KR102037411B1 - 측방 유동 분리 기반의 dna 추출 디바이스 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 측방 유동 분리 기반의 DNA 추출 디바이스에 대한 것이다.

Description

측방 유동 분리 기반의 DNA 추출 디바이스 {DNA EXTRACTION DEVICE BASED ON LATERAL FLOW SEPARATION}
본 발명은 측방 유동 분리 기반의 DNA 추출 디바이스에 대한 것이다.
DNA 는 미생물의 검출, 의학 진단, 식품 안전 및 법의학 등과 같은 다양한 응용 분야에서 유용한 바이오마커로 인정받고 있다. [1] 이에 따라, DNA를 추출하는 방법, 즉, DNA 추출 공정에 대한 중요성도 점차 증대되고 있다.
DNA 추출은 일반적으로 세포막의 용해, 단백질의 변성, DNA 안정성을 위한 DNase의 억제와 같은 화학 반응에 의하여 수행된다. [2] 상용화된 DNA 추출 키트들은 대부분 실리카 매트릭스를 사용한다. 실리카 매티릭스는 혈액, 소변, 조직, 타액 등과 같은 다양한 샘플들로부터 효과적으로 DNA를 추출할 수 있다. [3]
그러나, 이러한 종래의 DNA 추출 키트들은, DNA 추출 시간이 오래 걸리고, 비용이 많이 들며, 원심 분리 및 다중 세척 과정을 반드시 거쳐야 하는 등의 문제점이 있다.
[1] Niemz, A., T.M. Ferguson, and D.S. Boyle, Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends Biotechnol, 2011. 29(5): p. 240-50. [2] Thatcher, S.A., DNA/RNA preparation for molecular detection. Clin Chem, 2015. 61(1): p. 89-99. [3] Handbook, B.D.P., Qiagen. Gmbh, Germany, June, 2005.
본 발명자들은 전술한 문제점이 해결된 DNA 추출 디바이스를 개발하기 위하여 수많은 연구 및 노력을 기울였다. 그 결과, 측방 유동 분리 방식을 기반으로, 짧은 시간 내에 효율적으로 다양한 종류의 샘플들로부터 DNA 추출이 가능함을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 DNA 추출 효율이 높은 측방 유동 분리 기반의 DNA 추출 디바이스를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 측방 유동 분리 기반의 DNA 추출 디바이스를 이용하여 DNA 를 추출하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명의 목적들은 상술된 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기한 목적들을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 추출 디바이스는, DNA를 추출하고자 하는 샘플이 수용되는 샘플 패드(sample pad); 상기 샘플 패드에 수용된 샘플로부터 유출된 DNA를 운반하는 세척 버퍼(washing buffer)가 수용되는 로딩 패드(loading pad); 상기 세척 버퍼에 의하여 운반된 DNA가 농축되는 바인딩 패드(binding pad); 및 상기 바인딩 패드로 전개된 상기 세척 버퍼를 흡수하며, 상기 바인딩 패드의 다운 스트림에 위치하는 위킹 패드(wicking pad)를 포함한다.
실시예에서, 상기 DNA 추출 디바이스는, 상기 로딩 패드, 상기 샘플 패드, 상기 바인딩 패드 및 상기 위킹 패드가 순차적으로 상호 이격되어 나열된 구조를 포함한다.
실시예에서, 상기 로딩 패드, 상기 샘플 패드, 상기 바인딩 패드 및 상기 위킹 패드 각각은 다공성 멤브레인(porous membrane)으로 이루어져 상기 세척 버퍼에 대한 흡수성을 갖는다.
실시예에서, 상기 로딩 패드, 상기 샘플 패드, 상기 바인딩 패드 및 상기 위킹 패드는, 상기 세척 버퍼에 대한 흡수력이 서로 상이하다.
실시예에서, 상기 DNA 추출 디바이스는, 상기 로딩 패드, 상기 샘플 패드, 상기 바인딩 패드 및 상기 위킹 패드가 표면 상에 놓이는 지지체를 더 포함한다.
실시예에서, 상기 지지체는 상기 세척 버퍼 및 상기 DNA를 흡수하지 않는 물질로 이루어진다.
실시예에서, 상기 DNA 추출 디바이스는, 상기 바인딩 패드를 감싸도록 마련되며, 상기 바인딩 패드에 농축된 DNA를 밀집시키기 위한 홀(hole)을 포함하는 실링부재를 더 포함한다.
실시예에서, 상기 DNA 추출 디바이스는, 상기 로딩 패드, 상기 샘플 패드, 상기 바인딩 패드 및 상기 위킹 패드가 수용되는 케이스를 더 포함한다.
실시예에서, 상기 케이스는, 상기 로딩 패드와 대응되는 위치에 형성되어, 상기 로딩 패드에 상기 세척 버퍼를 주입시키기 위한 버퍼 주입구; 상기 샘플 패드와 대응되는 위치에 형성되어, 상기 샘플 패드에 상기 샘플을 주입시키기 위항 샘플 주입구; 및 상기 바인딩 패드와 대응되는 위치에 형성되어, 상기 바인딩 패드에 농축된 DNA를 추출하기 위한 DNA 추출구를 포함한다.
실시예에서, 상기 샘플 패드는, 상기 샘플로부터 DNA를 추출하는 라이시스 버퍼(lysis buffer)를 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 DNA를 추출하기 위한 방법은, 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 추출 디바이스를 이용하여 샘플로부터 DNA를 추출하기 위한 방법으로서, 상기 DNA를 추출하기 위한 방법은, 상기 샘플을 상기 샘플 패드에 주입하여, 상기 샘플을 상기 샘플 패드에 수용시키는 단계; 상기 세척 버퍼를 상기 로딩 패드에 주입하여, 상기 샘플 패드에 수용된 샘플로부터 유출된 DNA를 상기 바인딩 패드로 운반하는 단계; 상기 세척 버퍼를 상기 로딩 패드에 주입한 이후, 미리 설정된 시간 동안 정치하여 상기 샘플로부터 유출된 DNA가 상기 바인딩 패드에 농축시키는 단계; 및 상기 바인딩 패드에 농축된 DNA를 추출하는 단계를 포함한다.
상기한 목적들을 달성하기 위한 구체적인 사항들은 첨부된 도면들과 함께 상세하게 후술될 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다.
그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자(이하, "통상의 기술자")에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해서 제공되는 것이다.
본 발명은 다음과 같은 우수한 효과들을 가진다.
우선, 본 발명의 일 실시예에 따른 측방 유동 분리 기반의 DNA 추출 디바이스는 매우 높은 DNA 추출 효율을 갖는다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 측방 유동 분리 기반의 DNA 추출 디바이스에 의하면, 다양한 종류의 샘플들로부터 DNA를 추출하는데 매우 짧은 시간(약 3분)만이 요구된다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 측방 유동 분리 기반의 DNA 추출 디바이스는 원심 분리, 다중 세척 과정 등의 추가 처리를 요구하지 않기 때문에, 특히 제한적인 환경에서의 DNA 추출 분야에 유용하게 적용될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 측방 유동 분리 기반의 DNA 추출 디바이스는 다양한 샘플들로부터 DNA를 추출할 수 있어, 저비용, 신속성, 및 간편성을 추구할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 측방 유동 분리 기반의 DNA 추출 디바이스는 비교적 단순한 구조를 가지고 있어, 쉽고 빠르게 생산이 가능하므로, 쉽게 대량 생산 및 사업화 할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 효과들은 상술된 효과들로 제한되지 않으며, 본 발명의 기술적 특징들에 의하여 기대되는 잠정적인 효과들은 아래의 기재로부터 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1a 내지 도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 추출 디바이스를 도시한 도면이다.
도 2a 내지 도 7d는 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 추출 디바이스의 성능에 대한 실험 결과를 도시한 도면이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고, 여러 가지 실시예들을 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 이를 상세히 설명하고자 한다.
청구범위에 개시된 발명의 다양한 특징들은 도면 및 상세한 설명을 고려하여 더 잘 이해될 수 있을 것이다. 명세서에 개시된 장치, 방법, 제법 및 다양한 실시예들은 예시를 위해서 제공되는 것이다. 개시된 구조 및 기능 상의 특징들은 통상의 기술자로 하여금 다양한 실시예들을 구체적으로 실시할 수 있도록 하기 위한 것이고, 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다. 개시된 용어 및 문장들은 개시된 발명의 다양한 특징들을 이해하기 쉽게 설명하기 위한 것이고, 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.
본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우, 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 첨부된 도면들을 참조하여, 본 발명에 따른 DNA 추출 디바이스에 대하여 상세하게 설명한다.
도 1a 내지 도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 추출 디바이스를 도시한 도면이다.
도 1a 내지 도 1c를 참조하면, 본 발명에 따른 DNA 추출 디바이스(1)는, 샘플 패드(110), 로딩 패드(120), 바인딩 패드(130), 위킹 패드(140), 이송 패드(150), 지지체(160), 실링부재(170) 및 케이스(180)를 포함한다.
샘플 패드(110)(sample pad)에는 DNA를 추출하고자 하는 샘플이 수용된다. 샘플 패드(110)는 DNA 추출을 행할 샘플을 수용하여 함유할 수 있는 물질로 이루어진다. 여기서 샘플은, DNA 추출을 행할 생물학적 물질을 의미한다. 예를 들어, 샘플은 세포배양액, 타액, 혈액, 혈청, 인공 담액, 우유 등을 포함하며, 생리적 유체와 같은 어떠한 생물학적 공급원으로부터도 유래될 수 있다. 한편 샘플 패드(110)는 알칼리성을 갖도록 처리된다. 구체적으로, 샘플 패드(110)는 샘플 내의 타겟 세포를 파괴하여 타겟 세포로부터 DNA를 방출시키는 라이시스 버퍼(lysis buffer)를 포함한다. 이에, 샘플 패드(110)에 샘플이 주입되면, 샘플로부터 DNA가 유출된다.
로딩 패드(120)(loading pad)에는 샘플 패드(110)에 수용된 샘플로부터 유출된 DNA를 운반하는 세척 버퍼(washing buffer)가 수용된다. 후술할 샘플 패드(110), 로딩 패드(120), 바인딩 패드(130) 및 위킹 패드(140) 간의 액체 흡수성의 차이로 인하여, 로딩 패드(120)에 주입되어 로딩 패드(120)에 수용된 세척 버퍼는 DNA 추출 디바이스의 다운 스트림을 항햐여 전개된다. 즉, 로딩 패드(120)로부터 전개된 세척 버퍼는 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130) 및 위킹 패드(140)를 순차적으로 거치게 되어, 샘플 패드(110)에 수용된 샘플로부터 유출된 DNA를 바인딩 패드(130)로 운반한다.
바인딩 패드(130)(binding pad)에는 세척 버퍼에 의하여 운반된 DNA가 농축된다. 바인딩 패드(130)는 DNA가 농축될 수 있도록 생체적합성을 갖는 물질로 이루어진다. 한편, 본 실시예에 따른 DNA 추출 디바이스는, 바인딩 패드(130)를 감싸는 실링부재(170)를 포함한다. 실링부재(170)는 바인딩 패드(130)의 표면 상에 바인딩 패드(130)를 전체적으로 덮도록 마련된다. 그리고, 실링부재(170) 상에는 바인딩 패드(130)에 농축된 DNA를 밀집시키기 위한 홀(hole)이 형성되어 있다. 바인딩 패드(130)에 농축된 DNA는 실링부재(170) 상에 형성된 홀로 밀집되게 된다. 본 실시예에 따른 DNA 추출 디바이스는, DNA를 밀집시키는 실링부재(170)를 포함함으로써, DNA 추출 효율을 극대화시켰다.
위킹 패드(140)(wicking pad)는 바인딩 패드(130)로 전개된 세척 버퍼를 흡수한다. 위킹 패드(140)는 바인딩 패드(130)의 다운 스트림에 위치한다. 그리고, 세척 버퍼는 샘플 패드(110)에서 바인딩 패드(130)를 거쳐, 위킹 패드(140)로 흡수된다.
로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130) 및 위킹 패드(140) 각각은 다공성 멤브레인으로 이루어진다. 다공성 멤브레인을 이루는 다공성 물질의 비제한적인 예시로는, 섬유성 종이, 셀룰로오스 물질로 된 미세기공 멤브레인, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 유도체, 니트로셀룰로오스, 유리섬유, 카툰(cotton), 나일론과 같은 다공성 겔 등이 있다.
다공성 멤브레인으로 이루어져 있기 때문에, 로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130) 및 위킹 패드(140) 각각은 액체 흡수성을 갖는다. 구체적으로, 로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130) 및 위킹 패드(140) 각각은, 전술한 로딩 패드(120)에 주입되는 세척 버퍼에 대한 흡수성을 갖는다. 그리고, 로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130) 및 위킹 패드(140)의 액체 흡수력은 서로 상이하다. 보다 구체적으로, 로딩 패드(120)의 액체 흡수력이 가장 낮으며, 위킹 패드(140)의 액체 흡수력이 가장 크다. 즉, 로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130), 위킹 패드(140)로 갈수록 액체 흡수력이 커진다.
본 실시예에 따른 DNA 추출 디바이스는, 로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130) 및 위킹 패드(140)가 순차적으로 상호 이격되어 나열된 구조를 포함한다. 즉, 본 실시예에 따른 DNA 추출 디바이스는 복수의 패드들이 액체 흡수력의 순서대로 배열된 구조를 포함한다. 즉, 본 실시예에 따른 DNA 추출 디바이스는 업 스트림 쪽에 액체 흡수력이 가장 낮은 로딩 패드(120)가 마련되고, 다운 스트림으로 갈수록 액체 흡수력이 큰 패드가 마련되어, 다운 스트림의 가장 끝부분에는 위킹 패드(140)가 마련된 구조를 포함한다. 이러한 구조 때문에, 로딩 패드(120)에 주입된 세척 버퍼는 자연스럽게 위킹 패드(140)를 향하여 전개될 수 있다.
한편, 이송 패드(150)(transfer pad)는, 로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130) 및 위킹 패드(140)를 연결하여, 세척 버퍼가 이동할 수 있도록 한다. 즉, 이송 패드(150)는 로딩 패드(120)와 샘플 패드(110) 사이, 샘플 패드(110)와 바인딩 패드(130) 사이 및 바인딩 패드(130)와 위킹 패드(140) 사이에 각각 마련된다.
지지체(160)는, 로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130), 위킹 패드(140) 및 이송 패드(150)를 지지한다. 지지체(160)는 로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130), 위킹 패드(140) 및 이송 패드(150)를 지지할 수 있는 물질로써, 확산되는 DNA 및 세척 버퍼가 유출되지 않도록 액체 불투과성(액체 불흡수성)을 갖는 물질이라면 어떠한 물질로도 형성될 수 있다. 지지체(160) 상에는 로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130) 및 위킹 패드(140)가 순차적으로 마련된다. 그리고, 로딩 패드(120)와 샘플 패드(110) 사이, 샘플 패드(110)와 바인딩 패드(130) 사이 및 바인딩 패드(130)와 위킹 패드(140) 사이에는 각각 이송 패드(150)가 마련된다.
케이스(180)는 로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130), 위킹 패드(140), 이송 패드(150) 및 지지체(160)를 수용한다. 케이스(180)는 상부 케이스(180')와 하부 케이스(180")로 이루어진다. 하부 케이스(180")의 표면 상에는 로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130), 위킹 패드(140), 이송 패드(150) 및 지지체(160)가 놓인다. 하부 케이스(180")와 결합되는 상부 케이스(180')에는 버퍼 주입구, 샘플 주입구 및 DNA 추출구가 형성된다.
버퍼 주입구는 로딩 패드(120)와 대응되는 위치에 형성된다. 사용자는 버퍼 주입구를 통하여 로딩 패드(120)에 세척 버퍼를 주입할 수 있다.
샘플 주입구는 샘플 패드(110)와 대응되는 위치에 형성된다. 사용자는 샘플 주입구를 통하여 샘플 패드(110)에 샘플을 주입할 수 있다.
DNA 추출구는 바인딩 패드(130)와 대응되는 위치에 형성된다. 보다 구체적으로, DNA 추출구는 바인딩 패드(130)를 감싸는 실링부재(170)에 마련된 홀과 일렬로 정렬되도록 마련된다. 사용자는 DNA 추출구를 통하여 바인딩 패드(130)에 농축된 DNA를 추출할 수 있다.
이하, 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이하의 실험예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이하의 실험예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실험예
실험재료 및 방법
1. 실험재료
글래스 패드는 Millipore (Billerica, MA, USA)로부터 구입되었다. 비대칭 PES 멤브레인은 Pall Co. (Port Washington, NY, USA)로부터 구입되었다. ELISA 실링 테이프는 Excel Scientific (Victroville, CA, USA)로부터 구입되었다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머(Oligonucleotide primer)는 Genotech (Daejeon, South Korea)로부터 구입되었다. 단일 기증자의 타액 및 전혈은 innovative research (Novi, Michigan, USA)로부터 구입되었다.
2. S.auereus 샘플의 준비
S.aureus (ATCC 23235)는 Tryptic Soy Broth (Hach, CO, USA) 내에서 37℃ 의 온도 조건으로 18 시간 동안 200 rpm 의 진탕 배양기에 의하여 배양되었다. 배양된 세포들은 fresh Tryptic Soy Broth medium 내에 10배 희석되었고, 이후 18 시간 동안 37℃ 의 온도 조건으로 인큐베이션된 on Tryptic Soy Agar (Hach) plates 위에 놓여졌다. 하룻 밤 배양 후, 각 콜로니 점이 한번 계산되었고, 이후, S.aureus culture의 수가 기록되었다. 수가 기록된 S.aureus culture는 PBS 완충액으로 희석된 이후, 실험에 사용되었다.
3. QIAGEN kit 에 의한 DNA 추출
게놈 DNA는 갓 배양된 S.aureus 세포로부터 QIAamp DNA Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) 에 의하여 추출되었다. S.aureus 세포들을 포함하는 20μL 의 샘플이 Qiagen kit 의 라이시스 버퍼(lysis buffer)가 더해졌고, 이후 세척 버퍼에 의하여 처리되었다. 추출된 DNA는 50μL의 초순수에 의하여 분리되었고, 분리된 DNA의 농도는 UV-vis spectrometer 또는 CFX96 real-time PCR instrument (Bio-rad Laboratories, Hercules, CA) 에 의하여 측정되었다.
4. 게놈 DNA의 형광 표시
S.aureus 세포로부터 추출된 DNA는 ARES Alexa fluor 647 DNA labeling kit (Life Technologies, Carlsbad, CA)에 의하여 형광 표시 되었다. 틈번역(Nick translation)이 주형 게놈 DNA의 아민 작용기의 초기 표시에 사용되었다. 알코올 침전법에 의하여 처리된 DNA 용액은 QIAquick PCR purification kit (Qiagen)에 의하여 정제되었다. 형광 표시된 DNA 의 최종 농도는 qPRC 에 의하여 결정되었다.
5. 다양한 물질에 대한 DNA의 결합친화도 분석
결합친화도 분석을 위하여, glass fiber GF/C grade, 컨쥬게이트 패드(conjugate pad), glass fiber GF/F grade, 그리고 흡수 패드가 각각 5mm×5mm 크기로 재단되었다. 각 멤브레인 섹션은 10ng/μm 의 형광 표시된 DNA로 채워졌으며, 형광 이미지는 Chemi-Doc XRS+ imaging system (Bio-Rad)에 의하여 촬영되었다. 그리고, 각 멤브레인 물질은 15%(v/v) 이소프로필 알코올, 세척 버퍼와 동일한 버퍼 용액에 의하여 처리되었고, 동일한 방식에 의하여 형광 이미지가 획득되었다. 세척 전후 형광 이미지 및 각 물질의 강도는 Chemi-Doc system에 의하여 측정되었다.
6. 실시간 PCR 분석
6.1. PCR 조건
정량 실시간 PCR을 위한 프라이머는 NCBI 데이터베이스의 Staphylococcus aureus 165 ri bosomal RNA 유전자를 표적으로 설계되었다. 정방향 프라이머의 DNA 서열은 5'- GCACATCTTGACGGTACCTAATC-3' 이었고, 역방향 프라이머의 DNA 서열은 5'- CGCGCTTTACGCCCAATAA-3' 이었다. PCR 혼합물은 dNTPs, Taq 중합효소 및 반응 완충액이 사용되었다. 20μL의 반응 샘플은 100nM의 정방향 및 역방향 프라이머, 1X commercial qPCR mixture, 그리고 2μL 의 템플릿 DNA를 포함하는 샘플이 혼합되었다.
6.2. 실시간 PCR의 표준 정량 곡선
Qiagen extraction kit 으로부터 획득된 게놈 DNA 의 260nm 에서의 흡광도는 UV-vis spectrometer 에 의하여 측정되었으며, 이로부터 DNA의 절대 농도가 계산되었다. 농도가 측정된 DNA는 순차적으로 50ng 에서 0.05ng 까지 10배 희석되었으며, 각 용액에 대하여 실시간 PCR 곡선이 획득되었고(도 6a), S.aureus DNA 가 정량화 되었다. 실시간 PCR은 CFX96 real-time PCR instrument 에 의하여 수행되었고, 분석된 DNA의 정량은 DNA의 양과 Cq 값의 관계에 의하여 획득되었다. (도 6b)
7. DNA 추출을 위한 DNA 추출 디바이스
7.1. DNA 추출 디바이스의 제조
전술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 추출 디바이스는 이송 패드(150)(transfer pad), 로딩 패드(120)(loading pad), 샘플 패드(110)(sample pad), 바인딩 패드(130)(binding) 및 위킹 패드(140)(wicking pad)를 포함한다. 이송 패드(150)는 비대칭 PES 멤브레인의 종류 중 하나인 vivid plasma separation-GF (Pall)이다. 로딩 패드(120)로는 Glass pad GF/C grade (Whatman) 이 사용되었고, 샘플 패드(110)로는 conjugate pad (Pall)가 사용되었고, 바인딩 패드(130)로는 glass pad GF/F grade (Whatman) 가 사용되었다. 위킹 패드(140)는 DNA 추출 디바이스에서 유체의 흐름을 유도할 수 있도록 다운 스트림에 마련되었다.
우선, 적절한 길이로 절단된 이송 패드(150)가 지지체(160)(backing card) 상에 부착되었다. 균일한 길이로 절단된 로딩 패드(120)(10mm), 샘플 패드(110)(5mm) 및 위킹 패드(140)(15mm)는 지지체(160)의 나머지 부분들에 부착되었다. DNA 추출 디바이스의 모든 구성들이 부착된 이후, 받침 카드는 균일한 5mm 길이의 스트립 형태로 절단되었다. 그리고, 각 스트립은 DNA 추출 테스트를 위하여 프린트된 케이스(180) 안에 놓여졌다. 바인딩 패드(130)(5mm×5mm)는 1.5mm의 지름을 갖는 홀을 포함하는 ELISA 실링 테이프(실링부재(170))에 의하여 부착되었다. 마지막으로, 20μL의 라이시스 버퍼(200mM NaOH with 1% SDS)가 샘플 패드(110)에 피펫되었고, 이후 37℃ 오븐에서 건조되었다.
케이스(180)는 Solidwork software 에 의하여 디자인 되었고, 3D 프린팅에 의하여 제조되었다. 프린트된 케이스(180)는 상부 케이스(180')와 하부 케이스(180")를 포함한다. 상부 커버에 포함된 세개의 구멍들은 각각 버퍼 주입구, 샘플 주입구, 그리고 DNA 추출구로써, 각각 로딩 패드(120), 샘플 패드(110) 및 바인딩 패드(130)와 피팅되었다. DNA 추출 디바이스 내의 DNA 추출을 위한 모든 용액들은 주입구들을 통하여 주입되었고, 최종 DNA 용액은 피펫에 의하여 DNA 추출구 통하여 추출되었다.
7.2. DNA 추출 디바이스에 의한 DNA 추출
DNA 추출 디바이스에 의한 DNA 추출은 (1) 샘플 (2) 버퍼 (3) 추출 세 단계로 이루어진다. S.aureus 세포들을 포함하는 20μL 부피의 샘플 용액은 샘플 주입구를 통하여 주입되어, DNA 추출 디바이스 상의 샘플 패드(110)에 로딩되었다. 그리고, 75μL 의 세척 버퍼(15%(v/v) 이소프로필 알코올)가 버퍼 주입구를 통하여 샘플 용액 주입 이후 곧바로 주입되었다. 세척 버퍼가 주입된 지 3분이 경과된 이후, 2μL 의 D.W가 DNA 추출구를 통하여 3차례 주입 및 추출되었다. 마지막으로, 추출된 2μL 의 DNA 용액이 실시간 PCR에 의하여 분석되었다.
8. 복집한 시료들의 준비
다양한 샘플들에서의 DNA 추출을 평가하기 위하여, 세포배양액, 사람의 타액, 사람의 전혈, 인체 혈청, 인공 객담, 우유, 그리고 탈지면이 준비되었다. 그리고, 1μL 부피의 S.aureus 세포들이, 20 - 50μL 의 부피를 갖는 준비된 세포배양액, 사람의 타액, 사람의 전혈, 인체 혈청 등에 주입되었고, DNA 추출 디바이스에 의하여 테스트 되었다.
결과 및 고찰
1. 제안된 DNA 추출 디바이스의 개념
전술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 추출 디바이스는 도 1에 도시되었다. DNA 추출 디바이스에서의 DNA 추출을 위한 샘플 처리의 과정 및 예시는 도 1a에 도시되었다. DNA 추출 디바이스를 통한 DNA 추출은, (1) 샘플 주입 (2) 버퍼 주입 (3) DNA 추출의 간단한 과정만으로 가능하다. 그리고, 이러한 과정은 3분 내로 수행될 수 있다. 다양한 종류의 샘플들이 DNA 추출 디바이스에 의하여 필터링될 수 있다. DNA 추출 디바이스의 다공성 구조에 기반한 측방 유동 분리는, 부가적인 전처리 없이도, 박테리아 세포들을 포함하는 샘플의 점도, 농도 및 상태 등과 무관하게 복잡한 샘플들에 광범위하게 적용될 수 있다. 샘플 패드(110)에 샘플이 주입된 이후, 샘플 패드(110)의 라이시스 버퍼는 샘플 용액과 혼합되어, 타겟 세포를 파괴하여 DNA를 방출시킨다. 세척 버퍼는 로딩 패드(120)에 곧바로 주입되어, 방출된 DNA를 바인딩 패드(130)에 운반 및 농축 시킨다. 바인딩 패드(130)에 정제 및 농축된 DNA는 마이크로 피펫에 의하여 용출된다.
DNA 추출 디바이스의 구조 및 디자인된 케이스(180)는 도 1b에 도시되었다. 디자인된 케이스(180) 상의 세 개의 구멍의 위치는 로딩 패드(120), 샘플 패드(110) 및 바인딩 패드(130)의 위치에 대응된다. 구멍의 모양, 스트립 윤곽 및 케이스(180)의 압력은 오버플로우를 방지함과 동시에 DNA 추출 효율을 증대시키며, 다공성 구조 내의 유체 흐름 재현성을 향상시킨다.
완전히 조립된 DNA 추출 디바이스는 도 1c에 도시되었다. 실제 DNA 추출 디바이스의 크기는 동전과 비교되었다. DNA 추출 디바이스는 컴팩트한 디자인을 가지며 손에 들고 사용 가능한 크기를 가져, 제한된 환경에서의 핵산 테스트에 매우 적합하다.
2. DNA 추출 디바이스에서의 DNA 추출 원리
DNA 추출 디바이스는 다양한 다공성 물질들이 적절하게 배치되어, DNA 분자들의 상대적 친화도 차이에 따라 바인딩 패드(130) 상에 게놈 DNA 농도가 유도되도록 설계되었다.
로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130) 및 위킹 패드(140)는 도 2a에 도시된 바와 같이, 각각의 특성에 따라 배치되었다. 다양한 다공성 물질들의 결합친화도는 형광 표시된 게놈 DNA에 의하여 추정될 수 있었다.
도 2b는 형광 표시된 게놈 DNA를 로딩하고, 세척 버퍼에 의하여 처리하여 얻은 형광 이미지와 시험 물질의 분석 결과를 도시한 도면이다. DNA 분자들에 대한 각 물질의 결합친화도는 세척 이후의 형광 강도와 관련된 남은 DNA 양으로부터 비교될 수 있다. 형광 표시된 게놈 DNA와의 친화도는 다른 물질들에 비하여 glass filter 1에서 높게 나타났는데, 이는 glass filter 1이 DNA 추출 디바이스 내에서 바인딩 패드(130)로써 DNA를 농축할 수 있다는 것을 의미한다. 그리고, 컨쥬게이트 패드는 샘플 패드(110)로 효과적으로 사용될 수 있는데, 이는 컨쥬게이트 패드의 결합친화도가 다른 물질들에 비하여 매우 낮기 때문이다. 샘플 용액 내의 DNA 분자들의 대부분은 DNA 추출 디바이스의 동작 과정에서 샘플 패드(110)에 남지 않았다.
도 2c는 DNA 추출 디바이스의 동작 과정에서 바인딩 패드(130)의 형광 강도를 도시한 도면이다. 도 2c를 참조하면, 바인딩 패드(130)의 형광 강도는 3분 이후 새츄레이션 되는 것을 확인할 수 있는데, 이는, 3분의 시간은 바인딩 패드(130) 상에 DNA를 농축시키는데 충분한 시간이라는 것을 의미한다.
3. 분석 요소의 최적화
DNA 추출 디바이스로부터 고농도의 DNA를 회수할 수 있도록 하기 위하여, 형광 표시된 게놈 DNA를 이용하여 DNA 추출의 분석 요소를 최적화 하였다. 형광 표시된 DNA의 형광 강도는 유동 흐름 내에서 DNA 분자들의 분포에 대한 정보를 제공하는 바, 이로부터, DNA 추출의 다양한 파라미터들에 대한 최적 조건이 찾아질 수 있었다. 세척 버퍼의 부피와 DNA 추출 디바이스의 각 부분의 재로들은 바인딩 패드(130)에서의 형광 신호의 비교로부터 최적화되었다. 모든 최적화 테스트에서, 가장 효과적인 분석 요소들은 형광 표시된 DNA에 의하여 먼저 테스트 되고, 이후, 정량 실시간 PCR 분석을 통하여 최적화된 조건이 확인되었다.
세포 용해 효과와 관련된 몇가지 요소들은 효과적인 DNA 용출 효과에서와는 다른 결과를 보였다. 라이시스 버퍼는 DNA 방출과 직접적인 관련이 있었고, 형광 테스트에서는 다른 결과를 보였다. 화학적 세포 용해 메커니즘에서, 효소 용해, 알칼리 용해 및 세제 등과 같은 다양한 유형의 용해 버퍼가 개발되었다. 이 중, 알칼리 분해가 빠르고, 단백질을 완전히 변성시키며, 간단한 조성으로 복잡한 조건에서 반응할 수 있는 알칼리 용해 방법이 본 발명의 DNA 추출 디바이스에 적용되었다. 건조 상태에서의 알칼리 용해 버퍼의 적합한 조성은 샘플 패드(110)의 다공성 구조로부터 테스트 되었다. 도 7b는 용해 효과가 알칼리 용해 버퍼의 첨가 세제에 의존적임을 보여주는 비교 데이터를 도시한 도면이다. 이온성 세제인 SDS를 포함하는 실험군은 세포 용해 및 DNA 추출에 효과적이었다. Triton X-100 으로 대표되는 비이온성 세제의 경우 알칼리 용해 버퍼의 용해 효과를 증가시키지 않았다. 건조한 상태의 200mM NaOH with 1% SDS 가 가장 높은 DNA 추출 효율을 보여주었다.
용출 단계의 효율을 향상시키기 위하여, DNA의 농도를 통하여 DNA 용출 방법들을 상호 비교하였다. 이는 본 발명에 의한 DNA 추출 디바이스에 의한 DNA 추출 과정에서 추가적인 처리 없이 유체 흐름을 유도할 수 있도록 하는 적절한 방법을 찾고자 함이었다. 다양한 구조 또는 전통적인 방법들이 시험되었다. 바인딩 패드(130)를 덮는 실링 테이프의 구멍은 유출된 DNA의 효과적인 흐름을 유도하여, 결과적으로 바인딩 패드(130)의 DNA 농도를 증가시켰다.
4, 세포 수 및 샘플 부피에 따른 DNA 추출 효과
본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 추출 디바이스에 의하여, 다양한 샘플 용액들에 대한 DNA 추출이 수행되었다. 모든 DNA 추출 결과들은 Qiagen kit에 의한 결과들과 비교되었다. 도 3a는 PBS 내의 101 to 106 CFU 의 S.aureus 세포들로부터 DNA를 추출한 결과를 도시한 도면이다. DNA 추출 디바이스는 다양한 농도 범위에서 대조군(Qiagen kit에 의한 결과)과 필적할만한 DNA 추출 효율을 보였다. 104 CFU 이하의 S.aureus 세포 수에서, DNA 추출 디바이스의 DNA 농도는 대조군 보다 높았다. 본 발명에 의한 DNA 추출 디바이스는 특히, 낮은 수의 세포들을 포함하는 시료에 대하여 높은 효율을 보이는 것을 확인할 수 있는 바, 저 농도 샘플에 대한 급속 진단 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
DNA 추출 디바이스를 이용하여 다양한 부피를 갖는 샘플들을 효과적으로 정제될 수 있었다. 도 3b에서, 5μL~100μL의 부피를 갖는 PBS 용액 내의 5.5×102 CFU 의 S.aureus 세포가 처리되었고, 유사한 농도의 DNA 가 획득되었다. 이러한 부피 범위에서 DNA 추출 디바이스는 정확하고 신뢰성 있는 DNA 추출 효과를 보여주었다. 특히, DNA 추출 디바이스는 대조군에 비하여 이러한 부피 범위에서 높은 DNA 추출 효율을 보여주었다.
5. 다양한 복잡한 샘플들에서의 DNA 추출
5.5×102 CFU 의 S.aureus 세포들을 포함하는 다양한 복잡한 샘플들이 DNA 추출 디바이스에 의하여 처리되었고, 정량 실시간 PCR을 통하여 추출된 DNA의 농도가 분석되었다. 대조군으로써, PBS 버퍼가 DNA 추출 디바이스 및 Qiagen kit에 의하여 처리되었다. 샘플로는 세포배양액, 타액, 혈액, 혈청, 인공 담액, 우유, 탈지면 등이 사용되었으며, 각 샘플은 DNA 추출 디바이스 및 Qiagen kit에 의하여 처리되었다.
도 4는 이러한 샘플들에 대한 DNA 추출 결과를 도시한 도면이다. 이러한 샘플들에 대하여, DNA 추출 디바이스는 PBS 버퍼로부터 예상된 결과와 같은 DNA 추출을 수행하였다. 타액 및 우유와 같은 복잡한 샘플에서는 표준편차가 증가되었다. 복잡한 샘플들 내에 포함된 오염물은 DNA 추출에 영향을 주었으나, DNA 추출 디바이스에서의 측방 유동 분리에 영향을 미치는 중요한 요소는 아니었다. 탈지면의 경우, DNA 추출 디바이스는 Qiagen kit 보다 높은 효율성을 보였는데, DNA 추출 디바이스 내에 포함된 샘플 패드(110)의 접촉 면적이 Qiagen kit 에 포함된 실리카 컬럼의 접촉 면적 보다 높기 때문이다. 또한, 인공 담액의 경우 또한 높은 DNA 농도를 보였는데, 이는 DNA 추출 디바이스의 다공성 구조에 의한 측방 유동 분리에 의하여 점성을 갖는 샘플들이 효과적으로 여과되기 때문이다. 혈액 및 혈청의 경우, DNA 추출 디바이스는 효율성이 Qiagen kit에 비하여 다소 떨어졌다. 이는, 혈액 및 혈청에 포함된 특정 단백질이 DNA 분자들과 다공성 표면 간의 상호 작용을 방해하기 때문으로 이해될 수 있다. 다만, Qiagen kit에 비하여 상대적으로 추출 농도가 떨어졌을 뿐, DNA 추출 디바이스에 의하여 추출된 DNA 농도도 DNA 분석 등을 위하여 필요한 농도로는 충분한 수치이다. 특히, 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 추출 디바이스는 단순한 구조를 가지면서도, 쉽고 빠르게 복잡한 샘플들로부터 DNA를 추출할 수 있는 이점을 갖는다.
6. DNA 추출 디바이스에서의 DNA 샘플 장기 보관
다공성 멤브레인은 DNA 저장 및 운송을 위한 소재로 사용될 수 있다. 이에, 다공성 멤브레인에 기반한 본 발명의 DNA 추출 디바이스 또한 DNA 분자의 저장, 보관 및 운반 등에 사용될 수 있다. 도 5는 DNA 추출 디바이스가 DNA 분자의 저장, 보관 및 운반 등에 효과적으로 사용될 수 있음을 나타내는 도면이다. 도 5를 참조하면, 대기조건에서 8주 동안 보관된 S.aureus 세포로부터도 효과적으로 DNA가 추출될 수 있다는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 DNA 추출 디바이스가 전처리 및 DNA 추출이 요구되는 원 샘플에 대한 유용한 대안이 될 수 있다는 사실을 보여준다.
결론
본 발명의 DNA 추출 디바이스는 다공성 물질들에 기반하여 복잡한 샘플들의 DNA 추출에 효과적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 DNA 추출 디바이스에 의하여 그람 양성(gram-positive) 박테리아인 S.aureus 의 DNA가 효과적으로 추출될 수 있었으며, 다양한 유형의 샘플들에 대하여도 효과적인 DNA 추출이 수행될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 본 발명의 DNA 추출 디바이스는 단순한 조작만으로도 다양한 유형의 복잡한 샘플로부터 DNA를 추출할 수 있는 효과를 갖는다.
이상의 설명은 본 발명의 기술적 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로, 통상의 기술자라면 본 발명의 본질적인 특성이 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변경 및 수정이 가능할 것이다.
따라서, 본 명세서에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 한정하기 위한 것이 아니라, 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예들에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 보호범위는 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
1 : DNA 추출 디바이스
110 : 샘플 패드 120 : 로딩 패드
130 : 바인딩 패드 140 : 위킹 패드
150 : 이송 패드 160 : 지지체
170 : 실링부재 180 : 케이스

Claims (11)

  1. DNA를 추출하고자 하는 샘플이 수용되는 샘플 패드(sample pad);
    상기 샘플 패드에 수용된 샘플로부터 유출된 DNA를 운반하는 세척 버퍼(washing buffer)가 수용되는 로딩 패드(loading pad);
    상기 세척 버퍼에 의하여 운반된 DNA가 농축되는 바인딩 패드(binding pad);
    상기 바인딩 패드로 전개된 상기 세척 버퍼를 흡수하며, 상기 바인딩 패드의 다운 스트림에 위치하는 위킹 패드(wicking pad); 및
    상기 바인딩 패드를 감싸도록 마련되며, 상기 바인딩 패드에 농축된 DNA를 밀집시키기 위한 홀(hole)을 포함하는 실링부재를 포함하는,
    DNA 추출 디바이스.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 DNA 추출 디바이스는,
    상기 로딩 패드, 상기 샘플 패드, 상기 바인딩 패드 및 상기 위킹 패드가 순차적으로 상호 이격되어 나열된 구조를 포함하는,
    DNA 추출 디바이스.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 로딩 패드, 상기 샘플 패드, 상기 바인딩 패드 및 상기 위킹 패드 각각은 다공성 멤브레인(porous membrane)으로 이루어져 상기 세척 버퍼에 대한 흡수성을 갖는,
    DNA 추출 디바이스.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 로딩 패드, 상기 샘플 패드, 상기 바인딩 패드 및 상기 위킹 패드는, 상기 세척 버퍼에 대한 흡수력이 서로 상이한,
    DNA 추출 디바이스.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 DNA 추출 디바이스는,
    상기 로딩 패드, 상기 샘플 패드, 상기 바인딩 패드 및 상기 위킹 패드가 표면 상에 놓이는 지지체를 더 포함하는,
    DNA 추출 디바이스.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 지지체는 상기 세척 버퍼 및 상기 DNA를 흡수하지 않는 물질로 이루어진,
    DNA 추출 디바이스.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    상기 DNA 추출 디바이스는,
    상기 로딩 패드, 상기 샘플 패드, 상기 바인딩 패드 및 상기 위킹 패드가 수용되는 케이스를 더 포함하는,
    DNA 추출 디바이스.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 케이스는,
    상기 로딩 패드와 대응되는 위치에 형성되어, 상기 로딩 패드에 상기 세척 버퍼를 주입시키기 위한 버퍼 주입구;
    상기 샘플 패드와 대응되는 위치에 형성되어, 상기 샘플 패드에 상기 샘플을 주입시키기 위한 샘플 주입구; 및
    상기 바인딩 패드와 대응되는 위치에 형성되어, 상기 바인딩 패드에 농축된 DNA를 추출하기 위한 DNA 추출구를 포함하는,
    DNA 추출 디바이스.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 샘플 패드는, 상기 샘플로부터 DNA를 추출하는 라이시스 버퍼(lysis buffer)를 포함하는,
    DNA 추출 디바이스.
  11. DNA 추출 디바이스를 이용하여 샘플로부터 DNA를 추출하기 위한 방법으로서,
    상기 DNA 추출 디바이스는,
    DNA를 추출하고자 하는 샘플이 수용되는 샘플 패드(sample pad);
    상기 샘플 패드에 수용된 샘플로부터 유출된 DNA를 운반하는 세척 버퍼가 수용되는 로딩 패드(loading pad);
    상기 세척 버퍼에 의하여 운반된 DNA가 농축되는 바인딩 패드(binding pad); 및
    상기 바인딩 패드로 전개된 상기 세척 버퍼를 흡수하며, 상기 바인딩 패드의 다운 스트림에 위치하는 위킹 패드(wicking pad)를 포함하고,
    상기 DNA를 추출하기 위한 방법은,
    상기 샘플을 상기 샘플 패드에 주입하여, 상기 샘플을 상기 샘플 패드에 수용시키는 단계;
    상기 세척 버퍼를 상기 로딩 패드에 주입하여, 상기 샘플 패드에 수용된 샘플로부터 유출된 DNA를 상기 바인딩 패드로 운반하는 단계;
    상기 세척 버퍼를 상기 로딩 패드에 주입한 이후, 미리 설정된 시간 동안 정치하여 상기 샘플로부터 유출된 DNA가 상기 바인딩 패드에 농축시키는 단계; 및
    상기 바인딩 패드에 농축된 DNA를 추출하는 단계를 포함하는,
    DNA를 추출하기 위한 방법.
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