KR101897177B1

KR101897177B1 - 전처리 방법 및 그것에 사용되는 핵산 추출 키트

Info

Publication number: KR101897177B1
Application number: KR1020177004470A
Authority: KR
Inventors: 카즈토미 야마카와; 타카시 나가노
Original assignee: 가부시키가이샤 미즈호 메디
Priority date: 2014-09-03
Filing date: 2015-09-02
Publication date: 2018-09-10
Also published as: AU2015312884A1; US10316350B2; CA2957776C; KR20170028443A; BR112017004241B8; EP3190184B1; JP6437250B2; BR112017004241B1; BR112017004241A2; ES2734068T3; EP3190184A4; EP3190184A1; WO2016035812A1; JP2016052267A; CA2957776A1; DK3190184T3; PT3190184T; MX2017002770A; US20170335370A1; MY177446A

Abstract

유전자 검사의 전처리를 POCT화 할 수 있는 방법을 제공한다. 본 전처리 방법은 처리 대상과, 처리 대상에 포함되는 핵산을 추출하는 추출액과, 실리카 입자와, 여과재를 접촉시켜, 여과재에 핵산과 실리카 입자의 복합체를 담지시키고, 핵산 증폭 반응액을 사용하는 핵산 증폭 공정으로 송출하는 전처리 방법으로서, 실리카 입자의 입경 및 핵산 증폭 반응액 중에서의 실리카 입자의 농도를 일정 범위 내로 함으로써, 핵산 증폭 공정에 앞서는 건조 공정 및 용출 공정을 불필요하게 한다. 일정 범위는 실리카 입자 농도가 0.0625∼4㎍/㎕, 평균 입경이 0.01∼100㎛, 또한, 평균 입경으로부터 구해지는 표면적이 1×10^4∼1×10^8㎛^2이다.

Description

전처리 방법 및 그것에 사용되는 핵산 추출 키트{PRETREATMENT METHOD AND NUCLEIC ACID EXTRACTION KIT USED IN SAID METHOD}

본 발명은 핵산 증폭 공정에 앞서, 고상 추출법을 사용하여 핵산을 추출하는 전처리 방법에 관한 것이다. 또한, 핵산 증폭 공정은 표적으로 하는 핵산의 염기 배열을 검출 또는 동정하기 위한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 특별한 이화학 기기 없이 POCT화를 실현할 수 있는 것이다.

POCT란 Point of Care Testing의 약자이며, 피검자의 옆에서, 혹은 피검자 스스로가 행하는 검사이다. 이것에 의하면, 검사 시간을 단축하여, 그 자리에서 피검자 자신이 결과를 확인할 수 있다. 일본 임상 검사 자동화 학회는 POCT 가이드 라인에서, POCT를 「신속하고 또한 적절한 진료·간호, 질병의 예방, 건강 관리 등의 의료의 질, QOL(Quality of life) 및 만족도의 향상에 이바지하기 위한 검사」라고 정의한다.

최근, 생명과학 분야의 발전은 현저하여, DNA 및 RNA 등의 핵산의 해석 기술은 널리 이용되고 있다.

핵산의 해석 기술은 생물학 분야(생물종의 동정이나 기원의 연구 등), 의료 분야(병의 진단 등) 및 일상생활에 가까운 분야(식량의 안전성의 확인 등)에서 널리 이용되고 있다.

의료 분야에 있어서의 병의 진단, 특히, 조기의 감염증의 신속 진단에 있어서, 핵산의 해석 기술 중 PCR법이나 등온 핵산 증폭법 등을 사용하여 표적 핵산(예를 들면, 자기에 존재하지 않는 외래 유전자의 특징적인 유전자 배열이나 그 밖의 특정 배열 등)을 증폭하여 해석하는 기술(이하 「유전자 검사」라고 한다.)은 종래의 감염증 진단 기술인 배양 검사나 면역 검사(항원 또는 항체 등을 사용한 검사) 등과 비교하여 고감도이다.

유전자 검사를 사용하면, 인간에 감염증을 야기하는 원인이 되는 대부분의 세균, 진균, 원충 및 바이러스 등의 원인 미생물을 검출 또는 동정하는 것이 가능하다.

그러므로, 유전자 검사는 감염증의 조기 진단에 유용한 검사 방법이라고 여겨지고 있어, 기간병원 등 검사실을 가진 큰 병원, 위생연구소, 대학이나 기업 등의 연구시설, 그 밖의 인원이 충실한 시설 등, 전용의 검사실 또는 실험실을 가진 시설에서 자주 사용되고 있다.

가부시키가이샤 후지케이자이는 「2012 임상 검사 시장 No.3 세균·유전자·POC·병리 검사」에서 「유전자 검사 시장은 2013년도 이후도 연율 2∼3% 정도의 확대 추이가 예상된다.」고 지적하고 있어, 유전자 검사 시장은 감염증 조기 진단의 관점뿐만 아니라, 경제 활동의 관점에서도 그 중요도가 증가하고 있다고 생각된다.

일반 사람이 수진하는 기회가 많은 의료 시설, 예를 들면, 마을의 개인병원 또는 진료소 등에서, 유전자 검사는 거의 이용되고 있지 않다.

그 이유는 다음과 같은 것이다. 첫 번째로, 유전자 검사는 그 실시 전에 시약 조제나 핵산의 추출 조작과 같이 번잡하고 손이 많이 가며, 시설의 부담이 크다.

두 번째로, 유전자 검사를 행하기 위해서는 핵산의 추출을 위해 원심기나 마이크로 피펫 등의 이화학 기기나 자동화 기기가 필요하게 되어, 초기 투자 비용 및 유지관리 비용이 고액이 된다.

세 번째로, 시설 내의 의사나 간호사 등이 유전자 검사에 충분히 숙련되어 있다고 할 수 없다.

한편, POCT에 대응한 검사 키트로서 유전자 검사에 관계되지 않는 것(예를 들면, 표지항체법, 면역비탁법, 라텍스 응집법 및 이뮤노크로마토그래피법 등에 의한 것)은 상기한 바와 같은 시설에서도 널리 이용되고 있다. 후생노동성이 2009년 12월에 발표한 집계에 의하면, 인플루엔자 항원 신속 검사 키트의 생산 실적은 이전 시즌의 생산출하 수가 약 1300만 테스트에 이르고 있다.

핵산을 표적으로 하는 유전자 검사는 면역 검사보다 감도가 높아, 감염증에 있어서의 조기의 신속 진단에 대단히 유효하다.

유감스럽게도, 유전자 검사에 사용할 수 있는 POCT 키트 내지 그것에 준하는 키트는 현재에도 존재하지 않는다.

이 때문에, 작은 시설에서는, 유전자 검사를 행할 수 없어, 검체를 회수하여, 외부 시설에 의한 검사에 맡기고 있어, 유전자 검사 결과를 신속하게 얻을 수는 없다.

유전자 검사에 사용할 수 있는 POCT 키트 및 그것을 위한 방법을 개발할 수 있다면, 작은 시설이더라도 신속한 유전자 검사 결과를 얻을 수 있게 되어, 유용성이 대단히 높다.

현재의 유전자 검사법은 크게 다음 3개의 공정으로 분할할 수 있다. 제1 공정(전처리)에서는, 검체를 채취한 후, 검체 중에서 단백질의 외각이나 막 등에 포함된 핵산을 노출시키고, 유기 용매나 고상 담체 등을 사용하여 단백질 등의 협잡물을 세정 또는 분리를 행하고, 핵산만을 단리한다.

제2 공정(표적 핵산의 증폭)에서는, 분리한 핵산을 주형으로 하고 PCR 반응이나 LAMP 반응 등의 핵산 증폭 반응법을 사용하여 표적 핵산을 증폭한다.

제3 공정(검출 및 해석)에서는, 증폭 반응 중 또는 반응 후에, 증폭한 표적 핵산 또는 거기에 결합하는 마커 등을 사용하여, 정성 또는 정량한다.

제1 공정을 쉽게 하기 위한 자동화 기기가 존재한다.

그렇지만, 제1 공정의 자동화 기기는 고액이라는 등의 이유로, 현재에도 그다지 보급되어 있지 않다.

현실에는, 자동화 기기보다도 비교적 저렴하게 실시할 수 있는 용수법에 의해 전처리가 행해지는 경우가 많다.

그렇지만, 용수법은 원심기나 마이크로 피펫 등의 기기의 사용 방법이나 샘플의 취급 방법 등의 손기술의 숙련을 필요로 하는 등, 실시자에 대하여 조작의 부담이 크다.

이 용수법을 간편화 하여 POCT화 할 수 있는 수법이나 키트는 알려져 있지 않다.

자동화 기기에서 사용되는 고상 추출법의 대표적인 것 중 하나로 Boom 등이 보고한 방법(이하 「BOOM법」이라고 한다.)(비특허문헌 1, 특허문헌 1 참조.)이 있다.

BOOM법은 카오트로픽제의 존재하에서 핵산이 실리카 비드에 흡착되는 현상인 카오트로픽 효과(비특허문헌 2)를 기본 원리로 한 생체 시료로부터 핵산을 단리하기 위한 고상 추출법이다.

이 방법에 의하면, 고상 담체로부터 핵산을 용출하지 않고 고상 담체마다 핵산을 PCR 반응액에 첨가하는 것(특허문헌 2)도 가능하여, 용출 공정의 일부를 간략화할 수도 있지만, 검사실 등의 핵산의 추출을 실시하는 환경이 정비되어 있는 것이 전제가 된다.

특허문헌 3은 다음과 같이 기재하고 있다. 즉 「본 발명의 목적은 생물 재료로부터 유기 용매를 사용하지 않고, 간편하게, 단시간에, 더욱 안전하게, 또한 재현성 좋게 리보핵산를 추출하는 방법 및 그것을 위한 시약을 제공하는 것이다. 리보핵산의 경우, 데옥시리보핵산과는 달리, 고상 담체에 흡착시킨 후, 에탄올 등의 유기 용매를 전혀 포함하지 않는 저염 농도 완충액으로 세정해도, 용이하게 고상 담체로부터 용리되지 않고, 가열함으로써 비로소 용리가 촉진된다. 본 발명에서의 제2 공정은 제1 흡착 공정에 의해 리보핵산이 흡착한 고상 담체를, 카오트로픽 물질 등을 제거할 목적으로, 저염 농도 완충액으로 이루어지는 세정액으로 세정하는 공정이다. 여기에서 말하는 저염 농도 완충액으로 이루어지는 세정액이란 에탄올 등의 유기 용매 및 카오트로픽 물질을 전혀 포함하지 않는 완충액을 가리키며, 완충액으로서는 트리스계 완충액이 바람직하지만, 특별히 한정되지 않는다. 또한 저염 농도란 이 완충액이 제3 용출 공정에 잔류한 경우에도, RT-PCR 반응 등의 효소 반응에 영향을 주지 않을 정도의 염 농도를 가리키며, 단순한 물도 포함된다. 본 발명에서는, 100mM 이하의 완충액이 바람직하다. 또한 이 용액은 계면활성제를 함유해도 되고, pH는 특별히 한정되지 않는다. 또한 본 발명에서는 가열에 의해 용출을 촉진시키는 것이 필요하다. 가열 온도는 리보핵산에 악영향을 끼치지 않을 정도이면 특별히 한정되지 않지만, 50∼70℃가 바람직하다. 가열 시간은 30초∼10분간 정도이다. 이렇게 하여 용출한 리보핵산은 투석이나 에탄올 침전법 등의 탈염, 농축 조작을 행하지 않고, 역전사 효소 등을 사용한 효소 반응에 직접 사용할 수 있다(일부 생략).」

특허문헌 4는 「그렇지만, 본 발명자들은, (3)의 용출 공정에서, 80℃ 이상에서, 물 또는 저염 농도 수용액으로 핵산을 용출함으로써, DNA를 추출할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명의 완성에 이르렀다.」라고 기재한다.

이들 문헌에 기재된 방법은 다음과 같은 결점을 가지고 있어, POCT화 하기 어렵다. 즉 첫 번째로, 예를 들면, 수 ㎕∼수백 ㎕ 정도의 용액을 분취 또는 첨가하고, 정확한 피펫 조작에 의해 오염을 막고, 위험한 시약을 취급하지 않으면 안 되어, 고난도이고 번잡한 조작이 필요하다.

두 번째로, 염 또는 유기 용매를 함유한 세정액으로 복수회 세정하고, 건조에 의해 유기 용매를 확실하게 제거할 필요가 있다. 또한, 과도한 건조에 의한 핵산과 흡착 담체의 고착에 주의하면서 건조 조작을 실시하지 않으면 안 되어, 시간 및 노동력이 막대하게 된다.

세 번째로, 원심기나 마이크로 피펫을 사용한 조작이나, 사용하는 기기의 설치 장소 또는 작업 스페이스를 필요로 하여, 실시 환경을 조절하기 위한 초기 비용이 커진다.

일본 특허 제2680462호 일본 특개 평10-72485 일본 특허 제3812696호 일본 특개 2014-30364호

R Boom et al., J. Clin. Microbiol, 28(3), 495-503(1990) B Vogelstein and D Gillespie, PNAS, 76(2), 615-619(1979)

이상의 배경을 감안하여, 본 발명은 유전자 검사의 전처리를 POCT화 할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

제1 발명에 따른 전처리 방법은 처리 대상과, 처리 대상에 포함되는 핵산을 추출하는 추출액과, 실리카 입자와, 여과재를 접촉시켜, 여과재에 핵산과 실리카 입자의 복합체를 담지시키고, 핵산 증폭 반응액을 사용하는 핵산 증폭 공정으로 송출하는 전처리 방법으로서, 실리카 입자의 입경 및 핵산 증폭 반응액 중에서의 실리카 입자의 농도를 일정 범위 내로 함으로써, 핵산 증폭 공정에 앞서는 건조 공정 및 용출 공정을 불필요하게 한다.

제2 발명에 따른 전처리 방법에서는, 제1 발명에 더하여, 일정 범위는 실리카 입자 농도가 0.0625∼4㎍/㎕, 평균 입경이 0.01∼100㎛, 또한 평균 입경으로부터 구해지는 표면적이 1×10^4∼1×10^8㎛^2이다. 또한 제3 발명에 따른 전처리 방법에서는, 제1 발명에 더하여, 일정 범위는 실리카 입자 농도가 0.0625∼1㎍/㎕, 평균 입경이 0.01∼10㎛, 또한, 평균 입경으로부터 구해지는 표면적이 1×10^5∼5×10^7㎛^2이다.

제4 발명에 따른 전처리 방법에서는, 제1 발명에 더하여, 추출액에 처리 대상을 첨가하고, 처리 대상에 포함되는 핵산을 추출하는 추출 공정과, 추출된 핵산에 실리카 입자를 접촉시켜, 핵산과 실리카 입자의 복합체를 얻음과 아울러 복합체를 여과재에 접촉시키는 흡착 공정과, 여과재를 정제수로 세정하고, 세정된 여과재를 핵산 증폭 공정으로 송출하는 세정 공정을 포함한다. 또한 제5 발명에 따른 전처리 방법에서는, 제1 발명에 더하여, 여과재를 핵산 증폭 공정에 송출하기에 앞서, 여과재와 복합체를 분리하고, 분리된 복합체를 핵산 증폭 공정에 송출한다.

제6 발명에 따른 전처리 방법에서는, 제4 발명에 더하여, 흡착 공정과 세정 공정을 한번에 행한다. 제7 발명에 따른 전처리 방법에서는, 제4 발명에 더하여, 추출 공정과 흡착 공정을 한번에 행한다. 또한 제8 발명에 따른 전처리 방법에서는, 제4 발명에 더하여, 추출 공정과 흡착 공정과 세정 공정을 한번에 행한다.

제9 발명에 따른 전처리 방법에서는, 제1 발명에 더하여, 추출액에 처리 대상을 첨가하여, 처리 대상에 포함되는 핵산을 추출하는 추출 공정과, 실리카 입자를 담지하는 여과재에, 추출된 핵산을 접촉시켜, 핵산과 실리카 입자의 복합체를 얻음과 아울러 복합체를 여과재에 담지시키는 흡착 공정과, 여과재를 정제수로 세정하고, 세정된 여과재를 핵산 증폭 공정으로 송출하는 세정 공정을 포함한다. 제10 발명에 따른 전처리 방법에서는, 제9 발명에 더하여, 여과재를 핵산 증폭 공정으로 송출하기에 앞서, 여과재와 복합체를 분리하고, 분리된 복합체를 핵산 증폭 공정으로 송출한다. 또한 제11 발명에 따른 전처리 방법에서는, 제9 발명에 더하여, 흡착 공정과 세정 공정을 한번에 행한다.

본 발명의 방법에 의하면, 다음과 같은 효과가 있다. 첫 번째로, 유전자 검사에 있어서의 핵산의 추출 공정이 간단, 용이, 안전, 신속, 또한 저렴하게 되어, POCT화를 실현 가능하게 된다.

두 번째로, 안전하며 또한 간편하고 용이한 조작의 조합에 의해, 종래법보다도 처리 시간의 대폭적인 단축을 실현하고, 게다가, 저렴한 비용으로의 핵산의 추출을 실시할 수 있다. 그 이유는, 세정 공정의 세정액으로서 정제수를 사용하기 때문에, 복수의 시약 용액을 준비하고 구별하여 사용할 필요가 없어 간단한데다, 유기 용매를 필요로 하지 않아 안전하기 때문이다.

세 번째로, 유기 용매가 불필요하므로, 고상 담체의 건조 조작 및 핵산의 용출 공정도 불필요하게 된다. 요컨대, 세정 공정 후, 즉시 핵산 증폭 반응으로 이행할 수 있다. 아울러, 용액의 이동횟수를 최대한 적게 할 수 있기 때문에, 주변환경으로의 핵산 비산이나 교차 오염 등의 위험을 줄일 수 있다.

도 1은 본 발명의 일정 범위를 나타내는 그래프,
도 2는 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 전처리 방법의 각 공정도,
도 3은 본 발명의 실시형태 2에 있어서의 전처리 방법의 각 공정도,
도 4는 본 발명의 실시형태 3에 있어서의 전처리 방법의 각 공정도,
도 5는 본 발명의 실시형태 4에 있어서의 전처리 방법의 각 공정도,
도 6은 본 발명의 실시형태 5에 있어서의 전처리 방법의 각 공정도,
도 7은 본 발명의 실시형태 6에 있어서의 전처리 방법의 각 공정도이다.

(발명의 개요)

우선, 실시형태의 설명에 앞서, 발명의 요점을 기술한다. 본 발명자들은 전술의 과제를 해결하기 위해, 종래법에서 많이 볼 수 있던 「핵산의 추출에 사용한 시료로부터 가능한 한 다량의 핵산 시료를 회수하는 방법」으로부터 결별하고, 핵산 증폭 반응 1 테스트에 최저로 필요한 핵산량을 확보하는 방법에 주목하여, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 행했다.

검토의 결과, 본 발명자들은, 핵산의 전처리 방법에 있어서, (a) 카오트로픽제, 염, 산, 알칼리, 계면활성제, 유기 용매, 효소, 프렌치 프레스, 열 및 초음파 등의 통상 당업자가 생각할 수 있는 방법에 의해 처리 대상으로부터 핵산을 추출하는 공정(이하 「추출 공정」이라고 한다.)을 행한 후, (b) 추출한 핵산을 고상 담체에 흡착시키는 공정(이하 「흡착 공정」이라고 한다.)을 행하고, (c) 정제수를 사용하여 고상 담체에 흡착한 협잡물을 세정하는 공정(이하 「세정 공정」이라고 한다.)을 행하고, (d) 세정 공정 후, 즉시 핵산을 고상 담체마다 핵산 증폭 반응액에 첨가함으로써, 핵산 증폭 공정을 실시할 수 있는 것을 발견하고, 발명을 완성시켰다.

또한 본 발명자들은 본 발명의 방법을 응용하여, 여과재와 흡수재를 내포한 여과 장치와 고상 담체를 조합하여 사용함으로써, POCT가 행해지는 장소에서도 핵산의 추출이 실시 가능한 것을 발견하고, 정제수로의 세정과 담체마다 핵산 증폭 반응에 첨가하는 방법으로 이루어지는 POCT로 실시 가능한 핵산의 추출 키트를 완성시켰다.

(발명의 실시형태)

이하, 상세한 검토를 나타내기 전에, 본 발명에 있어서의 결론 부분을 먼저 기술한다.

본 발명에 의하면, 전처리 방법에 있어서, 세정 공정 후, 즉시 핵산 증폭 반응을 실시하는 것이 가능하다.

핵산이 흡착된 고상 담체와 세정액 등의 액체를 분리하는 방법은 원심 분리나 원심 컬럼을 사용한 분리, 또한 여과 분리 등의 방법을 사용할 수 있다. 당연히, 자성체를 포함하는 실리카 입자를 사용하면, 자력을 사용한 분리도 가능하다.

본 발명에서, 고상 담체는 실리카 입자이다.

본 발명에 의하면, 전처리 방법에 있어서의 흡착 공정에서 흡착한 핵산과 실리카 입자(이하 「핵산+실리카 복합체」라고 한다.)를, 세정 공정 후, 즉시 핵산 증폭 반응 시약액과 접촉시켜, 핵산 증폭 반응을 개시할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일정 범위를 나타내는 그래프이다. 결론을 먼저 말하면, 핵산 증폭 반응액 중에 존재하는 실리카 입자는 도 1의 점선 내의 범위가 바람직하다. 도 1에 있어서, 가로축은 핵산 증폭 반응액 중에 있어서의 실리카 입자 농도이며, 세로축은 실리카 입자의 평균 입경이다.

구체적으로는, 바람직한 일정 범위는 실리카 입자 농도가 0.0625∼4㎍/㎕, 평균 입경이 0.01∼100㎛, 또한 평균 입경으로부터 구해지는 표면적이 1×10^4∼1×10^8㎛^2(도 2의 점선으로 둘러싸인 범위)이다.

더욱 바람직한 일정 범위는 실리카 입자 농도가 0.0625∼1㎍/㎕, 평균 입경이 0.01∼10㎛, 또한, 평균 입경으로부터 구해지는 표면적이 1×10^5∼5×10^7㎛^2(도 2의 실선으로 둘러싸인 범위)이다.

본 발명에 있어서의 시료(처리 대상)란 핵산을 함유할 가능성이 있는 물질이면 되고, 예를 들면, 감염증의 진단시에 채취된 검체 시료이다.

감염증의 검체 시료란 인두 채취액, 비강 채취액, 비뇨기계 재료(각종 요검체), 생식기계 재료, 대변, 혈액 등의 감염증이 의심되었을 때 채취하는 검체이다.

핵산이란 DNA(dsDNA, ssDNA), RNA(dsRNA, ssRNA) 등의 핵산 증폭 반응의 주형이 될 수 있다고 당업자가 생각할 수 있는 것으로, 원인 미생물에 유래하는 핵산이나, 검체 시료를 산츨하는 생물에 유래하는 내재성의 핵산도 포함할 수 있다.

또한 감염증의 진단시에 채취된 검체 시료뿐만 아니라, 여러 장소에서 샘플링되는 핵산을 함유한 시료에 대한 이용도 포함할 수 있다.

예를 들면, 식품 검사(식중독 원인균 등이나, 재조합 유전자 검출), 농장에서의 작물의 감염증 검사 및 식음수나 공장 등에서의 수질 검사 등에 이용하는 것을 생각할 수 있다.

그렇지만, 이것들은 예시이며, 본 발명은 이것에만 한정되어 있는 것은 아니다.

본 발명에서의 핵산 시료는 1㎍ 이하의 핵산량을 처리하는 것을 상정하고 있고, 핵산 증폭 반응액에는, 1ag∼100ng, 바람직하게는 1pg∼10ng 정도의 핵산량을 반입하는 것을 상정하고 있다.

본 발명에 있어서, 흡착 공정은 카오트로픽제, 염, 산, 알칼리, 계면활성제, 유기 용매, 효소, 프렌치 프레스, 열 및 초음파 등을 사용한 핵산의 추출 방법에 의해 얻어진 핵산 함유 용액에, 직접 또는 그 용액을 희석 또는 치환한 후, 그 용액 중에 실리카 입자를 첨가함으로써 실시한다.

전처리에서의 흡착 공정을 추출 공정과 동시에 실시할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 세정 공정에 사용하는 세정액은 정제수이다. 이 정제수란 여러 수법으로 정제된 물이지만, 통상 당업자가 생각하는 핵산 증폭 반응을 실시할 때 시약 조제에도 이용 가능한 물을 포함한다. 예를 들면, 유기 용매를 함유하지 않고, 고농도의 염 등의 핵산 증폭 반응 저해 물질을 포함하지 않는 물이다(이하 「정제수」라고 함).

본 발명에 있어서, 세정 공정은, 흡착 공정 후, 적당량의 정제수에 의한 세정으로 실시된다. 세정횟수는 한정되지 않지만, 1∼수 차례 세정하면 된다.

세정 공정 후, 핵산+실리카 복합체는 즉시 핵산 증폭 반응 시약액에 첨가된다.

그렇지만, 흡착 공정에 있어서, 용매에 정제수를 사용한 경우, 또는, 흡착 공정 후에 얻어진 핵산 함유 용액을 정제수를 사용하여 희석 또는 용액 치환한 경우에 있어서, 세정 공정을 생략하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서, 여과 분리의 여과재는 멤브레인 필터 등의 통상 당업자가 선택하는 것 중, 핵산의 흡착이 적고, 전술한 실리카 입자를 여과할 수 있는 포어 사이즈를 보유하는 것이면 된다.

예를 들면, 폴리락트산, 셀룰로오스, PTFE 등을 원료로 한 막, 멤브레인 필터, 직포, 부직포 등을 들 수 있다.

형태도 막 형상의 것에 한정되지 않고, 자루 형상, 통 형상의 것 등을 여과에 이용할 수 있는 형태이면 가능하다.

예를 들면, 머크(니혼밀리포어)사제의 옴니포어(상표) 멤브레인 필터(JCWP) 등이 적합하다.

본 발명에서, 여과 분리는 흡수재를 내포한 여과 장치를 사용함으로써 POCT와 같은 조건하에서의 핵산의 추출에 대응할 수 있다.

흡수재를 내포한 여과 장치란 세정액 등의 용액의 흐름이 일방향이고, 게다가, 사용한 용액을 내부에 설치한 흡수재에 의해 흡수하여, 외부로 액체의 비산을 억제하는 장치이다.

본 발명은, 실시형태 및 실시예에 특별히 설명이 없는 경우에는, 당업자에게 있어서 표준적인 기술에 준하여 실시했다.

예를 들면, Molecular Cloning A LABORATORY MANUAL FOURTH EDITION(Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press), 세포공학 별책 바이오 실험 일러스트레이티드 시리즈(각켄메디칼 슈쥰샤), 또는 개정 제3판 유전자 공학 실험 노트(타무라 타카아키/편, 상하권, 요도샤) 등에 기술된 방법을 참고로 하여 실시했다.

또한 시판되고 있는 시약이나 기기를 사용하는 경우에는, 특별히 설명을 기술하지 않는 경우에는, 부속의 프로토콜에 준하여 행했다.

하기에 나타내는 실시예는 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 발명의 1 태양의 예시이며, 발명을 한정하는 것은 아니다.

(실시예 1)

<재료 및 방법>

(정제수)

본 실시예에 있어서의 정제수는 Direct-Q(등록상표) 5UV 초순수 제조 장치(머크 가부시키가이샤)로부터 얻어진 초순수를 이용했다.

(고상 담체)

본 실시예에 있어서의 고상 담체는 실리카 입자이다. (표 1)에 사용한 실리카 입자의 품명, 제품번호, 카탈로그 번호 등의 제품을 식별할 수 있는 정보와, 제조 또는 판매 회사의 정보를 나타낸다. 카탈로그나 제품에 첨부되어 있던 시험성적서 등의 정보로부터, 평균 입경이 큰 것부터 순서로 번호를 붙여 나타내고 있다. 그렇지만, (표 1)은 실시예에서 사용한 실리카 입자를 단지 예시하고 있을 뿐이며, 본 발명에서의 실리카 입자를 한정하는 것은 아니다.

(핵산 시료)

본 실시예에 있어서의 핵산 시료는 마이코플라스마 폐렴의 병원체인 Mycoplasma pneumoniae 유래 p1 유전자를 검출 대상으로 했다.

핵산 시료는, Mycoplasma pneumoniae 유래 p1 유전자의 단편을 상법을 사용하여 pUC57 플라스미드 DNA에 편입하고 클로닝 함으로써, 제작했다.

제작한 핵산 시료는 TE 완충액을 사용하여 3pg/㎕의 농도로 조제했다.

조제 후, 핵산 시료는 리얼타임 정량 PCR시의 검량선 작성을 위한 표준 시료 등으로서 이용했다.

조제한 핵산 시료의 일부는 분취한 후, TE 완충액을 사용하여 더 희석하여, 3pg/50㎕의 농도로 조제하고, 핵산의 추출을 실시할 때의 출발 재료로서 이용했다.

(프라이머 및 프로브)

프라이머는 Ieven 등의 보고(The Journal of Infectious Diseases, 1996; 173; 1445-52)에 기재되어 있는, 「P1 아드헤진 유전자에 대한 프라이머 세트(5'-GCCACCCTCGGGGGCAGTCAG-3' 및 5'-GAGTCGGGATTCCCCGCGGAGG-3')」를 사용했다.

프로브는 전술의 프라이머 세트의 증폭 산물로부터 특이적인 영역을 선택하고, 당업자가 통상 사용하는 방법으로 제작했다.

프로브의 제작은 닛테츠스미킨칸쿄 가부시키가이샤 J-BIO21 센터에 QProbe(등록상표)의 수탁 합성을 의뢰함으로써 행했다.

(그 밖의 시약류의 준비 및 조제)

그 밖의 시약류의 조제는, 통상 시판되고 있는 것을 이용하여, 상법에 따라 조제를 했다.

BOOM법을 재현 또는 일부를 재현하는 경우의 세포 용해액은 「용해용 완충액 L6」를 사용했다.

「용해용 완충액 L6」는 특허문헌 1에 기재된 방법에 준하여 조제했다.

(핵산 증폭 반응 및 그 해석 방법)

핵산 증폭 반응은 1 튜브당 20㎕의 반응액량으로, 리얼타임 정량 PCR을 행했다.

장치는 LightCycler(등록상표) nano system(로슈 다이아그노스틱스 가부시키가이샤)을 사용했다.

반응 프로필은 초기 변성 프로그램으로서 95℃: 120초, 증폭 프로그램으로서 95℃: 10초, 68℃: 10초 및 72℃: 10초를 40사이클로 실시했다.

열융해 프로그램은 68℃부터 95℃를 선택했다.

리얼타임 정량 PCR은 인터컬레이터법과 프로브법을 사용하여 실시했다.

인터컬레이터법은 색소로서 20×EvaGreen(등록상표) Dye(Biotium inc.)를, 프로브법은 QProbe(등록상표; 닛테츠스미킨칸쿄 가부시키가이샤)를 사용하여 실시했다.

반응 종료 후, 얻어진 증폭 곡선이 공시한 DNA 유래의 목적 산물인지의 확인은 열융해 프로그램의 결과로부터 행했다.

실시예에 있어서, 핵산 증폭 반응은 특별히 기재하지 않는 경우에는 인터컬레이터법을 사용하여 실시했다.

인터컬레이터법에 있어서, 증폭 곡선의 해석은 장치 전용의 해석 소프트웨어의 「Automatic Quantification」을 선택하고, 검량선으로부터 PCR 효율이나 R^2의 값이 정상 범위인지를 상법에 따라 확인한 후, 얻어진 Ct값과 정량값으로부터 행했다.

한편, QProbe와 같은 소광하는 타입의 프로브법의 해석은 LightCycler nano system에 비치된 해석법이 대응하고 있지 않았기 때문에, 일본 특허 제4724380호에 기재된 방법에 준하여, 미가공 데이터로부터, 직접 해석을 행하여, Ct값과 정량값으로부터 행했다.

해석에 이용한 데이터는 복수개의 동일 조건의 샘플로부터 얻어진 데이터를 평균한 것을 사용했다.

이하, 사항 1∼5의 세목에 대하여, 구체적으로 설명한다. 각 사항에서는, 기술적인 과제, 대응책, 결과 및 고찰을 나타낸다.

사항 1: 세정액을 정제수로 변경한 실시의 영향

사항 2: 실리카 입자를 첨가하는 것의 핵산 증폭 반응에의 영향

사항 3: 실리카 입자의 첨가량의 변화에 의한 핵산 증폭 반응에의 영향

사항 4: 실리카 입자의 사용량에 의한 핵산의 흡착 능력과 핵산 증폭 반응에의 영향

사항 5: 흡착 공정에 있어서의 카오트로픽제의 영향 및 간이한 여과 장치를 사용했을 때의 실시

(사항 1)

사항 1에서는, BOOM법(특허문헌 1에 기재되어 있는 프로토콜 Y(이하 「프로토콜 Y」라고 한다.)에 있어서, 세정 공정의 세정액으로서 사용되는 「L2」, 「70% 에탄올」 및 「아세톤」을 모두 정제수로 변경하거나, 그 밖의 조건을 프로토콜 Y에 준하여 실시하는 것이 가능한지 조사했다.

프로토콜 Y의 「출발 재료」로서 3pg/50㎕의 농도로 조제한 핵산 시료를 사용했다.

실리카 입자로서 (표 1)의 실리카 입자번호 4를 사용하고, 특허문헌 1의 재료 및 방법에 기재된 「실리카 조재(粗材)(SC)의 현탁액」에 준하여 조제했다.

추출 후, 얻어진 용출액의 2㎕를 분취하고, 18㎕의 PCR 시약액에 첨가하여, 전량이 20㎕의 PCR 반응액이 되도록 조제했다.

조제한 PCR 반응액에 리얼타임 정량 PCR을 적용하여, 정량값을 얻었다.

얻어진 정량값을 25배 하여, 1튜브당 회수할 수 있었던 핵산량으로 하고, 그것들의 평균을 구했다.

출발 재료에 함유되어 있던 핵산량 3pg을 100%로 한 경우의 퍼센티지를 구하고, 회수율(%)로 했다.

(표 2)에는 1튜브당의 평균 회수율(%)과, 용출액 10㎕당의 회수율(%)이 나타내어져 있다.

(표 2)에 있어서, 양성 대조는 출발 재료에 함유되어 있던 3pg을 100% 회수한 경우의 값을 참고로 하여 기재하고 있다.

종래예로서 BOOM법을 프로토콜 Y에 준하여 실시했다.

얻어진 정량값에 기초하여, 사항 1과 마찬가지로 회수율(%)을 구했다. (표 2)에는, 1튜브당의 평균 회수율(%)과, 용출액 10㎕당의 회수율(%)이 사항 1의 결과와 함께 병기되어 있다.

(표 2)로부터, 세정액을 모두 정제수로 변경한 경우에는, 종래예에서는 78.59%이었던 회수율이 사항 1에서는 1.99%로, 현저하게 핵산의 회수율이 저하되는 것을 알 수 있다.

즉 단순히 세정액을 정제수로 변경하는 것은 일반적인 용출 조작과 동일한 의미를 가져, 실리카 입자에 흡착된 핵산까지 씻어 내어버리는 것을 다시 확인할 수 있다.

데이터를 나타내고 있지는 않지만, 출발 재료가 3pg으로 소량의 핵산을 취급하는 경우, 출발 재료를 ㎍ 단위로 다룰 때보다도 회수율이 저하되는 경향이 있었다.

사항 1에 있어서 PCR 반응액은 최대로 10㎕까지의 용출액을 첨가하는 것이 가능하다고 추측할 수 있고, 그래도 3pg의 0.40%인 약 12fg밖에 핵산 증폭 반응액 중에 반입할 수 없다고 추론된다.

한편, 종래예는, 마찬가지로 고찰하면, 3pg의 15.72%인 약 470fg을 반입할 수 있다.

이상으로부터, BOOM법의 프로토콜 Y에 있어서, 단순히 세정액을 물로 변경하는 것만으로는 충분한 핵산량을 얻을 수 없는 것을 알 수 있다.

(표 2)에 있어서의 종래예의 결과는, 3pg의 핵산량을 함유한 출발 재료로부터, 5∼15% 전후 회수할 수 있으면, 1 테스트의 핵산 증폭 반응에서는 충분히 검출 가능한 양인 것을 나타내고 있다.

본 발명에서, 저농도의 핵산 용출액이 얻어진 경우에 있어서, 에탄올 침전법이나 농축 컬럼 등에 의한 농축 조작 또는 용액 치환 등의 조작은 조작의 번잡함이 증가해 버리기 때문에, 선택하기 어렵다.

이상의 결과로부터, BOOM법의 세정 공정의 세정액을 정제수로 단순히 치환하여 실시하는 방법은, 출발 재료의 핵산량이 적은 경우나 저농도의 핵산 용출액이 얻어진 경우에는, 불충분하다고 고찰할 수 있다.

한편, 정제수에 의한 세정이 가능하면, 여러 이점이 얻어진다.

종래예에 나타낸 BOOM법 등에서는 순수한 핵산 용액을 얻기 위하여, 협잡물을 제거하거나, 또는, 흡착에 이용한 염을 제거하기 위해, 복수의 세정액으로 복수회의 세정 조작을 행하고, 아울러, 건조 조작을 행하는 등, 번잡하고 손이 많이 가는 조작이 필요하다.

정제수에 의한 세정이 가능하면, 이들 조작을 대폭 생략할 수 있다. 아울러, 핵산+실리카 복합체는 습윤 상태에서 다음의 핵산의 증폭 공정으로 반입하기 때문에, 건조에 의한 실리카 입자에 대한 핵산의 고착의 강화를 염려할 필요가 없다. 또한, 단순한 조작으로의 핵산을 추출할 수 있기 때문에, 유전자 검사 등의 조작에 숙련되지 않은 실시자에 대해서도 용이한 조작을 제공할 수 있어, 건조 조작에 의한 핵산의 고착을 걱정할 필요가 없기 때문에, 핵산 흡착능이 높은 작은 실리카 입자도 유효하게 이용할 수 있다.

작은 입경을 가진 실리카 입자를 유효하게 이용할 수 있으면, 고상 담체로서의 실리카 입자는 사용량을 대폭 줄일 수 있다.

(사항 2)

사항 2에서는, 전량 20㎕의 리얼타임 정량 PCR 반응액을 사용한 반응계에 있어서, 실리카 입자(5㎍/tube)와 핵산 시료(3pg/tube)를 첨가하여 얻어진 Ct값을 비교함으로써, 실리카 입자를 첨가하는 것의 핵산 증폭 반응에 대한 영향을 조사했다.

Ct값의 비교대조를 위해, 양성 대조(실리카 입자(0㎍/tube), 핵산 시료(3pg/tube))와, 음성 대조(실리카 입자(0㎍/tube), 핵산 시료(0pg/tube))를 준비했다.

양성 대조에서는, Ct값의 기준으로 하기 위해, 얻어진 Ct값으로부터 평균값을 구하고, 그 값을 100%로 했다. 각 실리카 입자로부터 얻어진 Ct값은 마찬가지로 평균값을 구하고, 양성 대조의 평균값으로 나누고, 100을 곱함으로써 Ct값의 변화 비율(%)로 했다.

사항 2에서는, 사항 1과는 달리, 모든 실리카 입자를 시판되고 있는 상태 그대로(예를 들면, 사용하는 입자의 입경의 범위를 일치시키는 조작이나 표면의 수식 등, 시판된 상태의 실리카 입자로부터 개질 조작을 실시하지 않고) 사용하고, 설정한 사용량을 분취하기 쉬운 적당한 농도로 실리카 입자 현탁액을 조제하여 사용했다.

(사항 3)

사항 3에서는, 사항 2에 준하여, 각 실리카 입자의 첨가량의 변화에 의한 핵산 증폭 반응에 대한 영향을 조사했다.

실리카 입자를 PCR 튜브당 10㎍, 20㎍ 및 40㎍을 첨가하고, 전량 20㎕의 리얼타임 정량 PCR 반응액을 조제하여 실시했다.

(표 3)은 사항 2 및 사항 3의 결과를 정리하여 나타낸다.

사항 2에 대해서는, (표 3)을 세로방향으로 비교함으로써 동일한 사용량 조건하에서의 사용한 각 실리카 입자의 차이를 관찰할 수 있다.

사항 3에 대해서는, (표 3)의 각 실리카 입자를 가로방향으로 비교함으로써, 그 실리카 입자가 리얼타임 정량 PCR 반응액 중에 존재하는 양의 변화에 의해, 리얼타임 정량 PCR 반응에 미치는 영향을 관찰할 수 있다.

(표 3)에 있어서, 「n/a」라는 것은 데이터가 없는 것을, 「※1」이라는 것은 리얼타임 정량 PCR 반응액 ㎕당의 실리카 입자량(㎍)을 각각 나타낸다.

사항 2의 결과(5㎍/tube)는 실리카 입자가 리얼타임 정량 PCR 반응액 1㎕당 0.25㎍이 함유되어 있는 것뿐이어도, 리얼타임 정량 PCR 반응에 큰 영향(Ct값의 변화가 10%를 초과함)을 미치는 것이 있는 것을 나타낸다.

사용한 것 중, Ct값의 변화 비율이 2% 이하로 억제되어 있는 것도 있는 등, 거의 Ct값의 편차의 범위 내라고 평가해도 좋은 것도 있었다. 이 결과를 참고로 하여, 사항 3으로 진행했다.

사항 3에서는, 사항 2의 결과를 받고, 실리카 사용량을 증가시켜 비교했다.

사항 3의 결과는 핵산 흡착 능력이 높은 평균 입경이 작은 실리카 입자일수록 사용량의 증가와 함께 Ct값의 변화비율이 커지는 경향이 있어, 평균 입경이 큰 입자는 그다지 변화가 관찰되지 않는 경향이 있는 것을 나타낸다.

사항 1의 종래예의 실리카 입자의 사용량은 BOOM법의 프로토콜 Y를 재현한 「실리카 조재(SC)의 현탁액」의 경우에서 약 30∼50%의 실리카 입자 현탁액이 되었다. 그 때문에, 추출을 실시할 때에 1 튜브에 존재한 실리카 입자량은 약 12∼20mg 정도로 추측된다.

사용한 실리카 입자의 차이를 고려하여 적게 어림잡아도, BOOM법을 재현하기 위해서는 1mg 정도의 실리카 입자가 필요한 것으로 고찰된다.

특허문헌 2에서는, 핵산이 흡착된 채 고상 담체를 현탁액으로 한 후, 2/5량을 직접 첨가하여 PCR 반응을 실시하고 있다.

그때, PCR 반응액 중에 존재하는 실리카 입자는 BOOM법에서는 적어도 200㎍ 정도의 실리카 입자가 50㎕의 PCR 반응액(4.00㎍/㎕)에 존재하고 있었다.

그렇지만, 사항 2 및 사항 3에서는, 많아도 40㎍의 실리카 입자가 20㎕의 리얼타임 정량 PCR 반응액(2.00㎍/㎕)에 존재하고 있었다.

사항 2 및 사항 3의 결과로부터, BOOM법에서는 사용한 고상 담체의 모두를 다음의 조작에 반입하는 경우, 실리카 입자의 사용량이 많기 때문에 핵산 증폭 반응을 강하게 저해할 가능성이 있다고 생각된다.

BOOM법은 고상 담체량이 많기 때문에, 핵산을 용출하거나, 용출하지 않으면 일부의 담체를 분취하여, 사용량을 조제할 필요가 있는 등, 1㎍ 이하의 핵산량을 포함하는 출발 재료를 취급하기 위해서는 약간 낭비가 많은 방법이라고 할 수 있을 것이다. 또한 분취하는 조작이 필요하여, 번잡하기 때문에, 핵산의 추출 등의 핵산의 취급에 숙련되지 않은 실시자에 대하여 난이도가 높은 조작이 요구된다.

BOOM법은, 감염증의 신속 진단 등과 같이 검체 중에 함유되는 핵산량이 1ag∼500ng 정도의 경우나, 간편하고 신속한 조작이 요구되고 있는 경우, 또는, 단순하고 알기 쉬운 조작이 요구되고 있는 경우 등에는, 이용하기 어렵다고 생각된다.

사항 2, 3의 결과로부터, 핵산의 추출은 실리카 입자량을 조정하여, 필요한 핵산량을 확보하면서, 또한 핵산 증폭 반응을 저해하지 않고 또는 거의 저해하지 않는 사용범위를 한정할 수 있으면, 단순하고 용이한 조작만으로 신속하게 실시 가능하다고 고찰된다.

(사항 4)

사항 4에서는, 예시한 실리카 입자를 실제로 전처리에 이용할 수 있는지를 조사한다. 세정 공정까지는, 사항 1에 준하여 실시한다.

40㎕의 정제수 중에, 1.25㎍, 2.5㎍, 5㎍, 10㎍, 20㎍, 40㎍ 및 80㎍의 실리카 입자가 함유되도록 실리카 현탁액을 조정했다.

세정 공정 후, 즉시 5㎕ 정제수로 핵산+실리카 복합체를 현탁하고, 핵산+실리카 복합체의 현탁액을 얻었다.

핵산+실리카 복합체 현탁액의 전량을 15㎕의 리얼타임 정량 PCR 반응 시약에 첨가하고, 리얼타임 정량 PCR 반응을 행했다.

반응 종료 후, 각 사용량 조건하에서의 각 실리카 입자의 정량값은 평균을 구했다.

구한 평균의 정량값은 출발 재료로부터 직접 얻어진 정량값의 평균을 100%로 한 경우에 대한 퍼센티지를 구하고, 회수율로 했다.

회수율은 5% 이상을 평가 대상으로 하여 평가하고, 평가 기준과 함께 (표 4)에 정리했다.

(표 4)에 있어서, 「n/a」라는 것은 데이터 없음, 「※1」이라는 것은 리얼타임 정량 PCR 반응액 1㎕당의 실리카 입자량(㎍/㎕)을 나타낸다. 「※2」라는 것은 실리카 입자의 평균 입경을 나타내고, 구입한 제품에 첨부된 검사성적서에 의한 것, 혹은 검사성적서가 첨부되어 있지 않은 경우에는 카탈로그나 홈 페이지 등에 공개되어 있는 평균 입경을 기재하고 있다.

사항 4에 있어서의 회수율은 정제수를 사용한 세정 공정을 행하는 전처리 방법에 있어서 실리카 입자의 성질을 종합하여 평가하기 위한 것으로, 전처리 공정으로부터 증폭 반응 공정에 있어서 실리카 입자가 미치는 영향을 나타낸다.

예를 들면, 전처리에 있어서, 흡착 공정에서는 실리카 입자의 핵산 흡착능을, 세정 공정에서는 정제수에 노출된 경우의 핵산 유지능 등을 각각 나타낸다.

핵산 증폭 반응에 있어서, 리얼타임 정량 PCR 반응의 저해율 및 리얼타임 정량 PCR 반응에 있어서의 형광 검출의 저해율 등을 종합하여 평가한 것이 된다.

회수율은 (표 4)에 나타낸 「+」의 수가 많은 것일수록 보다 좋다.

10% 이상의 결과(「++, +++」)는 1.25∼2.5㎍/튜브의 조건하에서는 입경이 0.3㎛ 부근부터 그 이하의 입경의 범위에, 5㎍/튜브의 조건하에서는 입경이 0.01∼3㎛의 범위에서, 10∼20㎍/튜브의 조건하에서는 입경이 1∼5.3㎛의 범위에서, 40㎍/튜브의 조건하에서는 입경이 1.9㎛ 부근의 범위에서 관찰되었다.

한편, 80㎍/튜브의 조건하에서는, 실시한 조건의 범위에서 양호한 결과를 제시한 것은 관찰되지 않았다.

사항 4에서는, 고상 담체인 실리카 입자의 사용량과 입경과의 관계로부터, 결과가 크게 상이한 경우가 있는 것이 시사되었다.

즉, 실리카 입자의 사용량을 조제하여 사용함으로써, 정제수를 세정액으로서 사용하고, 또한 사용한 모든 핵산+실리카 복합체를 핵산 증폭 반응 시약에 첨가해도, 핵산 증폭 반응 1 테스트에 필요한 핵산량을 충분히 확보할 수 있고, 또한 핵산 증폭 반응을 저해하는 등의 영향을 미치지 않는 것이 시사되었다.

사항 4에 있어서, 양호한 결과를 나타낸 입경의 대부분은 이미 BOOM법 등 많은 방법에서, 특히 적합한 조건이라고 하고 있는 1∼10㎛의 입경을 갖는 것이었다.

또한, BOOM법 등의 종래법(예를 들면, 특허문헌 1∼4)은 0.05㎛∼500㎛의 범위의 실리카 입자를 사용 가능하다고 기재하고 있지만, 특허문헌 1에 「실제로, 실리카 입자의 NA 함유량은 입자가 작으면 작을수록 높지만, 특히 NA 함유량이 높은 출발 재료의 경우 및 NA 분자가 비교적 긴 경우에는, 과도하게 작은 실리카 입자를 사용하면, 형성되는 NA-실리카 복합체를 그 이상 유효하게 재분산할 수 없게 된다. 환언하면, 결합한 NA를 순수한 형태로 복합체로부터 회수할 수 없다.」(「NA」는 핵산을 의미함)라고 기재되어 있어, 작은 입경의 사용을 피하고 있는 것으로 생각된다. 아울러, 「실리카 조재(SC)의 현탁액」의 조제시에, 1㎛ 이하의 입자를 가능한 한 제외하는 조작도 행하고 있다.

그렇지만, 사항 4에서는, 평균 입경이 1㎛ 이하의 실리카 입자에서도 양호한 결과가 얻어지는 것을 알았다.

본 발명자들은 사항 2, 3 및 4를 인터컬레이터법을 사용한 재현 실험 및 QProbe를 사용한 프로브법으로의 재현 실험을 반복하여 행함으로써 Ct값의 변화 비율이 적어 리얼타임 정량 PCR 반응에 끼치는 영향이 적고, 또한 높은 회수율이 얻어져 양호한 결과를 나타낸 실리카 입자의 입경과 사용량의 관계를 조사했다.

그 결과, 도 1에 나타내는 바와 같이, 본 발명자들은 핵산 증폭 공정에도 영향을 끼치지 않고 또한 충분한 핵산량을 확보할 수 있는 실리카 입자의 사용 범위(일정 범위)를 특정하는 것에 성공했다.

반복되지만, 바람직한 일정 범위는, 도 1의 점선으로 나타내는 바와 같이, 실리카 입자 농도가 0.0625∼4㎍/㎕, 평균 입경이 0.01∼100㎛, 또한 평균 입경으로부터 구해지는 표면적이 1×10^4∼1×10^8㎛^2이다.

또한 바람직한 일정 범위는, 도 1의 실선으로 나타내는 바와 같이, 실리카 입자 농도가 0.0625∼1㎍/㎕, 평균 입경이 0.01∼10㎛, 또한, 평균 입경으로부터 구해지는 표면적이 1×10^5∼5×10^7㎛^2이다.

이상의 결과를 얻은 본 발명자들은 카오트로픽 효과에 의한 핵산과 실리카 입자의 흡착 현상뿐만 아니라, 실리카 입자의 구조가 초래하는 정전기력이나 분자력 등의 다른 현상이 유효하다고 하는 가설을 세웠다.

본 발명자들은, 이 가설의 진위를 확인하기 위해, 카오트로픽제 등의 염, 그 밖의 정전기력을 높이는 염, 또는 유기 용매 등을 일체 포함하지 않고, 추출을 유효하게 실시할 수 있는지 아닌지 조사했다.

본 발명자들은 카오트로픽제 등의 염, 그 밖의 정전기력을 높이는 염, 혹은 유기 용매 등을 전혀 사용하지 않아도 추출을 유효하게 실시할 수 있다고 하는 결과를 얻었다. 단, 카오트로픽 염을 사용하는 경우에 비교하면, 약간 회수율이 떨어지고 있지만, 실용상 충분한 결과가 얻어졌다. 또한 여과 분리를 병용하면, 추출이 보다 효과적이게 되는 점이 밝혀졌다.

(사항 5)

사항 5에서는, 흡착 공정에 있어서의 카오트로픽제의 영향을 조사하고, 도 2(e)에 나타내는 간이한 여과 장치를 사용하여 실제로 POCT화 할 수 있는지 아닌지 검토했다.

도 2(e)에 도시하는 바와 같이, 이 여과 장치는 직사각형 상자형을 이루는 하우징(7)과, 하우징(7)의 상부 중앙에 고착되는 깔때기부(2)를 구비하고, 하우징(7)의 내부에, 여과재(3), 제1 흡수재(4), 제2 흡수재(5) 및 조정 부재(6)로 이루어지는 층 구조체를 구비한다.

하우징(7)으로서는 시판의 플라스틱제 상자와 같이, 가공이 용이한 부재를 사용하면 된다. 본 예에서는, 하우징(7)으로서 가부시키가이샤 료힌케카쿠제의 PP 소형 비누 케이스(상품번호 47697681, 약 64mm×52mm×20mm)를 사용했지만, 물론, 이것은 단순한 예시이며, 여러 가지로 변경해도 본 발명의 보호 범위에 포함된다.

깔때기부(2)는 처리 대상을 포함하는 액을 적하하고, 낭비 없이 여과재(3)에 인도하기 위한 부재이며, 적하가 용이하면 생략해도 된다. 깔때기부(2)로서는, 예를 들면, 마이크로 피펫의 팁이나, 검사약 등에 많이 볼 수 있는 형상의 노즐부 등을 유용해도 된다.

본 예에서는, 하우징(7)의 상면에 5mm 정도의 구멍을 뚫고, 그 구멍에 깔때기부(2)의 하단부를 돌려 넣음으로써, 깔때기부(2)를 하우징(7)에 고착했다.

본 예의 층 구조체는 다음의 여과재(3), 제1 흡수재(4), 제2 흡수재(5) 및 조정 부재(6)로 이루어진다.

여과재(3)로서, 본 예에서는, 머크(니혼밀리포어)사제의 옴니포어 멤브레인 필터(JCWP)를, 칼크래프트사제의 1공펀치(구멍 직경 7mm)로 펀칭한 원 형상의 막편을 사용했다. 여과재(3)의 직경은 5∼7mm 정도, 여과재(3)의 포어 사이즈는 1∼10㎛ 정도가 적당하다.

여과재(3)는 깔때기부(2)의 하단부 등으로부터 용액(1)이 누출하지 않을 정도로 충분히 밀착시켜 설치할 필요가 있다.

제1 흡수재(4)로서, 본 예에서는 아드반테크(Advantech)사제의 생산용 여과지(No.60)를 25.0mm×25.0mm로 절단하고, 여과재(3)의 바로 아래에 1매 설치했다.

제2 흡수재(5)로서, GE 헬스케어·재팬 가부시키가이샤제의 Whatman 유리섬유 여과지 각형 그레이드 GF/D를 25.0mm×25.0mm로 절단하고, 제1 흡수재(4)의 하방에 2매 설치했다.

또한, 조정 부재(6)로서 제2 흡수재(5)의 하방에 플라스틱의 판을 겹쳤지만, 조정 부재(6)는 생략할 수 있는 경우도 있다.

사항 5의 흡착 공정에 있어서, 50㎕의 출발 재료를 1.5ml 튜브에 분취한 600㎕의 정제수에 첨가하고, 거기에, 40㎕의 실리카 입자 현탁을 첨가하고, 즉시 전도 혼화(5초간)한 후, 실온에서 5분간 방치하고, 다시, 전도 혼화(5초간)했다. 그 후, 균질화시킨 핵산과 실리카 입자를 함유한 용액을, 도 2(e)에 나타내는 여과 장치의 깔때기부(2)에 전량을 적하하고, 여과 분리를 행했다(1∼2분 정도). 여과 분리 후, 핵산+실리카 복합체를 얻었다. 사항 5에서 사용한 실리카 입자 현탁액은 정제수에 (표 1)에 나타낸 실리카 입자 번호 6을 첨가하고, 1.75㎍/㎕의 농도로 조제함으로써 준비했다.

세정 공정은 얻어진 핵산+실리카 복합체에 600㎕의 정제수에 첨가함으로써 행했다.

세정 공정 후, 핵산+실리카 복합체는 여과재마다 모두를 핀셋으로 회수하고, 즉시 68㎕ 리얼타임 정량 PCR 반응 시약에 첨가(핵산+실리카 복합체와 여과재의 체적을 약 2㎕분으로 하여, 전량으로 70㎕의 리얼타임 정량 PCR 반응액을 조제)하여, 핵산 증폭 반응에 사용했다.

마찬가지로, 양성 대조는 출발 재료를 50㎕ 정제수로 변경하여 사항 5를 행하고, 추출 후 얻어진 실리카 입자와 여과재를 핵산 증폭 반응 시약에 첨가하고, 또한 3pg 핵산 시료를 직접 첨가하여, 전량 70㎕의 리얼타임 정량 PCR 반응액을 조제했다.

음성 대조는 사항 5로부터 실리카 입자를 제외한 실시를 음성 대조 1(고상 담체 없음), 양성 대조로부터 핵산 시료를 제외한 실시를 음성 대조 2(핵산 시료 없음)로 했다.

이들 결과는 사항 4와 마찬가지로 회수율을 구하고, 구한 회수율과 그 평균을 (표 5)에 나타냈다.

사항 5에 있어서의 회수율은 평균 26%로 본 발명자들이 예상한 회수율보다도 높은 결과가 되었다.

이 결과는 시판되고 있는 실리카 기질을 보유한 전처리용 미니 컬럼에 용출 조작 후에도 잔류하고 있다고 여겨지고 있는 5-10%의 핵산량(Molecular Cloning A LABORATORY MANUAL FOURTH EDITION(Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), Vol. 1, p4를 참조)보다도, 잔류하고 용출되지 않은 핵산량(본 발명에서는 회수율)이 2배 이상이나 높은 수치이다.

음성 대조 1에서는, 잔류하고 용출되지 않은 핵산량(본 발명에서는 회수율)은 회수율이 평균 1.28%로 낮아, 실리카 입자가 존재하지 않으면, 핵산 증폭 반응의 주형으로서 충분한 핵산량을 얻는 것이 어려운 것이 나타내어졌다.

이들 결과로부터, 본 방법이 핵산을 고상 담체로부터 용출시키는 작용을 갖는 정제수 등의 용액에 노출되어도 핵산을 용출하기 어렵기 때문에, 충분한 핵산량을 유지할 수 있었던 것을 알 수 있다.

1 테스트의 핵산 증폭 반응액 속에서, 본 방법은 유지한 핵산을 핵산 증폭 반응에 이용할 수 있는 형태로 할 수 있는 것이 제시되었다.

본 방법은 카오트로픽 효과에 의지한 흡착 공정을 필요로 하지 않기 때문에, 검체 시료의 상태에 맞추어 다양한 전처리 방법을 선택할 수 있다.

BOOM법 프로토콜 Y에서는 1개의 샘플만을 처리하는 경우에도 최저라도 30분 정도 결렸던 시간을, 본 방법에서는 약 17분 정도로 단축할 수 있었다.

이상의 결과로부터, 본 방법은 종래법과 비교하여, 간단, 용이, 안전, 신속, 또한 저렴한 전처리 방법인 것이 명백하며, 유전자 검사의 전처리를 POCT화 할 수 있다.

본 발명의 여과 장치를 사용하면, 종래까지 필요하다고 생각되고 있던 이화학 기기(예를 들면, 건조 조작에 사용하는, 예를 들면, 히트 블록 등의 장치나, 원심 장치나 마이크로 피펫 등의 기본적인 이화학 기기)를 거의 사용하지 않고 실시할 수 있어, 기기의 유무에 의한 실시환경의 제한을 제거할 수 있다.

종래까지 필요하다고 생각되고 있던 이화학 기기는 고액의 것이 많아, 기기를 고루 갖추는 등의 초기 투자 비용은 면역 검사의 POCT 키트와 비교하면 막대하다.

본 발명은 이것들의 사용을 피하는 것이 가능하기 때문에, 핵산의 추출의 실시 비용을 억제할 수 있다.

본 발명은 세정 공정의 간편화 및 용출 공정의 생략에 의해 조작 수순을 단순화하여, 핵산의 추출에 숙련되지 않은 실시자에 대해서도, 충분히 실시 가능할 정도로 간편하다.

이상의 검토를 근거로 하면, 다음에 말하는 각 실시형태에 있어서의 전처리 방법을 실시할 수 있는 것이 이해될 것이다. 물론, 이상에서 몇 번이나 기술한 일정 범위의 조건을 충족시키는 것이 전제가 된다.

(실시형태 1)

도 2는 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 전처리 방법의 각 공정도이다.

실시형태 1은 기본형이다.

<추출 공정>

우선, 도 2(a)에 나타내는 바와 같이, 추출액(11)을 넣은 튜브(10)에 처리 대상(12)을 첨가한다. 소시간 정치하면, 처리 대상의 핵산을 피복하는 성분(예를 들면, 세포막이나 세포벽 등)이 추출액(11)에 의해 파괴되어, 도 2(b)에 나타내는 바와 같이, 핵산(13)과 협잡물(예를 들면, 세포막편 등)이 추출액(11)에 혼재하는 핵산 함유 용액이 된다.

<흡착 공정>

다음에 도 2(c)에 나타내는 바와 같이, 튜브(10)의 핵산 함유 용액에 실리카 입자(14)를 첨가하여, 핵산(13)과 실리카 입자(14)를 흡착시킨다. 그 결과, 핵산(13)과 실리카 입자(14)의 복합체(15)가 형성된다.

이 용액을, 도 2(d)에 나타내는 바와 같이, 여과 장치의 깔때기부(2)에 적하하고, 여과재(3) 등에 의해 여과하고, 도 2(e)에 나타내는 바와 같이, 여과재(3) 위에 복합체(15)를 회수한다.

<세정 공정>

도 2(f)에 나타내는 바와 같이, 여과재(3) 위에 회수된 복합체(15)에 정제수(16)를 적하하여, 세정한다. 그리고, 도 2(g)에 나타내는 바와 같이, 여과재(3)를 여과 장치로부터 떼어내면, 도 2(h)에 나타내는 바와 같이, 그대로 혹은 여과재(3)와 복합체(15)를 분리하고 복합체(15)만을 다음 핵산 증폭 공정으로 배출한다.

(실시형태 2)

도 3은 본 발명의 실시형태 2에 있어서의 전처리 방법의 각 공정도이다. 실시형태 2는 실시형태 1을 변형한 것으로, 흡착 공정과 세정 공정을 한번에 행하는 것이다.

실시형태 2는 양치질액, 타액, 눈물액 등의 처리 대상에 사용할 수 있다고 생각된다. 이들 처리 대상은 추출액으로 정제수를 사용할 수 있기 때문에, 핵산 증폭 반응을 저해하는 물질(단백질, 지질, 염, 유기용제 등)의 함유량이 비교적 적다고 생각되기 때문이다.

<추출 공정>

추출 공정(도 3(a)∼도 3(b))은 실시형태 1과 동일하다.

<흡착 공정+세정 공정>

실시형태 1과는 달리, 세정 공정에서 정제수(16)에 의한 세정은 행하지 않는다. 그 대신 용액을, 도 3(d)에 나타내는 바와 같이, 여과 장치의 깔때기부(2)에 적하하고, 여과재(3) 등에 의해 여과할 때에, 추출액(10) 자체로 세정을 행한다. 그 밖은 실시형태 1과 동일하다.

(실시형태 3)

도 4는 본 발명의 실시형태 3에 있어서의 전처리 방법의 각 공정도이다. 실시형태 3은 실시형태 1을 변형한 것으로, 추출 공정과 흡착 공정을 한번에 행하는 것이다.

즉 도 4(a')에 나타내는 바와 같이, 튜브(10)에 추출액(11)뿐만 아니라, 일정 범위를 충족시키도록 실리카 입자(14)를 미리 첨가해 둔다. 거기에, 처리 대상(12)을 첨가하고, 튜브(10) 내에서, 핵산(13)의 추출뿐만 아니라, 추출된 핵산(13)과 실리카 입자(14)를 흡착시켜, 복합체(15)를 형성한다.

그 밖의 점은 실시형태 1과 동일하다.

(실시형태 4)

도 5는 본 발명의 실시형태 4에 있어서의 전처리 방법의 각 공정도이다. 실시형태 4는 실시형태 1을 변형한 것으로, 추출 공정과 흡착 공정과 세정 공정을 한번에 행하는 것이다.

실시형태 4는 흡착 공정과 세정 공정을 한번에 행하는 점에서 실시형태 2와 동일하므로, 양치질액, 타액, 눈물액 등의 처리 대상에 사용할 수 있다고 생각된다. 이들 처리 대상은 추출액으로 정제수를 사용할 수 있기 때문에, 핵산 증폭 반응을 저해하는 물질(단백질, 지방질, 염, 유기용제 등)의 함유량이 비교적 적다고 생각되기 때문이다.

우선, 도 5(a')에 있어서, 튜브(10)에 추출액(11)뿐만 아니라, 일정 범위를 충족시키도록 실리카 입자(14)를 미리 첨가해 둔다. 거기에, 처리 대상(12)을 첨가하고, 튜브(10) 내에 있어서, 핵산(13)의 추출뿐만 아니라, 추출된 핵산(13)과 실리카 입자(14)를 흡착시켜, 복합체(15)를 형성한다.

또한, 실시형태 1과는 달리, 세정 공정에 있어서 정제수(16)에 의한 세정은 행하지 않는다. 그 대신, 용액을, 도 5(d)에 나타내는 바와 같이, 여과 장치의 깔때기부(2)에 적하하고, 여과재(3) 등에 의해 여과할 때, 추출액(10) 자체로 세정을 행한다. 그 밖은 실시형태 1과 동일하다.

(실시형태 5)

도 6은 본 발명의 실시형태 5에 있어서의 전처리 방법의 각 공정도이다. 실시형태 5는 다음과 같은 요소를 갖는 핵산 추출 키트를 사용하면 적합하게 실시할 수 있다. 즉 추출액(11)은 처리 대상(12)에 포함되는 핵산을 추출한다. 여과재(3)에는 실리카 입자(14)가 배치된다. 제1 흡수재(4)는 여과재(3)에 포개어 배치되어, 여과재(3)에 적하되는 추출액으로부터 흡수를 행한다. 여기에서, 실리카 입자(14)의 입경 및 핵산 증폭 반응액 중에 있어서의 실리카 입자(14)의 농도는 상기 일정 범위 내로 되어 있고, 이 핵산 추출 키트는 여과재(3)가 세정된 후 건조 공정 및 용출 공정을 거치지 않고 즉시 핵산 증폭 공정으로 이동할 수 있게 구성되어 있다.

<추출 공정>

우선, 도 6(a)에 나타내는 바와 같이, 추출액(11)을 넣은 튜브(10)에 처리 대상(12)을 적하 첨가한다. 소시간 정치하면, 처리 대상의 핵산을 피복하는 성분(예를 들면, 세포막이나 세포벽 등)이 추출액(11)에 의해 파괴되어, 도 6(b)에 나타내는 바와 같이, 핵산(13)과 협잡물(예를 들면, 세포막편 등)이 추출액(11)에 혼재하는 핵산 함유 용액이 된다.

<흡착 공정>

실시형태 5에서는, 실시형태 1과는 달리, 도 2(e')에 나타내는 바와 같이, 여과 장치의 여과재(14)에 실리카 입자(14)를 배치해 두는 것으로, 실리카 입자(14)를 용액에 첨가하지 않는다.

그렇지만, 튜브(10)의 핵산 함유 용액을 깔때기부(2)에 적하하면, 핵산(13)과 실리카 입자(14)가 흡착한다. 그 결과, 핵산(13)과 실리카 입자(14)의 복합체(15)가 형성된다.

그 밖은 실시형태 1과 동일하다.

(실시형태 6)

도 7은 본 발명의 실시형태 6에 있어서의 전처리 방법의 각 공정도이다. 실시형태 6은 실시형태 5를 변형한 것으로, 흡착 공정과 세정 공정을 한번에 행하는 것이다.

흡착 공정과 세정 공정을 한번에 행하는 점에 있어서 실시형태 2와 공통되기 때문에, 실시형태 6은 정제수가 사용되는 양치질액, 타액, 눈물액 등의 처리 대상에 사용할 수 있다고 생각된다. 이들 처리 대상은 추출액 중에 핵산 증폭 반응을 저해하는 물질(단백질, 지방질, 염, 유기용제 등)의 함유량이 비교적 적어, 추출액 중에서 핵산을 유리할 수 있다고 생각되기 때문이다.

그 밖은 실시형태 5와 동일하다.

2 깔때기부
3 여과재
4 제1 흡수재
5 제2 흡수재
6 조정 부재
7 하우징
10 튜브
11 추출액
12 처리 대상
13 핵산
14 실리카 입자
15 복합체
16 정제수

Claims

핵산 증폭 공정에 앞서 고상 추출법을 사용하여 핵산 추출의 전처리 방법으로서, 상기 전처리 방법은:
처리 대상과, 상기 처리 대상에 포함되는 핵산을 추출하는 추출액과, 실리카 입자와, 여과재를 접촉시키는 단계;
상기 여과재에 상기 핵산과 상기 실리카 입자의 복합체를 담지시키는 단계; 및
핵산 증폭 반응액을 사용하는 핵산 증폭 공정으로 송출하는 단계를 포함하고,
상기 실리카 입자의 입경 및 상기 핵산 증폭 반응액 중에서의 상기 실리카 입자의 농도를 일정 범위 내로 함으로써, 상기 핵산 증폭 공정에 앞서는 건조 공정 및 용출 공정을 불필요하게 하고;
상기 일정 범위는 처리 대상에 포함된 핵산의 100%에 기초하여 핵산의 5 내지 38%가 처리 대상으로부터 회수되고;
실리카 입자 농도가 0.0625∼4㎍/㎕;
실리카 입자의 평균 입경이 0.01∼100㎛;
평균 입경으로부터 구해지는 표면적이 1×10^4∼1×10^8㎛^2이며;
상기 전처리 방법은:
상기 추출액에 상기 처리 대상을 첨가하고, 상기 처리 대상에 포함되는 핵산을 추출하는 추출 공정과;
상기 추출된 핵산에 상기 실리카 입자를 접촉시켜, 상기 핵산과 상기 실리카 입자의 복합체를 얻음과 아울러 상기 복합체를 상기 여과재에 접촉시키는 흡착 공정과;
상기 복합체와 상기 여과재를 정제수로 세정하고, 습윤 상태에서 세정된 상기 복합체와 상기 여과재를 상기 핵산 증폭 공정으로 송출하는 세정 공정을
더 포함하는 것을 특징으로 하는 전처리 방법.
핵산 증폭 공정에 앞서 고상 추출법을 사용하여 핵산 추출의 전처리 방법으로서, 상기 전처리 방법은:
처리 대상과, 상기 처리 대상에 포함되는 핵산을 추출하는 추출액과, 실리카 입자와, 여과재를 접촉시키는 단계;
상기 여과재에 상기 핵산과 상기 실리카 입자의 복합체를 담지시키는 단계; 및
핵산 증폭 반응액을 사용하는 핵산 증폭 공정으로 송출하는 단계를 포함하고,
상기 실리카 입자의 입경 및 상기 핵산 증폭 반응액 중에서의 상기 실리카 입자의 농도를 일정 범위 내로 함으로써, 상기 핵산 증폭 공정에 앞서는 건조 공정 및 용출 공정을 불필요하게 하고;
상기 일정 범위는 처리 대상에 포함된 핵산의 100%에 기초하여 핵산의 5 내지 38%가 처리 대상으로부터 회수되고;
실리카 입자 농도가 0.0625∼1㎍/㎕;
실리카 입자의 평균 입경이 0.01∼10㎛;
평균 입경으로부터 구해지는 표면적이 1×10^5∼5×10^7㎛^2이며;
상기 전처리 방법은:
상기 추출액에 상기 처리 대상을 첨가하고, 상기 처리 대상에 포함되는 핵산을 추출하는 추출 공정과;
상기 추출된 핵산에 상기 실리카 입자를 접촉시켜, 상기 핵산과 상기 실리카 입자의 복합체를 얻음과 아울러 상기 복합체를 상기 여과재에 접촉시키는 흡착 공정과;
상기 복합체와 상기 여과재를 정제수로 세정하고, 습윤 상태에서 세정된 상기 복합체와 상기 여과재를 상기 핵산 증폭 공정으로 송출하는 세정 공정을
더 포함하는 것을 특징으로 하는 전처리 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 여과재를 상기 핵산 증폭 공정으로 송출하기에 앞서, 상기 여과재와 상기 복합체를 분리하고, 상기 분리된 복합체를 상기 핵산 증폭 공정으로 송출하는 것을 특징으로 하는 전처리 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 흡착 공정과 상기 세정 공정을 한번에 행하는 것을 특징으로 하는 전처리 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 추출 공정과 상기 흡착 공정을 한번에 행하는 것을 특징으로 하는 전처리 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 추출 공정과 상기 흡착 공정과 상기 세정 공정을 한번에 행하는 것을 특징으로 하는 전처리 방법.
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