KR102219895B1

KR102219895B1 - 쯔쯔가무시병 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트

Info

Publication number: KR102219895B1
Application number: KR1020200187520A
Authority: KR
Inventors: 김종철
Original assignee: 주식회사 에이아이더뉴트리진
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2021-02-24
Also published as: WO2022145658A1; KR102219895B9; CN116670301A

Abstract

본 발명은 쯔쯔가무시병 진단용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 쯔쯔가무시병을 유발하는 세균을 검출할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 조성물 및 키트를 이용하여 보다 정확도 높게 쯔쯔가무시병의 원인균인 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)를 검출하고, 신속하고 저렴하게 쯔쯔가무시병을 진단할 수 있다.

Description

쯔쯔가무시병 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트{Composition for diagnosis of Tsutsugamushi disease and kit comprising the same}

본 발명은 쯔쯔가무시병 진단용 조성물 및 이를 검출하기 위한 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 조성물에 포함된 프라이머 세트를 이용하여 보다 정확도 높게 쯔쯔가무시병의 원인균인 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)를 검출하고, 신속하고 저렴하게 쯔쯔가무시병을 진단할 수 있다.

쯔쯔가무시병은 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)에 의한 급성 열성 전염병으로, 사람이 쯔쯔가무시균에 감염된 털진드기에게 물릴 때 감염된다. 진드기에 물린 곳에 가피가 생기게 되며, 초기에는 아프지 않기 때문에 본인도 모르는 경우가 많다. 1~2주의 잠복기를 거치며, 피부발진은 발병 후 5-8일 경에 몸통에 주로 생기고 진드기에 물린 곳에 피부궤양이 나타난다. 쯔쯔가무시병은 동남아시아 및 극동 지역에서 주로 발견되는 감염병이며, 국내에서는 전국에서 감염자가 나타나고 있다. 주로 숲에서 감염되기 때문에 계절적으로 늦가을에 많이 감염되고, 겨울에는 발생되지 않고, 농촌지역, 야외활동이 많은 사람들, 군인 등이 주로 감염된다.

1-2주의 잠복기를 거쳐서 고열, 오한, 두통, 피부발진 및 림프절 비대 등의 증상이 나타나고, 피부발진은 발병 후 5-8일 경에 몸통에 주로 생기고, 간비종대, 결막 충혈 등이 나타날 수 있다. 진드기에 물린 피부 주위에 궤양이나 가피가 형성된다. 일부 환자는 가피가 없는 경우도 있고, 열이 나는 기간이 짧고 피부발진이 더욱 많이 나타나기도 한다.

급성 열성질환에서 벌레에 물린 자국이 피부에 있고, 소속림프절이 커져 있고 발진이 있으면 쯔쯔가무시병을 의심하게 되고 환자가 관목숲에 다녀온 경험 즉, 야영이나 야외 작업, 등산, 낚시 등의 경험이 있으면 거의 쯔쯔가무시병으로 진단을 받는다. 그러나, 숲이 많은 야외에 다녀오지 않고도 감염되는 사람이 있고, 증상도 모두 나타나지는 않는 까닭에 증상만으로 쯔쯔가무시병을 진단하는 것에는 어려움이 있다.

더욱이 국내에서 진드기에 의하여 매개되는 감염병으로 중증열성혈소판감소증후군(SFTS)이 있는데, 이는 쯔쯔가무시병과 증상이 유사하여 진단이 곤란한 경우가 많이 있다. 두 질환 모두 고열과 전신 통증을 호소하며, 이런 증상들은 흔히 몸살감기로 오인해서 진단이 늦어지는 경우가 잦다. 따라서, 신속하고 정확하게 쯔쯔가무시병을 진단할 수 있는 수단을 개발하는 것이 요구된다.

본 발명은 쯔쯔가무시병 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 쯔쯔가무시병 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 쯔쯔가무시병 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 생물학적 시료로부터 쯔쯔가무시병을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위한 하나의 구현예는 각각 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 표시되는 6 개의 프라이머를 포함하는, 프라이머 세트를 제공한다.

상기 프라이머 세트는 쯔쯔가무시병을 진단하기 위한 것으로서, 보다 구체적으로 쯔쯔가무시병의 원인균인 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)를 검출하기 위한 것일 수 있다.

상기 오리엔티아 쯔쯔가무시는 Gilliam, Karp, Kato를 포함하여, 한국에서 Boryong, Pajoo, Jecheon, Yonchon, Youngwori, Yeojoo 등의 지역별 다양한 유전형으로 존재하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 프라이머 세트는 다양한 균주로부터 보존 영역을 도출하는 과정을 통해 제조된 것이므로, 특정 균주를 가리지 않고 검출이 가능하다.

용어 "프라이머"는 자유 3말단 수산화기(free 3'hydroxyl group)를 가지는 짧은 폴리뉴클레오티드로서, 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능할 수 있다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역방향 전사효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphospate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

상기 프라이머 세트에서 각각의 프라이머는 표적하는 유전자에 특이적으로서, 용어 "유전자에 특이적" 또는 "상보적인"은 표적 유전자에 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 100% 염기쌍을 이룰 수 있는 것을 의미할 수 있다.

상기 프라이머 세트에서 각 프라이머는 서열번호 1 내지 6의 염기서열 중 하나의 염기서열로 이루어지거나 이를 포함하는 것일 수 있고, 오리엔티아 쯔쯔가무시의 유전 물질에 특이적으로 결합을 유지하는 한, 서열번호 1 내지 6으로 기재된 염기서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 상기 프라이머는 또한, 유전자 합성의 개시점으로서 작동하는데 기본적인 성질을 변화시키지 않는 범위에서 추가의 특징을 더 포함하도록 개조될 수 있다. 따라서, 상기 프라이머는 각 정의된 서열번호의 염기서열을 포함하면서 약 1 내지 20 bp, 1 내지 15 bp, 1 내지 10 bp, 또는 1 내지 5 bp의 추가적인 염기 서열을, 상기 프라이머의 3' 말단, 5' 말단 또는 염기서열 내부에 더 포함할 수 있고, 필요한 경우 각 말단 또는 특정 염기에 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 더 포함할 수 있다.

상기 표지의 예로는, 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드일 수 있다. 상기 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 상기 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일수 있고, 상기 방사성 동위원소는 32P일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 프라이머 세트는 등온증폭 (isothermal amplification)용으로 사용하기에 적합할 수 있다. 용어 “등온증폭(isothermal amplification)"은 하나의 온도 조건하에서 DNA를 증폭시키는 것을 의미한다. 기존의 중합효소 연쇄반응(PCR)이 변성 (Denaturation), 어닐링 (Annealing) 및 신장 (Extension) 단계가 각각 다른 온도와 조건을 요구함에 따라 특수한 PCR 장치로 수행해야 하는 것과 달리, 등온증폭 반응은 별도의 특수한 기기가 필요하지 않은 장점을 갖는다. 일반적으로 등온 증폭 방법은 특정 온도범위 내에서 1시간 내에 목표 핵산을 10^9개까지 증폭시킬 수 있으며, 상기 온도를 유지시킬 수 있는 항온 장치만 있으면 수행할 수 있다. 또한 등온 증폭 방법은 수행 시간이 짧고 결과를 육안으로 관찰할 수 있으므로 간편하게 증폭을 확인할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 등온증폭은 고리매개 등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification)일 수 있다. 용어 "고리매개 등온증폭방법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)"은 외부 프라이머, 내부 프라이머, 및 반응 속도를 향상시키기 위한 추가의 루프 프라이머를 사용하여 등온에서 수행되는 증폭 방법이다. 상기 LAMP 반응에서 사용되는 프라이머 중 외부 프라이머는 정방향 외부(forward outer, F3) 프라이머와 역방향 외부(backward outer, B3) 프라이머 2종으로 구성되고 반응의 비순환기(non-cyclic step) 동안 DNA 이중 가닥을 풀어주는 역할을 한다. 내부 프라이머는 정방향 내부 프라이머(forward inner primer, FIP)와 역방향 내부 프라이머(backward inner primer, BIP) 2종으로 구성되고 고리매개 등온증폭반응에 필수적인 고리(loop)를 만들 수 있도록 정방향 및 역방향 염기서열에 해당하는 뉴클레오티드로 구성된다. 이들 내부 프라이머는 바이러스 RNA 에는 포함되지 않으나 반응의 효율성을 높이기 위하여 특정 염기, 예를 들어, 일련의 티민 염기를 더 포함하도록 설계될 수 있다. 추가 2종의 프라이머는 정방향 고리(forward loop, LoopF) 프라이머와 역방향 고리(backward loop, LoopB) 프라이머 2종으로 구성되며 내부(inner) 프라이머가 결합하지 않는 염기서열(고리 부위)에 부착하여 고리매개등온증폭 반응을 가속화시킨다. 상기 고리매개 등온 증폭 방법은 내부 프라이머가 주형에 먼저 결합하여 신장된 후, 각 DNA 나선의 바깥쪽으로 외부 프라이머가 결합되어 신장된다. 이때, 외부 프라이머의 신장으로 인해 가닥(strand) 변위가 발생하고, 그에 따라 먼저 합성된 가닥은 주형에서 떨어지는데, 떨어진 합성 가닥이 5' 말단에서부터 고리(loop) 구조를 형성하고, 이어서 3' 말단에도 동일한 과정으로 고리 구조가 형성되며, 이를 매개로 증폭 반응이 일어난다. 상기 등온증폭 또는 고리매개 등온증폭 반응은 역전사 반응일 수 있다.

상기 등온증폭 반응은 50 내지 70℃, 52 내지 70℃, 52 내지 68℃, 52 내지 65℃, 55 내지 65℃, 50 내지 60℃, 또는 65℃에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 등온증폭방법은 10 내지 90분, 20 내지 90분, 25 내지 90분, 10 내지 80분, 20 내지 80분, 25 내지 80분, 10 내지 70분, 20 내지 70분, 25 내지 70분, 10 내지 60분, 20 내지 60분, 25 내지 60분, 또는 30분 동안 수행될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 프라이머 세트를 이용하면 40 pg 이하, 30 pg 이하, 또는 20 pg 이하, 예를 들어, 1 pg 내지 40 pg, 5 pg 내지 40 pg, 10 pg 내지 40 pg, 또는 20 pg 내지 40 pg의 매우 소량의 표적 유전자가 포함된 검체에서 오리엔티아 쯔쯔가무시 균주의 검출이 가능하다. 또한, 일반적인 등온증폭반응 조건에서 빠른 시간 내에 오리엔티아 쯔쯔가무시 균주의 검출이 가능하다. 예를 들어, 상기 프라이머 세트의 각 프라이머 0.2 내지 1.6 μM을 이용하여, 60 내지 65 ℃, 구체적으로 65 ℃에서 약 30 분, 예를 들어, 30 분 내지 60 분, 30 분 내지 50 분, 또는 30 분 내지 40 분 동안 등온증폭 반응하여 검출 결과를 확인할 수 있다. 상기 프라이머 세트에서 각 프라이머는 구체적으로, FIP 및 BIP 프라이머의 경우 각각 1.6 μM, F3 및 B3 프라이머의 경우 각각 0.2 μM, 및 FL 및 BL 프라이머의 경우 각각 0.4 μM로 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 등온증폭 반응은 등온이라는 제한된 환경에서 빠른 시간 내에 결과를 도출하여야 하므로 프라이머의 조합 및 각 성분비는 유의한 반응 결과를 얻기 위해 중요한 요소이다.

본 발명의 다른 구체예는, 상기 프라이머 세트를 포함하는 쯔쯔가무시병 진단용 조성물 또는 키트를 포함한다.

상기 쯔쯔가무시병 진단용 조성물 또는 키트는 등온증폭 반응을 수행하기 위한 적절한 반응물 및 시약을 더 포함할 수 있다. 이러한 반응물 및 시약은, 예를 들어 추가의 프라이머, dNTP, 및 효소 (DNA 중합효소 또는 역방향 전사효소)등을 포함할 수 있고, 반응의 효율을 위해 염화칼륨, 황산마그네슘, 황산암모늄과 같은 무기염류나 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 반응물 및 시약은 10 내지 20mM Tris-HCl, 1 내지 10mM (NH₄)₂SO₄, 10 내지 50mM KCl, 0.1 내지 2mM MgSO₄, 및 0.01 내지 0.1% Tween-20, 보다 구체적으로 20mM Tris-HCl, 10mM (NH₄)₂SO₄, 50nM KCl, 2mM MgSO₄, 및 0.1% Tween-20을 포함하는 pH 7 내지 9, 바람직하게는 pH 8.8의 용액일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 쯔쯔가무시병 진단용 조성물 또는 키트는 반응 결과물을 육안으로 확인할 수 있는 시약을 더 포함할 수 있다. 그러한 시약은 통상적으로 알려지거나 상업적으로 구매 가능한 것을 사용할 수 있고, 예를 들어, WarmStart®Colorimetric LAMP Mix가 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 시약은 반응이 효율적으로 일어나도록 하기 위해, 상기 언급한 바와 같은 Tris-HCl, (NH₄)₂SO₄, KCl, MgSO₄, 및 Tween-20을 포함하는 것일 수 있다.

상기 쯔쯔가무시병 진단용 조성물 또는 키트는 진단 결과를 정확하게 판독하기 위해서 음성대조물질 또는 양성대조물질을 더 포함할 수 있다. 음성대조물질로는 오리엔티아 쯔쯔가무시와 무관한 주형 RNA 또는 DNA를 이용할 수 있고, 양성대조물질로는 오리엔티아 쯔쯔가무시 감염 환자로부터 수득된 생물학적 시료 또는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 유전체 일부에 해당하는 주형 RNA 또는 DNA를 이용할 수 있다. 이들 대조 물질은 필요에 따라 하나의 튜브에서 생물학적 시료와 함께 또는 개별적으로 유전자 증폭 반응에 적용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예는, 상기 프라이머 세트 및 생물학적 시료를 혼합하는 단계; 및 상기 혼합액을 등온증폭 반응으로 유전자를 증폭하는 단계를 포함하는, 쯔쯔가무시병을 진단하는 방법을 제공한다.

상기 생물학적 시료는 검사 대상인 개체로부터 수득된 것으로서, 비인두 또는 구인두로부터 스왑 또는 비 세척을 통해 수득된 것, 기관지 세척 또는 흡인물, 기관 간의 흡인물 및 기관지 생검, 객담, 기관지 폐포세척액 (bronchoalveolar lavage), 침, 혈액, 소변, 대변 등을 이용할 수 있다.

상기 생물학적 시료는 증폭 반응의 효율을 높이기 위해 전처리를 가할 수 있다. 전처리는 물로 10배, 50배, 100배, 200배, 또는 400배 희석하는 것일 수 있고, proteinase K를 처리 후 열처리하는 것일 수 있고, 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법과 같은 통상적으로 알려진 것을 이용하거나 상업적으로 판매하는 키트를 이용해 생물학적 시료로부터 유전자를 추출하거나 일정 수준으로 정제하는 것일 수 있다. 생물학적 시료로부터 RNA를 추출하여 사용하는 경우, 표적 유전자를 증폭하기 전에 cDNA로 역전사하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 전처리는 Brij-35 0.1% ~ 0.5w/w%, Tris-HCl 10mM ~ 300mM (pH7.0 ~ 8.0), 및 CaCl₂ 1mM ~ 10mM, 구체적으로 Brij-35 0.3w/w%, Tris-HCl 100 mM(pH7.5), 및 CaCl₂ 5mM을 포함하는 용액을 처리하는 것을 의미할 수 있고, 구체적으로 상기 용액으로 처리한 후 통상적인 방법으로 정제하여 시료로부터 유전자만 수득하는 것을 의미할 수 있다. 상기 전처리 용액의 조합은 검체로부터 유전자가 쉽게 추출되도록 하고, 본 발명의 프라이머 세트의 등온증폭 반응 효율을 증진시킬 수 있다.

상기 쯔쯔가무시병 진단 방법은 증폭된 유전자를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 SYBR Green I을 이용한 형광 측정, 페놀 레드와 같은 지시약의 색상 변화, 탁색도, 침전물 생성, DNA laddering, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 키트는 각 반응 시약을 담은 용기나 시험에 사용하기 위한 도구 및 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 쯔쯔가무시병을 특이적으로 검출할 수 있고, 등온증폭반응을 이용하여 신속하고 정확하게 현장 검출이 가능하다.

또한, 등온증폭반응은 증폭 반응을 수행하기 위한 특정 온도 및 조건을 맞추는데 요구되는 고가의 기기와 전문 인력을 필요로 하지 않으므로, 효율적이면서도 저렴한 비용으로 수행이 가능하기에 다수의 검사 대상자를 조기에 진단할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 오리엔티아 쯔쯔가무시를 등온증폭반응으로 검출한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 오리엔티아 쯔쯔가무시를 등온증폭반응으로 검출한 결과를 전기영동으로 확인한 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 오리엔티아 쯔쯔가무시를 등온증폭반응으로 5분 간격으로 검출한 결과를 나타낸 이미지 및 전기영동 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 가상의 환자 검체에서 쯔쯔가무시병의 원인균을 등온증폭반응으로 검출한 결과를 색 변화와 전기영동으로 확인한 이미지이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 방해 물질 환경 하에 가상의 환자 검체에서 쯔쯔가무시병 원인균을 등온증폭반응으로 검출한 결과를 색 변화와 전기영동으로 확인한 이미지이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 쯔쯔가무시병 및 중증열성혈소판감소증후군 환자를 구분할 수 있음을 확인한 이미지이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 프라이머 제작

고리매개 등온증폭방법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 사용하여 오리엔티아 쯔쯔가무시를 검출하기 위해 프라이머를 설계 및 제작하였다. 20개의 스트레인 간의 블라스트 분석을 통하여 보존지역(conserved region)의 유전자 염기서열을 수집하여 염기서열을 확인하였다. 이후, 이를 주형으로 외부 프라이머와 내부 프라이머, 루프 프라이머를 제작하고, 그 서열을 하기의 표 1에 나타내었다. 프라이머 세트 1의 경우 Loop 형성을 촉진하고, 반응의 속도를 높이기 위하여 FIP 프라이머와 BIP 프라이머 내부에 4개의 티민을 포함시켰다.

	프라이머 유형	서열
프라이머 세트 1	F3	5'-TACACCTCCTCAGCCTAC-3' (서열번호 1)
	B3	5'-ACAATATCGGATTTATAACC-3' (서열번호 2)
	FIP	5'-TAAGCTGAGGATTCGCAGCTTGTTTTTAATGCCTATAAGTATAGCTGATCG-3' (서열번호 3)
	BIP	5'-AGCGTGCTGCAGCTAGAATCTTTTACAATTCTTTAACCAAGCGATT-3' (서열번호 4)
	FL	5'-GCCTGAGGTATGTTAGGAATATCAA-3' (서열번호 5)
	BL	5'- GAATTGTGCTGGTATTGACTATA-3' (서열번호 6)
프라이머 세트 2	F3	5'-GCGATAGAATTGGAGGATGA-3'
	B3	5'-GCAATTGTCATACCCGCA-3'
	FIP	5'-TCTGCACCAGTAATCATTCCTCCTTTAGGATTAGAGTGTGGTCCT-3'
	BIP	5'-TCTACTCGCTTGGATTCAACTGATTATGTACCACCAAATGGCA-3'
	FL	5'-TCTGCACCAGTAATCATTCCTCC-3'
	BL	5'-TCTACTCGCTTGGATTCAACTGA-3'
프라이머 세트 3	F3	5'-TGAAGTAGGTAAAGGCGAG-3'
	B3	5'-TAACCAAGCGATCCTAGC-3'
	FIP	5'-ACGGCTTACGTATAGGAGCATTTCTAAAGGTGAGATAAAGGCA-3'
	BIP	5'-AAGTATAGCTGATCGTGACTTTGGTTCATTAAGCGGAGGCTGTG-3'
	LF	5'-ACGGCTTACGTATAGGAGCAT-3'
	LB	5'-AAGTATAGCTGATCGTGACTTTGG-3'

※ F3, forward primer; B3, backward primer; FIP, forward inner primer; BIP, backward inner primer; LF, forward loop primer; LB, backward loop primer실시예 2: 유전자 증폭 확인

상기 표 1의 프라이머 세트는 하기의 표 2와 같은 조성과 농도의 primer mix 로서 제조하여 준비하였다. 한국에서 발견된 것으로 알려진 O. tsutsugamushi 균주를 구하여 Brij-35 0.3 w/w%, Tris-HCl 100 mM (pH7.5), 및 CaCl₂ 5mM을 포함하는 용액으로 전처리한 후, DNA 추출 키트 (Quiagen)를 이용하여 DNA를 추출하고 정량하였다. 추출된 DNA 1㎕에 10x primer mix 2㎕, Colorimetric LAMP 2X Master Mix 10㎕ (WarmStart®BioLabs Inc.), 및 dH₂O 7㎕을 혼합하여 총 20㎕가 되도록 혼합액을 제조하였다. 대조군에는 주형 DNA를 넣지 않았다. 상기 혼합액은 하기의 표 3과 같은 조성을 갖는다. 제조된 혼합액을 65 ℃에서 30 분 동안 등온증폭반응한 후, 반응을 멈추고 육안으로 색 변화를 확인하였다.

그 결과, 프라이머 믹스 1의 경우에 등온증폭반응으로 육안으로 색 변화가 가장 뚜렷하게 관찰되어 추가의 증폭 효과를 검증하였다.

프라이머	10X 농도(STOCK) (μM)	1X 농도(FINAL) (μM)
FIP	16	1.6
BIP	16	1.6
F3	2	0.2
B3	2	0.2
LF	4	0.4
LB	4	0.4

	DNA 표적 검출군	대조군
Colorimetric LAMP 2X Master Mix	10㎕	10㎕
Primer Mix(10X)	2㎕	2㎕
표적 DNA	1㎕	0
dH₂O	7㎕	8㎕
총 부피	20㎕	20㎕

시험예 1: 분석능 평가상기 실시예 2에서 선택된 프라이머 세트 1을 이용하여 본 발명에 따른 프라이머 세트의 분석능을 평가하였다.

구체적으로, 실시예 1에서 얻은 보존지역의 유전자 염기서열(약 700 bp)을 벡터 클로닝으로 템플릿 (Orientia tsutsugamushi positive control)을 확보하고 이를 사용하여 20pg, 30pg 및 40pg으로 연속 희석하여 각 농도마다 1 ㎕를 준비하였다. 여기에 상기 실시예 2와 같이 등온증폭반응을 실시하였다. 이후 색 변화를 육안으로 확인하고 전기영동을 통해 그 결과를 확인하였다. 반응산물의 색이 분홍색으로 남아있으면 음성으로, 노란색으로 변하였으면 양성으로 판단하였다. 또한 전기영동으로 증폭 결과물을 직접 확인하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 시험된 모든 농도에서 반응산물의 색이 노란색으로 변하였고, 도 2에 나타낸 바와 같이 전기영동으로 증폭 결과물을 존재함을 확인할 수 있었다.

시험예 2: 분석 특이도 평가

상기 실시예 2에서 선택된 프라이머 세트 1을 이용하여 본 발명에 따른 프라이머 세트의 O. tsutsugamushi에 대한 분석 특이도를 평가하였다.

본 평가를 위한 비교군으로 사람에게 진드기를 통해 유사한 증상의 질병을 유발하는 홍반열 리케치아균(Rickettsia rickettsii), 티푸스 리케치아균 (Rickettsia typhi), 보렐리아 병 원인균(Borrelia burgdorferi), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 및 중증열성혈소판감소증후군 원인균인 분야바이러스(Bunyavirus)를 이용하였다. 각 균주로부터 실시예 2와 같이 핵산을 추출하고, 이를 주형으로 사용하였다. O. tsutsugamushi 및 상기 비교군 각각에 대해 5 pg 수준의 주형을 사용하여 상기 표 1의 프라이머 세트 1 내지 3을 각각 이용하여 상기 실시예 2와 같이 증폭 반응을 위한 혼합액을 준비하고, 등온증폭반응 하였다. 반응 산물의 색 변화를 육안으로 확인하고, 전기영동으로 다시 검증하였다. 그 결과 프라이머 세트 1을 이용한 경우, 비교군들에서는 색 변화가 관찰되지 않고, O. tsutsugamushi에 대해서만 노란색으로의 색 변화가 관찰되었다. 반면, 프라이머 세트 2의 경우 O. tsutsugamushi 보다는 연하지만 리케치아균과 분야바이러스가 포함된 시료에서 약간의 색 변화가 관찰되었고, 프라이머 세트 3의 경우 O. tsutsugamushi 수준의 색 변화가 관찰되었다.

따라서 본 발명의 프라이머 세트는 쯔쯔가무시병을 진단하는데 특이성이 있음을 확인하였다.

시험예 3: 분석능 평가

상기 실시예 2에서 선택된 프라이머 세트 1을 이용하여 본 발명에 따른 프라이머 세트의 분석능을 평가하였다.

구체적으로 시험예 1과 같이 템플릿 5pg을 주형으로 사용하여 실시예 2와 같이 증폭 반응을 위한 혼합액을 준비하고, 5분 간격으로 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 및 40분 동안 등온증폭반응을 실시하였다. 음성대조군인 NTC는 40 분 동안 증폭반응하였다. 이후 색 변화를 육안으로 확인하고 전기영동을 통해 그 결과를 확인하였다. 반응산물의 색이 분홍색으로 남아있으며 음성으로, 노란색으로 변하였으면 양성으로 판단하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 30 분 후 반응산물의 색이 노란색으로 변하였고, 그에 따라 전기영동으로 증폭 결과물을 존재함을 확인할 수 있었다.

시험예 4: 가상 검체를 이용한 분석능 평가

실제 임상 검체에서 분석이 가능할지 평가하기 위해, 가상의 검체를 제조하여 본 발명에 따른 프라이머 세트의 분석능을 평가하였다.

진드기에 물리거나 쯔쯔가무시병에 걸린적이 없는 건강한 사람 15명의 비인두와 구인두에서 검체를 채취하고 각 검체를 두 개의 군(8개 샘플, 7개 샘플)으로 나눈 후, 8개 샘플군에 시험예 1에서 제조한 것과 같은 템플릿 5pg을 혼합하여 가상의 환자 검체로 하였다. 상기 15개의 시료를 이용하여 증폭반응을 위한 혼합액을 준비하고 등온증폭반응을 실시하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 가상의 환자 검체에서만 반응산물의 색이 노란색으로 변하고, 나머지 시료에서는 색이 변하지 않았다. 따라서, 실제 임상 검체에서도 우수한 분석능을 발휘할 수 있음을 확인하였다.

시험예 5: 방해물질을 이용한 분석능 평가

실제 임상 검체에 혼합될 수 있는 다양한 생체 성분과, 검체의 정제에 유입될 수 있는 용매 등에 의해 분석능이 영향을 받을 수 있는지 확인하였다.

상기 시험예 4에서 채취하여 제조한 15명의 검체를 5개 샘플씩 세 개의 군으로 나눈 후, 하나의 군에는 방해물질을 처리하지 않고, 두 개의 군에 각각 0.1v/v%의 인간의 전혈 및 0.1v/v%의 에탄올을 혼합하였다. 그런 다음, 각 군의 검체를 두 개의 시료로 나누어 하나의 시료만 시험예 4와 같이 가상의 환자 검체로 제조하고, 증폭반응을 위한 혼합액을 준비하고 등온증폭반응을 실시하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 세 개의 군 모두 가상의 환자 검체에서만 반응산물의 색이 노란색으로 변하고, 나머지 시료에서는 색이 변하지 않았다. 따라서, 분석능에 영향을 미칠 가능성이 있는 환경에서도 우수한 분석능을 발휘할 수 있음을 확인하였다.

시험예 6: 진단 정확도에 대한 교차 시험

국내에서 진드기에 의하여 매개되는 감염병은 쯔쯔가무시와 중증열성혈소판감소증후군(SFTS)이 있는데, 두 질병의 증상이 유사하여 진단이 곤란한 경우가 많이 있다. 이에 본 발명이 쯔쯔가무시병을 정확하게 진단할 수 있는지 확인하였다.

구체적으로, 가피 형성 여부와 혈소판 감소 여부 등으로 구분된 환자 집단을 분리하고 이로부터 수득한 혈액을 시료로 하여 실시예 2와 같이 증폭 반응을 위한 혼합액을 중비하여 등온 증폭하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 각 구분된 환자 집단에서 정확하게 쯔쯔가무시와 중증열성혈소판감소증후군을 구별할 수 있음을 확인하였다.

SEQUENCE LISTING <110> NUTRIGENE <120> Composition for diagnosis of Tsutsugamushi disease and kit comprising the same <130> P20201225 <160> 6 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> F3 (Forward primer) <400> 1 tacacctcct cagcctac 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> B3(backward primer) <400> 2 acaatatcgg atttataacc 20 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> FIP(forward inner primer) <400> 3 taagctgagg attcgcagct tgtttttaat gcctataagt atagctgatc g 51 <210> 4 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> BIP(backward inner primer) <400> 4 agcgtgctgc agctagaatc ttttacaatt ctttaaccaa gcgatt 46 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> FL(forward loop primer) <400> 5 gcctgaggta tgttaggaat atcaa 25 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> BL(backward loop primer) <400> 6 gaattgtgct ggtattgact ata 23

Claims

서열번호 1 내지 6의 염기서열로 표시되는 쯔쯔가무시병 진단용 프라이머 세트.
청구항 1에 있어서, 상기 프라이머 세트는 고리매개 등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification)하여 쯔쯔가무시병을 진단할 수 있는 것인 프라이머 세트.
청구항 1에 있어서, 상기 프라이머 세트는 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)를 검출하기 위한 것인 프라이머 세트.
청구항 1의 프라이머 세트를 포함하는, 쯔쯔가무시병 진단용 조성물.
청구항 4의 조성물을 포함하는 쯔쯔가무시병 진단용 키트.
청구항 4의 조성물 및 생물학적 시료를 혼합하는 단계; 및
상기 혼합액을 등온증폭 반응으로 유전자를 증폭하는 단계를 포함하는, 쯔쯔가무시병 진단 방법.
청구항 4의 조성물을 포함하는 쯔쯔가무시병 진단 장치.