TWI694146B - 前處理方法及用於其之核酸萃取套組 - Google Patents
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Abstract
本發明之課題在於提供一種可將基因檢查之前處理POCT化之方法。在解決手段上,本前處理方法是使處理對象、用以萃取含在處理對象中之核酸的萃取液、二氧化矽粒子與過濾材接觸,讓核酸與二氧化矽粒子之複合物載持於過濾材,並送到使用核酸放大反應液之核酸放大步驟,並且,藉由將二氧化矽粒子之粒徑及核酸放大反應液中二氧化矽粒子之濃度設在一定範圍內,在核酸放大步驟之前便不需要乾燥步驟及溶出步驟。一定範圍是二氧化矽粒子濃度為0.0625~4μg/μl、平均粒徑為0.01~100μm且自平均粒徑求得之表面積為1×10^4~1×10^8μm^2。
Description
本發明係有關於在核酸放大步驟之前使用固相萃取法萃取核酸之前處理方法。此外,核酸放大步驟是用於檢測或鑑定目標核酸的鹼基序列。更詳細的說,本發明不需特別的理化學機器就能實現POCT化。
所謂POCT,是Point of Care Testing之略稱,是在受檢者旁邊或受檢者自行進行之檢查。藉此可縮短檢查時間,且當場受檢者自己就能確認結果。日本臨床檢查自動化學會在POCT指南中,將POCT定義為「有助於迅速且適切之診療/看護、疾病之預防並提升健康管理等醫療之品質、QOL(Quality of life)及滿足度的檢查」。
近年來,生命科學領域之發展顯著,且DNA及RNA等核酸之分析技術是廣為利用。
核酸之分析技術在生物學領域(生物種之鑑定或起源之研究等)、醫療領域(疾病之診斷等)及與日常生活相近之領域(糧食之安全性的確認等)中是廣為利用。
在醫療領域之疾病診斷,特別是在早期感染症之迅速診斷中,使用核酸分析技術中的PCR法或等溫核酸放大法等放大並分析目標核酸(例如,不存在於自己之特徵性的外來基因之基因序列或其他之特定序列等)之技術(以下稱為「基因檢查」。),與以往之感染症診斷技術之培養檢查或免疫檢查(使用有抗原或抗體等之檢查)等相比,是高敏感度的。
若使用基因檢查,將可幾乎檢測或鑑定出成為在人類引起感染症之原因的細菌、真菌、原蟲及病毒等原因微生物。
因此,基因檢查可認為是在感染症之早期診斷上有用之檢查方法,且在醫學中心等具有檢查室之大醫院、衛生研究所、大學或企業等研究設施、其他人員充實之設施等,具有專用之檢查室或實驗室的設施中是常為使用。
股份有限公司富士經濟在「2012臨床檢查市場No.3細菌、基因、POC、病理檢查」中指出,「預測基因檢查市場在2013年度以後亦會有年率2~3%左右之擴大推移。」,可認為基因檢查市場不僅在感染症早期診斷之觀點,從經濟活動之觀點來看,其重要度亦是增加的。
在一般人看診機會多之醫療設施,例如,鄉鎮之個人醫院或診所等之中,幾乎沒有利用基因檢查。
其理由如下。第1,基因檢查在其實施前需要進行如調製試劑或操作核酸萃取之類煩雜的手續,設施的負
擔大。
第2,進行基因檢查需要用來萃取核酸之離心機或微量吸管(micropipette)等之理化學機器或自動化機器,初期投資費及維持管理費貴。
第3,設施內之醫師或護士等不可說是充分熟練基因檢查。
另一方面,支援POCT之檢查套組且與基因檢查無關係者(例如,透過標記抗體法、免疫比濁法、乳膠凝集法及免疫層析法等者),即便在如上述之設施亦是廣為利用。若根據厚生勞働省在平成21年12月發表之統計,流行性感冒抗原迅速檢查套組之生產實績在前一季之生產出貨數是爬升到約1300萬次測試。
以核酸做為目標之基因檢查,敏感度較免疫檢查高,且在感染症之早期迅速診斷上非常有效。
可惜的是,可用於基因檢查之POCT套組至應用其之套組,至今尚不存在。
因此,在小設施不能進行基因檢查,而是回收檢體,並委託外部設施來檢查,無法迅速獲得基因檢查結果。
若能夠開發可用於基因檢查之POCT套組及其進行之方法,則即便在小設施亦可迅速的獲得基因檢查結果,有用性極高。
現在的基因檢查法大致可分成如下之3個步驟。第1步驟(前處理)是,在採取檢體後,使在檢體中結合至蛋
白質殼或膜等的核酸露出,使用有機溶劑或固相載體等進行蛋白質等夾雜物之洗淨或分離,而僅純化出核酸。
第2步驟(目標核酸之放大)是,以分離好之核酸為模版並使用PCR反應或LAMP反應等核酸放大反應法來放大目標核酸。
第3步驟(檢測及分析)是,在放大反應中或反應後,使用已放大之目標核酸或結合於其之標誌等,進行定性或定量。
存在有自動化機器使第1步驟容易進行。
然而,第1步驟之自動化機器因高價等理由,即便現在仍不甚普及。
現實是,大多是藉由能夠比自動化機器更為便宜實施之手工方法來進行前處理。
然而,手工方法必須要熟練離心機或微量吸管等機器的使用方式或樣品的操作方式等技巧等,操作負擔對實施者而言重。
尚未知曉有可將此手工方法簡便化而可POCT化之手法或套組。
在自動化機器中所使用之代表性的固相萃取法其中之1,有Boom等人報告之方法(以下稱為「BOOM法」。)(參照非專利文獻1、專利文獻1。)。
BOOM法是以在離散劑(chaotropic agent)存在下,核酸會吸附在二氧化矽珠之現象的離散效果(非專利文獻2)為基本原理,是用來從生體試料純化核酸之固相萃
取法。
若以此方法,將可不用從固相載體溶出核酸,而可將固相載體連同核酸添加至PCR反應液(專利文獻2)中,並可簡略化溶出步驟之一部分,然而,前提是整備好檢查室等實施核酸萃取之環境。
專利文獻3記載如下。亦即,「本發明之目的是提供一種不使用有機溶劑而簡便、短時間,進一步安全且再現性佳的從生物材料萃取核糖核酸的方法,以及用於其之試劑。在核糖核酸之情況,與去氧核糖核酸相異,在使之吸附於固相載體後,即便以完全不含乙醇等有機溶劑之低鹽濃度緩衝液洗淨,仍無法容易使之從固相載體溶離,要藉由加熱才可開始促進溶離。本發明中的第2步驟是,將藉第1吸附步驟吸附了核糖核酸之固相載體,以去除離散物質等為目的,利用由低鹽濃度緩衝液構成之洗淨液來洗淨之步驟。在此所稱由低鹽濃度緩衝液構成之洗淨液是指完全不含乙醇等有機溶劑及離散物質之緩衝液,緩衝液宜為Tris系緩衝液,然不特別限定。又,所謂低鹽濃度是指即便該緩衝液殘留在第3溶出步驟之情況下,亦不影響RT-PCR反應等酵素反應之程度的鹽濃度,且亦包含單純之水。在本發明中,宜為100mM以下之緩衝液。又,該溶液亦可含有界面活性劑,且pH並無特別限定。又,在本發明需要藉由加熱來促進溶出。加熱溫度若為不對核糖核酸有不好影響之程度則無特別限定,然宜為50~70℃。加熱時間為30秒~10分鐘左右。依此溶出之核糖核酸可不用實施
透析或乙醇沉澱法等去鹽、濃縮操作,而可直接用於使用反轉錄酵素等的酵素反應(省略一部分)。」
專利文獻4記載,「然而,本案發明人等發現,在(3)之溶出步驟中,在80℃以上以水或低鹽濃度水溶液溶出核酸,藉此可萃取DNA,進而完成本發明。」。
該等文獻記載之方法有如下之缺點,難以POCT化。亦即,第1,例如,分取或添加數μl~數百μl左右之溶液,藉由正確之定量吸管(pipette)操作以防止汙染,不得不操作危險之試劑,需要高難度且煩雜之操作。
第2,需要以含有鹽或有機溶劑之洗淨液進行複數次洗淨,並藉由乾燥來確實去除有機溶劑。進一步,還不得不邊注意過度乾燥所致核酸與吸附載體之固著來邊實施乾燥操作,需要過多的時間及勞力。
第3,需要使用離心機或微量吸管之操作,或者需要使用機器的設置場所或作業空間,增加用以整備好實施環境之初期費用。
專利文獻1:日本特許第2680462號
專利文獻2:日本專利特開平10-72485
專利文獻3:日本特許第3812696號
專利文獻4:日本專利特開2014-30364號
非專利文獻1:R Boom et al.、J.Clin.Microbiol、28(3)、495-503(1990)
非專利文獻2:B Vogelstein and D Gillespie、PNAS、76(2)、615-619(1979)
有鑑於以上背景,本發明是以提供一種可將基因檢查之前處理POCT化之方法為目的。
第1發明之前處理方法,是使處理對象、用以萃取含在處理對象中之核酸的萃取液、二氧化矽粒子與過濾材接觸,讓核酸與二氧化矽粒子之複合物載持於過濾材,並送到使用核酸放大反應液之核酸放大步驟,並且,藉由將二氧化矽粒子之粒徑及核酸放大反應液中二氧化矽粒子之濃度設在一定範圍內,在核酸放大步驟之前便不需要乾燥步驟及溶出步驟。
第2發明之前處理方法是以第1發明為基礎,並且,一定範圍是二氧化矽粒子濃度為0.0625~4μg/μl、平均粒徑為0.01~100μm且自平均粒徑求得之表面積為1×10^4~1×10^8μm^2。又,第3發明之前處理方法是以第1發明為基礎,並且,一定範圍是二氧化矽粒子濃度為0.0625~1μg/μl、平均粒徑為0.01~10μm且自平均粒徑求得之表面積為1×10^5~5×10^7μm^2。
第4發明之前處理方法是以第1發明為基礎,並且包含以下述步驟:萃取步驟,將處理對象添加至萃取液,來萃取含在處理對象中之核酸;吸附步驟,使二氧化矽粒子接觸萃取出之核酸,而獲得核酸與二氧化矽粒子之複合物同時使複合物接觸過濾材;及洗淨步驟,將過濾材
以純水洗淨,並將經洗淨之過濾材送至核酸放大步驟。又,第5發明之前處理方法是以第1發明為基礎,並且,在將過濾材送至核酸放大步驟之前,分離過濾材與複合物,再將被分離之複合物送至核酸放大步驟。
第6發明之前處理方法是以第4發明為基礎,進行一次吸附步驟與洗淨步驟。第7發明之前處理方法是以第4發明為基礎,進行一次萃取步驟與吸附步驟。又,第8發明之前處理方法是以第4發明為基礎,進行一次萃取步驟、吸附步驟與洗淨步驟。
第9發明之前處理方法是以第1發明為基礎,並且包含以下步驟:萃取步驟,將處理對象添加至萃取液,來萃取含在處理對象中之核酸;吸附步驟,使萃取出之核酸接觸載持二氧化矽粒子之過濾材,而獲得核酸與二氧化矽粒子之複合物同時使複合物載持於過濾材;及洗淨步驟,將過濾材以純水洗淨,並將經洗淨之過濾材送至核酸放大步驟。第10發明之前處理方法是以第9發明為基礎,並且,在將過濾材送至核酸放大步驟之前,分離過濾材與複合物,再將被分離之複合物送至核酸放大步驟。又,第11發明之前處理方法是以第9發明為基礎,進行一次吸附步驟與洗淨步驟。
若以本發明之方法,有如下之效果。第1,在基因檢查中之核酸萃取步驟將會變得簡單、容易、安全、迅速且便宜,並可實現POCT化。
第2,藉由組合安全且簡便容易的操作,將可實現比習知方法更大幅縮短處理時間,而且可以便宜的成本實施核酸萃取。其理由是由於洗淨步驟之洗淨液是使用純水,因此不需要準備並分開使用複數個試劑溶液所以簡單,再加上不需要有機溶劑所以安全。
第3,由於不需要有機溶劑,因此亦不需要固相載體之乾燥操作及核酸之溶出步驟。簡言之,在洗淨步驟後,可立刻移至核酸放大反應。再加上可極力減少溶液的移動次數,因此可降低核酸飛散至周邊環境或交叉汙染等風險。
發明概要
首先,在說明實施形態之前,先敘述發明要點。本案發明人等為解決前述課題,與在習知方法多見之「從用於核酸萃取之試料盡可能的回收多量核酸試料之方法」分道揚鑣,而是著眼在,確保在核酸放大反應1次測試時最低限必須之核酸量的方法,並為了解決上述課題而進行全心研究。
探討的結果,本案發明人等發現在核酸之前處理方法中,藉由下述步驟,將可實施核酸放大步驟,進而完成發明:(a)透過離散劑、鹽、酸、鹼、界面活性劑、有機溶劑、酵素、壓力式細胞破碎裝置(french press)、熱,及超音波等之通常習於此藝者可想到的方法來進行從處理對象
萃取核酸之步驟(以下稱為「萃取步驟」。),之後,(b)進行使萃取出之核酸吸附在固相載體之步驟(以下稱為「吸附步驟」。),(c)使用純水進行將吸附在固相載體之夾雜物洗淨的步驟(以下稱為「洗淨步驟」。),(d)在洗淨步驟後,立刻將核酸連同固相載體添加至核酸放大反應液。
進一步,本案發明人等發現,藉由應用此發明方法,並組合使用內包有過濾材與吸水材之過濾裝置以及固相載體,在可實施POCT之場所中亦可實施核酸萃取,而完成由以純水之洗淨與將整個載體添加至核酸放大反應中之方法構成之可以POCT實施的核酸萃取套組。
2‧‧‧漏斗部
3‧‧‧過濾材
4‧‧‧第1吸水材
5‧‧‧第2吸水材
6‧‧‧調整構件
7‧‧‧框體
10‧‧‧管
11‧‧‧萃取液
12‧‧‧處理對象
13‧‧‧核酸
14‧‧‧二氧化矽粒子
15‧‧‧複合物
16‧‧‧純水
圖1係表示本發明一定範圍之圖表。
圖2(a)-(h)係本發明實施形態1中前處理方法的各步驟圖。
圖3(a)-(e)、(g)-(h)係本發明實施形態2中前處理方法的各步驟圖。
圖4(a’)、(c)-(h)係本發明實施形態3中前處理方法的各步驟圖。
圖5(a’)、(c)-(e)、(g)、(h)係本發明實施形態4中前處理方法的各步驟圖。
圖6(a)、(b)、(e’)、(d)-(h)係本發明實施形態5中前處理方法的各步驟圖。
圖7(a)、(b)、(e’)、(d)、(e)、(g)、(h)係本發明實施形態6中前處理方法的各步驟圖。
(發明之實施形態)
以下,在顯示詳細之探討之前,先敘述本發明中的結論部分。
若依本發明,在前處理方法中,在洗淨步驟後,將可立刻實施核酸放大反應。
將吸附有核酸之固相載體與洗淨液等液體分離之方法可利用使用有離心或離心管柱之分離,進一步,可利用過濾分離等方法。當然,若使用含有磁性物之二氧化矽粒子,亦可為使用有磁力之分離。
在本發明中,固相載體為二氧化矽粒子。
若依本發明,將在前處理方法中以吸附步驟吸附之核酸與二氧化矽粒子(以下稱為「核酸+二氧化矽複合物」。)進行洗淨步驟後,可立刻使之接觸核酸放大反應試劑液,而起始核酸放大反應。
圖1是顯示本發明之一定範圍的圖表。先從結論說,存在於核酸放大反應液中之二氧化矽粒子宜在圖1之點線內的範圍。在圖1中,橫軸是核酸放大反應液中二氧化矽粒子濃度,縱軸是二氧化矽粒子之平均粒徑。
具體而言,適宜之一定範圍是二氧化矽粒子濃度為0.0625~4μg/μl、平均粒徑為0.01~100μm,且自平均粒徑求得之表面積為1×10^4~1×10^8μm^2(以圖2之點線圍住之範圍)。
更適宜之一定範圍是二氧化矽粒子濃度為
0.0625~1μg/μl、平均粒徑為0.01~10μm,且自平均粒徑求得之表面積為1×10^5~5×10^7μm^2(以圖2之實線圍住之範圍)。
本發明中的試料(處理對象)若為可能含有核酸之物質即可,例如,在診斷感染症時採取之檢體試料。
感染症之檢體試料為咽喉擦拭液、鼻腔擦拭液、泌尿器系材料(各種尿檢體)、生殖器系材料、糞便、血液等在懷疑感染症時採取之檢體。
核酸是DNA(dsDNA、ssDNA)、RNA(dsRNA、ssRNA)等習於此藝者可想到之可成為核酸放大反應之模版者,亦可包含源自原因微生物之核酸,或源自產生檢體試料之生物的內生性核酸。
進一步,不只是應用於在診斷感染症時所採取之檢體試料,亦可包含對在各式場所採樣之含有核酸之試料的應用。
可以設想,例如,應用於食品檢查(檢測食品中毒原因菌等,或重組基因)、在農場之作物的感染症檢查,及在飲水或工場等之水質檢查等。
然而,該等為例示,本發明並非僅侷限於該等。
本發明中的核酸試料是預想處理1μg以下之核酸量,對核酸放大反應液是預想帶入1ag~100ng、且宜為1pg~10ng左右之核酸量。
在本發明中,吸附步驟是,對直接透過使用了離
散劑、鹽、酸、鹼、界面活性劑、有機溶劑、酵素、壓力式細胞破碎裝置、熱,及超音波等之核酸的萃取方法而獲得之含有核酸溶液,或在稀釋或取代該溶液後,藉由在該溶液中添加二氧化矽粒子來實施。
在前處理中,吸附步驟亦可同時與萃取步驟一起實施。
在本發明中,洗淨步驟所使用之洗淨液是純水。
該純水是以各式手法來純化之水,包含通常習於此藝者可想到之在實施核酸放大反應時亦可應用於調製試劑的水。
例如,不含有機溶劑,且不含高濃度之鹽等核酸放大反應阻礙物質的水(以下稱為「純水」)。
在本發明中,洗淨步驟是在吸附步驟後,實施以適量純水之洗淨。洗淨次數並無限定,可為1~數次洗淨。
洗淨步驟後,核酸+二氧化矽複合物可立刻添加到核酸放大反應試劑液。
然而,在吸附步驟中,當溶劑是使用純水時,或當將在吸附步驟後所得之核酸含有溶液使用純水來稀釋或溶液取代時,可省略洗淨步驟。
在本發明中,過濾分離之過濾材,在膜過濾器等通常習於此藝者會選擇者之內,若為核酸之吸附少,且為保持可過濾前述二氧化矽粒子之孔徑者即可。
可舉例如以聚乳酸、纖維素、PTFE等做為原料之膜、膜過濾器、織布、不織布等。
形態並不限定在膜狀,若為將袋狀、筒狀者等做成可應用於過濾之形態則可。
例如,宜為Merck(日本Millipore)公司製的Omnipore(商標)膜過濾器(JCWP)等。
在本發明中,過濾分離藉由使用內包有吸水材之過濾裝置,可支援在如POCT之條件下的核酸萃取。
內包有吸水材之過濾裝置是,洗淨液等溶液之流動為單方向,並且,將已使用之溶液利用設置在內部之吸水材吸水,抑制液體飛散至外部的裝置。
本發明在實施形態及實施例中無特別說明之情況下,是依對習於此藝者而言標準的技術來實施。
例如,參考記述在Molecular Cloning A LABORATORY MANUAL FOURTH EDITION(Green and Sambrook、Cold Spring Harbor Laboratory Press)、細胞工程別冊生物實驗圖示系列(學研medical秀潤社)、或修訂第3版基因工學實驗筆記(田村隆明/編、上下巻、羊土社)等之方法來實施。
進一步,在使用市售之試劑或機器時,在無特別記述說明之情況下,是依附帶之準則進行。
下示之實施例是用以詳細說明本發明之發明一態樣之例示,而非限定發明者。
(實施例1)
<材料及方法>
(純水)
在本實施例中之純水是利用從Direct-Q(註冊商標)5UV超純水製造裝置(Merck股份有限公司)獲得之超純水。
(固相載體)
在本實施例中的固相載體是二氧化矽粒子。(表1)顯示使用之二氧化矽粒子之品名、製品編號、目錄編號等可識別製品之資訊,與製造或販賣公司之資訊。並根據附屬在目錄或製品之試驗成績書等資訊,從平均粒徑大者依序附上編號顯示。然而,(表1)僅單純例示實施例所使用之二氧化矽粒子,並非限定本發明中的二氧化矽粒子。
(核酸試料)
本實施例中的核酸試料是以源自黴漿菌肺炎病原體之Mycoplasma pneumoniae的p1基因為檢測對象。
核酸試料是藉由將源自Mycoplasma pneumoniae p1基因之片段,使用常法重組複製至pUC57質體DNA中來製作。
製作好之核酸試料使用TE緩衝液調製成3pg/μl之濃度。
調製後,核酸試料是用做為用以做成實時定量PCR時之標準曲線的標準試料等。
分取已調製之核酸試料,之後,使用TE緩衝液進一步稀釋,調製成3pg/50μl之濃度,並用做為實施核酸萃取時之出發材料。
(引子及探針)
引子是使用記載於Ieven等人之報告(The Journal of Infectious Diseases、1996;173;1445-52)的「對P1黏附素(adhesin)基因之引子組(5’-GCCACCCTCGGGGGCAGTCAG-3’及5’-GAGTCGGGATTCCCCGCGGAGG-3’)」。
探針是從前述引子組的放大產物選擇專一性的區域,並以習於此藝者通常使用之方法來製作。
探針之製作是委託日鐵住金環境股份有限公司J-BIO21中心訂製合成QProbe(註冊商標)來進行。
(其他試劑類之準備及調製)
其他試劑類之調製可利用通常市售之物並依常法來調製。
重現或重現一部分BOOM法時之細胞溶解液是使用「溶解用緩衝液L6」。
「溶解用緩衝液L6」是依據專利文獻1記載之方法來調製。
(核酸放大反應及其分析方法)
核酸放大反應是以每1管20μl之反應液量來進行實時定量PCR。
裝置是使用LightCycler(註冊商標)nano system(Roche Diagnostics股份有限公司)。
反應設定(reaction profile):初期變性程序(denaturation)是實施95℃:120秒;放大程序是實施95℃:10秒、68℃:10秒及72℃:10秒,40個循環。
熱熔解程序是選自68℃~95℃。
實時定量PCR是使用嵌入法(intercalator method)與探針法來實施。
嵌入法在色素方面是使用20×EvaGreen(註冊商標)Dye(Biotium inc.)來實施;探針法是使用QProbe(註冊商標;日鐵住金環境股份有限公司)來實施。
反應結束後,確認所得放大曲線是否為源自受測DNA之目標產物,是從熱熔解程序之結果來進行。
在實施例中,在無特別記載時,核酸放大反應是使用嵌入法來實施。
在嵌入法中,放大曲線之分析是,選擇裝置專用之分析軟體之「Automatic Quantification」,依常法從標準曲線確認PCR效率或R^2之值是否在正常範圍後,再從獲得之Ct值與定量值來進行。
另一方面,如QProbe之消光型探針法的分析,由於LightCycler nano system所付的分析法無法支援,因此是依日本特許第4724380號記載之方法,從原始數據直接進行分析,並從Ct值與定量值來進行。
用於分析之數據是使用將從複數個同條件之樣品獲得之數據加以平均後的數據。
以下針對事項1~5之細項具體說明。各事項顯示技術性課題、對應策、結果及考察。
事項1:將洗淨液變更為純水對實施之影響
事項2:添加二氧化矽粒子對核酸放大反應之影響
事項3:因二氧化矽粒子添加量之變化對核酸放大反應的影響
事項4:因二氧化矽粒子之使用量對核酸之吸附能力與核酸放大反應的影響
事項5:在吸附步驟中離散劑之影響及使用簡易過濾裝置時之實施
(事項1)
事項1是調查在BOOM法(專利文獻1所記載之準則Y(以下稱「準則Y」。))中,是否可將洗淨步驟之使用作為洗淨液之「L2」、「70%乙醇」及「丙酮」全部變更為純水,而其他條件則依據準則Y來實施。
準則Y之「出發材料」是使用調製成3pg/50μl之濃度的核酸試料。
二氧化矽粒子是使用(表1)之二氧化矽粒子編號
4,並依據專利文獻1之材料及方法所記載之「二氧化矽粗材(SC)之懸浮液」來調製。
萃取後,分取獲得之溶出液2μl,並添加至18μl之PCR試劑液,調製成總量為20μl之PCR反應液。
將調製好之PCR反應液用於實時定量PCR,獲得定量值。
將獲得之定量值乘以25,設為每1管可回收之核酸量,並求出該等之平均。
求出設出發材料所含有之核酸量3pg為100%時之百分比,並令為回收率(%)。
(表2)顯示每1管之平均回收率(%)與每10μl溶出液之回收率(%)。
在(表2)中,陽性對象是100%回收出發材料含有之3pg時之值記載作為參考。
在習知例方面,BOOM法是依據準則Y來實施。
基於獲得之定量值,與事項1相同的求出回收率(%)。在表(2)中,每1管之平均回收率(%)與每10μl溶出液之回收率(%),是與事項1之結果一起合併記載。
從(表2)可知,將洗淨液全部變更為純水時,原本在習知例為78.59%之回收率,在事項1卻為1.99%,核酸之回收率顯著減少。
亦即再一次確認到,單純將洗淨液變更為純水具有與一般溶出操作相同的意味,且連吸附在二氧化矽粒子之核酸都會洗掉。
數據雖無顯示,當出發材料是採取3pg之少量核酸時,相較於出發材料是採取μg單位時,回收率有減少之傾向。
可推測事項1中的PCR反應液最大可添加至10μl之溶出液,即便如此,可推論只能將3pg之0.40%的約12fg帶入核酸放大反應液中。
另一方面,若相同的考量習知例,則可帶入3pg之15.72%的約470fg。
由上可知,在BOOM法之準則Y中,僅單純將洗淨液變更為水,將無法獲得充分的核酸量。
(表2)中習知例的結果顯示,若可從含有3pg核酸量之出發材料回收5~15%上下,則為在1測試的核酸放大反應中可充分檢測出的量。
在本發明中,在獲得低濃度核酸溶出液之情況下,由於藉乙醇沉澱法或濃縮管柱等的濃縮操作或溶液取代等操作會增加操作之煩雜程度,因此難以選擇。
從以上結果可獲知,將BOOM法之洗淨步驟的洗淨液單純取代為純水來實施之方法,在出發材料之核酸
量少之情況或獲得低濃度核酸溶出液之情況下,是不充分的。
另一方面,若利用純水之洗淨為可能的話,可獲得各式利點。
在習知例顯示之BOOM法等,為了獲得純粹之核酸溶液,因為要去除夾雜物,或去除用於吸附之鹽,要進行複數次之以複數個洗淨液的洗淨操作,再加上進行乾燥操作等,需要進行煩雜且費工之操作。
若利用純水之洗淨為可能,將可大幅省略該等操作。再加上由於核酸+二氧化矽複合物是以濕潤狀態帶入接下來的核酸放大步驟,因此不需擔心因乾燥所致核酸對二氧化矽粒子之固著強化。進一步,由於可進行單純操作之核酸萃取,對基因檢查等的操作不熟練之實施者亦可提供容易之操作,且由於不需擔心因乾燥操作所致核酸之固著,亦可有效利用核酸吸附能力高之小二氧化矽粒子。
若可有效利用具有小粒徑之二氧化矽粒子,將可大幅減少作為固相載體之二氧化矽粒子之使用量。
(事項2)
事項2是藉由在使用了總量20μl實時定量PCR反應液之反應系統中,比較添加二氧化矽粒子(5μg/tube)與核酸試料(3pg/tube)而得之Ct值,調查添加二氧化矽粒子對核酸放大反應之影響。
為了比較對照Ct值,準備陽性對照(二氧化矽粒子(0μg/tube)、核酸試料(3pg/tube)),與陰性對照(二氧化矽
粒子(0μg/tube)、核酸試料(0pg/tube))。
在陽性對照中,為了做為Ct值之基準,從所得Ct值求出平均值,並將該值設為100%。從各二氧化矽粒子獲得之Ct值是同樣的求出平均值,並除以陽性對照之平均值、乘以100,來設為Ct值之變化比例(%)。
事項2與事項1不同,是將全部的二氧化矽粒子直接以市售之狀態(例如,讓使用粒子之粒徑範圍一致的操作或表面修飾等,不從市售狀態之二氧化矽粒子實施改質操作)使用,且以能容易分取設定好之使用量的適當濃度來調製二氧化矽粒子懸浮液並使用。
(事項3)
事項3是依據事項2,調查因各二氧化矽粒子添加量之變化對核酸放大反應之影響。
將二氧化矽粒子在每1PCR管添加10μg、20μg及40μg,調製總量20μl之實時定量PCR反應液並實施。
(表3)統整顯示事項2及事項3之結果。
針對事項2,藉由縱向比較(表3),可觀察到在同樣使用量條件下之使用各二氧化矽粒子之差異。
針對事項3,藉由橫向比較(表3)之各二氧化矽粒子,可觀察到因該二氧化矽粒子存在於實時定量PCR反應液中之量的變化對實時定量PCR反應所及之影響。
在(表3)中,記為「n/a」是顯示無數據;記為「※1」是顯示每1μl實時定量PCR反應液之二氧化矽粒子量(μg)。
事項2之結果(5μg/tube)顯示,即便二氧化矽粒子在每1μl實時定量PCR反應液僅含有0.25μg,亦會對實時定量PCR反應有很大的影響(Ct值之變化超過10%)。
已使用者當中,有Ct值之變化比例抑制在2%以下者,此等亦可評價為幾乎在Ct值之差異範圍內。參考該
結果,進入事項3。
事項3是接受事項2之結果,使二氧化矽使用量增加來比較。
事項3之結果顯示,越是核酸吸附能力高之平均粒徑小的二氧化矽粒子,在增加使用量之同時,Ct值之變化比例會有變大的傾向,而平均粒徑大之粒子則有沒觀察到什麼變化之傾向。
事項1習知例二氧化矽粒子之使用量,在重現BOOM法準則Y之「二氧化矽粗材(SC)之懸浮液」之情況,是約30~50%之二氧化矽粒子懸浮液。因此可推測,在實施萃取時,存在於1管之二氧化矽粒子量在約12~20mg左右。
考慮到使用之二氧化矽粒子的差異,可推知為重現BOOM法最少需要1mg左右之二氧化矽粒。
在專利文獻2,將核酸為吸附狀態之固相載體做成懸浮液之後,直接添加2/5量並實施PCR反應。
此時,存在於PCR反應液中之二氧化矽粒子,在BOOM法中至少有200μg左右的二氧化矽粒子存在於50μl之PCR反應液(4.00μg/μl)中。
然而,在事項2及事項3,至多有40μg的二氧化矽粒子存在於20μl之實時定量PCR反應液(2.00μg/μl)中。
從事項2及事項3之結果可認為,在BOOM法中,當使用之固相載體全部帶入接下來的操作時,由於二氧化矽粒子之使用量多,因而會有強烈阻礙核酸放大反應
之可能性。
BOOM法由於固相載體量多,要溶出核酸,若不溶出則要分取一部分載體而需要調製使用量等,對操作含有1μg以下核酸量之出發材料可說是有些沒效率的方法。又,由於需要分取之操作而為煩雜,因此對核酸萃取等核酸操作不熟練之實施者來說,要求高難度之操作。
BOOM法在如感染症之迅速診斷等的檢體中含有核酸量在1ag~500ng左右之情形,或要求簡便且迅速之操作的情況,或者要求單純且易懂之操作的情況下,可認為是難以利用的。
從事項2、3之結果可推論,核酸之萃取若可在調整二氧化矽粒子量並確保必要之核酸量之同時,進一步限定在不阻礙核酸放大反應或幾乎不阻礙之使用範圍,將可僅以單純且容易之操作來迅速實施。
(事項4)
事項4是調查例示之二氧化矽粒子實際上是否可用於前處理。直到洗淨步驟是依據事項1來實施。
調整二氧化矽懸浮液使在40μl之純水中含有1.25μg、2.5μg、5μg、10μg、20μg、40μg及80μg之二氧化矽粒子。
在洗淨步驟後,立刻以5μl純水懸浮核酸+二氧化矽複合物,獲得核酸+二氧化矽複合物之懸浮液。
將核酸+二氧化矽複合物懸浮液之總量添加至15μl之實時定量PCR反應試劑,進行實時定量PCR反應。
反應結束後,將各使用量條件下各二氧化矽粒子之定量值求出平均。
將求得之平均定量值,求出相對於令從出發材料直接獲得之定量值平均為100%時之百分比,並設為回收率。
回收率是將5%以上作為評價對象來評價,並與評價基準一起統整在(表4)。
在(表4)中,記為「n/a」是表示無數據,記為「※1」是表示每1μl實時定量PCR反應液之二氧化矽粒子量(μg/μl)。記為「※2」是表示二氧化矽粒子之平均粒徑,且為依據購入製品所附屬之檢查成績書者,或者在無附屬檢查成績書時,則記載公開在目錄或網路首頁等的平均粒徑。
事項4中的回收率是用以綜合評價在進行使用有
純水之洗淨步驟的前處理方法中二氧化矽粒子之性質;並表現出從前處理步驟至放大反應步驟時二氧化矽粒子所及之影響。
例如,分別表示前處理中在吸附步驟下二氧化矽粒子之核酸吸附能力以及在洗淨步驟下暴露於純水時之核酸保持能力等。
是綜合評價在核酸放大反應中,實時定量PCR反應之阻礙率,及在實時定量PCR反應中螢光檢測之阻礙率等。
回收率在顯示於(表4)之「+」數越多則越良好。
10%以上之結果(「++、+++」)可在以下範圍觀察到:在1.25~2.5μg/管之條件下,粒徑在0.3μm附近至其以下之粒徑範圍;在5μg/管之條件下,粒徑在0.01~3μm之範圍;在10~20μg/管之條件下,粒徑在1~5.3μm之範圍;在40μg/管之條件下,粒徑在1.9μm附近之範圍。
另一方面,在80μg/管之條件下,在實施條件之範圍並未觀察到顯示良好結果者。
在事項4,從固相載體之二氧化矽粒子的使用量與粒徑之關係,顯示出結果有時會有很大差異。
亦即,藉由調製二氧化矽粒子之使用量並使用,即便使用純水做為洗淨液,進一步,將使用之核酸+二氧化矽複合物全部添加至核酸放大反應試劑中,可充分確保在1個核酸放大反應測試中必要的核酸量,甚至更暗示,不會有阻礙核酸放大反應等之影響。
在事項4中,顯示良好結果之粒徑大多是在BOOM法等大多方法中為特別合適條件之具有1~10μm之粒徑者。
此外,BOOM法等習知法(例如,專利文獻1~4)雖記載可使用0.05μm~500μm之範圍的二氧化矽粒子,然專利文獻1有記載「實際上,儘管二氧化矽粒子之NA含量是粒子越小則為越高,然而,特別是在NA含量高之出發材料的情況下,及NA分子比較長之情況下,若使用過小之二氧化矽粒子,則形成之NA-二氧化矽複合物將無法進行更有效的再分散。換言之,無法從複合物以純粹的型態回收結合之NA。」(「NA」意指核酸),而可認為要避免使用小粒徑。再加上在調製「二氧化矽粗材(SC)之懸浮液」時,亦進行盡可能排除1μm以下粒子之操作。
然而,在事項4可知,平均粒徑是在1μm以下之二氧化矽粒子時,亦可獲得良好之結果。
本發明人等藉由對事項2、3及4重複進行使用嵌入法之重現實驗及以使用了QProbe之探針法進行的重現實驗,調查出Ct值之變化比例少且對實時定量PCR反應之影響少又可獲得高回收率並顯示出良好結果的二氧化矽粒子之粒徑與使用量之關係。
其結果,如圖1所示,本案發明人等成功特定出不僅不影響核酸放大步驟,且可確保充分核酸量之二氧化矽粒子的使用範圍(一定範圍)。。
儘管會重複,然適宜之一定範圍,如以圖1之點
線所示,是二氧化矽粒子濃度在0.0625~4μg/μl、平均粒徑在0.01~100μm,且從平均粒徑求出之表面積在1×10^4~1×10^8μm^2。
更適宜之一定範圍,如以圖1之實線所示,是二氧化矽粒子濃度在0.0625~1μg/μl、平均粒徑在0.01~10μm,且從平均粒徑求出之表面積在1×10^5~5×10^7μm^2。
獲得以上結果之本案發明人等建立了如下假說:不僅只離散效果所致核酸與二氧化矽粒子之吸附現象,二氧化矽粒子之構造所造成之靜電作用力或分子間作用力等其他現象亦有發揮效用。
本案發明人等為了確認該假說之真偽,調查在一律不含離散劑等的鹽、其他提高靜電作用力之鹽,或有機溶劑等時,是否可有效實施萃取。
本案發明人等獲得了即便一律不使用離散劑等的鹽、其他提高靜電作用力之鹽,或有機溶劑等亦可有效實施萃取的結果。但是,若相較於使用離散鹽之情況,回收率有些許下降,然仍獲得可充分實用之結果。進一步得知,若併用過濾分離,則萃取會變得更有效。
(事項5)
事項5是調查在吸附步驟中離散劑之影響,並探討使用如圖2(e)所示之簡易過濾裝置是否可實際POCT化。
如圖2(e)所示,該過濾裝置具備為矩形箱狀之框體7與固著在框體7上部中央之漏斗部2,在框體7之內部具備有由過濾材3、第1吸水材4、第2吸水材5及調整構件6構
成之層構造體。
筐體7可使用如市售之塑膠製箱之類的容易加工的構件。在本例,筐體7是使用股份有限公司良品計畫製的PP小型皂盒(商品編號47697681、約64mm×52mm×20mm),當然,此僅單純為例示,即便進行各式變更仍包含在本發明之保護範圍。
漏斗部2是用以滴下含有處理對象之液體,且用來無浪費的引導至過濾材3之構件,若容易滴下則亦可省略。漏斗部2亦可轉用,例如微量吸管之滴管(tip),或在檢查藥等時多見形狀之噴嘴部(nozzle)等。
在本例,在框體7上面開設5mm左右之孔,將漏斗部2之下端部旋進該孔,藉此將漏斗部2固著於框體7。
本例之層構造體是由接下來的過濾材3、第1吸水材4、第2吸水材5及調整構件6構成。
過濾材3,在本例是使用將Merck(日本Millipore)公司製的Omnipore膜過濾器(JCWP)以Carlacraft公司製的單孔打洞器(one hole punch)(孔徑7mm)打下之圓形膜片。過濾材3之直徑在5~7mm左右,過濾材3之孔徑在1~10μm左右為適當。
必須設置過濾材3使其充分密著到溶液1不會從漏斗部2之下端部等漏出的程度。
第1吸水材4,在本例是將Advantech公司製的生產用濾紙(No.60)裁斷成25.0mm×25.0mm,並在過濾材3的正下方設置1枚。
第2吸水材5是將GE Healthcare Japan股份有限公司製的Whatman玻璃纖維濾紙角形等級GF/D裁斷成25.0mm×25.0mm,並在第1吸水材4之下方設置2枚。
進一步,調整構件6是在第2吸水材5之下方,與塑膠之板重疊,然有時調整構件6亦可省略。
在事項5之吸附步驟中,將50μl之出發材料添加至於1.5ml管分取之600μl的純水中,對其添加40μl之二氧化矽粒子懸浮並立刻轉倒混和(5秒),之後,在室溫放置5分鐘,並再一次轉倒混和(5秒)。之後,將含有均質化之核酸與二氧化矽粒子的溶液,全量滴入圖2(e)所示之過濾裝置的漏斗部2,進行過濾分離(1~2分左右)。過濾分離後,獲得核酸+二氧化矽複合物。事項5使用之二氧化矽粒子懸浮液是將(表1)所示之二氧化矽粒子編號6添加至純水,並調製成1.75μg/μl之濃度來準備。
洗淨步驟是將獲得之核酸+二氧化矽複合物添加至600μl之純水來進行。
洗淨步驟後,核酸+二氧化矽複合物是連同過濾材全部以鑷子來回收,並立刻添加於68μl實時定量PCR反應試劑(設核酸+二氧化矽複合物與過濾材之體積為約2μl分,調製在總量為70μl之實時定量PCR反應液),並用於核酸放大反應。
相同的,陽性對照是將出發材料變更成50μl純水並進行事項5,並將萃取後獲得之二氧化矽粒子與過濾材添加至核酸放大反應試劑中,進一步,直接添加3pg核酸試
料,調製總量70μl之實時定量PCR反應液。
陰性對照是將從事項5排除二氧化矽粒子之實施設為陰性對照1(無固相載體)、從陽性對照排除核酸試料之施實設為陰性對照2(無核酸試料)。
該等結果是與事項4相同的求出回收率,而求出之回收率及其平均顯示在(表5)。
事項5中的回收率為平均26%,結果是比本案發明人等予想之回收率還要高。
該結果為,在市售之保持有二氧化矽基質之前處理用迷你管柱(mini column)中溶出操作後,認為仍會殘留5-10%之核酸量(參照Molecular Cloning A LABORATORY MANUAL FOURTH EDITION(Green and Sambrook、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York)、Vol.1、p4),相較於
此,殘留且未溶出之核酸量(在本發明為回收率)為2倍以上之高數值。
陰性對照1顯示,残留且未溶出之核酸量(在本發明為回收率)回收率低至平均1.28%,若不存在二氧化矽粒子,則難以獲得充分的核酸量做為核酸放大反應模板。
從該等結果可知,由於本方法即便將核酸暴露在具有使之從固相載體溶出之作用的純水等溶液中,仍難以融出核酸,因此可保持充分的核酸量。
顯示出在1個測試的核酸放大反應液中,本方法可將保持之核酸做成可用於核酸放大反應之形態。
由於本方法不需要仰賴離散效果之吸附步驟,因此可配合檢體試料之狀態選擇多樣的前處理方法。
在BOOM法準則Y,即便在僅處理1個樣品之情況下,最少亦要花30分左右的時間,在本方法可縮短至約17分左右。
從以上結果可顯知,相較於習知法,本方法為簡單、容易、安全、迅速且便宜的前處理方法,並且可將基因檢查之前處理POCT化。
若使用本發明之過濾裝置,可幾乎不使用以往認為必要之理化學機器(例如,在乾燥操作時使用之,例如,加熱器(Heat block)等的裝置,或者離心裝置或微量吸管等的基本理化學機器)來實施,且可排除因機器之有無所致之實施環境的限制。
以往認為必要之理化學機器高價者多,備齊機器
等的初期投資費,相較於免疫檢查之POCT套組,是大得多。
由於本發明可避免該等之使用,因此萃取核酸之實施成本可抑制得很低。
本發明藉由簡便化洗淨步驟及省略溶出步驟,將操作手續單純化,即使對不熟練核酸萃取之實施者,亦為可充分實施之程度的簡便。
基於以上之探討,當可理解在接下來敘述之各實施形態中的前處理方法是可實施的。當然,前提是要滿足以上敘述數次之一定範圍之條件。
(實施形態1)
圖2是本發明實施形態1中前處理方法的各步驟圖。實施形態1是基本形。
<萃取步驟>
首先,如圖2(a)所示,將處理對象12添加於已置入萃取液11之管10。靜置些許時間後,被覆處理對象之核酸的成分(例如,細胞膜或細胞壁等)會被萃取液11破壞,而形成如圖2(b)所示之核酸13與夾雜物(例如,細胞膜片等)混在於萃取液11之核酸含有溶液。
<吸附步驟>
接著,如圖2(c)所示,添加二氧化矽粒子14至管10之核酸含有溶液中,使核酸13與二氧化矽粒子14吸附。結果便是,形成核酸13與二氧化矽粒子14之複合物15。
將該溶液,如圖2(d)所示,藉由滴入過濾裝置之漏斗部2,並由過濾材3等來濾過,如圖2(e)所示,在過濾材
3上回收複合物15。
<洗淨步驟>
如圖2(f)所示,對回收在過濾材3上的複合物15滴下純水16並洗淨。然後,如圖2(g)所示,若將過濾材3從過濾裝置移除,則如圖2(h)所示,直接、或者分離過濾材3與複合物15而僅將複合物15,送到接下來的核酸放大步驟。
(實施形態2)
圖3是本發明實施形態2中前處理方法的各步驟圖。實施形態2是實施形態1之變形者,且為進行一次吸附步驟與洗淨步驟者。
實施形態2是認為可使用在漱口液、唾液、淚液等的處理對象。可認為這是因為,由於該等處理對象在萃取液可使用純水,因此阻礙核酸放大反應之物質(蛋白質、脂質、鹽、有機溶劑等)的含量較少。
<萃取步驟>
萃取步驟(圖3(a)~圖3(b))與實施形態1相同。
<吸附步驟+洗淨步驟>
與實施形態1相異,在洗淨步驟中不進行利用純水16之洗淨。取而代之,是將溶液,如圖3(d)所示,藉由滴入過濾裝置之漏斗部2,並於過濾材3等來過濾時,自行進行萃取液10之洗淨。其他則與實施形態1相同。
(實施形態3)
圖4是本發明實施形態3中前處理方法的各步驟圖。實施形態3是實施形態1之變形者,且為進行一次萃取步驟與
吸附步驟者。
亦即,如圖4(a’)所示,管10不僅有萃取液11,並以滿足一定範圍來預先添加二氧化矽粒子14。在此,添加處理對象12,在管10內不僅萃取核酸13,且會使經萃取之核酸13與二氧化矽粒子14吸附,形成複合物15。
其他點與實施形態1相同。
(實施形態4)
圖5是本發明實施形態4中前處理方法的各步驟圖。實施形態4是實施形態1之變形者,且為進行一次萃取步驟、吸附步驟與洗淨步驟者。
由於實施形態4在進行一次吸附步驟與洗淨步驟這點與實施形態2相同,因此認為可使用在漱口液、唾液、淚液等的處理對象。可認為這是因為,由於該等處理對象在萃取液可使用純水,因此阻礙核酸放大反應之物質(蛋白質、脂質、鹽、有機溶劑等)的含量較少。
首先,在圖5(a’)中,管10不僅有萃取液11,並以滿足一定範圍來預先添加二氧化矽粒子14。在此,添加處理對象12,在管10內不僅萃取核酸13,且會使經萃取之核酸13與二氧化矽粒子14吸附,形成複合物15。
進一步,與實施形態1相異,在洗淨步驟中不進行利用純水16之洗淨。而是改為將溶液如圖5(d)所示滴入過濾裝置之漏斗部2,在藉由過濾材3等來過濾時,由萃取液10本身進行洗淨。其他則與實施形態1相同。
(實施形態5)
圖6是本發明實施形態5中前處理方法的各步驟圖。實施形態5若使用具有如下要素之核酸萃取套組則可適宜實施。亦即,萃取液11是用以萃取含在處理對象12中之核酸。在過濾材3配置二氧化矽粒子14。第1吸水材4是重疊配置於過濾材3,並且是從滴下過濾材3之萃取液進行吸水。在此,二氧化矽粒子14之粒徑及核酸放大反應液中二氧化矽粒子14之濃度是設在上述一定範圍內,該核酸萃取套組是構成使過濾材3在洗淨後可不經由乾燥步驟及溶出步驟而立刻移動至核酸放大步驟。
<萃取步驟>
首先,如圖6(a)所示,將處理對象12滴下添加於已置入萃取液11之管10。靜置些許時間後,被覆處理對象之核酸的成分(例如,細胞膜或細胞壁等)會被萃取液11破壞,而形成如圖6(b)所示之核酸13與夾雜物(例如,細胞膜片等)混在於萃取液11之核酸含有溶液。
<吸附步驟>
在實施形態5與實施形態1相異,如圖2(e’)所示,是先在濾過裝置之過濾材14配置二氧化矽粒子14,而不將二氧化矽粒子14添加至溶液。
然而,若管10之核酸含有溶液滴入漏斗部2,則會吸附核酸13與二氧化矽粒子14。結果便是,會形成核酸13與二氧化矽粒子14之複合物15。
其他則與實施形態1相同。
(實施形態6)
圖7是本發明實施形態6中前處理方法的各步驟圖。實施形態6是實施形態5之變形者,且為進行一次吸附步驟與洗淨步驟者。
由於在進行一次吸附步驟與洗淨步驟這一點上與實施形態2共通,因此認為實施形態6可用在有使用純水之漱口液、唾液、淚液等的處理對象。可認為這是因為,該等處理對象在萃取液中阻礙核酸放大反應之物質(蛋白質、脂質、鹽、有機溶劑等)的含量較少,且核酸可在萃取液中遊離。
其他則與實施形態5相同。
圖1係表示本發明一定範圍之圖表。
圖2(a)-(h)係本發明實施形態1中前處理方法的各步驟圖。
圖3(a)-(e)、(g)-(h)係本發明實施形態2中前處理方法的各步驟圖。
圖4(a’)、(c)-(h)係本發明實施形態3中前處理方法的各步驟圖。
圖5(a’)、(c)-(e)、(g)、(h)係本發明實施形態4中前處理方法的各步驟圖。
圖6(a)、(b)、(e’)、(d)-(h)係本發明實施形態5中前處理方法的各步驟圖。
圖7(a)、(b)、(e’)、(d)、(e)、(g)、(h)係本發明實施形態6中前處理方法的各步驟圖。
Claims (11)
- 一種前處理方法,其特徵在於使處理對象、用以萃取含在前述處理對象中之核酸的萃取液、二氧化矽粒子與過濾材接觸,讓前述核酸與前述二氧化矽粒子之複合物載持於前述過濾材,並送到使用核酸放大反應液之核酸放大步驟;並且,藉由將前述二氧化矽粒子之粒徑及前述核酸放大反應液中前述二氧化矽粒子之濃度設在一定範圍內,在前述核酸放大步驟之前便不需要乾燥步驟及溶出步驟;前述一定範圍是二氧化矽粒子濃度為0.0625~4μg/μl、平均粒徑為0.01~100μm且自平均粒徑求得之表面積為1×104~1×108μm2。
- 如請求項1之前處理方法,其中前述一定範圍是二氧化矽粒子濃度為0.0625~1μg/μl、平均粒徑為0.01~10μm且自平均粒徑求得之表面積為1×105~5×107μm2。
- 如請求項1之前處理方法,其包含下述步驟:萃取步驟,將前述處理對象添加至前述萃取液,來萃取含在前述處理對象中之核酸;吸附步驟,使前述二氧化矽粒子接觸前述萃取出之核酸,而獲得前述核酸與前述二氧化矽粒子之複合物同時使前述複合物接觸前述過濾材;及洗淨步驟,將前述複合物與前述過濾材以純水洗 淨,並將經洗淨之前述複合物與前述過濾材送至前述核酸放大步驟。
- 如請求項3之前處理方法,其在將前述過濾材送至前述核酸放大步驟之前,分離前述過濾材與前述複合物,再將前述被分離之複合物送至前述核酸放大步驟。
- 如請求項3或4之前處理方法,其進行一次前述吸附步驟與前述洗淨步驟。
- 如請求項3或4之前處理方法,其進行一次前述萃取步驟與前述吸附步驟。
- 如請求項3或4之前處理方法,其進行一次前述萃取步驟、前述吸附步驟與前述洗淨步驟。
- 如請求項1之前處理方法,其包含下述步驟:萃取步驟,將前述處理對象添加至前述萃取液,來萃取含在前述處理對象中之核酸;吸附步驟,使前述萃取出之核酸接觸載持前述二氧化矽粒子之過濾材,而獲得前述核酸與前述二氧化矽粒子之複合物同時使前述複合物載持於前述過濾材;及洗淨步驟,將前述複合物與前述過濾材以純水洗淨,並將經洗淨之前述複合物與前述過濾材送至前述核酸放大步驟。
- 如請求項8之前處理方法,其在將前述過濾材送至前述核酸放大步驟之前,分離前述過濾材與前述複合物,再將前述被分離之複合物送至前述核酸放大步驟。
- 如請求項8或9之前處理方法,其進行一次前述吸附步驟 與前述洗淨步驟。
- 一種核酸萃取套組,其特徵在於具備:萃取液,其萃取含在處理對象中之核酸;過濾材,其可配置二氧化矽粒子;及吸水材,其與前述過濾材重疊配置,並從滴至前述過濾材之已萃取出前述核酸的前述萃取液進行吸水;並且,該套組構成為藉由將前述二氧化矽粒子之粒徑及核酸放大反應液中前述二氧化矽粒子之濃度設在一定範圍內,使前述過濾材在經洗淨後不需經由乾燥步驟及溶出步驟即可立刻移動至核酸放大步驟;前述一定範圍是二氧化矽粒子濃度為0.0625~4μg/μl、平均粒徑為0.01~100μm,且自平均粒徑求得之表面積為1×104~1×108μm2。
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EP0389063A2 (en) * | 1989-03-23 | 1990-09-26 | Akzo Nobel N.V. | Process for isolating nucleic acid |
JP2003230380A (ja) * | 2002-02-06 | 2003-08-19 | Toyobo Co Ltd | 核酸の精製方法および当該方法に用いる核酸抽出用溶液ならびに核酸精製用試薬キット |
US20040014070A1 (en) * | 2002-01-08 | 2004-01-22 | Judith Pinsl-Ober | Use of silica material in an amplification reaction |
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2016
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Patent Citations (3)
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