측방 유동성의 일체형 시스템에 기반으로 정제 및 검출이 동시에 이루어지는핵산 검출용 랩-온-페이퍼 플랫폼에 관한 것이다. 보다 상세하게 본 발명은 시료로부터 핵산을 정제하지 않고 시료를 곧바로 적용하여 핵산의 정제와 검출이 동시에 가능한 구조물에 관한 것으로서, 측방 유동성의 일체형 시스템에 기반하여 시료로부터 핵산을 정제하지 않고 곧바로 적용함에도 검출 감도가 높고, 복수 개의 표적 핵산을 동시에 검출이 가능하여 다수의 질병을 쉽고 빠르게 진단할 수 있다.
의료서비스 수준이 증가하고 진단기기가 발전함에 따라 신종 바이러스, 슈퍼박테리아, 결핵, 식중독균 등 인체 건강을 위협하는 감염 미생물을 효과적으로 대처하기 위해 생활현장에서 빠른 시간에 간편하게 측정할 수 있는 기술이 개발되고 있다. 이들을 측정할 수 있는 분자진단은 민감도와 특이도가 우수한 진단 방법이나 특수한 장비나 시약을 요구하거나 복잡한 과정을 포함하는 경우가 많다. 면역진단 방법은 키트로 재현하기 쉽고 빠르고 간편하나 측정감도가 떨어지는 문제점이 있다.
현재 Real-time PCR을 이용한 진단법이 가장 빠르고 민감한 진단법으로 알려져 있으며, 일반적으로 8시간 이내에 진단이 가능하다. 현재 분자진단 방법은 PCR기술과 마이크로 채널 기술의 발전과 더불어 급속히 발전하고 있으며 Alere사의 AlereTM I 나 Roche의 Cobas Influenza 와 같이 60분 내에 검출이 가능한 제품도 상용화 되어 있다. 하지만 급속분자진단이 가능한 방법론의 경우에는 고가의 분석 장비 혹은 고가의 검사비용이 요구되며 분자진단의 전 과정을 구현하기 위해서는 여러 단계를 요구하고 있으므로 아직 현장 진단에는 한계점을 가지고 있다.
현재 보편화된 분자진단 법은 real-time PCR을 이용하는 것으로, 신속성 때문에 가장 보편화되어 있지만 현장진단 또는 1,2차 의료기관에서 사용하기에는 크고 고가의 장비를 요하기 때문에 쉽게 사용하는 것이 어려운 실정이다. 분자 진단을 위해서는 크게 시료의 전처리 (preparation), 핵산 증폭 반응 (reaction)과 검출 (detection)의 3단계가 요구되는데, 핵산 증폭 반응과 검출은 real-time PCR 장비에 의해 동시에 재현하는 것이 가능하지만 시료의 전처리 문제는 여전히 남아 있다.
한편, 랩온페이퍼(Lab-on-paper) 기술은 시료의 전처리, 등온증폭, 검출, 및 분석 단계를 하나의 칩 위에서 수행하도록 하는 일체형 시스템에 기반한 기술을 의미한다. 작은 페이퍼와 페이퍼에 심은 칩 구조물로 모든 반응을 자동화하여 빠르게 수행할 수 있으므로 검출 현장 등의 장소에 구애받지 않는 장점을 갖는다.
한국특허등록공보 제10-2037411호 한국출원공개공보 제10-2021-0018150호
일 양상은, 생물학적 시료를 수용하는 시료패드;
상기 시료패드와 접촉하여 배치되고, 재수화(rehydration) 완충액을 수용하는 버퍼패드;
상기 시료패드와 반응패드를 연결하는 제1연결패드;
상기 제1연결패드와 접촉하고, 표적 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머와 등온증폭반응 (LAMP)을 위한 시약을 포함하고, 등온증폭반응이 일어나는 반응패드;
상기 반응패드 상부에 배치되고, 반응온도 유지 및 시료의 증발을 차단하는 차단패드;
상기 반응패드와 접촉하고, 금 나노입자가 고정되어 있는 제2연결패드;
상기 제2연결패드와 접촉하고, 상기 금 나노입자와 결합된 등온증폭반응물로부터 증폭된 표적 핵산을 획득하는 검출패드; 및
상기 검출패드와 접촉하고, 잔류하는 시료를 흡수하는 흡수패드를 포함하고,
상기 등온증폭반응용 시약은 1 mM 내지 500 mM의 아스파르트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid) 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 다중 핵산 검출용 구조물을 제공한다.
또 다른 양상은, 상기 다중 핵산 검출용 구조물을 포함하는, 질병 또는 균 감염 진단 키트를 제공한다.
또 다른 양상은, 상기 다중 핵산 검출용 구조물을 이용하여, 질병 또는 균 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
여기서 사용되는 전문용어는 단지 특정 실시예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다. 여기서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함하는"의 의미는 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분을 구체화하며, 다른 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소, 성분 및/또는 군의 존재나 부가를 제외시키는 것은 아니다.
다르게 정의하지는 않았지만, 여기에 사용되는 기술용어 및 과학용어를 포함하는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다. 보통 사용되는 사전에 정의된 용어들은 관련기술문헌과 현재 개시된 내용에 부합하는 의미를 가지는 것으로 추가 해석되고, 정의되지 않는 한 이상적이거나 매우 공식적인 의미로 해석되지 않는다. 이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예에 의한 다중 핵산 검출용 구조물에 대하여 설명하기로 한다. 여기서 사용되는 전문용어는 단지 특정 실시예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다. 여기서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함하는"의 의미는 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분을 구체화하며, 다른 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소, 성분 및/또는 군의 존재나 부가를 제외시키는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 설명하기로 한다.
본 발명의 질병 또는 균 감염 진단 시스템은 랩온페이퍼 칩(lab-on-paper chip) 기술에 기반한 것으로서, 본 발명의 질병 또는 균 감염 진단 시스템을 이용하면 별도의 핵산을 정제하지 않아도 반응패드까지 이동하면서 핵산 물질이 정제되어 곧바로 증폭 반응에 적용될 수 있고, 1회의 시료를 적용하여 다수의 표적 핵산을 동시에 검출하고 관련 질병을 진단할 수 있다. 이를 실현하기 위해, 본 발명의 핵산 검출용 구조물은 버퍼패드(120), 시료패드(121), 제1연결패드(130), 반응패드(140), 가열패드(141), 차단패드(142), 제2연결패드(150), 검출패드(160), 흡수패드(170) 및 하우징(110)을 구성요소로 포함한다.
이하 각 구성요소에 대해 상세히 설명한다.
시료패드
시료패드(121)는 핵산 물질이 함유된 시료를 수용한다. 상기 시료는 인체로부터 분리된 것으로서 혈액, 혈청, 혈장, 침, 땀, 소변, 세포배양액, 조직현탁액 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 시료패드는 세포 용해 완충액(lysis buffer) 성분을 포함한다. 필요에 따라 상기 시료를 세포 용해 완충액과 혼합한 후 적용할 수 있고, 상기 세포 용해 완충액과 혼합 후, 원심분리, 여과, 침전 등 통상적으로 알려진 방법으로 추가 정제될 수 있다. 바람직하게는 상기 시료는 핵산 검출용 구조물 외에서 상기 시료패드에 적용하기 위해 시료로부터 핵산을 정제하는 단계를 포함하지 않는다.
상기 세포 용해용 완충액 성분은 Tris(트리스(히드록시메틸)아미노메탄(tris(hydroxymethyl)aminomethane))를 5 mM 내지 80 mM, 5mM 내지 50mM, 또는 10mM 내지 50 mM로 포함하는 것일 수 있다. Tris는 구체적으로 Tris-HCl일 수 있고, 세포 용해용 완충액에서 완충제로서 급격한 pH 변동을 줄일 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액 성분은 pH 8.0 내지 9.0일 수 있다. pH가 8.0 미만인 경우, 핵산 물질의 안정성이 감소되거나 이동 속도가 감소될 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액 성분은 염화칼륨(KCl)을 5 mM 내지 50 mM, 5mM 내지 40mM, 또는 10mM 내지 20 mM로 포함하는 것일 수 있다. 50 mM을 초과하는 고농도의 염화칼륨은 세포 용해에 도움이 되지만, 용출된 핵산 물질의 수용해도를 감소시켜 부가 완충액을 다량 가해야 하거나 반응패드까지 이동하는데 걸리는 시간을 증가시킬 수 있다. 반면 염화칼륨이 5 mM 미만인 경우 세포가 제대로 용해되지 않을 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액 성분은 황산마그네슘(MgSO4)을 1 mM 내지 30 mM, 1mM 내지 20mM, 또는 2mM 내지 16 mM 로 포함하는 것일 수 있다. 황산마그네슘을 적정량 포함하는 경우 핵산 물질의 안정성과 이동 속도가 증가하는 것으로 확인되었고, 점도에 영향을 미치지 않기 때문에 유체의 흐름을 방해하지 않아 페이퍼 칩 분석용으로 시료를 전처리하는데 유리하다.
상기 세포 용해용 완충액 성분은 황산암모늄((NH4)2SO4)을 5 mM 내지 50 mM, 5mM 내지 40mM, 또는 10mM 내지 20 mM로 포함하는 것일 수 있다. 50 mM을 초과하는 고농도의 황산암모늄은 세포 용해물을 침전시킬 수 있고, 황산암모늄이 5mM 미만인 경우 pH가 불안정해질 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액 성분은 단백질분해효소를 0.01 mg/ml 내지 0.1 mg/ml, 또는 0.03 mg/ml 내지 0.07 mg/ml을 포함하는 것일 수 있다. 단백질분해효소는 고분자 단백질을 분해하여 핵산이 이동 경로인 기판이나 페이퍼의 기공을 고분자 단백질이 차단하지 않도록 하고, RNase 및 DNase 활성을 억제하여 핵산 물질의 안정성을 증가시킨다. 상기 단백질분해효소는 프로테이나아제 K(proteinase K)일 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액 성분은 계면활성제를 포함할 수 있고, 상기 계면활성제는 TritonX-100 또는 Tween20 (폴리소르베이트20)일 수 있고, 세포 용해용 완충액 중량을 기준으로 0.01w/w% 내지 0.2w/w%, 바람직하게는 0.05w/w% 내지 0.1w/w%로 포함될 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액은 시료 패드에 적용 전에 시료와 혼합될 수 있는데 이 경우 상기 세포 용해용 완충액은 시료의 부피 대비 1:1로 사용되는 것일 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액 성분은 글리세롤을 포함하지 않는 것이 바람직할 수 있다. 글리세롤은 단백질의 침전을 막기 위해 첨가되기도 하나, 글리세롤은 점도를 증가시켜 세포 용해물의 유동성을 감소시키고, 핵산 물질의 이동에 방해가 될 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액 성분은 환원제를 포함하지 않는 것일 수 있다. 환원제는 디티오트레이톨(DTT), 머캅토에탄올 등으로서 단백질을 변성시키고 세포 용해물의 수용해도를 높이는데 도움이 되지만, 페이퍼 칩에 흘러 들어가는 용액 내 존재하는 경우 형광 발광 또는 검출 반응에 방해가 될 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액 성분은 폴리설폰 막 (예를 들어, Vivid GF) 또는 니트로셀룰로오스 막으로 이루어진 시료패드(121)에서 세포의 용해를 촉진하고, 핵산을 보다 쉽게 검출할 수 있도록 한다. 상기 폴리설폰 막 및 니트로셀룰로오스 막은 2개 이상이 적층된 구조를 이루는 것일 수 있다. 상기 폴리설폰 막은 비 대칭적인 것일 수 있고, 폴리설폰 막 및 니트로셀룰로오스 막은 0.5 ㎛ 내지 1 ㎛의 기공을 갖는 다공성 재질인 것일 수 있다. 상기 기공은 다소 큰 편인 것이 유리한데, 생물학적 시료는 점도를 갖는 것이 많고, 특히 시료에 세포 용해용 조성물을 처리하게 되면 핵산 물질과 단백질이 세포 밖으로 용출되면서 점도가 현저히 올라갈 수 있다. 따라서 시료패드의 기공 사이즈는 시료를 신속하게 흡수하기에 적절한 크기를 갖는 것이 바람직하다.
상기 세포 용해용 완충액을 이용함으로써 측방 유동식 (lateral flow)으로 핵산을 보다 쉽게 검출할 수 있다. 용어 “측방 유동식”이란 중력을 이용하지 않고, 수평 방향으로 모세관 현상이나 확산 현상에 의해 시료를 적용한 지점으로부터 목표 지점까지 흐르도록 하는 방식을 의미한다. 세포 용해물에는 핵산 물질을 분해할 수 있는 가수분해 효소들이 다량 함유되어 있으므로, 이동 경로에 오래 머무는 경우 핵산 물질의 수득량이 감소할 수 있다. 따라서 측방 유동식 핵산 검출용 구조물에 적용하려면, 흐름도가 우수해야 하고, 시료가 이동하는 동안 세포 용해물이 침전되어 이동 경로를 차단하지 않아야 한다. 또한, 핵산 물질과 염을 형성하여 침전이나 이동속도를 저하시키지 않아야 한다. 본 발명의 세포 용해용 완충액의 조성은 글리세롤 또는 환원제를 포함하지 않아도 세포 용해물이나 핵산 물질이 침전되지 않고, 높은 수율로 핵산 물질을 반응 패드까지 측방으로 이동시킬 수 있다.
버퍼패드
버퍼패드(120)는 재수화 완충액을 적가하는 패드로서, 구조물에 수압을 가하는 역할을 한다. 버퍼패드는 시료패드와 적어도 일부분 접촉하거나 연결될 수 있고, 단백질과 같은 세포 용해 잔해물의 반응패드로의 이동을 최소화하고 반응 완료 후 수압을 가하여 등온증폭반응물 만의 검출패드로의 이동을 유도한다.
버퍼패드에 적용되는 재수화 완충액은 부가 완충액으로서, 예를 들어 5 mM 내지 80 mM Tris-HCl, 20 mM 내지 70 mM 염화칼륨, 0.5 mM 내지 5 mM 황산마그네슘, 1 mM 내지 30 mM 황산암모늄, 및 0.01w/w% 내지 0.2 w/w% Tween® 20 내지 TritonX-100을 포함하고 산도가 pH 8.0 내지 9.0인 등온완충액 또는 인산 완충액 (50mM Na2HPO4, pH 7.2)일 수 있다. 상기 등온완충액은 보다 구체적으로 20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 50 mM KCl, 2 mM MgSO4, 및 0.1% Tween® 20을 포함하고, 산도는 pH 8.8일 수 있다. 상기 부가 완충액은 단백질분해효소, 글리세롤, 또는 환원제를 포함하지 않는 것일 수 있다.
상기 버퍼패드는 재수화 완충액을 충분히 수령할 수 있도록 0.5 ㎛ 내지 1 ㎛의 기공을 갖는 다공성 재질로서, 면, 융, 종이, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스아세테이트, 유리섬유, 폴리설폰, 폴리아크릴, 폴리니트릴, 폴리피페라진, 폴리아미드, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리덴플로리드, 폴리에틸렌이민, 폴리디메틸실록산 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
제1연결패드
제1연결패드(130)는 시료패드와 일부분 접촉하여 배치되고, 시료패드에 비해 상대적으로 폭이 좁은 구조물로 시료패드와 반응패드를 연결한다.
제1연결패드는 셀룰로오스 막으로 이루어진 재질로서, 0.005 ㎛ 내지 0.015 ㎛의 기공을 갖는 것일 수 있다.
부가완충액
부가완충액은 구조물에 수압을 가하는 역할을 한다. 시료패드(121)에 시료를 적용한 후 부가완충액을 버퍼패드(120)에 적가할 수 있고, 반응패드에서 등온증폭반응 완료 후 반응물의 검출패드로 이동을 돕기 위해 추가로 적가될 수 있다.
부가완충액은 5 mM 내지 80 mM Tris-HCl, 20 mM 내지 70 mM 염화칼륨, 0.5 mM 내지 5 mM 황산마그네슘, 1 mM 내지 30 mM 황산암모늄, 및 0.01w/w% 내지 0.2 w/w% Tween® 20 내지 TritonX-100을 포함하고 산도가 pH 8.0 내지 9.0인 등온완충액 또는 인산 완충액 (50mM Na2HPO4, pH 7.2)일 수 있다. 상기 등온완충액은 보다 구체적으로 20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 50 mM KCl, 2 mM MgSO4, 및 0.1% Tween® 20을 포함하고, 산도는 pH 8.8일 수 있다. 상기 부가 완충액은 단백질분해효소, 글리세롤, 또는 환원제를 포함하지 않는 것일 수 있다.
반응패드
반응패드는 랩온페이퍼에서 페이퍼 칩에 해당하는 구성요소로서, 증폭반응을 위한 dNTP, DNA 중합효소, 역전사 효소, 형광 표지자, 등온증폭반응 버퍼 등을 포함한 등온증폭반응 시약이 고정되어 있다. 따라서 부가 완충액을 적용하면 반응패드에 핵산 물질을 포함하는 용액이 스며들어 적셔지고, 상기 등온증폭반응 시약과 시료의 접촉물이 반응패드로 이동하여 반응패드 하부의 가열패드 또는 구조물 전체의 온도를 60 내지 70℃로 가열하면 등온증폭반응 또는 역전사 등온증폭반응이 일어난다.
상기 등온증폭반응 시약은 구체적으로 dNTP, 등온증폭버퍼, 및 역전사/DNA/RNA 중합효소 등을 포함할 수 있고, 이들은 반응패드 내에 혼합 후 건조하거나, 파우더 타입으로 반응패드 표면에 도포하여 예를 들어, 약 40℃ 오븐에서 약 30분 간 가열하여 고정시킨 것일 수 있다.
반응패드(140)는 제1연결패드와 일부분 접촉하여, 제1연결패드의 측방으로 배치될 수 있다. 등온증폭반응이 일어날 수 있는 온도로 빠르게 열을 전달하기 위해 상기 반응패드(140) 하부에는 가열패드(141)가 배치될 수 있다. 상기 가열패드는 열전도율이 높은 알루미늄, 구리, 또는 은과 같은 금속 재질을 포함하거나, 가열을 위한 열선 또는 열판을 포함할 수 있다. 반응패드에서 반응 온도 및 시간은 프라이머 세트의 증폭 효율에 따라 조절될 수 있다.
용어 "프라이머"는 자유 3말단 수산화기(free 3'hydroxyl group)를 가지는 짧은 폴리뉴클레오티드로서, 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능할 수 있다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역방향 전사효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphospate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 표지의 예로는, 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드일 수 있다. 상기 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 상기 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일수 있고, 상기 방사성 동위원소는 32P일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구조물은 등온증폭 (isothermal amplification)용으로 사용하기에 적합할 수 있다. 용어 “등온증폭(isothermal amplification)"은 하나의 온도 조건하에서 DNA를 증폭시키는 것을 의미한다. 기존의 중합효소 연쇄반응(PCR)이 변성 (Denaturation), 어닐링 (Annealing) 및 신장 (Extension) 단계가 각각 다른 온도와 조건을 요구함에 따라 특수한 PCR 장치로 수행해야 하는 것과 달리, 등온증폭 반응은 별도의 특수한 기기가 필요하지 않은 장점을 갖는다. 일반적으로 등온 증폭 방법은 특정 온도범위 내에서 1시간 내에 목표 핵산을 10^9개까지 증폭시킬 수 있으며, 상기 온도를 유지시킬 수 있는 항온 장치만 있으면 수행할 수 있다. 또한 등온 증폭 방법은 수행 시간이 짧고 결과를 육안으로 관찰할 수 있으므로 간편하게 증폭을 확인할 수 있다.
상기 반응패드는 등온증폭반응의 효율을 증가시키기 위해 반응패드 상부에 차단패드(142)가 배치되어 차단 역할을 할 수 있다. 일련의 배치된 패드를 라미네이트 처리된 차단패드에 의해 등온증폭반응 온도를 유지하고, 시약의 증발을 차단하여 반응의 효율을 증가시킬 수 있다. 상기 차단 패드는 비공성의 막 또는 외부 공기로부터 반응패드를 차단할 수 있는 구조물일 수 있다.
상기 프라이머 세트에서 정방향 및 역방향 프라이머들 중 어느 하나는 Cy3, Cy5, TAMRA, TEX, TYE, HEX, FAM, TET, JOE, MAX, ROX, VIC, Cy3.5, Texas Red, Cy5.5, TYE, BHQ, Iowa Black RQ, 및 IRDye로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 검출자로 표지된 것일 수 있다. 상기 검출자는 형광 분석기를 도입하는 경우 형광 표지자로 역할할 수 있고, 표적 핵산을 독립적으로 검출하기 위해 표적 핵산 마다 다르게 표지 될 수 있다.
상기 프라이머 세트에서 정방향 및 역방향 프라이머 중 나머지 어느 하나는 비오틴이 결합된 것일 수 있다. 비오틴은 스트렙타비딘(streptavidin)에 결합할 수 있으므로, 증폭된 표적 핵산에 결합된 형태로 존재하여 제2연결패드를 통과하면서, 금 입자의 표면에 스트렙타비딘과 결합하고 검출패드에서 포획되면 검출 결과가 가시화되도록 한다. 비오틴은 증폭된 표적 핵산에서 검출자와 서로 반대 위치에 존재하도록 설계될 수 있고, 예를 들어, 정방향 프라이머의 5' 말단에 검출자를 결합시킨 경우, 역방향 프라이머의 5' 말단에 비오틴을 결합시킬 수 있다.
일 구체예에서, 상기 등온증폭은 고리매개 등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification)일 수 있다. 용어 "고리매개 등온증폭방법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)"은 외부 프라이머, 내부 프라이머, 및 반응 속도를 향상시키기 위한 추가의 루프 프라이머를 사용하여 등온에서 수행되는 증폭 방법이다. 상기 LAMP 반응에서 사용되는 프라이머 중 외부 프라이머는 정방향 외부(forward outer, F3) 프라이머와 역방향 외부(backward outer, B3) 프라이머 2종으로 구성되고 반응의 비순환기(non-cyclic step) 동안 DNA 이중 가닥을 풀어주는 역할을 한다. 내부 프라이머는 정방향 내부 프라이머(forward inner primer, FIP)와 역방향 내부 프라이머(backward inner primer, BIP) 2종으로 구성되고 고리매개 등온증폭반응에 필수적인 고리(loop)를 만들 수 있도록 정방향 및 역방향 염기서열에 해당하는 뉴클레오티드로 구성된다. 이들 내부 프라이머는 균주의 유전물질에는 포함되지 않으나 반응의 효율성을 높이기 위하여 특정 염기, 예를 들어, 일련의 티민 염기를 더 포함하도록 설계될 수 있다. 추가 2종의 프라이머는 정방향 고리(forward loop, LoopF) 프라이머와 역방향 고리(backward loop, LoopB) 프라이머 2종으로 구성되며 내부(inner) 프라이머가 결합하지 않는 염기서열(고리 부위)에 부착하여 고리매개등온증폭 반응을 가속화시킨다. 상기 고리매개 등온 증폭 방법은 내부 프라이머가 주형에 먼저 결합하여 신장된 후, 각 DNA 나선의 바깥쪽으로 외부 프라이머가 결합되어 신장된다. 이때, 외부 프라이머의 신장으로 인해 가닥(strand) 변위가 발생하고, 그에 따라 먼저 합성된 가닥은 주형에서 떨어지는데, 떨어진 합성 가닥이 5' 말단에서부터 고리(loop) 구조를 형성하고, 이어서 3' 말단에도 동일한 과정으로 고리 구조가 형성되며, 이를 매개로 증폭 반응이 일어난다.
상기 등온증폭 반응은 50 내지 75℃, 55 내지 75℃, 60 내지 72℃, 60 내지 72℃, 또는 60 내지 65℃에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 등온증폭방법은 10분 내지 60분, 10분 내지 40분, 20분 내지 40분, 또는 20분 내지 30분 동안 수행될 수 있다. 온도는 각 패드 하부에 배치된 가열패드를 가열하거나, 구조물 전체를 오븐에 넣고 인큐베이션하여 조절할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 구조물을 이용하면 25 ㎕ 반응용액을 기준으로, 100 copies 이하, 50 copies 이하, 20 copies 이하, 10 copies 이하, 5 copies 이하, 또는 1 copies 이하면서, 0.1 copies 이상, 0.01 copies 이상, 또는 0.001 copies 이상의 DNA, RNA와 같은 표적 유전자가 포함된 검체에서 각 원인균의 검출이 가능하다. 또한, 일반적인 등온증폭반응 조건에서 빠른 시간 내에 각 원인균의 검출이 가능하다. 예를 들어, 각 원인균을 검출하기 위해 표적 유전 물질에 결합하는 6개의 프라이머(Primer) 세트(F3, B3, FIP, BIP, LF, BF)와 Isothermal Amplification buffer, dNTPs, Bst 3.0 DNA polymerase 등이 포함된 LAMP 반응 조성물, 비색분석용 Phenol red, 실시간 형광물질분석용 SYBR™ Green I(Thermo Fisher Scientific, 미국) 등의 시약을 사용하고, 상기 프라이머 세트의 각 프라이머 0.2 내지 1.6 μM을 이용하여, 60 내지 65 ℃에서 20 분 내지 30 분 동안 등온증폭 반응하여 검출 결과를 확인할 수 있다. 상기 프라이머 세트에서 각 프라이머는 구체적으로, FIP 및 BIP 프라이머의 경우 각각 1.6 μM, F3 및 B3 프라이머의 경우 각각 0.2 μM, 및 FL 및 BL 프라이머의 경우 각각 0.4 μM로 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
상기 증폭 반응에 사용되는 등온증폭반응용 시약은 1 mM 내지 500 mM의 산성 아미노산을 포함한다. 상기 산성 아미노산은 구체적으로 100 mM 내지 300 mM, 또는 100 mM 내지 200 mM일 수 있다. 상기 산성 아미노산은 아스파르트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid) 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 산성 아미노산의 양이 상기 범위 보다 적으면 검출 감도에 영향을 미치지 못할 수 있고, 상기 범위를 초과하는 경우 DNA 증폭반응물이 충분하지 않아도 색 변화가 관찰되어서 신뢰도가 낮아질 수 있다.
상기 등온증폭반응용 시약은 100 mM 내지 300 mM Tris-HCl (pH 8.0 내지 9.0), 50 mM 내지 150 mM (NH4)2SO4, 10 mM 내지 100 mM MgCl2, 및 300 mM 내지 800 mM KCl을 더 포함한다. 보다 구체적으로 상기 등온증폭반응용 시약은 150 mM 내지 250 mM Tris-HCl (pH 8.5 내지 9.0), 80 mM 내지 120 mM (NH4)2SO4, 30 mM 내지 60 mM MgCl2, 및 500 mM 내지 700 mM KCl을 더 포함한다. 등온증폭반응용 시약은 산성 아미노산 외에 다른 성분들과의 조합으로 완충 효과를 나타내기 때문에, 각 시약 성분과 그 함량의 조합은 검출 속도 및 신뢰도에 중요할 수 있다.
다른 양상은, 1 mM 내지 500 mM의 아스파르트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid) 또는 이들의 조합, 100 mM 내지 300 mM Tris-HCl (pH 8.0 내지 9.0), 50 mM 내지 150 mM (NH4)2SO4, 10 mM 내지 100 mM MgCl2, 및 300 mM 내지 800 mM KCl을 포함하는, SNP 마커 검출을 위한 등온증폭반응용 키트를 제공한다.
또 다른 양상은, 1 mM 내지 500 mM의 아스파르트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid) 또는 이들의 조합, 100 mM 내지 300 mM Tris-HCl (pH 8.0 내지 9.0), 50 mM 내지 150 mM (NH4)2SO4, 10 mM 내지 100 mM MgCl2, 및 300 mM 내지 800 mM KCl을 포함하는, SNP 마커 검출을 위한 등온증폭반응용 조성물을 제공한다. 아스파르트산 및 글루탐산의 조합을 사용하는 경우, 두 아미노산의 비율은 몰비로 0.5 내지 1.5:1, 보다 바람직하게는 0.8 내지 1.2:1일 수 있다. 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 아미노산을 사용하는 것이 바람직하고, 다른 아미노산의 경우 검출 민감도를 오히려 감소시킬 수 있다.
상기 반응패드는 셀룰로오스아세테이트 막의 재질로 이루어진 것으로서, 시료 및 부가완충액의 흐름은 자유롭도록 하면서 핵산이 머물면서 충분히 등온증폭반응할 수 있도록, 0.001㎛ 내지 0.005㎛, 바람직하게는, 0.005㎛의 기공 사이즈를 갖는 것일 수 있다.
상기 반응패드는 40 mM 내지 50 mM 수크로오스, 0.001 내지 0.01% Triton X-100, 및 0.1w/w% 내지 0.3w/w%의 글리세롤을 포함할 수 있다. 상기 수크로오스 대신 트레할로스를 사용할 수 있다. 이는 수분 또는 산소에 등온증폭반응 시약 및 프라이머세트 등이 노출되었을 때, 이들의 보관 안정성을 증가시킬 수 있다. 상기 보관 안정성이란 25℃ 내지 30℃에서 분해물이나 부산물 없이 3 주 이상 보관할 수 있는 것을 의미할 수 있다.
제2연결패드
제2연결패드(150)는 반응패드와 일부분 접촉하여 반응패드의 상부 및 측방으로 배치될 수 있다. 제2연결패드(150)는 금 나노입자를 포함하고, 상기 금 나노입자는 반응패드에서 증폭된 핵산과 결합하여 검출패드로 이동된다. 금 나노입자는 바람직하게는 표면에 스트렙타비딘이 고정된 것일 수 있다. 제2연결패드는 증폭된 핵산이 쉽게 검출패드로 이동할 수 있도록, 면, 융, 종이, 니트로셀룰로오스, 유리섬유, 폴리설폰, 폴리아크릴, 폴리니트릴, 폴리피페라진, 폴리아미드, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리덴플로리드, 폴리에틸렌이민, 폴리디메틸실록산 또는 이들의 혼합물인 다공성 재질로서, 0.01㎛ 내지 0.05㎛, 바람직하게는, 0.05㎛의 기공 사이즈를 갖는 것일 수 있다.
제2연결패드는 셀룰로오스 재질을 갖는 것을 수 있고, 반응패드와 접촉하는 부분의 제2연결패드는 저융점 아가로오스 또는 왁스로 코팅된 개패구역(151)을 포함할 수 있다. 패드를 코팅하면 반응패드의 등온증폭반응물의 이동이 차단되었다가, 제2연결패드를 가열하는 시점에서 코팅이 녹아 등온증폭반응물이 측방으로 다시 이동하여 시료 내 미반응 유전물질의 소실을 막을 수 있다.
상기 제2연결패드 하부에는 가열을 위한 가열패드(141)가 배치될 수 있다. 등온증폭이 끝나는 시점에 부가 완충액을 가하면, 반응패드로부터 등온증폭된 결과물이 검출 패드로 쉽게 이동하도록 한다. 상기 가열은 60 내지 80℃로 1 분 내지 5 분간, 바람직하게는 2 분 간 수행되는 것일 수 있다.
검출패드
검출패드(160)는 제2연결패드와 일부분 접촉하여, 제2연결패드의 하부 및 측방에 배치될 수 있다. 검출패드(160)에는 검출자와 결합할 수 있는 수용체가 고정되어 있다. 상기 수용체는 검출자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 단백질, 또는 이의 절편일 수 있다.
상기 검출패드는 복수 개의 검출 구역을 포함하고, 상기 검출 구역은 선 또는 웰의 형태로 구분될 수 있다. 각 검출 구역 마다 각 수용체가 독립적으로 고정되고, 예를 들어, 폴리에틸렌프탈레이트 성분의 잉크로 스탬핑하여 검출 구역을 만든 후, 여기에 수용체를 포함하는 잉크로 다시 스탬핑 하거나 웰의 경우 수용체를 포함하는 용액을 적용하고, EDC(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide) 또는 NHS(N-hydroxysulfosuccinimide)를 적용할 수 있다. 하나의 반응패드에는 수십개 내지 수백개 이상의 검출 구역이 형성되어, 1회의 시료를 적용하여 형성된 검출 구역의 수만큼의 표적 핵산을 검출할 수 있다.
상기 검출패드는 니트로셀룰로오스로서, 시료가 흡수패드까지 측방으로 이동할 수 있도록, 0.001㎛ 내지 0.005㎛, 바람직하게는, 0.005㎛의 기공 사이즈를 갖는 것일 수 있다.
가열패드
상기 버퍼패드, 시료패드, 반응패드, 또는 제2연결패드 하부에는 가열패드(141)가 배치될 수 있다. 상기 가열패드는 열전도성을 갖는 금속판으로서, 철, 스테인리스, 알루미늄, 은, 구리 등의 재질로 이루어진 것일 수 있다. 상기 가열패드는 열선으로 연결될 수 있고, 각 열선은 상기 시료패드, 반응패드, 및 제2연결패드 하부의 가열패드에 독립적으로 연결되어 가열이 되는 패드를 제어할 수 있다.
일 구체예에서, 시료패드의 하부에 배치되고 상기 시료패드를 가열하기 위한 가열패드(141)를 포함한다. 세포 용해용 완충액에 의한 시료의 용해를 효율적으로 하기 위해 가열패드를 60 내지 80℃의 온도에서 1 분 내지 5분 간, 바람직하게는 5 분 간 가열 처리해줌으로써 시료패드에서 바이러스, 균주 또는 세포 등의 포함하는 시료의 용해를 촉진할 수 있다.
다른 구체예에서, 가열패드는 열선을 포함하지 않고, 이 경우 본 발명의 구조물 외부의 열이 구조물 전체와 가열패드에 집적되어 등온증폭반응을 유발한다.
상기 시료패드, 제1연결패드, 반응패드, 제2연결패드, 검출패드, 및 흡수패드는 시료나 완충액이 소실되지 않도록 하단에 하우징(110)이 존재할 수 있고, 전체 구조물은 지지체 또는 비공성 재질의 케이스로 둘러싸인 것일 수 있다.
흡수패드는 상기 시료와 완충액 등을 흡수하여 역흐름을 차단하고 측방 유동성이 유발될 수 있도록 기여한다. 흡수패드는 다공성 재질로서, 면, 융, 종이, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스아세테이트, 유리섬유, 폴리설폰, 폴리아크릴, 폴리니트릴, 폴리피페라진, 폴리아미드, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리덴플로리드, 폴리에틸렌이민, 폴리디메틸실록산 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 흡수패드는 바람직하게는 유리섬유로서 0.1 내지 0.5㎛의 기공 사이즈를 갖는 것일 수 있다.
상기 시료패드; 제1연결패드; 반응패드; 제2연결패드; 검출패드; 및 흡수패드는 순차적으로 서로 일부분 접촉되어 측방으로 배치된다.
시료가 흡수패드까지 도달하는 동안 핵산 물질 외에 세포 용해물을 여과하여 핵산 물질을 정제할 수 있고, 시료의 이동 방향이 지면과 평행한 방향인 측방 유동성을 실현할 수 있다. 세포 내에서 핵산은 히스톤, 중합효소, 핵산분해효소, 전사인자 등의 단백질이 결합된 형태로 존재한다. 세포 용해 조성물과 같은 계면활성제에 의해 많은 단백질이 핵산과의 결합을 소실하게 되나, 세포 용해물이 반응패드까지 이동할 수 있도록 추가로 가해지는 증류수 또는 부가 완충액에 의해 반응패드에 도달할 쯤에는 계면활성제가 희석되어 외부 환경이 단백질의 전하를 다시 회복할 있게 된다. 이 경우 단백질은 다시 핵산 물질과 결합하여 중합효소와의 접촉 면적을 축소시키거나 증폭 반응을 방해할 수 있다. 따라서 반응패드에는 핵산과 결합할 수 있는 대부분의 세포 구성 요소가 정제되어 제거되는 것이 바람직하다.
이하, 상기 핵산 검출용 구조물을 이용하여 핵산을 검출하는 방법을 서술한다.
본 발명의 다른 양상은, 핵산 검출용 구조물을 포함하는 키트를 제공한다.
상기 키트는 등온증폭 반응을 수행하기 위한 적절한 반응물 및 시약을 더 포함할 수 있다. 이러한 반응물 및 시약은, 예를 들어 추가의 프라이머, dNTP, 및 효소 (DNA 중합효소 또는 역방향 전사효소)등을 포함할 수 있고, 반응의 효율을 위해 염화칼륨, 황산마그네슘, 황산암모늄과 같은 무기염류나 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 반응물 및 시약은 최종 반응액 기준 10 내지 20mM Tris-HCl, 1 내지 10mM (NH4)2SO4, 10 내지 50nM KCl, 0.1 내지 2mM MgSO4, 및 0.01 내지 0.1% Tween-20, 보다 구체적으로 20mM Tris-HCl, 10mM (NH4)2SO4, 50nM KCl, 2mM MgSO4, 및 0.1% Tween-20을 포함하는 pH 7 내지 9, 바람직하게는 pH 8.8의 용액일 수 있다. 상기 반응물 또는 시약은, 40 mM 내지 50 mM 수크로오스, 0.001 내지 0.01% Triton X-100, 및 0.1w/w% 내지 0.3w/w%의 글리세롤을 더 포함할 수 있다. 상기 수크로오스 대신 트레할로스를 사용할 수 있다. 수크로오스, Triton X-100, 및 글리세롤의 조합은 본 발명의 진단용 조성물 및 키트의 보관 안정성을 높여서 반응 효율을 유지하는데 도움이 된다.
일 구체예에서, 상기 키트는 검출의 편의성 및 결과분석의 명확성을 높이고 반응 결과물을 육안으로 확인하기 위해 비색분석용 물질, 형광분석용 물질 또는 검출용 표지 화합물과 같은 시약을 더 포함할 수 있다. 그러한 시약은 통상적으로 알려지거나 상업적으로 구매 가능한 것을 사용할 수 있고, 예를 들어, WarmStart®LAMP Mix가 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 시약은 반응이 효율적으로 일어나도록 하기 위해, 상기 언급한 바와 같은 Tris-HCl, (NH4)2SO4, KCl, MgSO4, 및 Tween-20을 포함하는 것일 수 있고, DNA 중합효소, 역전사효소와 같이 증폭 반응을 수행하기 위한 효소를 더 포함할 수 있다. 비색 분석의 경우 SimpliampTM Thermal Cycler/QuantStudioTM 3을 이용할 수 있고, 형광 분석의 경우 CFX96TM을 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 그 외에 상기 진단용 조성물 또는 키트의 검출 결과를 확인 하는 방법으로서 전기영동(electrophoresis), 검출용 표지 사용한 방사성 측정 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 비색분석 시 통상적인 PCR 기기(Thermocycler)를 사용할 수 있고, 형광분석 시 분석에 사용하는 형광물질의 탐지가 가능한 Real-Time PCR 기기를 사용할 수 있다.
상기 키트는 진단 결과를 정확하게 판독하기 위해서 음성대조물질 또는 양성대조물질을 더 포함할 수 있다. 음성대조물질로는 검출하거나 진단하고자 하는 질병과 관련이 없는 주형 RNA 또는 DNA를 이용할 수 있고, 양성대조물질로는 성병 원인균의 감염 환자로부터 수득된 생물학적 시료 또는 상기 원인균의 유전체 일부에 해당하는 주형 RNA 또는 DNA를 이용할 수 있다. 이들 대조 물질은 필요에 따라 하나의 튜브에서 생물학적 시료와 함께 또는 개별적으로 유전자 증폭 반응에 적용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는, 상기 핵산 검출용 구조물에 개체로부터 분리된 시료를 적용하는 단계; 및 상기 구조물 또는 가열패드에 열을 가하여 유전자를 증폭하는 단계를 포함하는, 핵산 검출 방법을 제공한다. 상기 검출 방법은 등온증폭반응 전에 역전사 하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한 상기 검출 방법은 비색분석 또는 형광분석하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 등온증폭반응은 구조물을 밀폐하여 등온 수조에 담궈 두거나 오븐에 넣어 두는 등의 방식으로 구조물 전체에 열을 가하는 것 만으로 반응이 일어나므로 사용하기 편리하다.
상기 생물학적 시료는 검사 대상인 개체로부터 수득된 것으로서, 비인두 또는 구인두로부터 스왑 또는 비 세척을 통해 수득된 것, 기관지 세척 또는 흡인물, 기관 간의 흡인물 및 기관지 생검, 객담, 기관지 폐포세척액 (bronchoalveolar lavage), 침, 혈액, 소변, 대변, 땀 등을 이용할 수 있다.
상기 생물학적 시료는 증폭 반응의 효율을 높이기 위해 전처리를 가할 수 있다. 전처리는 물로 10배, 50배, 100배, 200배, 또는 400배 희석하는 것일 수 있고, protenase K를 처리 후 열처리하는 것일 수 있고, 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법과 같은 통상적으로 알려진 것을 이용하거나 상업적으로 판매하는 키트를 이용해 생물학적 시료로부터 유전자를 추출하거나 일정 수준으로 정제하는 것일 수 있다. 생물학적 시료로부터 RNA를 추출하여 사용하는 경우, 표적 유전자를 증폭하기 전에 cDNA로 역전사하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 전처리는 50mM Tris-HCl (pH8.0),150mM NaCl, 5mM EDTA, 및 1% NP-40를 포함하는 lysis buffer, Brij-35 0.1% ~ 0.5w/w%, Tris-HCl 10mM ~ 300mM (pH7.0 ~ 8.0), 및 CaCl2 1mM ~ 10mM, 구체적으로 Brij-35 0.3w/w%, Tris-HCl 100 mM(pH7.5), 및 CaCl2 5mM을 포함하는 용액으로 검체 시료를 처리하는 것을 의미할 수 있고, 구체적으로 상기 용액으로 처리한 후 통상적인 방법으로 정제하여 시료로부터 유전자만 수득하는 것을 의미할 수 있다. 상기 전처리 용액의 조합은 검체로부터 유전자가 쉽게 추출되도록 하고, 등온증폭 반응 효율을 증진시킬 수 있다.
상기 증폭 산물의 검출은 SYBR Green I과 같은 형광 물질이나 형광표지자를 이용한 형광 측정, 페놀 레드와 같은 지시약의 색상 변화, 탁색도, 침전물 생성, DNA laddering, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트는 각 반응 시약을 담은 용기나 시험에 사용하기 위한 도구 및 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한 시료패드에 완충액을 가할 수 있다. 상기 완충액은 핵산 물질이 반응패드까지 이동할 수 있도록 하면서, 핵산 물질을 정제하는 역할을 한다. 상기 완충액은 적절한 양의 완충 성분을 함유하므로, 증류수를 첨가하는 경우 발생할 수 있는 급격한 염도나 pH 변화로 인한 단백질이나 핵산 물질의 침전 현상을 예방할 수 있다. 본 발명의 핵산 검출용 구조물의 각 패드는 핵산이 측방으로 이동하면서 정제될 수 있도록 작은 기공을 갖는 다공성 재질로 이루어진다. 따라서 단백질이나 핵산 물질이 착염이나 응집되어 기공을 막게 되면 시료의 이동속도가 감소하고 핵산 물질의 수득률이 저하될 수 있다.
본 발명의 핵산 검출용 구조물을 이용하면, 휴대하기 쉽고 신속하고 정확하게 현장 검출이 가능하다.
또한, 등온증폭반응은 증폭 반응을 수행하기 위한 특정 온도 및 조건을 맞추는데 요구되는 고가의 기기와 전문 인력을 필요로 하지 않으므로, 효율적이면서도 저렴한 비용으로 수행이 가능하기에 다수의 검사 대상자를 조기에 진단할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머 세트를 랩온페이퍼 기반의 키트에 적용하면, 시료의 전처리 (preparation), 핵산 증폭 반응 (reaction)과 검출 (detection)을 각각 별도로 수행하지 않고, 시료의 1회 적용으로 검출까지 한 번에 수행할 수 있다. 각 단계를 별도로 수행하지 않으므로, 전 과정이 단순화되어 다양한 시료나 장치를 요하지 않고, 관련 기술자가 아니어도 쉽게 수행할 수 있다.
도 1은 본 발명의 다중 핵산 검출용 구조물의 전체 구조물의 구조도이다.
도 2는 본 발명의 다중 핵산 검출용 구조물의 이용방법을 도식화 한 것이다.
도 3은 검출패드(160)에 표적 핵산이 획득되는 원리를 도식화한 것이다.
도 4는 본 발명의 다중 핵산 검출용 구조물의 측면 구조도이다.
도 5는 본 발명의 다중 핵산 검출용 구조물의 사시도이다.
도 6는 검출패드(160)의 구조를 확대한 구조도이다.
도 7은 등온증폭반응 시약 성분에 따른 핵산 증폭 효율을 보여주는 결과이다.
도 8은 혈액 시료로 비색진단 하는 검출 결과를 보여주는 예시이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
제조예 1. 랩온페이퍼 핵산 검출용 구조물의 제조
본 발명의 랩온페이퍼 핵산 검출용 구조물을 제조하기 위해, 시료패드(121) 및 버퍼패드(120)로는 0.5 ㎛ 폴리설폰, 제1연결패드(131)로는 0.01㎛ 셀룰로오스, 반응패드(140)로는 0.005㎛ 셀룰로스아세테이트, 제2연결패드(150)로는 0.05㎛ 셀룰로오스, 검출패드(160)로는 0.005㎛ 니트로셀룰로오스, 및 흡수패드(170)로는 0.5 ㎛ 유리섬유 재질로 준비하였다.
반응패드(140)는 셀룰로오스아세테이트 막을 겹쳐서 패드로 만들고 이를 45 mM 수크로오스, 0.005 w/w% TritonX-100, 및 0.2 w/w% 글리세롤을 포함하는 용액에 담근 후 건조시켜 준비하였다. 그리고 여기에 미세 드릴로 웰을 형성하고, 상기 웰의 바닥에 프라이머 세트를 포함하는 히드로겔 층을 형성하였다. 상기 히드로겔 층을 형성하기 위해 우선 히드로겔 용액 총 부피를 기준으로 UV-광가교성 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 (PEGDA, Sigma-Aldrich, MW700) 20% v/v, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG, Sigma-Aldrich, MW600) 40% v/v 및 광개시제 2-하이드록시-2-메틸프로피오페논 (Sigma-Aldrich) 5% v/v 및 버퍼(PBS 완충액, pH7.5) 35%를 혼합하고, 여기에 각 프라이머 세트를 혼합하여 하이드로겔 용액을 제조하였다. 상기 폴리(에틸렌 글리콜)은 히드로겔 미세입자의 공극율을 증가시키기 위하여 포함되는 것이 바람직하다. 그런 다음, 상기 히드로겔 용액을 반응패드의 각 웰 내부 표면에 도포하고, 1분간 UV 노출(360 nm wavelength, 35 mJ/cm2)하여 히드로겔 코팅층을 형성하였다.
그런 다음 반응패드(140)의 표면에 dNTP(1.4mM, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 등온증폭버퍼(1X, 20mM Tris-HCl, 10mM (NH4)2SO4, 50mM KCl, 2mM MgSO4, 및 0.1% Tween-20, pH7.5)에 더하여 각각 150 mM 글루탐산(시약 1), 100mM 시트르산(시약 2), 및 150 mM 만니톨(시약 3)을 더 포함하는 파우더를 사용하였다. 대조군은 공통 성분만을 포함하는 시약을 이용하였다. 추가적으로 Bst 3.0 DNA 중합효소(320U/㎖)를 도포하고, 약 38℃ 오븐에서 약 30분 간 가열하여 고정하였다.
제2연결패드(150)에 고정된 금 나노입자는 콜로이드 입자로서 하기와 같이 제조하였다. 0.1% HAuCl4용액을 교반 가열하면서 끓기 시작하면 0.5% 소듐시트르산 용액을 첨가하여 용액을 환원시켜 금 입자를 만들고, 여기에 스트렙타비딘(streptavidin)을 금 입자용액 100㎖당 각각 1mg을 첨가하여 축합시켰다. 축합체를 10,000g에서 원심분리하여 침전시키고 0.1% BSA를 함유하는 생리식염수(PBS)로 용해하여 OD450값이 10이 되도록 만들어 보관하였다.
제2연결패드(150)는 하기와 같이 제조하였다. 구체적으로, 셀룰로오스 막을 여러 겹쳐 준비하여 절단하고, 0.4 M의 Tris (pH 6.5), 0.2%의 Tween-20, 1%의 카제인나트륨, 0.1%의 소듐아지드(sodium azide), 및 0.05%의 Proclin 300으로 제조된 용액에 담궈 적셔 두었다. 상기 제조된 금 축합체는 상기 용액과 동일한 조성의 용액에 투석하여 준비하였다. 그런 다음, 상기 셀룰로오스 막에 상기 투석한 금 축합체를 처리하고 건조하여 제2연결패드(150)를 완성하였다.
검출패드(160)는 폴리에틸렌프탈레이트 잉크로 검출 구역을 스탬핑하여 지정하고, 그 위에 FAM, HEX, 및 Cy5 등의 형광 표지자에 결합할 수 있는 항체를 함유하는 용액으로 다시 스탬핑 한 후, NHS(N-hydroxysulfosuccinimide) 용액을 적용하고 반응시켜 항체를 고정하였다.
상기 제2연결패드(150)의 반응패드와 접촉하는 부분에는 5%의 저융점 아가로오스(Lonza, NuSieve GTG Agarose) 용액으로 코팅하였다.
그런 다음, 각 구조물의 구성요소를 도 1과 같이 배치하고, 상기 시료패드(121), 필요에 따라 버퍼패드(120), 반응패드(140), 및 제2연결패드(150)의 하단에는 가열패드로(141)로 구리판을 배치하고, 반응패드의 상부에는 차단패드(142)로 폴리아크릴 막을 배치하였다. 하우징(110)까지 구비하는 경우 도 2의 외관을 가질 수 있다.
시험예 1. 혈액 시료를 이용한 바이러스 검출
본 발명의 랩온페이퍼 핵산 검출용 구조물을 이용하여 침, 점막 분비물, 또는 혈액과 혼합된 시료로부터 핵산을 추출하고 이를 증폭하여 형광을 측정함으로써 SARS-CoV-2와 같은 바이러스 감염 여부를 쉽게 측정할 수 있다.
SARS-CoV-2를 검출하기 위해 SARS-CoV-2에 특징적인 N 단백질 유전자, 또는 Rdrp 유전자에 선택적으로 결합할 수 있는 프라이머 세트를 이용할 수 있다. 이러한 프라이머 세트를 사용하는 경우, 각 세트의 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머 중 어느 하나는 예를 들어, FAM, HEX, 또는 Cy5가 결합한 형태이고, 다른 프라이머는 비오틴으로 결합된 것이다. 시료 내에 상기 프라이머 세트가 특이적으로 결합할 수 있는 표적 핵산이 존재하는 경우, 반응패드 (140)에서 증폭되고, 제2연결패드(150)를 통과하면서 증폭된 핵산에 결합된 비오틴이 금 나노입자의 스트렙타비딘과 특이적으로 결합한다. 측방 흐름에 의해 금 나노입자와 결합한 증폭된 핵산은 검출패드(160)로 이동하고, 증폭된 핵산의 다른 측에 결합된 검출자가 상기 검출패드(160)에 고정된 FAM, HEX, 또는 Cy5에 특이적으로 결합할 수 있는 수용체에 결합하면서 검출 패드의 검출 구역을 분홍색으로 색변화 시킨다.
검출패드에 표적 핵산이 결합하는 원리를 도식화하면 도 2와 같다.
신뢰도를 높이기 위해 검출패드에 추가의 검출 구역을 형성한 후, SARS-CoV-2와 교차검출 가능성이 높은 바이러스에 특징적인 유전자에 선택적으로 결합하는 프라이머 세트를 도입하여 이를 음성대조군으로서 함께 검출할 수 있다.
시험예 2. 혈액 시료를 이용한 핵산 추출 및 증폭
(1) 시험 시료 및 페이퍼 칩의 준비
본 발명의 랩온페이퍼 핵산 검출용 구조물을 이용하여 침과 혼합된 시료로부터 핵산을 추출하고 이를 증폭하여 형광을 나타낼 수 있는지 확인하였다.
먼저 PCR 검사를 통해 음성으로 판정된 건강한 성인의 입 안에서 면봉으로 침을 채취한 후, 양성 대조군으로서 18S rRNA의 프라이머 (Tocris(# 7325, USA))와 siTOOLs Biotech 사의 SARS-CoV-2 positive control를 0.1pg/㎕로 준비하고, 양성대조군과 SARS-CoV-2 positive control을 각 1㎕를 혼합하여 1 개의 시험 시료를 준비하였다. 또한 18S rRNA의 프라이머만을 포함하는 시료를 준비하였다.
혼합된 SARS-CoV-2의 검출을 위한 프라이머 세트는 하기의 표 1과 같다. 각 프라이머 세트에서 F3 프라이머는 5' 말단에 검출자를 결합하였고, 양성대조군의 프라이머에는 FAM, SARS-CoV-2 positive control 프라이머에는 HEX로 표지하여 준비하였다.
유전자 프라이머 유형 서열
SARS-CoV-2의
N 유전자		 F3 5'-ACCGAAGAGCTACCAGACGA-3'
B3 5'-CTGCGTAGAAGCCTTTTGGC-3'
FIP 5'-TCCAGCTTCTGGCCCAGTTCCTTTTTATTCGTGGTGGTGACGGTAA-3'
BIP 5'-TATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTTTTTCATTGTTAGCAGGATTGCGGG-3'
FL 5'-ACCATCTTGGACTGAGATCTTTC-3'
BL 5'-TACACCAAAAGATCACATTGGCA-3'
※ F3, forward primer; B3, backward primer; FIP, forward inner primer; BIP, backward inner primer; FL, forward loop primer; BL, backward loop primer상기 각 프라이머 세트에서 F3 프라이머는 5' 말단에 검출자를 결합하였고, B3 프라이머 5' 말단에는 비오틴을 결합하였다.
(2) 등온증폭반응 효율 확인
상기 양성대조군과 SARS-CoV-2 positive control을 혼합한 시험 시료와 양성대조군은 혼합하되 SARS-CoV-2를 혼합하지 않은 시료를 증류수에 담궈 흔들어준 뒤 각각 50㎕ 취하여, 제조예 1에서 제조된 각각 시약 1, 시약 2, 시약 3, 및 대조군의 반응 시약을 포함하는 핵산 검출용 구조물의 시료패드(121)에 5 분 내로 천천히 적가하고, 부가 완충액 (20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 50 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0.1% Tween® 20, pH 8.8) 250㎕를 버퍼패드(120)에 약 2 분 동안 천천히 적가한 후, 구조물을 60℃ 오븐에 넣고 20분 간 반응시켰다. 그런 다음 검출패드 부분 만을 절단하여 증류수에 담근 후 볼텍싱하고 원심분리하여 상등액만을 수득하고, LAMP의 시각화를 위한 검출자로 100 μM 뉴트럴 레드 (N-red) 를 첨가한 후 색 변화를 관찰하였다.
그 결과 LAMP 반응에서 소량의 산성 아미노산이 첨가(시약 1)되는 경우 LAMP 반응의 감도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. (도 7)
(3) 시료로부터 핵산 검출
상기 시험예2-(2)와 같이 시료를 채취하여 본 발명의 핵산 검출용 구조물에 적용하였다. 사용한 구조물은 제조예 1에서 제조된 것 중 시약 1을 포함하는 것이었다. 그런 다음, 검출 패드에 표시되는 검출 구역의 색변화를 관찰하였다.
그 결과, 도 8과 같이 모두 양성대조군(FAM) 밴드를 확인함으로써 구조물이 정상적으로 작동함을 확인하였고, 시험 시료에서는 SARS-CoV-2 (HEK, 시험군 밴드)가 검출된 반면, 음성대조군 시료에서는 양성대조군(FAM) 밴드만 관찰되어 본 발명의 시스템을 이용하여 질병, 바이러스 또는 균 감염 여부를 진단할 수 있음을 확인하였다.
110: 하우징 구조물
120: 버퍼패드
121: 시료패드
130: 제1연결패드
140: 반응패드
141: 가열패드
142: 차단패드
150: 제2연결패드
160: 검출패드
170: 흡수패드
161: 검출구역

Claims (10)

  1. 생물학적 시료를 수용하는 시료패드;
    상기 시료패드와 접촉하여 배치되고, 재수화(rehydration) 완충액을 수용하는 버퍼패드;
    상기 시료패드와 반응패드를 연결하는 제1연결패드;
    상기 제1연결패드와 접촉하고, 표적 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머와 등온증폭반응 (LAMP)을 위한 시약을 포함하고, 등온증폭반응이 일어나는 반응패드;
    상기 반응패드 상부에 배치되고, 반응온도 유지 및 시료의 증발을 차단하는 차단패드;
    상기 반응패드와 접촉하고, 금 나노입자가 고정되어 있는 제2연결패드;
    상기 제2연결패드와 접촉하고, 상기 금 나노입자와 결합된 등온증폭반응물로부터 증폭된 표적 핵산을 획득하는 검출패드; 및
    상기 검출패드와 접촉하고, 잔류하는 시료를 흡수하는 흡수패드를 포함하고,
    상기 등온증폭반응용 시약은 10 내지 20mM Tris-HCl, 1 내지 10mM (NH4)2SO4, 10 내지 50nM KCl, 0.1 내지 2mM MgSO4, 및 0.01 내지 0.1% Tween-20 및 1 mM 내지 500 mM의 글루탐산(glutamic acid)을 포함하는
    다중 핵산 검출용 구조물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 버퍼패드, 시료패드 및 제1연결패드; 반응패드; 제2연결패드; 검출패드; 및 흡수패드는 순차적으로 적어도 일부분 접촉되어 측방으로 배치된 것인, 다중 핵산 검출용 구조물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 검출패드는 복수 개의 구분된 검출 구역을 포함하는 것인, 다중 핵산 검출용 구조물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 금 나노입자는 표면에 스트렙타비딘(streptavidin)을 포함하는 것인, 다중 핵산 검출용 구조물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 반응패드는 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 포함하고, 상기 정방향 및 역방향 프라이머 중 하나는 비오틴이 결합된 것이고, 나머지 하나의 프라이머에 Cy3, Cy5, TAMRA, TEX, TYE, HEX, FAM, TET, JOE, MAX, ROX, VIC, Cy3.5, Texas Red, Cy5.5, TYE, BHQ, Iowa Black RQ, 및 IRDye로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 형광 표지자로 표지된 것인, 다중 핵산 검출용 구조물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 시료패드에 적용된 시료는 흡수 패드까지 측방으로 이동하는 것인, 다중 핵산 검출용 구조물.
  7. 삭제
  8. 청구항 1의 다중 핵산 검출용 구조물을 포함하는, 질병, 바이러스 또는 균 감염 진단 키트.
  9. 청구항 1의 다중 핵산 검출용 구조물의 시료패드에 생물학적 시료를 적용하고, 표적 핵산을 증폭하는 단계; 및
    상기 핵산 증폭물을 검출패드에서 검출하는 단계를 포함하는, 질병, 바이러스 또는 균 감염 진단을 위한 정보 제공 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 생물학적 시료를 적용한 후, 부가 완충액을 상기 버퍼패드에 적가하는 단계를 더 포함하는, 질병, 바이러스 또는 균 감염 진단을 위한 정보 제공 방법.
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Citations (9)

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