KR20230081571A - 다중 성 매개 감염병 진단용 조성물을 포함하는 가정용 랩온페이퍼 진단 칩 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 클라미디아, 임질을 포함한 다중 성 매개 감염병 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 동시다중 분자진단 방법과 랩온페이퍼 기반 진단 키트에 관한 것이다. 구체적으로, 클라미디아 균 및 임균을 각각 검출할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 조성물 및 키트를 이용하여 보다 정확도 높게 다수의 성병 원인균을 동시에 검출하고, 신속하고 저렴하게 다양한 성병을 진단할 수 있다. 또한 상기 프라이머 세트를 랩온페이퍼(Lab-on-paper) 기술을 적용하여 시료의 전처리, 등온증폭, 검출 및 분석 단계를 하나의 칩 위에서 수행함으로써 1회의 시료를 적용하여 쉽고 빠르게 다수의 성병을 동시에 진단할 수 있다.

Description

다중 성 매개 감염병 진단용 조성물을 포함하는 가정용 랩온페이퍼 진단 칩{Household lab-on-paper diagnostic chip comprising a composition for diagnosing multiple sexually transmitted diseases}
본 발명은 다중 성 매개 감염병 진단용 조성물을 포함하는 가정용 랩온페이퍼 진단 칩에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 조성물에 포함된 프라이머 세트를 이용하여 여러 가지의 성병 관련 원인균을 동시에 검출하고, 신속하고 저렴하게 다양한 성병을 동시에 진단할 수 있고, 랩온페이퍼 기반 진단 키트에 적용할 수 있다.
클라미디아 감염증(Chlamydia infection)은 클라미디아 트라코마티스라는 박테리아에 의해 사람에게 발생하는 흔한 성병이다. 감염이 된 사람들은 대부분 증상이 발현되지 않고, 증상이 발현되더라도 감염 후 몇 주가 걸린다. 남성에서는 비임균성 요도염, 여성에서는 자궁경부염의 형태로 나타난다.
여성의 경우 보균을 하고 있더라도 대부분의 경우 보균을 하고 있더라도 증상이 없기 때문에 정확히 알기 어렵고 실제로 약 70%는 무증상인 것으로 보고 된다. 여성과 마찬가지로 남성도 종종 증상이 전혀 없거나 있더라도 미약해서 본인이 전혀 모르고 있는 경우가 많다. 남녀 모두 치료하지 않으면 드물게 불임으로 이어질 수 있고, 클라미디아가 눈에 감염되는 경우, 영구적인 실명으로 이어질 수 있다. 클라미디아를 치료하기 위해서 에리스로마이신과 같이 일반적인 항생제를 사용할 수 있으나, 무증상인 상태에서 집단 감염이 가능하기 때문에 클라미디아의 보균 여부의 확인과 빠른 치료는 매우 중요하게 인식된다.
임질(Gonorrhea)은 매독과 함께 대표적인 성병 중 하나로, 임질구균(gonococcus)에 의해 전염된다. 임질의 증상은 염증, 소변시 통증 등이 일반적이나, 여성은 이로 인해 불임이 될 수도 있으며, 임균에 감염된 임산부는 출산 시 아기에게 임질성 안염을 일으킬 수 있다.
임질의 원인균인 임균(Neisseria gonorrhea)은 우리 몸 여러 곳에 침범하여 감염을 일으킬 수 있지만, 주로 요도염이나 자궁경부염 등을 일으킨다. 임균의 잠복기는 약 2~7로, 30일 후에야 증상이 생기는 경우도 있다. 임질이 있는 여성과 관계를 한 번 가졌을 경우, 남성이 임질에 걸릴 확률은 17% 정도로 알려져 있고, 40~60%는 증상이 나타나지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서 무증상인 상태에서 임균을 옮길 가능성이 많기 때문에 집단 내 임균의 전염을 막기 위해서는 조기 발견이 매우 중요하다.
한편, 보균 여부를 확인하는 수단으로서 Real-time PCR을 이용한 진단법이 가장 빠르고 민감한 진단법으로 알려져 있으며, 일반적으로 8시간 이내에 진단이 가능하다. 현재 분자진단 방법은 PCR기술과 마이크로 채널 기술의 발전과 더불어 급속히 발전하고 있으며 Alere사의 AlereTM I 나 Roche의 Cobas Influenza 와 같이 60분 내에 검출이 가능한 제품도 상용화 되어 있다. 하지만 급속분자진단이 가능한 방법론의 경우에는 고가의 분석 장비 혹은 고가의 검사비용이 요구되며 분자진단의 전 과정을 구현하기 위해서는 여러 단계를 요구하고 있으므로 아직 현장 진단에는 한계점을 가지고 있다.
현재 보편화된 분자진단법은 real-time PCR을 이용하는 것으로, 신속성 때문에 가장 보편화되어 있지만 현장진단 또는 1,2차 의료기관에서 사용하기에는 크고 고가의 장비를 요하기 때문에 쉽게 사용하는 것이 어려운 실정이다. 분자 진단을 위해서는 크게 시료의 전처리 (preparation), 핵산 증폭 반응 (reaction)과 검출 (detection)의 3단계가 요구되는데, 핵산 증폭 반응과 검출은 real-time PCR 장비에 의해 동시에 재현하는 것이 가능하지만 시료의 전처리 문제는 여전히 남아 있다.
이러한 어려움을 해결하기 위해 제안된 기술이 랩온페이퍼(Lab-on-paper)이다. 랩온페이퍼 기술은 시료의 전처리, 등온증폭, 검출, 및 분석 단계를 하나의 칩 위에서 수행하도록 하는 일체형 시스템에 기반한 기술을 의미한다. 작은 페이퍼와 페이퍼에 심은 칩 구조물로 모든 반응을 자동화하여 빠르게 수행할 수 있으므로 검출 현장 등의 장소에 구애받지 않는 장점을 갖는다.
한국특허등록공보 제10-2037411호 한국출원공개공보 제10-2021-0018150호
본 발명은 다수 성병 동시 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 다수 성병 동시 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 다수 성병 동시 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 생물학적 시료로부터 다수의 성병을 동시에 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하는 랩온페이퍼 기반의 다수 성병 동시 진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하는 랩온페이퍼 기반의 다수 성병 동시 진단 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 랩온페이퍼 기반의 진단 키트를 이용하는 다수의 성병을 동시에 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
여기서 사용되는 전문용어는 단지 특정 실시예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다. 여기서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함하는"의 의미는 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분을 구체화하며, 다른 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소, 성분 및/또는 군의 존재나 부가를 제외시키는 것은 아니다.
다르게 정의하지는 않았지만, 여기에 사용되는 기술용어 및 과학용어를 포함하는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다. 보통 사용되는 사전에 정의된 용어들은 관련기술문헌과 현재 개시된 내용에 부합하는 의미를 가지는 것으로 추가 해석되고, 정의되지 않는 한 이상적이거나 매우 공식적인 의미로 해석되지 않는다. 이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예에 의한 다중 핵산 검출용 구조물에 대하여 설명하기로 한다. 여기서 사용되는 전문용어는 단지 특정 실시예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다. 여기서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함하는"의 의미는 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분을 구체화하며, 다른 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소, 성분 및/또는 군의 존재나 부가를 제외시키는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 설명하기로 한다.
상기 과제를 해결하기 위한 하나의 구현예는 성병 관련 병원균(이하, 병원균은 세균, 진균, 바이러스 등을 포함하는 의미로 사용된다)에 특이적인 프라이머 세트를 제공한다. 상기 프라이머 세트는 한 개의 세트당 6 개의 프라이머로 구성된다.
상기 성병은, 클라미디아 트라코마티스(C. trachomatis) 및 임균(Neisseria gonorrhea)으로 이루어진 군으로부터 선택된 병원균에 의한 감염병을 의미할 수 있다.
상기 클라미디아 감염증은 성병과 안구 감염을 모두 포함하는 것일 수 있다. 상기 클라미디아 원인균을 검출하는 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.
상기 임질의 원인균은 구체적으로 네이세리아 고노래(Neisseria gonorrhea)일 수 있다. 임질은 피부 염증과 안구 감염을 모두 포함하는 것일 수 있다. 각각의 프라이머 세트는 구체적으로 네이세리아 고노래의 Por(porin protein), Opa(neisserial opacity), 및 Car 단백질(Carbamoyl-phosphate synthase large chain)에 특이적인 것으로서, 네이세리아 고노래의 Por는 서열번호 7 내지 12의 염기서열; 네이세리아 고노래의 Opa는 서열번호 13 내지 18의 염기서열; 및 네이세리아 고노래의 Car는 서열번호 19 내지 24의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 검출될 수 있다. 임질 진단용 조성물은, 진단 결과의 신뢰도를 높이기 위해 상기 세 가지의 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다.
용어 "프라이머"는 자유 3말단 수산화기(free 3'hydroxyl group)를 가지는 짧은 폴리뉴클레오티드로서, 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능할 수 있다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역방향 전사효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphospate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 프라이머 세트에서 각각의 프라이머는 표적하는 유전자에 특이적으로서, 용어 "유전자에 특이적" 또는 "상보적인"은 표적 유전자에 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 100% 염기쌍을 이룰 수 있는 것을 의미할 수 있다.
상기 프라이머 세트에서 각 프라이머는 서열번호 1 내지 24의 염기서열 중 하나의 염기서열로 이루어지거나 이를 포함하는 것일 수 있고, 각 원인균의 유전 물질에 특이적으로 결합을 유지하는 한, 서열번호 1 내지 24로 기재된 염기서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 상기 프라이머는 또한, 유전자 합성의 개시점으로서 작동하는데 기본적인 성질을 변화시키지 않는 범위에서 추가의 특징을 더 포함하도록 개조될 수 있다. 따라서, 상기 프라이머는 각 정의된 서열번호의 염기서열을 포함하면서 약 1 내지 20 bp, 1 내지 15 bp, 1 내지 10 bp, 또는 1 내지 5 bp의 추가적인 염기 서열을, 상기 프라이머의 3' 말단, 5' 말단 또는 염기서열 내부에 더 포함할 수 있고, 필요한 경우 각 말단 또는 특정 염기에 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 더 포함할 수 있다.
상기 표지의 예로는, 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드일 수 있다. 상기 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 상기 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일수 있고, 상기 방사성 동위원소는 32P일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 프라이머 세트는 등온증폭 (isothermal amplification)용으로 사용하기에 적합할 수 있다. 용어 “등온증폭(isothermal amplification)"은 하나의 온도 조건하에서 DNA를 증폭시키는 것을 의미한다. 기존의 중합효소 연쇄반응(PCR)이 변성 (Denaturation), 어닐링 (Annealing) 및 신장 (Extension) 단계가 각각 다른 온도와 조건을 요구함에 따라 특수한 PCR 장치로 수행해야 하는 것과 달리, 등온증폭 반응은 별도의 특수한 기기가 필요하지 않은 장점을 갖는다. 일반적으로 등온 증폭 방법은 특정 온도범위 내에서 1시간 내에 목표 핵산을 10^9개까지 증폭시킬 수 있으며, 상기 온도를 유지시킬 수 있는 항온 장치만 있으면 수행할 수 있다. 또한 등온 증폭 방법은 수행 시간이 짧고 결과를 육안으로 관찰할 수 있으므로 간편하게 증폭을 확인할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 등온증폭은 고리매개 등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification)일 수 있다. 용어 "고리매개 등온증폭방법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)"은 외부 프라이머, 내부 프라이머, 및 반응 속도를 향상시키기 위한 추가의 루프 프라이머를 사용하여 등온에서 수행되는 증폭 방법이다. 상기 LAMP 반응에서 사용되는 프라이머 중 외부 프라이머는 정방향 외부(forward outer, F3) 프라이머와 역방향 외부(backward outer, B3) 프라이머 2종으로 구성되고 반응의 비순환기(non-cyclic step) 동안 DNA 이중 가닥을 풀어주는 역할을 한다. 내부 프라이머는 정방향 내부 프라이머(forward inner primer, FIP)와 역방향 내부 프라이머(backward inner primer, BIP) 2종으로 구성되고 고리매개 등온증폭반응에 필수적인 고리(loop)를 만들 수 있도록 정방향 및 역방향 염기서열에 해당하는 뉴클레오티드로 구성된다. 이들 내부 프라이머는 균주의 유전물질에는 포함되지 않으나 반응의 효율성을 높이기 위하여 특정 염기, 예를 들어, 일련의 티민 염기를 더 포함하도록 설계될 수 있다. 추가 2종의 프라이머는 정방향 고리(forward loop, LoopF) 프라이머와 역방향 고리(backward loop, LoopB) 프라이머 2종으로 구성되며 내부(inner) 프라이머가 결합하지 않는 염기서열(고리 부위)에 부착하여 고리매개등온증폭 반응을 가속화시킨다. 상기 고리매개 등온 증폭 방법은 내부 프라이머가 주형에 먼저 결합하여 신장된 후, 각 DNA 나선의 바깥쪽으로 외부 프라이머가 결합되어 신장된다. 이때, 외부 프라이머의 신장으로 인해 가닥(strand) 변위가 발생하고, 그에 따라 먼저 합성된 가닥은 주형에서 떨어지는데, 떨어진 합성 가닥이 5' 말단에서부터 고리(loop) 구조를 형성하고, 이어서 3' 말단에도 동일한 과정으로 고리 구조가 형성되며, 이를 매개로 증폭 반응이 일어난다.
상기 등온증폭 반응은 50 내지 75℃, 55 내지 75℃, 60 내지 72℃, 60 내지 72℃, 또는 63 내지 68℃에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 등온증폭방법은 10분 내지 60분, 10분 내지 40분, 20분 내지 40분, 또는 25분 내지 35분 동안 수행될 수 있다. 상기 프라이머 세트를 사용하는 경우 Ct 값은 50 이하, 40 이하, 또는 30 이하일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 검출 감도가 매우 높으므로, 상기 프라이머 세트를 이용하면 25 ㎕ 반응용액을 기준으로, 100 copies 이하, 50 copies 이하, 20 copies 이하, 10 copies 이하, 5 copies 이하, 또는 1 copies 이하면서, 0.1 copies 이상, 0.01 copies 이상, 또는 0.001 copies 이상의 DNA, RNA와 같은 표적 유전자가 포함된 검체에서 각 원인균의 검출이 가능하다. 또한, 일반적인 등온증폭반응 조건에서 빠른 시간 내에 각 원인균의 검출이 가능하다. 예를 들어, 각 원인균을 검출하기 위해 표적 유전 물질에 결합하는 6개의 프라이머(Primer) 세트(F3, B3, FIP, BIP, LF, BF)와 Isothermal Amplification buffer, dNTPs, Bst 3.0 DNA polymerase 등이 포함된 LAMP 반응 조성물, 비색분석용 Phenol red, 실시간 형광물질분석용 SYBR™ Green I(Thermo Fisher Scientific, 미국) 등의 시약을 사용하고, 상기 프라이머 세트의 각 프라이머 0.2 내지 1.6 μM을 이용하여, 63 내지 68 ℃에서 25 분 내지 35 분 동안 등온증폭 반응하여 검출 결과를 확인할 수 있다. 상기 프라이머 세트에서 각 프라이머는 구체적으로, FIP 및 BIP 프라이머의 경우 각각 1.6 μM, F3 및 B3 프라이머의 경우 각각 0.2 μM, 및 FL 및 BL 프라이머의 경우 각각 0.4 μM로 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 등온증폭 반응은 등온이라는 제한된 환경에서 빠른 시간 내에 결과를 도출하여야 하므로 프라이머의 조합 및 각 성분비는 유의한 반응 결과를 얻기 위해 중요한 요소이다. 상기 프라이머 세트는 각 세트마다 다른 표지자를 결합함으로써 동시에 사용될 수 있고, 이로써 결과의 신뢰도를 더욱 높일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는, 상기 프라이머 세트를 포함하는 다수 성병 동시 진단용 조성물 또는 키트를 포함한다.
*상기 조성물 또는 키트는 등온증폭 반응을 수행하기 위한 적절한 반응물 및 시약을 더 포함할 수 있다. 이러한 반응물 및 시약은, 예를 들어 추가의 프라이머, dNTP, 및 효소 (DNA 중합효소 또는 역방향 전사효소)등을 포함할 수 있고, 반응의 효율을 위해 염화칼륨, 황산마그네슘, 황산암모늄과 같은 무기염류나 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 반응물 및 시약은 최종 반응액 기준 10 내지 20mM Tris-HCl, 1 내지 10mM (NH4)2SO4, 10 내지 50nM KCl, 0.1 내지 2mM MgSO4, 및 0.01 내지 0.1% Tween-20, 보다 구체적으로 20mM Tris-HCl, 10mM (NH4)2SO4, 50nM KCl, 2mM MgSO4, 및 0.1% Tween-20을 포함하는 pH 7 내지 9, 바람직하게는 pH 8.8의 용액일 수 있다. 상기 반응물 또는 시약은, 40 mM 내지 50 mM 수크로오스, 0.001 내지 0.01% Triton X-100, 및 0.1w/w% 내지 0.3w/w%의 글리세롤을 더 포함할 수 있다. 상기 수크로오스 대신 트레할로스를 사용할 수 있다. 수크로오스, Triton X-100, 및 글리세롤의 조합은 본 발명의 진단용 조성물 및 키트의 보관 안정성을 높여서 반응 효율을 유지하는데 도움이 된다.
일 구체예에서, 상기 진단용 조성물 또는 키트는 검출의 편의성 및 결과분석의 명확성을 높이고 반응 결과물을 육안으로 확인하기 위해 비색분석용 물질, 형광분석용 물질 또는 검출용 표지 화합물과 같은 시약을 더 포함할 수 있다. 그러한 시약은 통상적으로 알려지거나 상업적으로 구매 가능한 것을 사용할 수 있고, 예를 들어, WarmStart®LAMP Mix가 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 시약은 반응이 효율적으로 일어나도록 하기 위해, 상기 언급한 바와 같은 Tris-HCl, (NH4)2SO4, KCl, MgSO4, 및 Tween-20을 포함하는 것일 수 있고, DNA 중합효소, 역전사효소와 같이 증폭 반응을 수행하기 위한 효소를 더 포함할 수 있다. 비색 분석의 경우 SimpliampTM Thermal Cycler/QuantStudioTM 3을 이용할 수 있고, 형광 분석의 경우 CFX96TM을 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 그 외에 상기 진단용 조성물 또는 키트의 검출 결과를 확인 하는 방법으로서 전기영동(electrophoresis), 검출용 표지 사용한 방사성 측정 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 비색분석 시 통상적인 PCR 기기(Thermocycler)를 사용할 수 있고, 형광분석 시 분석에 사용하는 형광물질의 탐지가 가능한 Real-Time PCR 기기를 사용할 수 있다.
상기 진단용 조성물 또는 키트는 진단 결과를 정확하게 판독하기 위해서 음성대조물질 또는 양성대조물질을 더 포함할 수 있다. 음성대조물질로는 성병 원인균과 무관한 다른 균주의 주형 RNA 또는 DNA를 이용할 수 있고, 양성대조물질로는 성병 원인균의 감염 환자로부터 수득된 생물학적 시료 또는 상기 원인균의 유전체 일부에 해당하는 주형 RNA 또는 DNA를 이용할 수 있다. 이들 대조 물질은 필요에 따라 하나의 튜브에서 생물학적 시료와 함께 또는 개별적으로 유전자 증폭 반응에 적용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는, 상기 프라이머 세트 또는 상기 프라이머 세트를 포함하는 조성물과 생물학적 시료를 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물을 등온증폭 반응하여 유전자를 증폭하는 단계를 포함하는, 다수 성병을 동시에 진단하는 방법을 제공한다. 상기 진단 방법은 등온증폭반응 전에 역전사 하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한 상기 진단 방법은 비색분석 또는 형광분석하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 생물학적 시료는 검사 대상인 개체로부터 수득된 것으로서, 비인두 또는 구인두로부터 스왑 또는 비 세척을 통해 수득된 것, 기관지 세척 또는 흡인물, 기관 간의 흡인물 및 기관지 생검, 객담, 기관지 폐포세척액 (bronchoalveolar lavage), 침, 혈액, 소변, 대변, 땀 등을 이용할 수 있다.
상기 생물학적 시료는 증폭 반응의 효율을 높이기 위해 전처리를 가할 수 있다. 전처리는 물로 10배, 50배, 100배, 200배, 또는 400배 희석하는 것일 수 있고, protenase K를 처리 후 열처리하는 것일 수 있고, 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법과 같은 통상적으로 알려진 것을 이용하거나 상업적으로 판매하는 키트를 이용해 생물학적 시료로부터 유전자를 추출하거나 일정 수준으로 정제하는 것일 수 있다. 생물학적 시료로부터 RNA를 추출하여 사용하는 경우, 표적 유전자를 증폭하기 전에 cDNA로 역전사하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 전처리는 50mM Tris-HCl (pH8.0),150mM NaCl, 5mM EDTA, 및 1% NP-40를 포함하는 lysis buffer, Brij-35 0.1% ~ 0.5w/w%, Tris-HCl 10mM ~ 300mM (pH7.0 ~ 8.0), 및 CaCl2 1mM ~ 10mM, 구체적으로 Brij-35 0.3w/w%, Tris-HCl 100 mM(pH7.5), 및 CaCl2 5mM을 포함하는 용액으로 검체 시료를 처리하는 것을 의미할 수 있고, 구체적으로 상기 용액으로 처리한 후 통상적인 방법으로 정제하여 시료로부터 유전자만 수득하는 것을 의미할 수 있다. 상기 전처리 용액의 조합은 검체로부터 유전자가 쉽게 추출되도록 하고, 본 발명의 프라이머 세트의 등온증폭 반응 효율을 증진시킬 수 있다.
상기 진단 방법은 증폭된 유전자를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 SYBR Green I과 같은 형광 물질이나 형광표지자를 이용한 형광 측정, 페놀 레드와 같은 지시약의 색상 변화, 탁색도, 침전물 생성, DNA laddering, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트는 각 반응 시약을 담은 용기나 시험에 사용하기 위한 도구 및 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는, 상기 프라이머 세트를 포함하는 랩온페이퍼 기반의 다수 성병 동시 진단 키트를 제공한다.
또한 본 발명의 또 다른 구체예는, 상기 프라이머 세트를 포함하는 랩온페이퍼 기반의 다수 성병 동시 진단 시스템을 제공한다.
또한 본 발명의 또 다른 구체예는, 상기 랩온페이퍼 기반의 진단 키트를 이용하는 다수 성병을 동시에 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
상기 프라이머 세트를 랩온페이퍼 칩(lab-on-paper chip) 기술을 적용하면, 별도의 핵산을 정제하지 않아도 반응패드까지 이동하면서 핵산 물질이 정제되어 곧바로 증폭 반응에 적용될 수 있고, 1회의 시료를 적용하여 다수의 표적 핵산을 동시에 검출하고 관련 질병을 진단할 수 있다. 이를 실현하기 위해, 상기 랩온페이퍼 기반의 진단 키트 및 시스템은 시료패드(120), 제1연결패드(130), 반응패드(140), 가열패드(141), 차단패드(142), 제2연결패드(150), 검출패드(160), 흡수패드(170) 및 하우징 구조물(110)을 구성요소로 포함한다.
구체적으로, 생물학적 시료를 수용하는 시료패드; 상기 시료패드의 상부에 배치되고, 시료패드와 반응패드를 연결하는 제1연결패드; 상기 제1연결패드의 하부에 배치되고, 표적 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 세트와 등온증폭반응 (LAMP)을 위한 시약을 포함하고, 등온증폭반응이 일어나는 반응패드; 상기 반응패드 상부에 배치되고, 반응온도 유지 및 시료의 증발을 차단하는 차단패드; 상기 반응패드의 상부에 배치되고, 금 나노입자가 고정되어 있는 제2연결패드; 상기 제2연결패드의 하부에 배치되고, 상기 금 나노입자와 결합된 등온증폭반응물로부터 증폭된 표적 핵산을 획득하는 검출패드; 및 상기 검출패드의 측방에 배치되고, 잔류하는 시료를 흡수하는 흡수패드를 포함하고, 상기 시료패드, 반응패드, 및 제2연결패드 하부에 배치된 가열패드를 포함하는, 다수 성병 동시 진단용 구조물을 제공한다.
상기 반응패드, 제2연결패드, 및 검출패드는 하나의 세트를 구성하고, 복수 개 이다.
상기 프라이머 세트는 성병 원인균에 특이적인 것으로서, 각 세트의 반응패드는 서로 다른 프라이머 세트를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 시료패드; 제1연결패드; 반응패드; 제2연결패드; 검출패드; 및 흡수패드는 순차적으로 적어도 일부분 접촉되어 측방으로 배치된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 시료패드, 제1연결패드, 반응패드, 제2연결패드, 검출패드, 및 흡수패드는 하우징 구조물로 둘러 싸인 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 반응패드는 상부에 차단패드가 배치된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 시료패드에 적용된 시료는 흡수패드까지 측방으로 이동하는 것일 수 있다.
일 양상은, 상기 다수 성병 동시 진단용 키트 또는 시스템의 시료패드에 생물학적 시료를 적용하고, 등온증폭반응하여 표적 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는 다수의 성병을 동시에 진단하기 위한 정보제공 방법을 제공한다.
이하 각 구성요소에 대해 상세히 설명한다.
시료패드
시료패드(120)는 핵산 물질이 함유된 시료를 수용한다. 상기 시료는 인체로부터 분리된 것으로서 혈액, 혈청, 혈장, 침, 땀, 소변, 세포배양액, 조직현탁액 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 시료는 세포 용해 완충액(lysis buffer)과 혼합된 것일 수 있고, 필요에 따라 상기 세포 용해 완충액과 혼합 후, 원심분리, 여과, 침전 등 통상적으로 알려진 방법으로 추가 정제될 수 있다. 바람직하게는 상기 시료는 세포 용해 완충액과 혼합된 후 핵산 검출용 구조물 외에서 상기 시료패드에 적용하기 위해 정제하는 단계를 포함하지 않는다.
상기 세포 용해용 완충액(Lysis buffer)은 Tris(트리스(히드록시메틸)아미노메탄(tris(hydroxymethyl)aminomethane))를 5 mM 내지 80 mM, 5mM 내지 50mM, 또는 10mM 내지 50 mM로 포함하는 것일 수 있다. Tris는 구체적으로 Tris-HCl일 수 있고, 세포 용해용 완충액에서 완충제로서 급격한 pH 변동을 줄일 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액은 pH 8.0 내지 9.0일 수 있다. pH가 8.0 미만인 경우, 핵산 물질의 안정성이 감소되거나 이동 속도가 감소될 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액은 염화칼륨(KCl)을 5 mM 내지 50 mM, 5mM 내지 40mM, 또는 10mM 내지 20 mM로 포함하는 것일 수 있다. 50 mM을 초과하는 고농도의 염화칼륨은 세포 용해에 도움이 되지만, 용출된 핵산 물질의 수용해도를 감소시켜 부가 완충액을 다량 가해야 하거나 반응패드까지 이동하는데 걸리는 시간을 증가시킬 수 있다. 반면 염화칼륨이 5 mM 미만인 경우 세포가 제대로 용해되지 않을 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액은 황산마그네슘(MgSO4)을 1 mM 내지 30 mM, 1mM 내지 20mM, 또는 2mM 내지 16 mM 로 포함하는 것일 수 있다. 황산마그네슘을 적정량 포함하는 경우 핵산 물질의 안정성과 이동 속도가 증가하는 것으로 확인되었고, 점도에 영향을 미치지 않기 때문에 유체의 흐름을 방해하지 않아 페이퍼 칩 분석용으로 시료를 전처리하는데 유리하다.
상기 세포 용해용 완충액은 황산암모늄((NH4)2SO4)을 5 mM 내지 50 mM, 5mM 내지 40mM, 또는 10mM 내지 20 mM로 포함하는 것일 수 있다. 50 mM을 초과하는 고농도의 황산암모늄은 세포 용해물을 침전시킬 수 있고, 황산암모늄이 5mM 미만인 경우 pH가 불안정해질 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액은 단백질분해효소를 0.01 mg/ml 내지 0.1 mg/ml, 또는 0.03 mg/ml 내지 0.07 mg/ml을 포함하는 것일 수 있다. 단백질분해효소는 고분자 단백질을 분해하여 핵산이 이동 경로인 기판이나 페이퍼의 기공을 고분자 단백질이 차단하지 않도록 하고, RNase 및 DNase 활성을 억제하여 핵산 물질의 안정성을 증가시킨다. 상기 단백질분해효소는 프로테이나아제 K(proteinase K)일 수 있다.
상기 계면활성제는 TritonX-100 또는 Tween20 (폴리소르베이트20)일 수 있고, 세포 용해용 완충액 중량을 기준으로 0.01w/w% 내지 0.2w/w%, 바람직하게는 0.05w/w% 내지 0.1w/w%로 포함될 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액은 시료의 부피 대비 1:1로 사용되는 것일 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액은 글리세롤을 포함하지 않는 것일 수 있다. 글리세롤은 단백질의 침전을 막기 위해 첨가되기도 하나, 글리세롤은 점도를 증가시켜 세포 용해물의 유동성을 감소시키고, 핵산 물질의 이동에 방해가 될 수 있다.
상기 세포 용해용 완충액은 환원제를 포함하지 않는 것일 수 있다. 환원제는 디티오트레이톨(DTT), 머캅토에탄올 등으로서 단백질을 변성시키고 세포 용해물의 수용해도를 높이는데 도움이 되지만, 페이퍼 칩에 흘러 들어가는 용액 내 존재하는 경우 형광 발광 또는 검출 반응에 방해가 될 수 있다.
상기 시료패드의 하부에 배치되고 상기 시료패드를 가열하기 위한 가열패드(141)를 포함한다. 세포 용해용 완충액에 의한 시료의 용해를 효율적으로 하기 위해 가열패드를 60 내지 80℃의 온도에서 1 분 내지 5분 간, 바람직하게는 5 분 간 가열 처리해줌으로써 시료패드에서 바이러스, 균주 또는 세포 등의 포함하는 시료의 용해를 촉진한다.
상기 세포 용해용 조성물을 적용하면 폴리설폰 막 (예를 들어, Vivid GF) 또는 니트로셀룰로오스 막으로 이루어진 시료패드(120)에서 세포의 용해를 촉진하고, 핵산을 보다 쉽게 검출할 수 있도록 한다. 상기 폴리설폰 막 및 니트로셀룰로오스 막은 2개 이상이 적층된 구조를 이루는 것일 수 있다. 상기 폴리설폰 막은 비 대칭적인 것일 수 있고, 폴리설폰 막 및 니트로셀룰로오스 막은 0.5 ㎛ 내지 1 ㎛의 기공을 갖는 다공성 재질인 것일 수 있다. 상기 기공은 다소 큰 편인 것이 유리한데, 생물학적 시료는 점도를 갖는 것이 많고, 특히 시료에 세포 용해용 조성물을 처리하게 되면 핵산 물질과 단백질이 세포 밖으로 용출되면서 점도가 현저히 올라갈 수 있다. 따라서 시료패드의 기공 사이즈는 시료를 신속하게 흡수하기에 적절한 크기를 갖는 것이 바람직하다.
상기 세포 용해용 완충액을 이용함으로써 측방 유동식 (lateral flow)으로 핵산을 보다 쉽게 검출할 수 있다. 용어 “측방 유동식”이란 중력을 이용하지 않고, 수평 방향으로 모세관 현상이나 확산 현상에 의해 시료를 적용한 지점으로부터 목표 지점까지 흐르도록 하는 방식을 의미한다. 세포 용해물에는 핵산 물질을 분해할 수 있는 가수분해 효소들이 다량 함유되어 있으므로, 이동 경로에 오래 머무는 경우 핵산 물질의 수득량이 감소할 수 있다. 따라서 측방 유동식 핵산 검출용 구조물에 적용하려면, 흐름도가 우수해야 하고, 시료가 이동하는 동안 세포 용해물이 침전되어 이동 경로를 차단하지 않아야 한다. 또한, 핵산 물질과 염을 형성하여 침전이나 이동속도를 저하시키지 않아야 한다. 본 발명의 세포 용해용 완충액의 조성은 글리세롤 또는 환원제를 포함하지 않아도 세포 용해물이나 핵산 물질이 침전되지 않고, 높은 수율로 핵산 물질을 반응 패드까지 측방으로 이동시킬 수 있다.
* 제1연결패드
제1연결패드(130)는 시료패드와 일부분 접촉하여 시료패드의 상부에 배치되고, 시료패드에 비해 상대적으로 폭이 좁은 구조물로 시료패드와 반응패드를 연결한다.
제1연결패드는 셀룰로오스 막으로 이루어진 재질로서, 0.005 ㎛ 내지 0.015 ㎛의 기공을 갖는 것일 수 있다.
부가완충액
*부가완충액은 구조물에 수압을 가하는 역할을 한다. 시료패드(120)에 시료를 적용한 후 부가완충액을 적가할 수 있고, 반응패드에서 등온증폭반응 완료 후 반응물의 검출패드로 이동을 돕기 위해 추가로 적가될 수 있다.
부가완충액은 5 mM 내지 80 mM Tris-HCl, 20 mM 내지 70 mM 염화칼륨, 0.5 mM 내지 5 mM 황산마그네슘, 1 mM 내지 30 mM 황산암모늄, 및 0.01w/w% 내지 0.2 w/w% Tween® 20 내지 TritonX-100을 포함하고 산도가 pH 8.0 내지 9.0인 등온완충액 또는 인산 완충액 (50mM Na2HPO4, pH 7.2)일 수 있다. 상기 등온완충액은 보다 구체적으로 20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 50 mM KCl, 2 mM MgSO4, 및 0.1% Tween® 20을 포함하고, 산도는 pH 8.8일 수 있다. 상기 부가 완충액은 단백질분해효소, 글리세롤, 또는 환원제를 포함하지 않는 것일 수 있다.
반응패드
반응패드는 랩온페이퍼에서 페이퍼 칩에 해당하는 구성요소로서, 증폭반응을 위한 dNTP, DNA 중합효소, 역전사 효소, 형광 표지자, 등온증폭반응 버퍼 등을 포함한 등온증폭반응 시약이 고정되어 있다. 따라서 시료패드에 적용되는 부가 완충액에 의해 반응패드에 핵산 물질을 포함하는 용액이 스며들어 적셔지고, 상기 등온증폭반응 시약과 시료의 접촉물이 반응패드로 이동하여 반응패드 하부에서 가열패드에 의해 온도를 60 내지 70℃로 가열하면 등온증폭반응 또는 역전사 등온증폭반응이 일어난다.
상기 등온증폭반응 시약은 구체적으로 dNTP, 등온증폭버퍼, 및 역전사/DNA/RNA 중합효소 등을 포함할 수 있고, 이들은 반응패드 내에 혼합 후 건조하거나, 파우더 타입으로 반응패드 표면에 도포하여 예를 들어, 약 40℃ 오븐에서 약 30분 간 가열하여 고정시킨 것일 수 있다.
반응패드(140)는 제1연결패드와 일부분 접촉하여, 제1연결패드의 하부 및 측방으로 배치될 수 있다. 등온증폭반응이 일어날 수 있는 온도로 가열하기 위해 상기 반응패드(140) 하부에는 가열패드(141)가 배치될 수 있다. 상기 가열패드는 가열을 위한 열선 또는 열판을 포함할 수 있다. 반응패드에서 반응 온도 및 시간은 프라이머 세트의 증폭 효율에 따라 조절될 수 있다.
상기 반응패드는 등온증폭반응의 효율을 증가시키기 위해 반응패드 상부에 차단패드(142)가 배치되어 차단 역할을 할 수 있다. 일련의 배치된 패드를 라미네이트 처리된 차단패드에 의해 등온증폭반응 온도를 유지하고, 시약의 증발을 차단하여 반응의 효율을 증가시킬 수 있다. 상기 차단 패드는 비공성의 막 또는 외부 공기로부터 반응패드를 차단할 수 있는 구조물일 수 있다.
상기 프라이머 세트에서 정방향 및 역방향 프라이머들 중 어느 하나는 Cy3, Cy5, TAMRA, TEX, TYE, HEX, FAM, TET, JOE, MAX, ROX, VIC, Cy3.5, Texas Red, Cy5.5, TYE, BHQ, Iowa Black RQ, 및 IRDye로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 검출자로 표지된 것일 수 있다. 상기 검출자는 형광 분석기를 도입하는 경우 형광 표지자로 역할할 수 있고, 표적 핵산을 독립적으로 검출하기 위해 표적 핵산 마다 다르게 표지 될 수 있다.
상기 프라이머 세트에서 정방향 및 역방향 프라이머 중 나머지 어느 하나는 비오틴이 결합된 것일 수 있다. 비오틴은 스트렙타비딘(streptavidin)에 결합할 수 있으므로, 증폭된 표적 핵산에 결합된 형태로 존재하여 제2연결패드를 통과하면서, 금 입자의 표면에 스트렙타비딘과 결합하고 검출패드에서 포획되면 검출 결과가 가시화되도록 한다. 비오틴은 증폭된 표적 핵산에서 검출자와 서로 반대 위치에 존재하도록 설계될 수 있고, 예를 들어, 정방향 프라이머의 5' 말단에 검출자를 결합시킨 경우, 역방향 프라이머의 5' 말단에 비오틴을 결합시킬 수 있다.
상기 반응패드는 셀룰로오스아세테이트 막의 재질로 이루어진 것으로서, 시료 및 부가완충액의 흐름은 자유롭도록 하면서 핵산이 머물면서 충분히 등온증폭반응할 수 있도록, 0.001㎛ 내지 0.005㎛, 바람직하게는, 0.005㎛의 기공 사이즈를 갖는 것일 수 있다.
상기 반응패드는 40 mM 내지 50 mM 수크로오스, 0.001 내지 0.01% Triton X-100, 및 0.1w/w% 내지 0.3w/w%의 글리세롤을 포함할 수 있다. 상기 수크로오스 대신 트레할로스를 사용할 수 있다. 이는 수분 또는 산소에 등온증폭반응 시약 및 프라이머세트 등이 노출되었을 때, 이들의 보관 안정성을 증가시킬 수 있다. 상기 보관 안정성이란 25℃ 내지 30℃에서 분해물이나 부산물 없이 3 주 이상 보관할 수 있는 것을 의미할 수 있다.
제2연결패드
제2연결패드(150)는 반응패드와 일부분 접촉하여 반응패드의 상부 및 측방으로 배치될 수 있다. 제2연결패드(150)는 금 나노입자를 포함하고, 상기 금 나노입자는 반응패드에서 증폭된 핵산과 결합하여 검출패드로 이동된다. 금 나노입자는 바람직하게는 표면에 스트렙타비딘이 고정된 것일 수 있다. 제2연결패드는 증폭된 핵산이 쉽게 검출패드로 이동할 수 있도록, 면, 융, 종이, 니트로셀룰로오스, 유리섬유, 폴리설폰, 폴리아크릴, 폴리니트릴, 폴리피페라진, 폴리아미드, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리덴플로리드, 폴리에틸렌이민, 폴리디메틸실록산 또는 이들의 혼합물인 다공성 재질로서, 0.01㎛ 내지 0.05㎛, 바람직하게는, 0.05㎛의 기공 사이즈를 갖는 것일 수 있다.
제2연결패드는 셀룰로오스 재질을 갖는 것을 수 있고, 반응패드와 접촉하는 부분의 제2연결패드는 저융점 아가로오스 또는 왁스로 코팅된 개패구역(151)을 포함할 수 있다. 패드를 코팅하면 반응패드의 등온증폭반응물의 이동이 차단되었다가, 제2연결패드를 가열하는 시점에서 코팅이 녹아 등온증폭반응물이 측방으로 다시 이동하여 시료 내 미반응 유전물질의 소실을 막을 수 있다.
상기 제2연결패드 하부에는 가열을 위한 가열패드(141)가 배치될 수 있다. 등온증폭이 끝나는 시점에 부가 완충액을 가하면, 반응패드로부터 등온증폭된 결과물이 검출 패드로 쉽게 이동하도록 한다. 상기 가열은 60 내지 80℃로 1 분 내지 5 분간, 바람직하게는 2 분 간 수행되는 것일 수 있다.
검출패드
검출패드(160)는 제2연결패드와 일부분 접촉하여, 제2연결패드의 하부 및 측방에 배치될 수 있다. 검출패드(160)에는 검출자와 결합할 수 있는 수용체가 고정되어 있다. 상기 수용체는 검출자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 단백질, 또는 이의 절편일 수 있다.
상기 검출패드는 복수 개의 검출 구역을 포함하고, 상기 검출 구역은 선 또는 웰의 형태로 구분될 수 있다. 각 검출 구역 마다 각 수용체가 독립적으로 고정되고, 예를 들어, 폴리에틸렌프탈레이트 성분의 잉크로 스탬핑하여 검출 구역을 만든 후, 여기에 수용체를 포함하는 잉크로 다시 스탬핑 하거나 웰의 경우 수용체를 포함하는 용액을 적용하고, EDC(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide) 또는 NHS(N-hydroxysulfosuccinimide)를 적용할 수 있다. 하나의 반응패드에는 수십개 내지 수백개 이상의 검출 구역이 형성되어, 1회의 시료를 적용하여 형성된 검출 구역의 수 만큼의 표적 핵산을 검출할 수 있다. 도 6은 반응패드에 형성된 검출 구역의 구조를 상세히 설명하기 위한 것이고, 개수를 한정하는 의미는 아니다.
상기 검출패드는 니트로셀룰로오스로서, 시료가 흡수패드까지 측방으로 이동할 수 있도록, 0.001㎛ 내지 0.005㎛, 바람직하게는, 0.005㎛의 기공 사이즈를 갖는 것일 수 있다.
가열패드
상기 시료패드, 반응패드, 및 제2연결패드 하부에는 가열패드(141)가 배치될 수 있다. 상기 가열패드는 열전도성을 갖는 금속판으로서, 철, 스테인리스, 알루미늄, 은, 구리 등의 재질로 이루어진 것일 수 있다. 상기 가열패드는 열선으로 연결될 수 있고, 각 열선은 상기 시료패드, 반응패드, 및 제2연결패드 하부의 가열패드에 독립적으로 연결되어 가열이 되는 패드를 제어할 수 있다.
상기 시료패드, 제1연결패드, 반응패드, 제2연결패드, 검출패드, 및 흡수패드는 시료나 완충액이 소실되지 않도록 하단에 하우징(110)이 존재할 수 있고, 전체 구조물은 지지체 또는 비공성 재질의 케이스로 둘러싸인 것일 수 있다.
흡수패드는 상기 시료와 완충액 등을 흡수하여 역흐름을 차단하고 측방 유동성이 유발될 수 있도록 기여한다. 흡수패드는 다공성 재질로서, 면, 융, 종이, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스아세테이트, 유리섬유, 폴리설폰, 폴리아크릴, 폴리니트릴, 폴리피페라진, 폴리아미드, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리덴플로리드, 폴리에틸렌이민, 폴리디메틸실록산 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 흡수패드는 바람직하게는 유리섬유로서 0.1 내지 0.5㎛의 기공 사이즈를 갖는 것일 수 있다.
상기 시료패드; 제1연결패드; 반응패드; 제2연결패드; 검출패드; 및 흡수패드는 순차적으로 서로 일부분 접촉되어 측방으로 배치된다.
시료가 흡수패드까지 도달하는 동안 핵산 물질 외에 세포 용해물을 여과하여 핵산 물질을 정제할 수 있고, 시료의 이동 방향이 지면과 평행한 방향인 측방 유동성을 실현할 수 있다. 세포 내에서 핵산은 히스톤, 중합효소, 핵산분해효소, 전사인자 등의 단백질이 결합된 형태로 존재한다. 세포 용해 조성물과 같은 계면활성제에 의해 많은 단백질이 핵산과의 결합을 소실하게 되나, 세포 용해물이 반응패드까지 이동할 수 있도록 추가로 가해지는 증류수 또는 부가 완충액에 의해 반응패드에 도달할 쯤에는 계면활성제가 희석되어 외부 환경이 단백질의 전하를 다시 회복할 있게 된다. 이 경우 단백질은 다시 핵산 물질과 결합하여 중합효소와의 접촉 면적을 축소시키거나 증폭 반응을 방해할 수 있다. 따라서 반응패드에는 핵산과 결합할 수 있는 대부분의 세포 구성 요소가 정제되어 제거되는 것이 바람직하다.
이하, 상기 핵산 검출용 구조물을 이용하여 핵산을 검출하는 방법을 서술한다.
핵산을 검출하고자 하는 시료는 시료패드에 적용하기 전에 세포 용해 완충액과 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 세포 용해 완충액과 혼합되면 세포 내에 존재하는 핵산 물질이 용출될 수 있으므로 시료 내에 검출 가능한 핵산 물질의 양을 증가시킬 수 있다.
시료패드에 5 mM 내지 80 mM Tris-HCl, 염화칼륨 5 mM 내지 50 mM, 황산마그네슘 1 mM 내지 30 mM, 황산암모늄 5 mM 내지 50 mM, 단백질분해효소 0.01 mg/ml 내지 0.1 mg/ml, TritonX-100 또는 Tween20 0.01w/w% 내지 0.2w/w%, pH 8.0 내지 9.0인 세포 용해용 완충액과 혼합된 세포 용해물을 적가하고, 상기 시료패드를 가열하기 위한 시료패드 하방의 가열패드를 작동시킴으로서 시료의 용해를 효율성을 높인다. 상기 시료패드 하방의 가열패드를 60 내지 80℃의 온도에서 2분간 가열 처리해줌으로써 시료패드에서 균주, 바이러스, 세포 등을 포함하는 시료의 용해를 촉진한다.
또한 시료패드에 완충액을 가할 수 있다. 상기 완충액은 핵산 물질이 반응패드까지 이동할 수 있도록 하면서, 핵산 물질을 정제하는 역할을 한다. 상기 완충액은 적절한 양의 완충 성분을 함유하므로, 증류수를 첨가하는 경우 발생할 수 있는 급격한 염도나 pH 변화로 인한 단백질이나 핵산 물질의 침전 현상을 예방할 수 있다. 본 발명의 핵산 검출용 구조물의 각 패드는 핵산이 측방으로 이동하면서 정제될 수 있도록 작은 기공을 갖는 다공성 재질로 이루어진다. 따라서 단백질이나 핵산 물질이 착염이나 응집되어 기공을 막게 되면 시료의 이동속도가 감소하고 핵산 물질의 수득률이 저하될 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 클라미디아, 임균과 같은 성병 원인균을 동시에 특이적으로 검출할 수 있고, 등온증폭반응을 이용하여 신속하고 정확하게 현장 검출이 가능하다.
또한, 등온증폭반응은 증폭 반응을 수행하기 위한 특정 온도 및 조건을 맞추는데 요구되는 고가의 기기와 전문 인력을 필요로 하지 않으므로, 효율적이면서도 저렴한 비용으로 수행이 가능하기에 다수의 검사 대상자를 조기에 진단할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머 세트를 랩온페이퍼 기반의 키트에 적용하면, 시료의 전처리 (preparation), 핵산 증폭 반응 (reaction)과 검출 (detection)을 각각 별도로 수행하지 않고, 시료의 1회 적용으로 검출까지 한 번에 수행할 수 있다. 각 단계를 별도로 수행하지 않으므로, 전 과정이 단순화되어 다양한 시료나 장치를 요하지 않고, 관련 기술자가 아니어도 쉽게 수행할 수 있다.
도 1은 본 발명의 다중 핵산 검출용 구조물의 전체 구조 물의 구조도이다.
도 2는 본 발명의 다중 핵산 검출용 구조물의 전체 구조 물을 위에서 바라본 경우의 구조도이다.
도 3은 검출패드(160)에 표적 핵산이 획득되는 원리를 도식화한 것이다. 도 2A는 형광분석법에 기반한 경우이고, 도 2B는 비색분석법에 기반하는 경우의 예시이다.
도 4는 본 발명의 다중 핵산 검출용 구조물의 측면 구조도이다.
도 5는 본 발명의 다중 핵산 검출용 구조물의 사시도이다.
도 6는 검출패드(160)의 구조를 확대한 구조도이다.
도 7은 케이스로 둘러싸인 본 발명의 다중 핵산 검출용 구조물의 외관을 보여주는 예시이다.
도 8은 혈액 시료로 비색진단 하는 경우 클라미디아 균 및 임균의 검출 결과를 보여주는 예시이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
제조예 1: 프라이머 제작
고리매개 등온증폭방법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 사용하여 클라미디아 균 및 임균을 검출하기 위해 프라이머를 설계 및 제작하였다. 프라이머 세트 후보군을 얻기 위해, 클라미디아 균 및 임균의 유전 정보를 블라스트 분석을 통하여 확인하고, 그 중 가장 효율이 높을 것이라 예상되는 서열을 상위 순서대로 도출하였다. 구체적으로, 각 유형의 클라미디아 균 및 임균의 전체 염기서열은 GenBank(National Center for Biotechnology Information)에서 얻었고, 클라미디아 균 및 임균의 정제된 DNA 표준물질은 ATCC 社(American Type Culture Collection, 미국)에서 구매하였고, 각 병원균 유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머는 Eiken 웹 사이트 (http://primerexplorer.jp/e/)의 Primer Explorer V5 프로그램을 사용하여 디자인하였다. NCBI의 BLAST(basic local alignment search tool)를 사용하여 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머를 동정하였고, 설계된 모든 프라이머는 바이오닉스로부터 합성되었다. 각 병원균의 유전자 정보 출처는 클라미디아 균의 경우 NC_000117.1, 임균의 경우 GCF013030075.1 이다. 프라이머 세트 후보군으로는, 클라미디아 균의 경우 5개의 후보군을 선정하였고, 임규의 경우 임균에 특이적인 3 가지 단백질 Por(PopSet: 31616630), Opa(UniProtKB: Q04876), Car(UniProtKB: Q59599)을 각각 코딩하는 유전자에 특이적인 것으로 총 6개의 후보군을 선정하였다.
선정된 프라이머 후보군들은 모두 외부 프라이머와 내부 프라이머, 루프 프라이머를 포함하고, Loop 형성을 촉진하고 반응의 속도를 높이기 위하여 FIP 프라이머와 BIP 프라이머 내부에 4개의 티민을 포함시켰다.
시험예 1: 프라이머 세트의 선별
상기 제조예 1에서 도출된 프라이머 세트 후보들에 대해 하기의 시험을 진행하여 최종적으로 프라이머 세트를 선별하였다.
(1) 등온증폭반응
역전사 고리매개등온증폭 반응은 25 ㎕ PCR 튜브에 하기의 용액을 혼합한 반응액을 이용하여 수행되었다; 정방향(forward) 및 역방향(backward)의 외부 프라이머(Outer primer: F3 및 B3, 0.2 μM) 각각 1 ㎕, 내부 프라이머(Inner primer: FIP 및 BIP, 1.6 μM) 각각 1 ㎕, 고리 프라이머(Loop primer: LF 및 LB, 0.4 μM) 각각 1 ㎕, 2X 등온증폭반응액 12.5 ㎕, SYBR Green I(25X) 또는 Phenol red(250 μM) 1 ㎕, 정제수(DW) 3.5 ㎕, 및 정제된 DNA 표준물질 용액 2.0 ㎕로 하여 각 반응별 25 ㎕로 LAMP 반응 혼합액을 조제하였다.
2X Master Mix(등온증폭반응액)은 당사에서 조제하여 사용하였고 최종반응액 기준 20mM Tris-HCl, 10mM (NH4)2SO4, 50nM KCl, 2mM MgSO4, 및 0.1% Tween-20, pH 8.8이 된다. Bst 3.0 DNA 중합효소 및 dNTPs는 New England Biolabs(미국)에서 구입하였다. 비색분석용 시약인 Phenol red은 Sigma-Aldrich(미국), 형광염색물질인 SYBR™ Green I은 Thermo Fisher Scientific(미국)에서 구입하였다. 반응액의 조제와 반응에 첨가되는 증류수는 초순수제조장치(New-P.NIX® Power, 대한과학, 한국)를 통해 생산하여 사용하였다.
음성 대조군으로는 정제수를 사용하였고, LAMP 반응은 65℃의 온도에서 30분 동안 SimpliampTM Thermal Cycler(비색분석)/QuantStudioTM 3 및 CFX96TM(형광분석)을 사용하여 수행하였다. DNA 농도는 분광광도계(Epoch, Agilent Biotek, 미국)를 사용하여 측정하였고, 등온증폭반응에 사용된 기기는 비색분석용 SimpliampTM Thermal Cycler(Thermo Fisher Scientific, 미국)와 형광물질분석용 QuantStudioTM 3(Thermo Fisher Scientific, 미국) 및 Bio-Rad CFX96TM(BIO-RAD, 미국)을 사용하였다.
프라이머 10X 농도(STOCK) (μM) 1X 농도(FINAL) (μM)
FIP 16 1.6
BIP 16 1.6
F3 2 0.2
B3 2 0.2
FL 4 0.4
BL 4 0.4
(2) 비특이적 반응(위음성 및 위양성)의 발생 여부
음성/양성 대조군 및 서로 다른 균(예를 들어, 클라미디아의 경우 임균, 임균의 경우 매독균 등)를 위양성군으로 사용하여, 모든 검사 항목에서 비특이적 반응이 발생하지 않은 프라이머 쌍을 선정하였다. 검사에 사용된 검체의 농도는 표준물질 기준 10 copies/rxn이며, 반응 시간은 30분으로 수행하였다.
서로 다른 검체 3개를 각 3회 반복 검사한 결과에서 오진단 발생 비율이 0.3% 미만으로 확인된 프라이머 쌍을 선별하였다.
(3) 비색분석
구체적으로 시험예 1과 각 균주의 DNA 10 copies/rnx를 주형으로 사용하여 시험예 1-(1)과 같이 증폭 반응을 위한 혼합액을 준비하고, 30분, 35분, 40 분, 50 분, 및 60 분으로 구간을 나누고 등온증폭반응을 실시하였다. 반응 시간의 선정 방법은 검사 1회 기준 93/100 개의 이상의 반응에서 반응액의 색상이 붉은색에서 노란색으로 변화한 것이 구분되는 시간을 기준으로 하고, 각 프라이머별로 서로 다른 검체 3개를 각 3 회반복 검사한 결과로 재현성을 확보하였다.
(4) 형광분석
검체 농도 10 copies/rnx, 1 cycle을 1분으로 설정하여 프라이머의 반응 효율성을 확인하였다. 반응 시간의 선정 방법은 검사 1회 기준 93/100개 이상의 반응에서 형광물질 검출값 기준점(Threshold) 500 기준으로 Ct 값이 30 이하인 것으로 선별하였다.
설계된 각 프라이머별로 서로 다른 검체 3개를 각 3 회 반복 검사한 결과로 재현성을 확보하였다.
(5) 등온증폭 반응의 민감도(검출한계)
각 병원균의 정제된 DNA 표준물질을 ATCC 社(American Type Culture Collection, 미국)에서 구입하여 각 물질의 농도(Copy number)를 1,000, 100, 50, 40, 30, 25, 20, 및 10 copy/rxn으로 나누어 등온증폭반응의 검출한계를 확인하였다. 반응 시간 30분으로 검사 1회 기준 93/100개 이상의 반응을 나타낸 농도를 검출한계(Limit of detection, LOD)로 설정하였다.
설계된 각 프라이머별로 서로 다른 검체 3개를 각 3회 반복 검사한 결과로 재현성을 확보하였다.
(6) 프라이머 선별
그 결과를 정리하면 표 2, 및 4와 같고, 모든 조건을 만족시킨 선별된 프라이머 세트의 각 프라이머 염기서열은 표 3 및 5에 표시하였다.
병원균 Chlamydia trachomatis
염기 서열 쌍 실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5
반응 시간 32 Ct 28 C t 32 Ct 27 Ct 29 Ct
반응 특이성 95% 99% 99% 94% 92%
반응 민감도 25 copies/rxn 10 copies/rxn 25 copies/rxn 25 copies/rxn 10 copies/rxn
병원균 염기서열(5'-3') 비고
Ct-F3 GAACAGATGCAGCGACAG 서열번호 1
Ct-B3 TGGGTTTAGAGTAGTGAATATC 서열번호 2
Ct-FIP TTAACTCCAATGTAAGGAGTTTTCAATGCCTCTATTGACTACCAT 서열번호 3
Ct-BIP GGTCTAGAGCAAGTTTTGATGCCGCAAGATAGCTTCAGCCAATT 서열번호 4
Ct-LF CATATTCAAATCCGTATAGCTCAGCC 서열번호 5
Ct-LB ATTCGTATAGCTCAGCC 서열번호 6
병원균유전자 N.gonorrhoeae_por N.gonorrhoeae_opa N.gonorrhoeae_car
염기 서열 쌍 실시예 6 실시예 7 실시예 8 실시예 9 실시예 10 실시예 11
반응 시간 31 Ct 28 C t 29 C t 31 Ct 28 C t 36 Ct
반응 특이성 95% 99% 99% 94% 99% 90%
반응 민감도 25 copies/rxn 10 copies/rxn 10 copies/rxn 25
copies/rxn		 10 copies/rxn 10 copies/rxn
병원균유전자 염기서열(5'-3') 비고
Ng_por-F3 CCTCGTATTGTCCGCACTG 서열번호 7
Ng_ por-B3 CCACCCCCTTAAAGCCGA 서열번호 8
Ng_ por-FIP ACTGCAGCCGGATTTTCCTGGGCAGTTGCCGATGTCAG 서열번호 9
Ng_ por-BIP CCTCAGAAGGTTTTACGGGCAAAACGAGCCGAAATCACTGA 서열번호 10
Ng_ por-LF CTTTGACTTCGCCGTACAGG 서열번호 11
Ng_ por-LB AGTTACTAAGGCCAAAAGCCGCA 서열번호 12
Ng_opa-F3 ATTCTGGCGGCAACAAGC 서열번호 13
Ng_opa-B3 TGTGGGTAAGTGGTAACAGC 서열번호 14
Ng_opa-FIP GCGGACAAGCCGATTTTAGAGCCCGAAAGACGGAACATCG 서열번호 15
Ng_opa-BIP AACCCTATATCGGCATGCGCTTTTGAACCGAACGAACCTGA 서열번호 16
Ng_opa-LF GGCGTGGAATGTGCCGTTTT 서열번호 17
Ng_opa-LB GCCTACGGACACGTCAGACA 서열번호 18
Ng_car-F3 ATTTTGCCGGTCGGGTTG 서열번호 19
Ng_car-B3 GGCGTGGAAAAAGAAGTCGT 서열번호 20
Ng_car-FIP GCTCCACCGGCGAAGTTTTGCCGAGTTGGGCTTTGTAGT 서열번호 21
Ng_car-BIP TCAAAATCGTTTTCACGCCCGGCCCCGATTTCTATGCCGTTA 서열번호 22
Ng_car-LF GTGGGCGCAAGTTTCGG 서열번호 23
Ng_car-LB GAATTTGATGAATGGGAACACGG 서열번호 24
※ Ct, Chlamydia trachomatis; Ng, Neisseria gonorrhea; F3, forward primer; B3, backward primer; FIP, forward inner primer; BIP, backward inner primer; LF, forward loop primer; LB, backward loop primer
[선정된 프라이머 세트]
-클라미디아 균 검출용 프라이머 세트: 실시예 2
-임균 검출용 프라이머 세트: 실시예 7, 8, 및 10
시험예 2: 4T의 유무에 따른 효율 변화의 확인
표 3 및 5와 같은 염기서열을 갖되 4개의 티민이 추가되지 않은 경우 효율 변화를 확인하였다. 구체적으로 프라이머 세트로서 실시예 2, 7, 8, 및 10을 준비하고, 상기 실시예에서 4개의 티민을 포함하지 않는 프라이머 세트로 각각 비교예 1 내지 4를 제작하였다. 그런 다음 각 프라이머 세트를 이용하여 시험예 1과 같이 특이성 및 효율 등을 시험하였고, 그 결과를 하기의 표 6 및 7에 나타내었다.
염기 서열 쌍 실시예 2 비교예 1
반응 시간 28 Ct 38 Ct
반응 특이성 99% 93%
반응 민감도 10 copies/rxn 50 copies/rxn
병원균유전자 N.gonorrhoeae_por N.gonorrhoeae_opa N.gonorrhoeae_car
염기 서열 쌍 실시예 7 비교예 2 실시예 8 비교예 3 실시예 10 비교예 4
반응 시간 28 Ct 32 Ct 28 Ct 31 Ct 27 Ct 33 Ct
반응 특이성 99% 94% 99% 92% 99% 90%
반응 민감도 10 copies/rxn 30 copies/rxn 10 copies/rxn 30copies/rxn 10 copies/rxn 30 copies/rxn
그 결과, 실시예들은 상기 시험항목을 모두 만족한 반면, 비교예들은 효율이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.
시험예 3: 가상 검체를 이용한 분석능 평가
실제 임상 검체에서 분석이 가능할지 평가하기 위해, 가상의 검체를 제조하여 본 발명에 따른 프라이머 세트의 분석능을 평가하였다.
구체적으로, 건강한 사람 3명의 혈액샘플을 채취하여 소분하고, 혈액샘플 당 10 copies/25㎕로 각 병원균(클라미디아 및 임균) 유전물질을 혼합하여 가상의 환자 검체로 하였다. 음성대조군으로는 유전물질을 혼합하지 않은 것으로 준비하였고, 비교예 1 내지 6과 효율을 비교하였다. 상기의 시료를 이용하여 증폭반응을 위한 혼합액을 준비하고 등온증폭반응을 실시하였다.
그 결과를 하기의 표 8 및 9에 나타내었다.
염기 서열 쌍 실시예 2 비교예 1
반응 시간 29 Ct 39 Ct
반응 특이성 99% 93%
반응 민감도 10 copies/rxn 50 copies/rxn
병원균유전자 N.gonorrhoeae_por N.gonorrhoeae_opa N.gonorrhoeae_car
염기 서열 쌍 실시예 7 비교예 2 실시예 8 비교예 3 실시예 10 비교예 4
반응 시간 29 Ct 35 Ct 28 Ct 33 Ct 29 Ct 35 Ct
반응 특이성 99% 92% 99% 94% 99% 90%
반응 민감도 10 copies/rxn 40 copies/rxn 10 copies/rxn 40copies/rxn 10 copies/rxn 30 copies/rxn
그 결과 가상 검체에서도 프라이머 세트가 작동하는 것으로 확인되어, 검체로부터 바이러스 유전 물질을 별도로 정제하지 않아도 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 다수의 성병을 동시에 진단할 수 있음을 확인하였다.
제조예 2. 랩온페이퍼 핵산 검출용 구조물의 제조
본 발명의 랩온페이퍼 핵산 검출용 구조물을 제조하기 위해, 시료패드(120) 로는 0.5 ㎛ 폴리설폰, 제1연결패드(130)로는 0.01㎛ 셀룰로오스, 반응패드(140)로는 0.005㎛ 셀룰로스아세테이트, 제2연결패드(150)로는 0.05㎛ 셀룰로오스, 검출패드(160)로는 0.005㎛ 니트로셀룰로오스, 및 흡수패드(170)로는 0.5 ㎛ 유리섬유 재질로 준비하였다.
반응패드(140)는 셀룰로오스아세테이트 막을 겹쳐서 패드로 만들고 이를 45 mM 수크로오스, 0.005 w/w% TritonX-100, 및 0.2 w/w% 글리세롤을 포함하는 용액에 담근 후 건조시켜 준비하였다. 그리고 여기에 미세 드릴로 웰을 형성하고, 상기 웰의 바닥에 프라이머 세트를 포함하는 히드로겔 층을 형성하였다. 반응 패드는 세 개를 준비하였고, 각 반응패드에는 독립적으로 실시예 2 및 7의 프라이머 세트를 사용하였다. 상기 히드로겔 층을 형성하기 위해 우선 히드로겔 용액 총 부피를 기준으로 UV-광가교성 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 (PEGDA, Sigma-Aldrich, MW700) 20% v/v, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG, Sigma-Aldrich, MW600) 40% v/v 및 광개시제 2-하이드록시-2-메틸프로피오페논 (Sigma-Aldrich) 5% v/v 및 버퍼(PBS 완충액, pH7.5) 35%를 혼합하고, 여기에 각 프라이머 세트를 혼합하여 하이드로겔 용액을 제조하였다. 상기 폴리(에틸렌 글리콜)은 히드로겔 미세입자의 공극율을 증가시키기 위하여 포함되는 것이 바람직하다. 그런 다음, 상기 히드로겔 용액을 반응패드의 각 웰 내부 표면에 도포하고, 1분간 UV 노출(360 nm wavelength, 35 mJ/cm2)하여 히드로겔 코팅층을 형성하였다.
그런 다음 반응패드(140)의 표면에 dNTP(1.4mM, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 등온증폭버퍼(1X, 20mM Tris-HCl, 10mM (NH4)2SO4, 50mM KCl, 2mM MgSO4, 및 0.1% Tween-20, pH7.5)를 함유하는 파우더와 Bst 3.0 DNA 중합효소(320U/㎖)를 도포하고, 약 38℃ 오븐에서 약 30분 간 가열하여 고정하였다.
제2연결패드(150)에 고정된 금 나노입자는 콜로이드 입자로서 하기와 같이 제조하였다. 0.1% HAuCl4용액을 교반 가열하면서 끓기 시작하면 0.5% 소듐시트르산 용액을 첨가하여 용액을 환원시켜 금 입자를 만들고, 여기에 스트렙타비딘(streptavidin)을 금 입자용액 100㎖당 각각 1mg을 첨가하여 축합시켰다. 축합체를 10,000g에서 원심분리하여 침전시키고 0.1% BSA를 함유하는 생리식염수(PBS)로 용해하여 OD450값이 10이 되도록 만들어 보관하였다.
제2연결패드(150)는 하기와 같이 제조하였다. 구체적으로, 셀룰로오스 막을 여러 겹쳐 준비하여 절단하고, 0.4 M의 Tris (pH 6.5), 0.2%의 Tween-20, 1%의 카제인나트륨, 0.1%의 소듐아지드(sodium azide), 및 0.05%의 Proclin 300으로 제조된 용액에 담궈 적셔 두었다. 상기 제조된 금 축합체는 상기 용액과 동일한 조성의 용액에 투석하여 준비하였다. 그런 다음, 상기 셀룰로오스 막에 상기 투석한 금 축합체를 처리하고 건조하여 제2연결패드(150)를 완성하였다. 그런 다음 제2연결패드에서 중앙 부분에 녹인 왁스를 흡수시킨 후 냉각하여 개패구역(151)을 형성하였다.
검출패드(160)는 폴리에틸렌프탈레이트 잉크로 검출 구역을 스탬핑하여 지정하고, 그 위에 FAM, HEX, 및 Cy5 등의 형광 표지자에 결합할 수 있는 항체를 함유하는 용액으로 다시 스탬핑 한 후, NHS(N-hydroxysulfosuccinimide) 용액을 적용하고 반응시켜 항체를 고정하였다.
그런 다음, 각 구조물의 구성요소를 도 1 및 2와 같이 배치하고, 상기 시료패드(120), 반응패드(140), 및 제2연결패드(150)의 하단에는 가열패드로(141)로 열선이 연결된 구리판을 배치하고, 반응패드의 상부에는 차단패드(142)로 폴리아크릴 막을 배치하였다.
시험예 4. 혈액 시료를 이용한 핵산 추출 및 증폭
(1) 시험 시료 및 페이퍼 칩의 준비
본 발명의 랩온페이퍼 핵산 검출용 구조물을 이용하여 혈액 시료로부터 핵산을 추출하고 이를 증폭하여 형광을 나타낼 수 있는지 확인하였다.
먼저 인간 혈액을 전혈로서 Innovative research (IWB1K2E10ML, USA)에서 구입하여 준비하고, 양성 대조군인 18S rRNA의 프라이머는 Tocris(# 7325, USA)에서 구입하였다. 사용된 전혈은 일체의 바이러스나 박테리아에 감염된 것이 아님을 data sheet를 통해 확인하였다. 상기 인간 혈액에 클라미디아 균 및 임균의 DNA 표준물질을 각각 10 copies/25㎕로 혼합하여 시험 시료를 준비하였다. 음성대조군은 인간 혈액 성분만을 포함한다.
혈액에 혼합된 균주의 검출을 위한 프라이머 세트는 실시예 2 및 7의 프라이머 세트를 사용하였고, 각 프라이머 세트에서 F3 프라이머는 5' 말단에 검출자를 결합하였고, 양성대조군인 인간 18s RNA는 FAM, 실시예 2는 HEX, 실시예 7은 Cy5로 표지하였고, 각 검출패드는 FAM에 특이적인 수용체와 각 검출 라인에 따라 HEX, 및 Cy5에 특이적인 수용체를 포함하는 검출구역을 갖는다.
(2) 시료로부터 핵산 검출
상기 시료 50㎕를 취하여 Lysis buffer (20mM Tris·HCl (pH 8.8), 15mM MgSO4, 15mM KCl, 15mM (NH4)2SO4, 0.1 w/w% Tween20, 0.05 mg/ml 단백질분해효소 (Protenase K)) 50㎕를 첨가하고 가볍게 탭핑(tapping)한 후, 5분 정도 상온에서 인큐베이션 하였다. 그런 다음, 시료패드(120) 하부의 가열패드(141)를 60℃로 작동시킨 상태에서 시료패드(120)에 시료를 5 분 내로 천천히 적가하고, 부가 완충액 (20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 50 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0.1% Tween® 20, pH 8.8) 250㎕를 시료패드에 약 2 분 동안 천천히 적가한 후, 반응패드 하부의 가열패드를 65℃로 가열하여 30분 간 반응시켰다. 그런 다음, 제2연결패드 하부의 가열패드를 65℃로 가열하고 상기 부가 완충액 250㎕을 시료패드에 2 분 동안 천천히 적가하였다.
그 결과, 도 8과 같이 모든 검출패드에서 양성대조군 밴드를 확인함으로써 구조물이 정상적으로 작동함을 확인하였고, 각 병원균 표준물질에 일치하여 검출패드의 밴드가 검출되었다. 따라서 본 발명의 키트 또는 시스템을 이용하여 다수의 성병을 동시에 진단할 수 있다.
110: 하우징 구조물
120: 시료패드
130: 제1연결패드
140: 반응패드
141: 가열패드
142: 차단패드
150: 제2연결패드
151: 개패구역
160: 검출패드
170: 흡수패드
161: 검출구역
SEQUENCE LISTING <110> NUTRIGENE <120> Composition for diagnosis of multiple sex-borne diseases and kit comprising the same <130> NUTRIGENE_2021-10(7) <160> 24 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chlamydia forward primer <400> 1 gaacagatgc agcgacag 18 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chlamydia backward primer <400> 2 tgggtttaga gtagtgaata tc 22 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chlamydia forward inner primer <400> 3 ttaactccaa tgtaaggagt tttcaatgcc tctattgact accat 45 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chlamydia backward inner primer <400> 4 ggtctagagc aagttttgat gccgcaagat agcttcagcc aatt 44 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chlamydia forward loop primer <400> 5 catattcaaa tccgtatagc tcagcc 26 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chlamydia backward loop primer <400> 6 attcgtatag ctcagcc 17 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ng_por-F3 <400> 7 cctcgtattg tccgcactg 19 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ng_ por-B3 <400> 8 ccaccccctt aaagccga 18 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ng_ por-FIP <400> 9 actgcagccg gattttcctg ggcagttgcc gatgtcag 38 <210> 10 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ng_ por-BIP <400> 10 cctcagaagg ttttacgggc aaaacgagcc gaaatcactg a 41 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ng_ por-LF <400> 11 ctttgacttc gccgtacagg 20 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ng_ por-LB <400> 12 agttactaag gccaaaagcc gca 23 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ng_opa-F3 <400> 13 attctggcgg caacaagc 18 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ng_opa-B3 <400> 14 tgtgggtaag tggtaacagc 20 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ng_opa-FIP <400> 15 gcggacaagc cgattttaga gcccgaaaga cggaacatcg 40 <210> 16 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ng_opa-BIP <400> 16 aaccctatat cggcatgcgc ttttgaaccg aacgaacctg a 41 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ng_opa-LF <400> 17 ggcgtggaat gtgccgtttt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ng_opa-LB <400> 18 gcctacggac acgtcagaca 20 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ng_car-F3 <400> 19 attttgccgg tcgggttg 18 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ng_car-B3 <400> 20 ggcgtggaaa aagaagtcgt 20 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ng_car-FIP <400> 21 gctccaccgg cgaagttttg ccgagttggg ctttgtagt 39 <210> 22 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ng_car-BIP <400> 22 tcaaaatcgt tttcacgccc ggccccgatt tctatgccgt ta 42 <210> 23 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ng_car-LF <400> 23 gtgggcgcaa gtttcgg 17 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ng_car-LB <400> 24 gaatttgatg aatgggaaca cgg 23

Claims (9)

  1. 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 7 내지 12의 염기서열; 서열번호 13 내지 18의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 19 내지 24의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 다수 성병 동시 진단용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 프라이머 세트는 고리매개 등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification)반응에 적용할 수 있는 것인 다수 성병 동시 진단용 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 성병은 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 및 네이세리아 고노래(Neisseria gonorrhea)로 이루어진 군에서 선택된 병원균에 의한 것인, 다수 성병 동시 진단용 조성물.
  4. 청구항 3의 조성물을 포함하는 다수 성병 동시 진단용 키트.
  5. 청구항 3의 조성물 및 생물학적 시료를 혼합하는 단계; 및
    상기 혼합물을 등온증폭 반응하여 유전자를 증폭하는 단계를 포함하는, 다수의 성병을 동시에 진단하는 방법.
  6. 생물학적 시료를 수용하는 시료패드;
    상기 시료패드의 상부에 배치되고, 시료패드와 반응패드를 연결하는 제1연결패드;
    상기 제1연결패드의 하부에 배치되고, 표적 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 세트와 등온증폭반응 (LAMP)을 위한 시약을 포함하고, 등온증폭반응이 일어나는 반응패드;
    상기 반응패드 상부에 배치되고, 반응온도 유지 및 시료의 증발을 차단하는 차단패드;
    상기 반응패드의 상부에 배치되고, 금 나노입자가 고정되어 있는 제2연결패드;
    상기 제2연결패드의 하부에 배치되고, 상기 금 나노입자와 결합된 등온증폭반응물로부터 증폭된 표적 핵산을 획득하는 검출패드; 및
    상기 검출패드의 측방에 배치되고, 잔류하는 시료를 흡수하는 흡수패드를 포함하고,
    상기 시료패드, 반응패드, 및 제2연결패드 하부에 배치된 가열패드를 포함하고,
    상기 반응패드, 제2연결패드, 및 검출패드는 복수 개이고,
    상기 프라이머 세트는 성병 원인균에 특이적인 것으로서, 상기 각 반응패드는 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 7 내지 12의 염기서열; 서열번호 13 내지 18의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 19 내지 24의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 서로 상이한 프라이머 세트를 포함하는 것인, 다수 성병 동시 진단용 구조물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 시료패드; 제1연결패드패드; 반응패드; 제2연결패드; 검출패드; 및 흡수패드는 순차적으로 적어도 일부분 접촉되어 측방으로 배치된 것인, 다수 성병 동시 진단용 구조물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 금 나노입자는 표면에 스트렙타비딘(streptavidin)을 포함하는 것인, 다수 성병 동시 진단용 구조물.
  9. 청구항 6의 구조물을 포함하는, 다수 성병 동시 진단용 키트.
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