JP2022033527A - Ｒｎａろ過器及びｒｎａろ過方法 - Google Patents

Abstract

【課題】試料に混在する夾雑物であるＤＮＡ等を除去し、ＤＮＡを含まずＲＮＡを含む成分のみを抽出できるＲＮＡろ過器を提供する。
【解決手段】本ＲＮＡろ過器は、ＤＮＡとＲＮＡとが混在する試料が適用される抽出液と、抽出液を収納する容器１と、抽出液に接触し、ＤＮＡには結合するが、ＲＮＡには結合しないシリカ粒子４と、抽出液に接触し、シリカ粒子４の粒径よりも小さい孔径を有するメンブレンフィルター７とを備える。試料に含まれるＤＮＡは、シリカ粒子４と結合してメンブレンフィルター７上に残置され、透過成分８から分離・除去される。
【選択図】図２

Description

本発明は、ＲＴ－ＰＣＲ法による増幅に先立ち、ろ過により試料からＤＮＡを除去した透過成分を提供するＲＮＡろ過器及びその関連技術に関するものである。

感染症診断において、原因となる微生物やウイルスの病原検査は、非常に重要である。一般的には検鏡、培養検査、免疫学的検査、遺伝子検査などの方法を用いて病原体の同定が行われている。その中でも、特に遺伝子検査は、その簡便性と感度において優れており、近年様々な遺伝子検査が普及してきている。

ウイルスは、細菌よりも更に小さく、顕微鏡でも容易に観察することができず、培養検査では宿主細胞を要することもある。このため、ウイルスの検査は、難易度が高いとされ、遺伝子検査が広く行われている。

遺伝子検査に主に用いられるＤＮＡ（デオキシリボ核酸）の増幅反応、すなわちＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は、ＤＮＡウイルスにおいては、比較的容易に実施可能である。これは、ＤＮＡウイルスの内部にＤＮＡ遺伝子が存在し、そのままＰＣＲに供することが可能なためである。

ところが、ウイルスにはＤＮＡ遺伝子ではなくＲＮＡ（リボ核酸）を遺伝子として持つもの（ＲＮＡウイルス）があり、ＲＮＡウイルスは、そのまま遺伝子増幅に供することができない。

よって、ＲＮＡウイルスの場合、ＰＣＲに先立ち、逆転写反応を行うことで、予めＲＮＡをＤＮＡに変換する。変換されたＤＮＡをＰＣＲに供して遺伝子増幅させ検出が行われる。

ＲＮＡウイルスには、二本鎖ＲＮＡウイルスであるロタウイルス、一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスであるインフルエンザウイルス、センダイウイルス、ＲＳウイルス、ムンプスウイルス、エボラウイルスなど、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスであるノロウイルス、ジカ熱ウイルス、デング熱ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、日本脳炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、コロナウイルスなど様々なものがあり、それぞれの感染症の診断としてこれらの検査は非常に重要である。

２０１９年に中国武漢市で発生し２０２０年に急速に世界的な感染拡大を惹き起こしている新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）においても、その遺伝子検査は非常に重要度が高くＰＣＲ検査の普及の重要性が提言されている。この新型コロナウイルスもＲＮＡウイルスであり、その検出法については、国立感染症研究所より、非特許文献１：「病原体検出マニュアル２０１９－ｎＣｏＶ」として紹介されており、特に逆転写反応、遺伝子増幅反応を連続して行うことができるワンステップ法すなわちリアルタイムｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ法は、非常に有効と考えられる。

しかしながら、このリアルタイムｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ法の実施においては、「ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ キットによるＲＮＡの抽出」としてＲＮＡを精製するための煩雑な前処理が求められており、尚且つ、このプロセスは２次感染を防ぐためにバイオセーフティーレベル２の安全対策が求められているため、十分な感染症対策の設備が整った施設においてのみしか実施できず、ある程度熟練した技術者が実施しなければならない。更に、煩雑な操作の間に、試料間のコンタミネーション（汚染）が発生する例も報告されており、検査精度も重大な課題となっている。

本発明者らは、この様な煩雑な操作をなくすべく簡便なＰＣＲの実施技術を開発し、市場に提案してきた。

すなわち、特許文献１（特開２０１６－５２２６７号公報）に示すように、一定範囲の粒径を持つシリカ粒子を遺伝子捕捉の担体として用い、カオトロピック剤の存在下で試料中の遺伝子を吸着させ、精製水にて洗浄後にそのままＰＣＲを行う方法がその一つである。

更に、特許文献２（特開２０１８－９３７５０号公報）では、この原理をオールインワンの形態として核酸増幅反応用デバイスに組み入れた技術を開示している。

このような技術を用いることにより、検査者は、試料をカオトロピック剤含有の抽出液中に採取して前処理を行い、規定量の前処理後の試料を核酸反応用デバイスに滴下するだけで、専用装置内で核酸の捕捉、洗浄、増幅反応、および検出までを全自動で実施することが可能となる。こうして従来必要とされてきた煩雑な核酸精製の工程（乾燥や抽出操作）をなくすことが可能となり、時間の短縮や簡便さのみならず安全性の改善とコンタミネーション回避にも大きな効果を得ることができている。

しかしながら、標的がＲＮＡウイルスである場合、このような技術の実施が困難となる。試料は、一般的には患部から採取した鼻咽頭拭い、喀痰、唾液、または血液などのヒト体液成分を含む。つまり、試料中に大量に夾雑物、特にヒトゲノムＤＮＡやＲＮａｓｅ（ＲＮＡ分解酵素）などが含まれることにより、感度が大幅に低下するためである。

これら夾雑物の存在により、検出の標的となるＲＮＡ以外のＤＮＡなどによってプライマーやプローブとの非特異的な反応が引き起こされ、目的ＲＮＡの逆転写や転写後の標的ＤＮＡの増幅が阻害される、及び／又は、検出が不能となる事態が招来される。

標的ＲＮＡの捕捉においてもＤＮＡの存在が競合的に効率を低下させることが考えられる。加えて、検体中に存在するＲＮａｓｅによって標的ＲＮＡ自体の分解が進んでいくことにより重大な感度低下が発生することも考えられる。
特開２０１６－５２２６７号公報 特開２０１８－９３７５０号公報 「病原体検出マニュアル２０１９－ｎＣｏＶ」国立感染症研究所

そこで本発明は、試料に混在する夾雑物であるＤＮＡ等を除去し、ＤＮＡを含まずＲＮＡを含む成分のみを抽出できるＲＮＡろ過器を提供することを目的とする。

第１の発明に係るＲＮＡろ過器は、ＤＮＡとＲＮＡとが混在する試料が適用される抽出液と、抽出液を収納する容器と、抽出液に接触し、ＤＮＡには結合するが、ＲＮＡには結合しないシリカ粒子と、抽出液に接触し、シリカ粒子の粒径よりも小さい孔径を有するメンブレンフィルターとを備える。

この構成において、試料に混在するＤＮＡは、シリカ粒子に結合すると、その後にシリカ粒子から分離されることはなく、言い換えれば、シリカ粒子に拘束されることになる。メンブレンフィルターの孔径は、シリカ粒子の粒径よりも小さいため、ＤＮＡは、メンブレンフィルターを透過することができず、メンブレンフィルター上に残置されることになる。

一方、試料に混在するＲＮＡは、シリカ粒子に結合せず、自由に移動することができ、メンブレンフィルターを透過する他の成分と共に、ＤＮＡから分離される。

その結果、試料から増幅を阻害する夾雑物である、ＤＮＡが除去されて、後段の増幅を感度良く円滑に実施できる。

好ましくは、ＲＮＡろ過器は、第１の発明に加え、抽出液のうちメンブレンフィルターを透過した透過成分を容器外へ吐出する滴下ノズルを備える。

この構成により、ＤＮＡが除去された透過成分のみを滴下ノズルを介して容器の外へ容易に排出することができる。

好ましくは、ＲＮＡろ過器は、第１の発明に加え、抽出液は、カオトロピック剤を含有する。

好ましくは、ＲＮＡろ過器は、第１の発明に加え、シリカ粒子の粒径が、０．５乃至１０［μｍ］である。

これらの構成により、試料からＤＮＡを円滑に除去することができる。

好ましくは、ＲＮＡろ過器は、第１の発明に加え、シリカ粒子は、メンブレンフィルター上に担持される。

この構成により、シリカ粒子を安定した姿勢で保持することができる。

好ましくは、ＲＮＡろ過器は、第１の発明に加え、メンブレンフィルターは、試料に含有されるタンパク質を吸着する能力を有する。

好ましくは、ＲＮＡろ過器は、第１の発明に加え、メンブレンフィルターは、ニトロセルロースメンブレン又はナイロンメンブレンである。

これらの構成により、試料に含まれるＲＮａｓｅをメンブレンフィルターに吸着させ、除去することが出来る。

以上述べたように、本発明によれば、試料に含まれるＤＮＡは、シリカ粒子と結合してメンブレンフィルター上に残置される。一方、試料に含まれるＲＮＡは、シリカ粒子に結合せず、メンブレンフィルターを透過する他の成分と共に、ＤＮＡから分離される。その結果、ＤＮＡとＲＮＡを分離して、後段の増幅を感度良く円滑に実施できる。

（本発明の概要）
以下本発明の具体的な実施の形態を説明するに先立ち、本発明の概要を述べる。本発明は、遺伝子増幅反応に先立つ前処理に関する。

ＲＮＡを持つ病原体を含む検体を前処理するために、検体中に存在する夾雑物（ＤＮＡ、ＲＮａｓｅ等）を分離し、夾雑物による反応阻害の影響を低減するＲＮＡろ過器を提供する。

このろ過器を利用すれば、リアルタイムｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ法を実施するための検体の前処理を容易に実施できるのみでなく、２次感染やコンタミネーションのリスクを大きく低減できる。

具体的には、試料を、抽出液（カオトロピック剤の存在下でＤＮＡを選択的に結合しうるシリカ粒子を含む）と混合し、非特異反応の原因となるＤＮＡをシリカ粒子に結合させてシリカ粒子に拘束し、次に、シリカ粒子の粒径より小さい孔径を有するメンブレンフィルターを透過させる。ＤＮＡはシリカ粒子に拘束されシリカ粒子はメンブレンフィルターを透過できないので、結果として、ＤＮＡが分離される。つまり、メンブレンフィルターを透過した透過成分には、ＤＮＡが含有されず、ＲＮＡ及びそのほかの成分のみが、透過成分として抽出されることになる。

得られた透過成分を用いてＲＴ－ＰＣＲに供することにより、検体中の夾雑物の影響を受けずにＲＮＡウイルスを検出することが可能となる。さらに、ろ過除去のために用いるフィルターにニトロセルロースなどの高いタンパク吸着能を有する素材を用いることで、検体中のＲＮａｓｅを吸着させて標的ＲＮＡの分解の進行を防止することもできる。

試料中に含まれる微生物を検出することは感染症の診断、治療などにおいて非常に重要であるが、検体中の様々な夾雑物の影響により核酸検出中に反応阻害などが起こり、正しい測定結果が得られないことがある。そのため、前処理として、試料中の核酸の精製が一般的に行われており、様々な試薬、キットとして販売されている。しかしながら、核酸精製は、操作が非常に複雑、操作時間が長い、熟練した技術者や専用の装置が必要、コストが高い等の課題があった。更に測定作業者自身が感染してしまう２次感染のリスクや、試料間での飛沫物の混入などによる偽陽性の発生などコンタミネーションのリスクも指摘されている。

本発明は、ＲＮＡ検出のための前処理法として、ＲＮＡには結合せずＤＮＡに選択的に結合しうるシリカ粒子を、カオトロピック剤を含む抽出液に含有させておく。

この抽出液に検体を添加して、検体中のＤＮＡをシリカ粒子に結合させたのちに、シリカ粒子をフィルターろ過して除去することで、実質的にＤＮＡを除去し、標的物質であるＲＮＡを含むろ液を得て、これをリアルタイム ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ法に用いる方法を提供する。

ここで「検体」とは血液などの体液成分、もしくはウイルス感染患部からの鼻咽頭拭い液、喀痰、唾液などがあげられるが、後にＰＣＲに供されるものであれば任意である。

（実施の形態１）
以下図面を参照しながら、本発明の実施の形態を説明する。ここで、図１は、本発明の一実施の形態におけるＲＮＡろ過器の操作説明図、図２は同キャップ内部の拡大断面図、図３は同透過成分を核酸増幅反応用デバイスへ適用する状態を示す斜視図である。

図１に示すように、本形態のＲＮＡろ過器は、容器本体１と、蓋２と、キャップ６とを主要な要素とする。

図１（ａ）～図１（ｃ）に示すように、容器本体１の底部１ｄには、抽出液３が収納され、容器本体１の上部にフランジ１ａが形成され、フランジ１ａよりも上側周面には、ねじ部１ｃが設けられる。

使用前には、ねじ部１ｃと螺合するねじ部（図示せず）を内部に有する蓋２が取り付けられて、容器本体１の開口部１ｂは閉鎖された状態にある。

抽出液３は、シリカ粒子４（図２参照。）を含有する溶液であり、溶液はカオトロピック剤として５．２［Ｍ］グアニジンチオシアン酸塩を含む。

シリカ粒子４は、ＲＮＡには結合せずにＤＮＡには結合するものであれば十分であり、例えば、非晶質シリカ粒子などが好適に使用できる。

ここでは、シリカ粒子４として二酸化ケイ素（カタログ番号：ＳＩ０１４ＰＢ、粒径１［μｍ］、株式会社高純度化学研究所製）を用いているが、ＲＮＡが結合せず、ＤＮＡに結合するものであれば任意に選択可能であり、この例に限定されない。

検査時には、図１（ｂ）に示すように、蓋２を回転させて、容器本体１の開口部１ｂを露呈させる。次に、スワブ５の先端部をウイルス感染患部等に接触させた後、スワブ５を容器本体１の底部１ｄまで差し込み、軽く左右に回転させる。これにより、底部１ｄ内にある抽出液３とスワブ５の先端部とが接触し、検体が抽出液３内へ適用されることになる。

スワブ５としては、ポリエステル製、スポンジ製など種々のものが使用可能であり、特に限定されない。更に、検体及び抽出液３の両方に接触させて抽出液３に検体を適用できるのであれば、スワブ５ではない器具を使用しても差し支えない。

適用が完了したら、スワブ５を容器本体１内から抜き取り、図１（ｃ）に示すように、キャップ６の滴下ノズル６ａが上向きとなるようにして、キャップ６をねじ部１ｃにねじ込む。

その次に、図１（ｄ）に示すように、キャップ６の滴下ノズル６ａが下向きとなるように、容器本体１を天地逆転させる。

図２に拡大して示されるように、キャップ６の滴下ノズル６ａの直上には、滴下ノズル６ａよりも拡径された座６ｂが形成されている。座６ｂには、座６ｂとほぼ同径のメンブレンフィルター７が装着されている。

メンブレンフィルター７の孔径（ポアサイズ）は、シリカ粒子４の粒径より小さく設定され、メンブレンフィルター７は、シリカ粒子４及びそれに結合するＤＮＡをろ過して、透過成分８から除去する。

上述したように、シリカ粒子４は、抽出液３内に予め含有されていても良い。また、シリカ粒子４は、メンブレンフィルター７上に担持されていても良い。いずれにしても、メンブレンフィルター７によるろ過が行われる前に、ＤＮＡがシリカ粒子４と結合し、シリカ粒子４に拘束される状態となれば十分である。

シリカ粒子４の粒径が１［μｍ］であれば、メンブレンフィルター７の孔径は、０．４５［μｍ］～１［μｍ］程度に設定するのが望ましい。もちろん、選定するシリカ粒子４の粒子径が異なれば、メンブレンフィルター７の孔径もこれに合わせて選択可能である。

更に、メンブレンフィルター７の材料として、検体中の夾雑物として存在する様々なタンパク質、特に標的ＲＮＡを分解する酵素ＲＮａｓｅを吸着して除去できるようタンパク質吸着能が高い材料を使用するのが好適である。具体的な材質としては、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレンなどであり、ニトロセルロースメンブレンは特に好ましい。

本形態においては、孔径０．４５［μｍ］のニトロセルロースフィルター（ワットマン社製）を直径１０［ｍｍ］に切り抜き、滴下ノズル６ａの座６ｂに溶着して設置してある。

勿論本発明は、このような具体例に制限されるものではなく、同様の効果を得られる、組成、材質、寸法などが使用される場合も、本発明の保護範囲に包含されることが理解されねばならない。

そして、図３に示すように、本形態では、反応チューブ１１を備えた核増幅反応用デバイス１０が使用される（特許文献２参照。）ものであり、メンブレンフィルター７を透過する透過成分（ＤＮＡは除去されている）が、同デバイス１０の試料滴下部１２に滴下され、後段のＲＴ－ＰＣＲに供されることとなる。

（実施例１）
（抽出液中にシリカ粒子を含有させることの効果の検証）
上記の実施の形態において、抽出液３中のシリカ粒子４の濃度を０、１０、２０、５０［ｍｇ／ｍＬ］というように変化させ、その効果を確認する。

本例では、シリカ粒子４として、（株式会社高純度化学研究所製、カタログ番号：ＳＩ０１４ＰＢ、粒径１［μｍ］）を用いる。

また、本例では、メンブレンフィルター７として、通常の湿潤強化タイプ濾紙（ＬＳ－１００、安積濾紙製、孔径０．５［μｍ］）を用いる。

新型コロナウイルス検出試薬を、図３に示す、特許文献２（特開２０１８－９３７５０号公報）の核酸増幅反応用デバイス１０に適用することを前提として作製する。

（新型コロナウイルス検出用の核酸増幅反応用デバイスの作製）
核酸増幅反応用デバイス１０の反応チューブ１１内に、０．６［％］アガロース、０．４［ｍＭ］ｄＮＴＰ、２．５［ｍＭ］Ｍｎ（ＯＡｃ）、０．５４［μＭ］ＮＩＩＤ ２０１９－ｎＣＯＶ Ｎ Ｆ２（フォワードプライマー）、０．１８［μＭ］ ＮＩＩＤ ２０１９－ｎＣＯＶ Ｎ Ｒ２（リバースプライマー）、０．１［μＭ］Ｑ Ｐｒｏｂｅ（商標）を含む溶液を充填する。

使用したプライマー対は「病原体検出マニュアル ２０１９－ｎＣｏＶ」に記載の配列を株式会社日本遺伝子研究所に委託して作製してある。

Ｑ Ｐｒｏｂｅ（商標）は、（表１）に示す配列を用いて、３'末端の「Ｃ」をＢＯＤＹＰＹ ＦＬ蛍光色素で標識する。本プローブは相補的な配列と結合することで、特異的に消光を起こす性質を有する。

フィルター支持部のメンブレンには、ＲＮＡを捕捉するための結晶性シリカ（Ｓ５６３１、粒径０．５～１０［μｍ］、シグマアルドリッチジャパン合同社製）を８０［μｇ］塗布する。

また、試薬塗布部には、ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ用のＤＮＡ合成酵素を３［Ｕ］添加し乾燥させた。洗浄液には精製水を用い、洗浄ポットに１．２［ｍＬ」を添加して封止する。

上記それぞれの濃度のシリカ粒子４を添加した容器本体１を予め５回ほど転倒混和して、内部のシリカ粒子４を分散させ、次いで測定試料を添加する。健常者の鼻咽頭をスワブで拭って抽出液３に適用し、これに陽性コントロールとなる合成ＲＮＡ（株式会社日本遺伝子研究所）を４００［コピー／μＬ］になるよう抽出液に添加して試料とする。

ろ過された透過成分８を４滴（約１２０［μＬ］）を滴下ノズル６ａより核酸増幅反応用デバイス１０の試料滴下部１２に滴下し、本件出願人に係る全自動測定装置（図示せず）の挿入口に挿入し、開始ボタンを押して測定を開始する。

全自動測定装置内では、設定されたパラメーターに従って、洗浄が行われ、その後にＲＮＡを反応チューブ内に移動させ、サーマルサイクルモジュールの温度制御により、５１℃、１０分の逆転写反応を行う。その後、１００℃、１０秒、及び５６℃、２５秒のサイクルを４５回繰り返してＰＣＲ反応を行う。これらの操作は全自動測定装置内で自動的に行われ、測定結果は、全自動測定装置のモニター画面（図示せず）に表示される。

（測定結果）
図４は本発明の一実施の形態におけるシリカ粒子の量と相対蛍光値との関係を示すグラフ、図５は同形態におけるシリカ粒子の量と融解曲線との関係を示すグラフである。

図４の実線で示すように、抽出液３中にシリカ粒子４が存在しない場合、殆ど反応が起こらない。これに対し、１０（一点鎖線）、２０（粗い鎖線）、５０（細かい鎖線）［ｍｇ］とシリカ粒子の添加量を増やすにつれ、反応性（消光率）が改善されていく。なお、図４において、線の下降が大きいほど、反応性が高いことが示される。

図５に示す熱融解曲線分析では、６６［℃］にピークを持つ増幅産物がシリカ粒子４の添加量が増加するにつれ、明確に増えていく様子が確認できる。なお、図５において、該ピークにおける頂部が高いほど、反応性が高いことが示される。

なお、この反応性は拭い検体成分が入っていない状況と同等であり、５０［ｍｇ／ｍＬ］のシリカ粒子を入れると、拭い検体成分中の夾雑物質の影響を、ほぼ排除できると考えられる。

（実施例２）
本例では、実施例１の結果を踏まえ、抽出液３に濃度５０［ｍｇ／ｍＬ］のシリカ粒子４を入れる場合と、対照法（シリカ粒子４がない場合）との比較を行う。

拭い成分を含む抽出液３にシリカ粒子有りと無しのサンプルをそれぞれ準備し、これらに陽性コントロール合成ＲＮＡを添加して、０（無添加）、５、４０、４００［コピー／μＬ］の濃度に調整する。これらのサンプルを核酸増幅反応用デバイス１０に滴下し、実施例１と同様に反応させる。

（表２）は、本例の結果を示す。対照法においては、４００［コピー／μＬ］のみが検出できたのに対し、本法では５［コピー／μＬ］が２回測定のうち１回陽性となり、実質的な感度は、５０倍～８０倍程度、顕著に向上したものと考えられる。

この事象は、検体中に存在するＤＮＡの影響で、本来の標的物に対する逆転写反応、ＰＣＲ反応が大きく阻害を掛けられている状況に対して、抽出液中のシリカ粒子４と阻害因子とが結合し、ろ過により除去された効果であると考えられる。

（実施例３）
本例では、実施例２とは異なり、容器本体１のキャップ６に装着するメンブレンフィルターとして、濾紙ＬＳ－１００、親水性ナイロンメンブレン０．４５［μｍ］（メルクミリポア社製）、およびニトロセルロースメンブレン０．４５［μｍ］（メルクミリポア社製）をそれぞれ装着する。

シリカ粒子４を濃度５０［ｍｇ／ｍＬ］の抽出液に、４００［コピー／μＬ］の陽性コントロール合成ＲＮＡを加え、抽出操作後に準備した３種類のメンブレンフィルター７を溶着したキャップ６を用い、核酸増幅反応用デバイス１０にそれぞれ４滴ずつ滴下し、測定を実施する。

（結果）
図６は本発明の一実施の形態におけるメンブレンフィルターの材料と相対蛍光値との関係を示すグラフ、図７は、同形態におけるメンブレンフィルターの材料と融解曲線との関係を示すグラフである。見方は、図４、図５のそれぞれと同様である。

図６に示すように、増幅曲線においてＬＳ－１００濾紙（実線）に比べ、ナイロンメンブレン（一点鎖線）、ニトロセルロースメンブレン（鎖線）は、明らかにより大きく下降しており消光率が大きく、図７に示すように増幅産物由来の熱融解曲線分析のピークがより盛り上がっており変化が大きい。この結果は、メンブレンフィルター７の素材としては、ＬＳ－１００濾紙よりも、ナイロンメンブレン、特に、ニトロセルロースメンブレンがより好適であるという事実を示すものである。

この事象は、検体中の夾雑物（特にタンパク質）が、ナイロンメンブレン又はニトロセルロースメンブレンからなるメンブレンフィルター７によって、濾紙よりもより効果的に吸着除去されるためと考察される。検体中のタンパク質の中では、とりわけＲＮＡ分解酵素であるＲＮａｓｅの存在が重要であり、標的物質であるＲＮＡを徐々に分解していくと考えられ、好ましい材料からなるメンブレンフィルター７を用いて、このＲＮａｓｅをより有効に取り除くことで標的ＲＮＡを分解から保護する効果があると考えられる。

（本法での新型コロナウイルスの検出）
以上の結果を踏まえ、抽出液中のシリカ濃度を５０［ｍｇ／ｍＬ］、また、滴下ノズルのフィルターにニトロセルロースメンブレンを用いて容器本体１及びキャップ６を作製する。また、実施例１と同様に核酸増幅反応用デバイス１０を用意する。これらを用いて実際の臨床検体の測定を行う。なお、検体の採取にはニプロ スポンジスワブ Ｒタイプを用いる。

また、対照法としては、ウイルス輸送用の汎用輸送培地ＵＴＭおよび添付のスワブを用い、スワブ採取後にＵＴＭ培地中に懸濁された試料の１２０［μＬ］を用いてＲＴ－ＰＣＲにて測定を行う。ＲＴ－ＰＣＲは国立感染症研究所より病原体検出マニュアル ２０１９－ｎＣｏＶに従って行う。試験は、新型コロナウイルス感染疑い（１１６例）について実施する。

（結果）
（表３）は、実施結果を示す。
感染研の病原体検出マニュアルに従って測定した結果、陽性は３０例、陰性は８６例であり、本法での測定では、陽性２９例、陰性８７例であった。不一致検体については、感染研法で８（コピー／テスト）の低濃度検体である。

得られた感度は、９６．６％、特異度１００％、全体一致率９９．１％と極めて良好な結果といえよう。

よって、本発明に係るＲＮＡろ過器を用いて測定を行うと、検体中の夾雑物の影響を回避でき、良好な測定結果を得られる点が示された。

本発明によれば、従来法のような遠心分離などの煩雑な操作、時間を要することなく、誰でも簡便に短時間で検出したい標的ＲＮＡのリアルタイムｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ法による検出が可能となる。また特別な装置も必要なく、熟練した技術者も必要せず、医療現場のよりベットサイドに近いところでの迅速な検査に役立つ点が理解されよう。

本発明の一実施の形態におけるＲＮＡろ過器の操作説明図 本発明の一実施の形態におけるキャップ内部の拡大断面図 本発明の一実施の形態における透過成分を核酸増幅反応用デバイスへ適用する状態を示す斜視図 本発明の一実施の形態におけるシリカ粒子の量と相対蛍光値との関係を示すグラフ 本発明の一実施の形態におけるシリカ粒子の量と融解曲線との関係を示すグラフ 本発明の一実施の形態におけるメンブレンフィルターの材料と相対蛍光値との関係を示すグラフ 本発明の一実施の形態におけるメンブレンフィルターの材料と融解曲線との関係を示すグラフ

１ 容器本体
１ａ フランジ
１ｂ 開口部
１ｃ ねじ部
１ｄ 底部
２ 蓋
３ 抽出液
４ シリカ粒子
５ スワブ
６ キャップ
６ａ 滴下ノズル
６ｂ 座
７ メンブレンフィルター
８ 透過成分
１０ 核酸増幅反応用デバイス
１１ 反応チューブ
１２ 試料滴下部

Claims (8)

1. ＤＮＡとＲＮＡとが混在する試料が適用される抽出液と、
   前記抽出液を収納する容器と、
   前記抽出液に接触し、前記ＤＮＡには結合するが、前記ＲＮＡには結合しないシリカ粒子と、
   前記抽出液に接触し、前記シリカ粒子の粒径よりも小さい孔径を有するメンブレンフィルターとを備えるＲＮＡろ過器。
2. 前記抽出液のうち前記メンブレンフィルターを透過した透過成分を前記容器外へ吐出する滴下ノズルを更に備える請求項１記載のＲＮＡろ過器。
3. 前記抽出液は、カオトロピック剤を含有する請求項１又は２記載のＲＮＡろ過器。
4. 前記シリカ粒子の粒径が、０．５乃至１０［μｍ］である請求項１から３のいずれかに記載のＲＮＡろ過器。
5. 前記シリカ粒子は、前記メンブレンフィルター上に担持される請求項１から４のいずれかに記載のＲＮＡろ過器。
6. 前記メンブレンフィルターは、前記試料に含有されるタンパク質を吸着する能力を有する請求項１から５のいずれかに記載のＲＮＡろ過器。
7. 前記メンブレンフィルターは、ニトロセルロースメンブレン又はナイロンメンブレンである請求項１から６のいずれかに記載のＲＮＡろ過器。
8. 請求項１から７のいずれかに記載のＲＮＡろ過器を用いて、前記試料から前記ＤＮＡを除去した透過成分を提供するＲＮＡろ過方法。

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