KR102370566B1 - 원스텝 형광 다중 핵산진단 방법 - Google Patents

원스텝 형광 다중 핵산진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 1회의 시료를 적용하여 다수의 질환을 동시에 진단할 수 있는 구조물에 관한 것으로서, 랩온페이퍼(Lab-on-paper) 기술을 적용하여 시료의 전처리, 등온증폭, 검출 및 분석 단계를 하나의 칩 위에서 수행할 수 있고, 측방 유동식으로 시료를 이동시켜 최종적으로 질병 및 균주 감염과 관련된 유전자 빅 데이터와 연결되어 곧바로 상기 질병 및 균주 감염 여부를 판단할 수 있는 구조인 것을 특징으로 한다.

Description

원스텝 형광 다중 핵산진단 방법{Diagnostic method for detecting multiple nucleic acid with one-step}
본 발명은 1회의 시료를 적용하여 다수의 질환을 동시에 진단할 수 있는 측방 유동성의 일체형 시스템에 기반한 구조물에 관한 것으로서, 시료로부터 핵산을 정제하지 않고 곧바로 적용함에도 검출 감도가 높고, 복수 개의 표적 핵산을 동시에 검출이 가능하여 다수의 질병을 쉽고 빠게 진단할 수 있다.
의료서비스 수준이 증가하고 진단기기가 발전함에 따라 신종 바이러스, 슈퍼박테리아, 결핵, 식중독균 등 인체 건강을 위협하는 감염 미생물을 효과적으로 대처하기 위해 생활현장에서 빠른 시간에 간편하게 측정할 수 있는 기술이 개발되고 있다. 이들을 측정할 수 있는 분자진단은 민감도와 특이도가 우수한 진단 방법이나 특수한 장비나 시약을 요구하거나 복잡한 과정을 포함하는 경우가 많다. 면역진단 방법은 키트로 재현하기 쉽고 빠르고 간편하나 측정감도가 떨어지는 문제점이 있다.
현재 Real-time PCR을 이용한 진단법이 가장 빠르고 민감한 진단법으로 알려져 있으며, 일반적으로 8시간 이내에 진단이 가능하다. 현재 분자진단 방법은 PCR기술과 마이크로 채널 기술의 발전과 더불어 급속히 발전하고 있으며 Alere사의 AlereTM I 나 Roche의 Cobas Influenza 와 같이 60분 내에 검출이 가능한 제품도 상용화 되어 있다. 하지만 급속분자진단이 가능한 방법론의 경우에는 고가의 분석 장비 혹은 고가의 검사비용이 요구되며 분자진단의 전 과정을 구현하기 위해서는 여러 단계를 요구하고 있으므로 아직 현장 진단에는 한계점을 가지고 있다.
현재 보편화된 분자진단 법은 real-time PCR을 이용하는 것으로, 신속성 때문에 가장 보편화되어 있지만 현장진단 또는 1,2차 의료기관에서 사용하기에는 크고 고가의 장비를 요하기 때문에 쉽게 사용하는 것이 어려운 실정이다. 분자 진단을 위해서는 크게 시료의 전처리 (preparation), 핵산 증폭 반응 (reaction)과 검출 (detection)의 3단계가 요구되는데, 핵산 증폭 반응과 검출은 real-time PCR 장비에 의해 동시에 재현하는 것이 가능하지만 시료의 전처리 문제는 여전히 남아 있다.
한편, 랩온페이퍼(Lab-on-paper) 기술은 시료의 전처리, 등온증폭, 검출, 및 분석 단계를 하나의 칩 위에서 수행하도록 하는 일체형 시스템에 기반한 기술을 의미한다. 작은 페이퍼와 페이퍼에 심은 칩 구조물로 모든 반응을 자동화하여 빠르게 수행할 수 있으므로 검출 현장 등의 장소에 구애받지 않는 장점을 갖는다.
한국특허등록공보 제10-2037411호 한국출원공개공보 제10-2021-0018150호
일 양상은, 생물학적 시료를 수용하는 시료패드;
상기 시료패드와 분리되어 배치되고, 재수화(rehydration) 완충액을 수용하는 버퍼패드;
상기 시료패드의 상부에 배치되고, 시료패드와 반응패드를 연결하는 제1연결패드;
상기 버퍼패드의 상부에 배치되고, 버퍼패드와 반응패드를 연결하는 개시자 (opener)패드;
상기 제1연결패드와 개시자패드의 하부에 배치되고, 표적 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머와 등온증폭반응 (LAMP)을 위한 시약을 포함하고, 등온증폭반응이 일어나는 반응패드;
상기 반응패드 상부에 배치되고, 반응온도 유지 및 시료의 증발을 차단하는 차단패드;
상기 반응패드의 상부에 배치되고, 상기 등온증폭반응물을 운반하는 제2연결패드;
상기 제2연결패드의 하부에 배치되고, 상기 등온증폭반응물로부터 증폭된 표적 핵산을 획득하는 검출패드;
상기 검출패드의 측방에 배치되고, 잔류하는 시료를 흡수하는 흡수패드;
상기 검출패드의 상부에 배치되고, 상기 검출패드로부터 형광이미지를 획득하고, 형광 세기를 측정하는 인식부; 및
상기 인식부로부터 측정된 형광 세기 값을 이용하여 유의성 값을 도출하고, 상기 유의성 값으로 부터, 질병, 바이러스 또는 균 감염 여부를 출력하는 출력부를 포함하고,
상기 시료패드, 반응패드, 및 제2연결패드 하부에 배치된 가열패드를 포함하는,
질병, 바이러스 또는 균 감염 진단 시스템을 제공한다.
다른 양상은, 상기 시료패드 및 제1연결패드와 버퍼패드 및 개시자패드; 반응패드; 제2연결패드; 검출패드; 및 흡수패드는 순차적으로 적어도 일부분 접촉되어 측방으로 배치된 것인, 질병, 바이러스 또는 균 감염 진단 시스템을 제공한다.
또 다른 양상은, 상기 질병, 바이러스 또는 균 감염 진단시스템을 이용하여, 질병, 바이러스 또는 균 감염 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
여기서 사용되는 전문용어는 단지 특정 실시예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다. 여기서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함하는"의 의미는 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분을 구체화하며, 다른 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소, 성분 및/또는 군의 존재나 부가를 제외시키는 것은 아니다.
다르게 정의하지는 않았지만, 여기에 사용되는 기술용어 및 과학용어를 포함하는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다. 보통 사용되는 사전에 정의된 용어들은 관련기술문헌과 현재 개시된 내용에 부합하는 의미를 가지는 것으로 추가 해석되고, 정의되지 않는 한 이상적이거나 매우 공식적인 의미로 해석되지 않는다. 이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예에 의한 시스템에 대하여 설명하기로 한다. 여기서 사용되는 전문용어는 단지 특정 실시예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다. 여기서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함하는"의 의미는 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분을 구체화하며, 다른 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소, 성분 및/또는 군의 존재나 부가를 제외시키는 것은 아니다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예에 의한 구조물에 대하여 설명하기로 한다.
본 발명의 질병, 바이러스 또는 균 감염 진단 시스템은 랩온페이퍼 칩(lab-on-paper chip) 기술에 기반한 것으로서, 본 발명의 질병, 바이러스 또는 균 감염 진단 시스템을 이용하면 별도의 핵산을 정제하지 않아도 반응패드까지 이동하면서 핵산 물질이 정제되어 곧바로 증폭 반응에 적용될 수 있고, 1회의 시료를 적용하여 다수의 표적 핵산을 동시에 검출하고 관련 질병을 진단할 수 있다. 이를 실현하기 위해, 본 발명의 핵산 검출용 구조물은 시료패드(120), 버퍼패드(121), 제1연결패드(131), 개시자패드(132), 반응패드(140), 가열패드(141), 차단패드(142), 제2연결패드(150), 검출패드(160), 흡수패드(170) 및 하우징 구조물(110)을 구성요소로 포함한다.
이하 각 구성요소에 대해 상세히 설명한다.
시료패드
시료패드(120)는 핵산 물질이 함유된 시료를 수용한다. 상기 시료는 인체로부터 분리된 것으로서 혈액, 혈청, 혈장, 침, 땀, 소변, 세포배양액, 조직현탁액 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 시료는 세포 용해 완충액(lysis buffer)과 혼합된 것일 수 있고, 필요에 따라 상기 세포 용해 완충액과 혼합 후, 원심분리, 여과, 침전 등 통상적으로 알려진 방법으로 추가 정제될 수 있다. 바람직하게는 상기 시료는 세포 용해 완충액과 혼합된 후 핵산 검출용 구조물 외에서 상기 시료패드에 적용하기 위해 정제하는 단계를 포함하지 않는다.
상기 세포 용해용 완충액(Lysis buffer)은 Tris(트리스(히드록시메틸)아미노메탄(tris(hydroxymethyl)aminomethane))를 5 mM 내지 80 mM, 5mM 내지 50mM, 또는 10mM 내지 50 mM로 포함하는 것일 수 있다. Tris는 구체적으로 Tris-HCl일 수 있고, 세포 용해용 완충액에서 완충제로서 급격한 pH 변동을 줄일 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액은 pH 8.0 내지 9.0일 수 있다. pH가 8.0 미만인 경우, 핵산 물질의 안정성이 감소되거나 이동 속도가 감소될 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액은 염화칼륨(KCl)을 5 mM 내지 50 mM, 5mM 내지 40mM, 또는 10mM 내지 20 mM로 포함하는 것일 수 있다. 50 mM을 초과하는 고농도의 염화칼륨은 세포 용해에 도움이 되지만, 용출된 핵산 물질의 수용해도를 감소시켜 부가 완충액을 다량 가해야 하거나 반응패드까지 이동하는데 걸리는 시간을 증가시킬 수 있다. 반면 염화칼륨이 5 mM 미만인 경우 세포가 제대로 용해되지 않을 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액은 황산마그네슘(MgSO4)을 1 mM 내지 30 mM, 1mM 내지 20mM, 또는 2mM 내지 16 mM 로 포함하는 것일 수 있다. 황산마그네슘을 적정량 포함하는 경우 핵산 물질의 안정성과 이동 속도가 증가하는 것으로 확인되었고, 점도에 영향을 미치지 않기 때문에 유체의 흐름을 방해하지 않아 페이퍼 칩 분석용으로 시료를 전처리하는데 유리하다.
상기 세포 용해용 완충액은 황산암모늄((NH4)2SO4)을 5 mM 내지 50 mM, 5mM 내지 40mM, 또는 10mM 내지 20 mM로 포함하는 것일 수 있다. 50 mM을 초과하는 고농도의 황산암모늄은 세포 용해물을 침전시킬 수 있고, 황산암모늄이 5mM 미만인 경우 pH가 불안정해질 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액은 단백질분해효소를 0.01 mg/ml 내지 0.1 mg/ml, 또는 0.03 mg/ml 내지 0.07 mg/ml을 포함하는 것일 수 있다. 단백질분해효소는 고분자 단백질을 분해하여 핵산이 이동 경로인 기판이나 페이퍼의 기공을 고분자 단백질이 차단하지 않도록 하고, RNase 및 DNase 활성을 억제하여 핵산 물질의 안정성을 증가시킨다. 상기 단백질분해효소는 프로테이나아제 K(proteinase K)일 수 있다.
상기 계면활성제는 TritonX-100 또는 Tween20 (폴리소르베이트20)일 수 있고, 세포 용해용 완충액 중량을 기준으로 0.01w/w% 내지 0.2w/w%, 바람직하게는 0.05w/w% 내지 0.1w/w%로 포함될 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액은 시료의 부피 대비 1:1로 사용되는 것일 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액은 글리세롤을 포함하지 않는 것일 수 있다. 글리세롤은 단백질의 침전을 막기 위해 첨가되기도 하나, 글리세롤은 점도를 증가시켜 세포 용해물의 유동성을 감소시키고, 핵산 물질의 이동에 방해가 될 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액은 환원제를 포함하지 않는 것일 수 있다. 환원제는 디티오트레이톨(DTT), 머캅토에탄올 등으로서 단백질을 변성시키고 세포 용해물의 수용해도를 높이는데 도움이 되지만, 페이퍼 칩에 흘러 들어가는 용액 내 존재하는 경우 형광 발광 또는 검출 반응에 방해가 될 수 있다.
상기 시료패드의 하부에 배치되고 상기 시료패드를 가열하기 위한 가열패드(141)를 포함한다. 세포 용해용 완충액에 의한 시료의 용해를 효율적으로 하기 위해 가열패드를 60 내지 80℃의 온도에서 1 분 내지 5분 간, 바람직하게는 5 분 간 가열 처리해줌으로써 시료패드에서 바이러스와 상피세포를 포함하는 시료의 용해를 촉진한다.
상기 세포 용해용 조성물을 적용하면 폴리설폰 막 (예를 들어, Vivid GF) 또는 니트로셀룰로오스 막으로 이루어진 시료패드(120)에서 세포의 용해를 촉진하고, 핵산을 보다 쉽게 검출할 수 있도록 한다. 상기 폴리설폰 막 및 니트로셀룰로오스 막은 2개 이상이 적층된 구조를 이루는 것일 수 있다. 상기 폴리설폰 막은 비 대칭적인 것일 수 있고, 폴리설폰 막 및 니트로셀룰로오스 막은 0.5 ㎛ 내지 1 ㎛의 기공을 갖는 다공성 재질인 것일 수 있다. 상기 기공은 다소 큰 편인 것이 유리한데, 생물학적 시료는 점도를 갖는 것이 많고, 특히 시료에 세포 용해용 조성물을 처리하게 되면 핵산 물질과 단백질이 세포 밖으로 용출되면서 점도가 현저히 올라갈 수 있다. 따라서 시료패드의 기공 사이즈는 시료를 신속하게 흡수하기에 적절한 크기를 갖는 것이 바람직하다.
상기 세포 용해용 완충액을 이용함으로써 측방 유동식 (lateral flow)으로 핵산을 보다 쉽게 검출할 수 있다. 용어 “측방 유동식”이란 중력을 이용하지 않고, 수평 방향으로 모세관 현상이나 확산 현상에 의해 시료를 적용한 지점으로부터 목표 지점까지 흐르도록 하는 방식을 의미한다. 세포 용해물에는 핵산 물질을 분해할 수 있는 가수분해 효소들이 다량 함유되어 있으므로, 이동 경로에 오래 머무는 경우 핵산 물질의 수득량이 감소할 수 있다. 따라서 측방 유동식 핵산 검출용 구조물에 적용하려면, 흐름도가 우수해야 하고, 시료가 이동하는 동안 세포 용해물이 침전되어 이동 경로를 차단하지 않아야 한다. 또한, 핵산 물질과 염을 형성하여 침전이나 이동속도를 저하시키지 않아야 한다. 본 발명의 세포 용해용 완충액의 조성은 글리세롤 또는 환원제를 포함하지 않아도 세포 용해물이나 핵산 물질이 침전되지 않고, 높은 수율로 핵산 물질을 반응 패드까지 측방으로 이동시킬 수 있다.
제1연결패드
제1연결 패드는 시료패드의 상부에 배치되고, 시료패드에 비해 상대적으로 폭이 좁은 구조물로 시료패드와 반응패드를 연결한다.
제1연결 패드는 셀룰로오스 막으로 이루어진 재질로서, 0.005 ㎛ 내지 0.015 ㎛의 기공을 갖는 것일 수 있다.
버퍼패드
버퍼패드(121)는 재수화 완충액을 적가하는 패드로서, 구조물에 수압을 가하는 역할을 한다. 버퍼패드는 단백질과 같은 세포 용해 잔해물의 반응패드로의 이동을 최소화하고 반응 완료 후 수압을 가하여 등온증폭반응물 만의 검출패드로의 이동을 유도하기 위해 시료패드와 분리되어 배치될 수 있다.
버퍼패드에 적용되는 재수화 완충액은 부가 완충액으로서, 예를 들어 5 mM 내지 80 mM Tris-HCl, 20 mM 내지 70 mM 염화칼륨, 0.5 mM 내지 5 mM 황산마그네슘, 1 mM 내지 30 mM 황산암모늄, 및 0.01w/w% 내지 0.2 w/w% Tween® 20 내지 TritonX-100을 포함하고 산도가 pH 8.0 내지 9.0인 등온완충액 또는 인산 완충액 (50mM Na2HPO4, pH 7.2)일 수 있다. 상기 등온완충액은 보다 구체적으로 20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 50 mM KCl, 2 mM MgSO4, 및 0.1% Tween® 20을 포함하고, 산도는 pH 8.8일 수 있다. 상기 부가 완충액은 단백질분해효소, 글리세롤, 또는 환원제를 포함하지 않는 것일 수 있다.
상기 버퍼패드는 재수화 완충액을 충분히 수령할 수 있도록 0.5 ㎛ 내지 1 ㎛의 기공을 갖는 다공성 재질로서, 면, 융, 종이, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스아세테이트, 유리섬유, 폴리설폰, 폴리아크릴, 폴리니트릴, 폴리피페라진, 폴리아미드, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리덴플로리드, 폴리에틸렌이민, 폴리디메틸실록산 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
개시자 (opener) 패드
개시자 패드(132)는 버퍼패드의 상부에 배치되고, 버퍼패드에 비해 상대적으로 폭이 좁은 구조물로 버퍼패드와 반응패드를 연결한다.
개시자 패드는 셀룰로오스 막으로 이루어진 재질로서, 0.005 ㎛ 내지 0.015 ㎛의 기공을 갖는 것일 수 있다.
반응패드
반응패드는 랩온페이퍼에서 페이퍼 칩에 해당하는 구성요소로서, 증폭반응을 위한 dNTP, DNA 중합효소, 역전사 효소, 형광 표지자, 등온증폭반응 버퍼 등을 포함한 등온증폭반응 시약이 고정되어 있다. 따라서 시료패드에 적용되는 부가 완충액에 의해 반응패드에 핵산 물질을 포함하는 용액이 스며들어 적셔지고, 상기 등온증폭반응 시약과 시료의 접촉물이 반응패드로 이동하여 반응패드 하부에서 가열패드에 의해 온도를 60 내지 70℃로 가열하면 등온증폭반응 또는 역전사 등온증폭반응이 일어난다.
상기 등온증폭반응 시약은 구체적으로 dNTP(1.4mM, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 등온증폭버퍼(1X, 20mM Tris-HCl, 10mM (NH4)2SO4, 50mM KCl, 2mM MgSO4, 및 0.1% Tween-20, pH7.5), 및 Bst 3.0 DNA 중합효소(320U/㎖)를 포함할 수 있고, 이들은 반응패드 내에 혼합 후 건조하거나, 파우더 타입으로 반응패드 표면에 도포하여 예를 들어, 약 35 내지 40℃ 오븐에서 약 30분 간 가열하여 고정시킨 것일 수 있다.
반응패드(140)는 제1연결패드 및 제2연결패드와 일부분 접촉하여, 제1연결패드의 하부 및 측방으로 배치될 수 있다. 등온증폭반응이 일어날 수 있는 온도로 가열하기 위해 상기 반응패드(140) 하부에는 가열패드(141)가 배치될 수 있다. 상기 가열패드는 가열을 위한 열선 또는 열판을 포함할 수 있다. 상기 가열은 60 내지 70℃, 바람직하게는 60 내지 65℃에서 20분 내지 1 시간, 바람직하게는 20분 내지 30분 간 수행되는 것일 수 있다.
반응패드(140)는 제1연결패드 및 개시자패드와 일부분 접촉하여, 제1연결패드와 개시자패드의 하부 및 측방으로 배치될 수 있다. 등온증폭반응이 일어날 수 있는 온도로 가열하기 위해 상기 반응패드(140) 하부에는 가열패드(141)가 배치될 수 있다. 상기 가열패드는 가열을 위한 열선 또는 열판을 포함할 수 있다. 상기 반응패드는 등온증폭반응의 효율을 증가시키기 위해 반응패드 상부에 차단패드(142)가 배치되어 차단 역할을 할 수 있다. 일련의 배치된 패드를 라미네이트 처리된 차단패드에 의해 등온증폭반응 온도를 유지하고, 시약의 증발을 차단하여 반응의 효율을 증가시킬 수 있다. 상기 차단 패드는 비공성의 막 또는 외부 공기로부터 반응패드를 차단할 수 있는 구조물일 수 있다.
상기 반응패드에는 복수 개의 웰이 존재하고, 각 웰에는 등온증폭반응을 위한 프라이머 세트로서 정방향 및 역방향내부 프라이머(inner primer: FIP 및 BIP, 1.6μM), 루프 프라이머(loop primer: FL 및 BL, 0.4 μM) 및 외부 프라이머(outer primer: F3 및 B3, 0.2μM)가 고정될 수 있다. 상기 프라이머의 농도는 웰 부피에 대한 농도이고, 웰에서 프라이머 세트의 농도는 각 프라이머 간의 농도 비율을 유지하면서 변경될 수 있다. 반응 패드에 웰이 존재함으로써 등온증폭반응이 보다 집중적으로 일어날 수 있다. 상기 웰은 구체적으로 바닥에 히드로겔 층이 형성되어 있고, 상기 프라이머 세트가 히드로겔 층에 고정된 형태일 수 있다. 특정 표적 핵산의 집중적인 증폭을 위해, 각 웰에는 서로 다른 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트가 고정될 수 있다.
상기 프라이머를 함유하는 히드로겔 층은 예를 들어 하기와 같은 방법으로 형성될 수 있다. 히드로겔 용액 총 부피를 기준으로 UV-광가교성 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 (PEGDA, Sigma-Aldrich, MW700) 20% v/v, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG, Sigma-Aldrich, MW600) 40% v/v 및 광개시제 2-하이드록시-2-메틸프로피오페논 (Sigma-Aldrich) 5% v/v 및 버퍼(PBS 완충액, pH7.5) 35%를 혼합하고, 여기에 프라이머 세트를 혼합하여 하이드로겔 용액을 제조한다. 상기 폴리(에틸렌 글리콜)은 히드로겔 미세입자의 공극율을 증가시키기 위하여 포함되는 것이 바람직하다. 그런 다음, 상기 히드로겔 용액을 반응 패드의 각 웰 내부 표면에 도포하고, 1분간 UV 노출(360 nm wavelength, 35 mJ/cm2)하여 히드로겔 코팅층을 형성한다. 히드로겔 층은 공극을 가지므로 히드로겔 층 내 프라이머에 결합하여 공극 내에서 집중적으로 증폭반응이 일어날 수 있다.
상기 프라이머 세트에서 정방향 및 역방향 프라이머 중 어느 하나는 Cy3, Cy5, TAMRA, TEX, TYE, HEX, FAM, TET, JOE, MAX, ROX, VIC, Cy3.5, Texas Red, Cy5.5, TYE, BHQ, Iowa Black RQ, 및 IRDye로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 형광 표지자로 표지된 것일 수 있다. 상기 형광 표지자는 표적 핵산을 독립적으로 검출하기 위해, 표적 핵산 마다 다르게 표지 될 수 있다.
상기 프라이머 세트에서 정방향 및 역방향 프라이머 중 나머지 어느 하나는 비오틴이 결합된 것일 수 있다. 비오틴은 검출부 표면에 고정된 스트렙타비딘(streptavidin)에 결합할 수 있으므로, 최종적으로 검출 패드에서 스트렙타비딘과 결합하고 포획되면 형광 검출 결과를 가시화한다. 비오틴은 증폭된 표적 핵산에서 검출자와 서로 반대 위치에 존재하도록 설계될 수 있고, 예를 들어, 정방향 프라이머의 5' 말단에 검출자를 결합시킨 경우, 역방향 프라이머의 5' 말단에 비오틴을 결합시킬 수 있다.
상기 반응패드는 시료 및 부가완충액의 흐름은 자유롭도록 하면서 핵산이 머물면서 충분히 등온증폭반응할 수 있도록, 0.001㎛ 내지 0.005㎛, 바람직하게는, 0.005㎛의 기공 사이즈를 갖는 것일 수 있다.
상기 반응패드는 셀룰로오스아세테이트 막의 재질로 이루어진 것으로서, 시료 및 부가완충액의 흐름은 자유롭도록 하면서 핵산이 머물면서 충분히 등온증폭반응할 수 있도록, 0.001㎛ 내지 0.005㎛, 바람직하게는, 0.005㎛의 기공 사이즈를 갖는 것일 수 있다.
상기 반응패드는 40 mM 내지 50 mM 수크로오스, 0.001 내지 0.01% Triton X-100, 및 0.1w/w% 내지 0.3w/w%의 글리세롤을 포함할 수 있다. 이는 수분 또는 산소에 등온증폭반응 시약 및 프라이머세트 등이 노출되었을 때, 이들의 보관 안정성을 증가시킬 수 있다. 상기 보관 안정성이란 25℃ 내지 30℃에서 분해물이나 부산물 없이 3 주 이상 보관할 수 있는 것을 의미할 수 있다.
제2연결패드
제2연결패드(150)는 반응패드와 일부분 접촉하여 검출패드의 상부 및 측방으로 배치될 수 있다. 제2연결패드(150)는 반응패드에서 증폭된 핵산을 검출패드로 이동시킨다. 제2연결패드는 증폭된 핵산이 쉽게 검출패드로 이동할 수 있도록, 면, 융, 종이, 니트로셀룰로오스, 유리섬유, 폴리설폰, 폴리아크릴, 폴리니트릴, 폴리피페라진, 폴리아미드, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리덴플로리드, 폴리에틸렌이민, 폴리디메틸실록산 또는 이들의 혼합물인 다공성 재질로서, 0.01㎛ 내지 0.05㎛, 바람직하게는, 0.05㎛의 기공 사이즈를 갖는 다공성 재질일 수 있다.
제2연결패드는 반응패드의 상부에 배치되고, 반응패드나 검출패드에 비해 상대적으로 폭이 좁은 구조물로 반응패드와 검출패드를 연결한다.
제2연결패드는 셀룰로오스 재질을 갖는 것을 수 있고, 반응패드와 접촉하는 부분의 제2연결패드는 저융점 아가로오스 또는 왁스로 코팅된 것일 수 있다. 패드를 코팅하면 반응패드의 등온증폭반응물의 이동이 차단되었다가, 제2연결패드를 가열하는 시점에서 코팅이 녹아 등온증폭반응물이 측방으로 다시 이동하여 시료 내 미반응 유전물질의 소실을 막을 수 있다.
상기 제2연결패드 하부에는 가열을 위한 가열패드(141)가 배치될 수 있다. 등온증폭이 끝나는 시점에 부가 완충액을 가하면, 반응패드로부터 등온증폭된 결과물이 검출 패드로 쉽게 이동하도록 한다. 상기 가열은 60 내지 80℃로 1 분 내지 5 분간, 바람직하게는 2 분 간 수행되는 것일 수 있다.
검출패드
검출패드(160)는 제2연결패드와 일부분 접촉하여, 제2연결패드의 하부 및 측방에 배치될 수 있다. 검출패드(160)에는 형광 표지자와 결합할 수 있는 수용체가 고정되어 있다. 상기 수용체는 형광 표지자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 단백질, 또는 이의 절편일 수 있다.
상기 검출패드는 복수 개의 검출 구역을 포함하고, 상기 검출 구역은 선 또는 웰의 형태로 구분될 수 있다. 각 검출 구역 마다 각 수용체가 독립적으로 고정되고, 예를 들어, 폴리에틸렌프탈레이트 성분의 잉크로 스탬핑하여 검출 구역을 만든 후, 여기에 수용체를 포함하는 잉크로 다시 스탬핑 하거나 웰의 경우 수용체를 포함하는 용액을 적용하고, EDC(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide) 또는 NHS(N-hydroxysulfosuccinimide)를 적용할 수 있다. 하나의 반응패드에는 수십개 내지 수백개 이상의 검출 구역이 형성되어, 1회의 시료를 적용하여 형성된 검출 구역의 수 만큼의 표적 핵산을 검출할 수 있다. 도 5는 반응패드에 형성된 검출 구역의 구조를 상세히 설명하기 위한 것이고, 개수를 한정하는 의미는 아니다.
상기 검출패드는 니트로셀룰로오스 재질로서, 시료가 흡수패드까지 측방으로 이동할 수 있도록, 0.001㎛ 내지 0.005㎛, 바람직하게는, 0.005㎛의 기공 사이즈를 갖는 것일 수 있다.
가열패드
상기 시료패드, 반응패드, 및 제2연결패드 하부에는 가열패드(141)가 배치될 수 있다. 상기 가열패드는 열전도성을 갖는 금속판으로서, 철, 스테인리스, 알루미늄, 은, 구리 등의 재질로 이루어진 것일 수 있다. 상기 가열패드는 열선으로 연결될 수 있고, 각 열선은 상기 시료패드, 반응패드, 및 제2연결패드 하부의 가열패드에 독립적으로 연결되어 가열이 되는 패드를 제어할 수 있다.
상기 시료패드, 버퍼패드, 제1연결패드, 개시자패드, 반응패드, 제2연결패드, 검출패드, 및 흡수패드는 시료나 완충액이 소실되지 않도록 상하단에 하우징 구조물(110)이 존재할 수 있고, 전체 구조물은 하우징으로 정의될 수 있는 지지체 또는 비공성 재질의 케이스로 둘러싸인 것일 수 있다.
상기 흡수패드(170)는 시료와 완충액 등을 흡수하여 역흐름을 차단하고 측방 유동성이 유발될 수 있도록 기여한다. 흡수패드는 다공성 재질로서, 면, 융, 종이, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스아세테이트, 유리섬유, 폴리설폰, 폴리아크릴, 폴리니트릴, 폴리피페라진, 폴리아미드, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리덴플로리드, 폴리에틸렌이민, 폴리디메틸실록산 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 흡수패드는 바람직하게는 유리섬유로서 0.1 내지 0.5㎛의 기공 사이즈를 갖는 것일 수 있다.
상기 시료패드 및 제1연결패드와 버퍼패드 및 개시자패드; 반응패드; 제2연결패드; 검출패드; 및 흡수패드는 순차적으로 서로 일부분 접촉되어 측방으로 배치된다. 구체적으로, 시료패드 및 제1연결패드와 버퍼패드 및 개시자패드는 반응패드를 기준으로 분리되어 반응패드의 일 측면에 배치되고, 반응패드의 다른 측면에 이어서 제2연결패드, 검출패드, 및 흡수패드가 순차적으로 배치된다.
본 발명에 따른 구조물은, 구조물의 각 구성요소의 배치와 특성에 의해 시료가 흡수패드까지 도달하는 동안 핵산 물질 외에 세포 용해물을 여과하여 핵산 물질을 정제할 수 있고, 시료의 이동 방향이 지면과 평행한 방향인 측방 유동성을 실현할 수 있다. 세포 내에서 핵산은 히스톤, 중합효소, 핵산분해효소, 전사인자 등의 단백질이 결합된 형태로 존재한다. 세포 용해 조성물과 같은 계면활성제에 의해 많은 단백질이 핵산과의 결합을 소실하게 되나, 세포 용해물이 반응패드까지 이동할 수 있도록 추가로 가해지는 증류수 또는 부가 완충액에 의해 반응패드에 도달할 쯤에는 계면활성제가 희석되어 외부 환경이 단백질의 전하를 다시 회복할 있게 된다. 이 경우 단백질은 다시 핵산 물질과 결합하여 중합효소와의 접촉 면적을 축소시키거나 증폭 반응을 방해할 수 있다. 따라서 반응패드에는 핵산과 결합할 수 있는 대부분의 세포 구성 요소가 정제되어 제거되는 것이 바람직하다.
인식부
인식부(200)는 검출패드의 상부에 배치된다. 인식부는 검출패드로부터 형광 이미지를 획득하고, 획득한 형광 이미지로부터 형광 세기를 측정한다. 형광 세기는 측정 가능한 최대 값을 기준으로 실제 측정된 값의 비율로 산출할 수 있고, 복수 개의 형광 표지자를 여기하고 형광 이미지를 인식하기 위해, 다양한 파장대, 예를 들어 400 내지 700 λ 파장대의 광원과 각 여기 광의 선택적인 획득을 위한 필터를 포함할 수 있다. 인식부는 반응패드에 형성된 복수 개의 검출 구역을 독립적으로 인식하여 각 검출 구역의 형광 세기를 산출하고, "해당 검출 구역에서 측정된 형광 세기 값과 음성대조군의 형광 세기 값의 차이"를 출력부로 전송한다.
출력부
출력부(210)는 상기 인식부(200)로부터 전송된 형광 세기 값 차이를 이용하여 유의성 값을 도출한다. 유의성 값은 상기 인식부에서 측정 가능한 최대 값을 1로 설정하고, 형광 세기 값 차이가 0.3 이상인 경우 상기 유의성 값은 "70% 이상의 확률의 해당 검출 구역의 표적 핵산에 대해 양성"으로 출력하고, 형광 세기 값 차이가 0.5 이상인 경우 상기 유의성 값은 "해당 검출 구역의 표적 핵산에 대해 90% 이상의 확률의 양성"으로 출력할 수 있다. 상기 출력부는 질병, 바이러스 또는 균 감염과 관련된 유전자 정보를 포함하는 빅 데이터에 기반하여, 상기 도출된 유의성 값을 이용해 양성으로 출력된 표적 핵산과 관련된 질병, 바이러스 또는 균 감염 증상을 찾아내고, 최종적으로 시료가 획득된 개체의 질병, 바이러스 또는 균 감염 여부를 진단할 수 있도록 한다. 형광 세기 값 차이가 0.3 미만인 경우 상기 유의성 값은 "음성"으로 출력할 수 있다.
상기 표적 핵산은 프라이머 세트를 제작할 때에 이미 알고 있는 질병, 바이러스 또는 균 감염 증상과 관련된 것일 수 있고, 다른 예로는, 상업적으로 판매되거나 획득할 수 있는 프라이머 세트를 무작위로 적용하여 반응패드를 제작한 후, 시료로 부터 획득된 유의성 값을 빅 데이터에 기반하여 도출한 후 해당 프라이머 세트가 특이적으로 결합하는 염기서열과 관련 질병, 바이러스 또는 균 감염 증상을 매칭시킬 수 있다.
빅 데이터는 공개된 생물학적 데이터베이스로부터 획득될 수 있고, 염기서열의 경우 Genebank, EMBL(The European Molecular Biology Laboratory), DDBJ(DNA Data Bank of Japan) 등이 있고, 유전체데이터베이스로 Entrez Genome, Ensembl 등이 있고, 대사회로 데이터베이스로 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), WikiPathways 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
이하, 상기 핵산 검출용 구조물을 이용하여 핵산을 검출하는 방법을 서술한다.
핵산을 검출하고자 하는 시료는 시료패드에 적용하기 전에 세포 용해 완충액과 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 세포 용해 완충액과 혼합되면 세포 내에 존재하는 핵산 물질이 용출될 수 있으므로 시료 내에 검출 가능한 핵산 물질의 양을 증가시킬 수 있다.
시료패드에 5 mM 내지 80 mM Tris-HCl, 염화칼륨 5 mM 내지 50 mM, 황산마그네슘 1 mM 내지 30 mM, 황산암모늄 5 mM 내지 50 mM, 단백질분해효소 0.01 mg/ml 내지 0.1 mg/ml, TritonX-100 또는 Tween20 0.01w/w% 내지 0.2w/w%, pH 8.0 내지 9.0인 세포 용해용 완충액과 혼합된 세포 용해물을 적가하고, 상기 시료패드를 가열하기 위한 시료패드 하방의 가열패드를 작동시킴으로서 시료의 용해를 효율성을 높인다. 상기 시료패드 하방의 가열패드를 60 내지 80℃의 온도에서 2분간 가열 처리해줌으로써 시료패드에서 바이러스와 상피세포를 포함하는 시료의 용해를 촉진한다.
또한 버퍼패드에 완충액을 가할 수 있다. 상기 완충액은 핵산 물질이 반응패드까지 이동할 수 있도록 하면서, 핵산 물질을 정제하는 역할을 한다. 상기 완충액은 핵산 물질이 검출패드까지 이동할 수 있도록 하면서, 핵산 물질을 정제하는 역할을 한다. 상기 완충액은 적절한 양의 완충 성분을 함유하므로, 증류수를 첨가하는 경우 발생할 수 있는 급격한 염도나 pH 변화로 인한 단백질이나 핵산 물질의 침전 현상을 예방할 수 있다. 본 발명의 핵산 검출용 구조물의 각 패드는 핵산이 측방으로 이동하면서 정제될 수 있도록 작은 기공을 갖는 다공성 재질로 이루어진다. 따라서 단백질이나 핵산 물질이 착염이나 응집되어 기공을 막게 되면 시료의 이동속도가 감소하고 핵산 물질의 수득률이 저하될 수 있다.
상기 부가 완충액은 예를 들어 5 mM 내지 80 mM Tris-HCl, 20 mM 내지 70 mM 염화칼륨, 0.5 mM 내지 5 mM 황산마그네슘, 1 mM 내지 30 mM 황산암모늄, 및 0.01w/w% 내지 0.2 w/w% Tween® 20 내지 TritonX-100을 포함하고 산도가 pH 8.0 내지 9.0인 등온완충액 또는 인산 완충액 (50mM Na2HPO4, pH 7.2)일 수 있다. 상기 등온완충액은 보다 구체적으로 20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 50 mM KCl, 2 mM MgSO4, 및 0.1% Tween® 20을 포함하고, 산도는 pH 8.8일 수 있다. 상기 부가 완충액은 단백질분해효소, 글리세롤, 또는 환원제를 포함하지 않는 것일 수 있다.
상기 핵산 증폭반응이 원활히 일어날 수 있도록, 반응패드 하부의 가열패드를 60 내지 65 ℃로 가열하고, 온도를 유지하면서 20 분 내지 1 시간 바람직하게는 20 분 내지 30 분 동안 방치할 수 있다.
상기 다중 핵산 검출용 구조물을 이용해서 진단할 수 있는 질병은 특정 유전자가 원인이나 질병의 지표로서 이용될 수 있는 것으로, 예를 들어, 비만, 고혈압, 당뇨병 등과 같은 대사성 질환, 유전질환, 암 등이 있고, 바이러스 또는 균은 감염성 질환과 관련 있는 것으로, 균 감염증을 유발할 수 있는 균으로는 세균, 원충, 기생충, 진균 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 핵산 추출 및 증폭 방법을 이용하면, 시료의 전처리 (preparation), 핵산 증폭 반응 (reaction)과 검출 (detection)을 각각 별도로 수행하지 않고, 시료의 1회 적용으로 검출까지 한 번에 수행할 수 있다. 각 단계를 별도로 수행하지 않으므로, 전 과정이 단순화되어 다양한 시료나 장치를 요하지 않고, 관련 기술자가 아니어도 쉽게 수행할 수 있다.
또한, 각 단계를 수행하기 위한 복잡한 장치를 요구하지 않으므로, 장소에 제약을 받지 않고, 배포가 용이한 장점을 갖고, 1회의 시료를 적용하여 다수의 핵산 검출이 가능하므로 경제적이다.
도 1은 본 발명의 시스템이 포함하는 다중 핵산 검출용 구조물의 전체 구조 및 SARS-CoV-2에 감염된 환자의 시료를 이용하는 경우 결과물의 예시이다.
도 2는 검출패드(160)에 표적 핵산이 획득되는 원리를 도식화한 것이다.
도 3은 본 발명의 시스템이 포함하는 다중 핵산 검출용 구조물의 측면 구조도이다.
도 4는 본 발명의 시스템이 포함하는 다중 핵산 검출용 구조물의 사시도이다.
도 5는 검출패드(160)의 구조를 확대한 구조도이다.
도 6은 케이스로 둘러싸인 본 발명의 다중 핵산 검출용 구조물의 외관을 보여주는 예시이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 자세하게 설명하나, 이들은 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 이들에 의하여 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
제조예 1. 랩온페이퍼 핵산 검출용 구조물의 제조
본 발명의 랩온페이퍼 핵산 검출용 구조물을 제조하기 위해,
시료패드(120) 및 버퍼패드(121)로는 0.5 ㎛ 폴리설폰, 제1연결패드 또는 개시자패드(130)로는 0.01㎛ 셀룰로오스, 반응패드(140)로는 0.005㎛ 셀룰로스아세테이트, 제2연결패드(150)로는 0.05㎛ 셀룰로오스, 검출패드(160)로는 0.005㎛ 나이트로셀룰로오스, 및 흡수패드(170)로는 0.5 ㎛ 유리섬유 재질로 준비하였다.
반응패드(140)는 셀룰로오스아세테이트 막을 겹쳐서 패드로 만들고 이를 45 mM 수크로오스, 0.005 w/w% TritonX-100, 및 0.2 w/w% 글리세롤을 포함하는 용액에 담근 후 건조시켜 준비하였다. 그리고 여기에 미세 드릴로 웰을 형성하고, 상기 웰의 바닥에 프라이머 세트를 포함하는 히드로겔 층을 형성하였다. 상기 히드로겔 층을 형성하기 위해 우선 히드로겔 용액 총 부피를 기준으로 UV-광가교성 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 (PEGDA, Sigma-Aldrich, MW700) 20% v/v, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG, Sigma-Aldrich, MW600) 40% v/v 및 광개시제 2-하이드록시-2-메틸프로피오페논 (Sigma-Aldrich) 5% v/v 및 버퍼(PBS 완충액, pH7.5) 35%를 혼합하고, 여기에 각 프라이머 세트를 혼합하여 하이드로겔 용액을 제조하였다. 상기 폴리(에틸렌글리콜)은 히드로겔 미세입자의 공극율을 증가시키기 위하여 포함되는 것이 바람직하다. 그런 다음, 상기 히드로겔 용액을 반응패드의 각 웰 내부 표면에 도포하고, 1분간 UV 노출(360 nm wavelength, 35 mJ/cm2)하여 히드로겔 코팅층을 형성하였다.
그런 다음 반응패드(140)의 표면에 dNTP(1.4mM, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 등온증폭버퍼(1X, 20mM Tris-HCl, 10mM (NH4)2SO4, 50mM KCl, 2mM MgSO4, 및 0.1% Tween-20, pH7.5)를 함유하는 파우더와 Bst 3.0 DNA 중합효소(320U/㎖)를 도포하고, 약 38℃ 오븐에서 약 30분 간 가열하여 고정하였다.
검출패드(160)는 폴리에틸렌프탈레이트 잉크로 검출 구역을 스탬핑하여 지정하고, 그 위에 FAM, HEX, 및 Cy5 등의 형광 표지자에 결합할 수 있는 항체를 함유하는 용액으로 다시 스탬핑 한 후, NHS(N-hydroxysulfosuccinimide) 용액을 적용하고 반응시켜 항체를 고정하였다.
상기 개시자패드(132) 및 제2연결패드(150)는 반응패드와 접촉하는 부분에 5%의 저융점 아가로오스(Lonza, NuSieve GTG Agarose) 용액으로 코팅하였다.
그런 다음, 각 구조물의 구성요소를 도 3과 같이 배치하고, 상기 시료패드(120), 반응패드(140), 및 제2연결패드(150)의 하단에는 가열패드로(141)로 열선이 연결된 구리판을 배치하고, 반응패드의 상부에는 차단패드(142)로 폴리아크릴 막을 배치하였다.
시험예 1. 혈액 시료를 이용한 바이러스 검출
본 발명의 랩온페이퍼 핵산 검출용 구조물을 이용하여 혈액 시료로부터 핵산을 추출하고 이를 증폭하여 형광을 측정함으로써 SARS-CoV-2와 같은 바이러스 감염 여부를 쉽게 측정할 수 있다.
SARS-CoV-2를 검출하기 위해 SARS-CoV-2에 특징적인 N 단백질 유전자, 또는 Rdrp 유전자에 선택적으로 결합할 수 있는 프라이머 세트를 이용할 수 있다. 이러한 프라이머 세트를 사용하는 경우, 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머 중 어느 하나는 형광 표지자로 표지되고, 그에 따라 SARS-CoV-2에 감염된 환자의 시료로부터 SARS-CoV-2의 유전자를 검출할 수 있다.
신뢰도를 높이기 위해 검출패드에 추가의 웰을 형성한 후, SARS-CoV-2와 교차검출 가능성이 높은 바이러스에 특징적인 유전자에 선택적으로 결합하는 프라이머 세트를 도입하여 이를 음성대조군으로서 함께 검출할 수 있다.
시험예 2. 혈액 시료를 이용한 핵산 추출 및 증폭
(1) 시험 시료 및 페이퍼 칩의 준비
본 발명의 랩온페이퍼 핵산 검출용 구조물을 이용하여 혈액 시료로부터 핵산을 추출하고 이를 증폭하여 형광을 나타낼 수 있는지 확인하였다.
먼저 인간 혈액을 전혈로서 Innovative research (IWB1K2E10ML, USA)에서 구입하여 준비하고, 양성 대조군인 18S rRNA의 프라이머는 Tocris(# 7325, USA)에서 구입하였다. 사용된 전혈은 일체의 바이러스나 박테리아에 감염된 것이 아님을 data sheet를 통해 확인하였다. 상기 인간 혈액에 보렐리아 아프젤리(B. Afzelii) 를 각각 1*102 cell/ml로 혼합하여 1 개의 시험 시료를 준비하였다.
혈액에 혼합된 균주의 검출을 위한 프라이머 세트와 음성 대조군으로 사용된 및 보렐리아 부르그도르페리(B. Burgdorferi)의 프라이머 세트는 하기의 표 1과 같다. 본 시험예에서 사용된 프라이머는 염기서열 데이터베이스인 Genebank로부터 획득된 데이터에 기반하여 시료 내 존재하는 인간의 18sRNA 및 상기 혼합된 균주에 선택적으로 결합하는 것으로 설계된 것이다.
프라이머
유형		 서열
프라이머 세트 1
(B.afzelii 표적)		 F3 5'-GGTATACTGACAGCAGCTT-3'
B3 5'-CTTGCAGCTTAATAATAGCCTT-3'
FIP 5'-GTTGCTCGGTCCTCCATGTTTAAATTTTTAATGTTATCCGTGATATGGTTCCGA-3'
BIP 5'-GGATTTCGTATCAATTTTGGAGGCATTTTAAGTTACAAAGGTCCCATTGC-3'
FL 5'-ATAAGGCCTTCGGTATTG-3'
BL 5'-ATTCTACGTTCCGATTCTCAGTAT-3'
프라이머 세트 2
(B.burgdorferi 표적)		 F3 5'-AGAGCAGCTGAGGAGCT-3'
B3 5'-CTTCCAGTTGAACACCATCTT-3'
FIP 5'-AAGTCCACGACGGTTGAGACCTTTTTGCAGCCTGCTTAAATTAACA-3'
BIP 5'-GAGCAAACGAAGTTGAAGCTATTTTAGCCTGAGCAGTTAGAGC-3'
FL 5'-TGAATGCGATCCTGGT-3'
BL 5'-TATGGAGCTAATGTTGCTAAT-3'
※ F3, forward primer; B3, backward primer; FIP, forward inner primer; BIP, backward inner primer; FL, forward loop primer; BL, backward loop primer
상기 각 프라이머 세트에서 F3 프라이머는 5' 말단에 형광 표지자를 결합하였고, 양성대조군인 인간 18s RNA (A)는 FAM, 보렐리아 아프젤리(B)는 HEX, 및 보렐리아 부르그도르페리(C)를 표적하는 프라이머는 Cy5로 표지하였다.
(2) 시료로부터 핵산 검출
상기 시료 50㎕를 취하여 Lysis buffer (20mM Tris·HCl (pH 8.8), 15mM MgSO4, 15mM KCl, 15mM (NH4)2SO4, 0.1 w/w% Tween20, 0.05 mg/ml 단백질분해효소 (Protenase K)) 50㎕를 첨가하고 가볍게 탭핑(tapping)한 후, 5분 정도 상온에서 인큐베이션 하였다. 그런 다음, 시료패드(120) 하부의 가열패드(141)를 60℃로 작동시킨 상태에서 제조예 1에서 제조된 핵산 검출용 구조물의 시료패드(120)에 5 분 내로 천천히 적가하고, 부가 완충액 (20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 50 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0.1% Tween® 20, pH 8.8) 250㎕를 시료패드에 약 2 분 동안 천천히 적가한 후, 반응패드 하부의 가열패드를 60℃로 가열하여 30분 간 반응시켰다. 그런 다음, 제2연결패드 하부의 가열패드를 65℃로 가열하여 상기 부가 완충액 250㎕을 버퍼패드에 2 분 동안 천천히 적가하여 반응을 종료하였다.
그런 다음, 인식부(200)인 400 내지 700 λ의 파장대 광원 필터가 세팅된 Chemi-Doc XRS + 이미징 시스템 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 이용하여 각 형광 표지자에 해당하는 파장대에서 형광 이미지를 획득하고, 상기 형광 이미지로부터 형광을 측정하여 형광 세기를 최대 값 1 및 최소값 0으로 하고 그에 대한 비율로 산출한 후 하기의 식에 따라 형광세기 값을 구하였다.
형광 세기 값 = I - I N
(I N : 음성대조군의 형광 세기, I : 시료의 형광 세기)
검출된 형광세기 값에 기반하여 도출된 유의성 값을 산출하면 하기의 표 2와 같다.
형광 세기 값 유의성 값
A 0.65 90% 이상의 확률의 양성 (정상작동)
B 0.62 90% 이상의 확률의 양성
C 0.05 음성
상기 유의성 값에 기반하여 판단하면, 양성대조군(A)로서 구조물은 정상적으로 작동하였고, 보렐리아 아프젤리(B)에 감염되었고, 및 보렐리아 부르그도르페리(C)에는 감염되지 않는다는 결과가 출력된다. 이는 제조된 시료에서 의도한 바와 동일하여, 본 발명의 시스템을 이용하여 다수의 질병, 바이러스 또는 균 감염 여부를 진단할 수 있음을 확인하였다.
110: 하우징 구조물
120: 시료패드
121: 버퍼패드
131: 제1연결패드
132: 개시자패드
140: 반응패드
141: 가열패드
142: 차단패드
150: 제2연결패드
160: 검출패드
170: 흡수패드
161: 검출구역
200: 인식부
210: 출력부

Claims (10)

  1. 생물학적 시료를 수용하는 시료패드;
    상기 시료패드와 분리되어 배치되고, 재수화(rehydration) 완충액을 수용하는 버퍼패드;
    상기 시료패드의 상부에 배치되고, 시료패드와 반응패드를 연결하는 제1연결패드;
    상기 버퍼패드의 상부에 배치되고, 버퍼패드와 반응패드를 연결하는 개시자 (opener)패드;
    상기 제1연결패드와 개시자패드의 하부에 배치되고, 표적 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 세트와 등온증폭반응 (LAMP)을 위한 시약을 포함하고, 등온증폭반응이 일어나는 반응패드;
    상기 반응패드 상부에 배치되고, 반응온도 유지 및 시료의 증발을 차단하는 차단패드;
    상기 반응패드의 상부에 배치되고, 등온증폭반응물을 운반하는 제2연결패드;
    상기 제2연결패드의 하부에 배치되고, 상기 등온증폭반응물로부터 증폭된 표적 핵산을 획득하는 검출패드;
    상기 검출패드의 측방에 배치되고, 잔류하는 시료를 흡수하는 흡수패드;
    상기 검출패드의 상부에 배치되고, 상기 검출패드로부터 형광 이미지를 획득하고, 형광 세기를 측정하는 인식부; 및
    상기 인식부로부터 측정된 형광 세기 값을 이용하여 유의성 값을 도출하고, 상기 유의성 값으로 부터, 질병, 바이러스 또는 균 감염 여부를 출력하는 출력부를 포함하고,
    상기 시료패드, 반응패드, 및 제2연결패드 하부에 배치된 가열패드를 포함하고, 상기 프라이머 세트는 정방향 및 역방향 프라이머 중 어느 하나가 형광 표지자로 표지된 것인, 질병, 바이러스 또는 균 감염 진단 시스템.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 시료패드 및 제1연결패드와 버퍼패드 및 개시자패드; 반응패드; 제2연결패드; 검출패드; 및 흡수패드는 순차적으로 적어도 일부분 접촉되어 측방으로 배치된 것인, 질병, 바이러스 또는 균 감염 진단 시스템.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 시료패드, 제1연결패드, 버퍼패드, 개시자패드, 반응패드, 제2연결패드, 검출패드, 및 흡수패드는 하우징 구조물로 둘러 싸인 것인, 질병, 바이러스 또는 균 감염 진단 시스템.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 반응패드는 상부에 차단패드가 배치된 것인, 질병, 바이러스 또는 균 감염 진단 시스템.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 검출패드는 복수 개의 구분된 웰을 포함하는 것인, 질병, 바이러스 또는 균 감염 진단 시스템.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 반응패드는 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 포함하고, 상기 정방향 및 역방향 프라이머 중 하나는 비오틴이 결합된 것이고, 나머지 하나의 프라이머에 Cy3, Cy5, TAMRA, TEX, TYE, HEX, FAM, TET, JOE, MAX, ROX, VIC, Cy3.5, Texas Red, Cy5.5, TYE, BHQ, Iowa Black RQ, 및 IRDye로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 형광 표지자로 표지된 것인, 질병, 바이러스 또는 균 감염 진단 시스템.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 시료패드에 적용된 시료는 흡수패드까지 측방으로 이동하는 것인, 질병, 바이러스 또는 균 감염 진단 시스템.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 시료는 5 mM 내지 80 mM Tris-HCl(pH 8.0 내지 9.0), 염화칼륨 5 mM 내지 50 mM, 황산마그네슘 1 mM 내지 30 mM, 황산암모늄 5 mM 내지 50 mM, 단백질분해효소 0.01 mg/ml 내지 0.1 mg/ml, 및 계면활성제로서 TritonX-100 또는 Tween20 0.01w/w% 내지 0.2w/w%를 포함하는 세포 용해용 완충액과 혼합된 것인 질병, 바이러스 또는 균 감염 진단 시스템.
  9. 청구항 1의 질병, 바이러스 또는 균 감염 진단시스템의 시료패드에 생물학적 시료를 적용하고, 등온증폭반응하여 표적 핵산을 증폭하는 단계;
    상기 증폭된 표적 핵산으로부터 형광 이미지를 획득하고, 형광 세기를 측정하는 단계;
    상기 측정된 각 표적 핵산의 형광 세기 값을 이용하여 유의성 값을 결정하는 단계;
    상기 각 표적 핵산의 유의성 값으로부터 질병, 바이러스 또는 균 감염 여부를 출력하는, 바이러스 또는 균 감염 진단을 위한 정보 제공 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 생물학적 시료를 적용한 후, 부가 완충액을 상기 버퍼패드에 적가하는 단계를 더 포함하는, 질병, 바이러스 또는 균 감염 진단을 위한 정보 제공 방법.
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