WO2005075680A1

WO2005075680A1 - 核酸検出方法およびその利用

Info

Publication number: WO2005075680A1
Application number: PCT/JP2005/001840
Authority: WO
Inventors: Akio Matsuhisa; Seiji Yamamoto; Souji Eda; Shinji Yamazaki
Original assignee: Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd.
Priority date: 2004-02-09
Filing date: 2005-02-08
Publication date: 2005-08-18
Also published as: KR20070003883A; JP4974528B2; AU2005210362A1; AU2005210362B8; CA2555346A1; US8187805B2; JPWO2005075680A1; EP1721991A4; US20070111212A1; CN1918305B; EP1721991B1; EP1721991A1; CN1918305A; HK1101414A1; CA2555346C; AU2005210362B2

Abstract

　従来の方法より検出感度を高めるとともに、正確かつ迅速に標的核酸を検出することが可能な核酸検出方法および当該方法を用いる遺伝子検出キットを提供する。　細胞を含む試料を支持体に固定し、そのまま支持体上で核酸を増幅し、増幅された核酸を検出する。試料から核酸を抽出しないので核酸抽出過程の核酸のロスに伴う検出感度の低下を防止できる。また、増幅後の核酸を検出するので、試料に含まれる標的核酸が微量であっても検出可能となる。

Description

明細書

核酸検出方法およびその利用

技術分野

[0001] 本発明は、核酸検出方法およびその利用に関するものであり、より具体的には、試料中の微量核酸を効率よく増幅し、正確かつ迅速に検出する方法、および当該方法を利用した遺伝子検出キットに関するものである。

背景技術

[0002] ある特定の核酸や遺伝子の存在の有無を調べたい場合、標的の核酸や遺伝子を増幅し、その増幅産物を検出する方法が用いられる。標的の核酸や遺伝子を特異的に増幅させる方法としては、 PCR法 (例えば、非特許文献 1、 2参照）、 RT-PCR法（例えば、非特許文献 1、 2参照）、 ICAN法 (例えば、特許文献 1参照）、 LAMP法 (例えば、非特許文献 3参照）、 RCA法 (例えば、非特許文献 4参照）、プライマーェクステンション法（例えば、非特許文献 5参照）等が知られている。なかでも PCR法、 RT- PCR法が最もよく使われている。これらの方法は、目的とする核酸の塩基配列を含む短い核酸をプライマーとして用いて、 DNAポリメラーゼまたは RNAポリメラーゼによる錡型特異的な核酸合成反応を in vitroで行う方法である。

[0003] さらに、上記核酸増幅方法において、増幅反応中または増幅反応後に、増幅された核酸断片を適当な手段を用いて標識することにより、試料中にわず力、しか存在しない核酸を検出することが可能となる。また、ランダムな塩基配列のプライマーを使用し非特異的に核酸を増幅および標識し、それを用いて核酸を検出する DNAマイクロア々な疾病に関連する遺伝子を網羅的に検出する DNAマイクロアレイは、非常に注目を集めている。

[0004] また、ある特定の核酸や遺伝子を調べたい場合、上記核酸増幅方法以外の方法として、組織や細胞中の標的となる核酸を、それと相補的な塩基配列を含む標識した核酸をプローブとしてハイブリダィゼーシヨンさせる ISH法（in situハイブリダィゼーシヨン法）や FISH法（fluorescein in situハイブリダィゼーシヨン法）がある（例えば、非特許文献 1参照）。 ISH法は組織内の特定の遺伝子の発現の有無や量の比較に広く用いられている。 FISH法は染色体上の特定の遺伝子領域の判別に広く用いられている。

[0005] また、 PCR法で標的核酸を増幅し、 ISH法によりプローブを用いてハイブリダィゼーシヨンさせ、最終的に顕微鏡で検出する in situ PCR法 (例えば、非特許文献 2参照)も存在するが、反応に最適な条件を出すのが困難であるため再現性に乏しぐ一般化していない。

[0006] 本出願人は、 ISH法に基づいて末梢血における白血球中の細菌検出キット「ハイブリゼップ (登録商標）」を体外診断用医薬品（承認番号: AMZ00620000)として販売してレ、る。「ハイブリゼップ (登録商標）」を用いた場合、従来用いられている血液培養法と比較して約 4倍の感度で菌を検出することが可能となり、少なくとも 3日以上を要した検查時間を 1日以内で行うことが可能となったことから、感染症分野において脚光を浴びている（例えば、非特許文献 6参照）。なお、本出願人は、食細胞に貪食された外来微生物を ISH法に基づいて検出および同定のための方法（特許文献 2参照）およびその改良方法 (特許文献 3参照）を提案しており、「ハイブリゼップ (登録商標）」はこれらの発明に基づいて開発された商品である。

[0007] 〔特許文献 1〕特許第 3433929号公報 (登録日：平成 15年 5月 30日、発行日：平成

15年 8月 4日）

〔特許文献 2〕国際公開 WO89/10411 (国際公開日： 1989年 11月 2日、対応公告公報：特公平 07 - 40号）

〔特許文献 3〕国際公開 WO02/099133 (国際公開日： 2002年 12月 12日）

L非特千文献 1」 bambrook et al. 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third EditionJ Cold Spring Harbor Laboratory (2001)

〔非特許文献 2〕監修：真木寿治、 rpCR Tips 使いこなすためのコッとヒント一」秀潤社（1999)

L非特千文献 3」Tsugunon Notomi et ai. Loop - mediated isothermal amplincation or DNA. Nucleic Acids Research, vol.28, No.12: e63 (2000)

〔非特許文献 4〕 Lizardi PM et al. Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nature Genetics, jul; 19(3):225-32. ( 1998)

〔非特許文献 5〕B.D.Hame_S, S.J.Higgins：著、堀越正美：訳「遺伝子発現と転写因子」メディカル'サイエンス 'インターナショナル（1996)

〔非特許文献 6〕松久明生、荒木宏昌、「In Situ Hybridization法による敗血症診断の臨床的有用性」、 BIO Clinica、北隆館、 1999年、 14卷、 1号、 p. 97—101

ここで、ある特定の核酸や遺伝子の存在の有無を調べたい場合に用いる、上記 PC R法等の核酸増幅方法や、 ISH法等のハイブリダィゼーシヨンを用いる方法では、標的とする核酸や遺伝子が試料中に微量しか存在しない場合に、十分な検出感度、再現性、簡便性等を実現できなレ、場合があるとレ、う課題を有してレ、る。

[0008] まず、 PCR法等の核酸増幅方法を用いる方法では、試料から核酸を抽出する必要力ある。この核酸を抽出する過程で、核酸のロスが生じることを回避することは困難である。例えば、試料中に増幅するための铸型として必要な量の標的核酸が含まれていたとしても、核酸抽出過程のロスにより铸型として必要な量が回収できなかった場合には、増幅効率が低下するため標的核酸を十分増幅できず、試料中の標的核酸を検出できない場合が生じ得る。このような場合は、偽陰性となり、正確な結果が得られない。また、同一の試料を用いた場合でも、核酸抽出過程のロスの程度により異なつた結果が得られる可能性があり、再現性が乏しくなる。すなわち、核酸の抽出を必要とする核酸増幅方法においては、試料中に含まれる標的の核酸が非常に微量である場合に、核酸抽出過程の核酸のロスにより、増幅効率の低下に起因する検出感度の低下を招くという問題がある。

[0009] また、増幅反応を阻害する物質 (例えば、へパリン、界面活性剤、タンパク質変性剤、有機溶媒等）が試料溶液中に含まれている場合があり、上記と同様に、増幅効率の低下に起因する検出感度の低下を招くという問題もある。

[0010] 次に、 ISH法等のハイブリダィゼーシヨンを用いる方法では、試料から核酸を抽出する必要がないため核酸のロスは生じないが、試料に含まれる標的の核酸が非常に微量である場合には、標的核酸とハイブリッドを形成しているプローブ核酸を検出するのが困難であるという問題がある。 [0011] また、本出願人が開発した「ハイブリゼップ (登録商標）」は、 ISH法に基づいて末梢血における白血球中の細菌を高感度かつ迅速に検出することを可能とした力克服すべき課題として以下の 2点を挙げることができる。

1)菌のシグナルの有無は顕微鏡による肉眼的観察に委ねられているため、ある程度の熟練を要すること。

2)白血球に貪食された細菌のみが検出標的であるため、白血球数の減少した患者の臨床検体については、検出率が低下すること。

[0012] 本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、試料中に含まれる標的核酸が非常に微量であっても、正確かつ迅速に標的核酸を検出することが可能な核酸検出方法を提供することにある。

発明の開示

[0013] 本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、試料を支持体に固定し、試料力核酸を抽出せずにそのまま支持体上で核酸を増幅することにより、試料中の核酸のロスに伴う検出感度の低下を招くことなぐ簡便かつ迅速に試料中の標的核酸の検出が可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は、以下の発明を包含する。

[0014] (1)細胞を含む試料を支持体に固定する試料固定化工程と、試料中の核酸を支持体上で増幅する核酸増幅工程と、増幅された核酸が標的の核酸であるか否力、を判定する判定工程とを含むことを特徴とする核酸検出方法。

[0015] (2)上記核酸増幅工程の前段に、試料に含まれる核酸を露出させる核酸露出工程を含むことを特徴とする、（1)に記載の核酸検出方法。

[0016] (3)上記核酸露出工程における核酸露出方法として、界面活性剤処理法、酵素処理法または加熱処理法のいずれか 1の方法、あるいは 2以上の方法を組み合わせて用いることを特徴とする（2)に記載の核酸検出方法。

[0017] (4)上記核酸増幅工程における核酸増幅方法として、 PCR (ポリメラーゼ連鎖反応

)法を用いることを特徴とする（1)ないし（3)のいずれ力 1項に記載の核酸検出方法。

[0018] (5)上記核酸増幅工程において増幅された核酸を標識することを特徴とする（1)ないし (4)のいずれ力 1項に記載の核酸検出方法。 [0019] (6)上記判定工程における判定方法として、核酸増幅工程で増幅かつ標識された核酸をプローブとし、当該プローブと既知の遺伝子断片との相補的なハイブリダィゼーシヨンを指標として標的の核酸であるか否力を判定することを特徴とする（5)に記載の核酸検出方法。

[0020] (7)上記既知の遺伝子断片は、あらかじめ支持体に固定されていることを特徴とする（6)に記載の核酸検出方法。

[0021] (8)上記判定工程における判定方法として、核酸増幅工程で増幅かつ標識された核酸をプローブとし、 DNAマイクロアレイを用いて標的の核酸であるか否かを判定することを特徴とする（5)に記載の核酸検出方法。

[0022] (9)上記試料は生体由来試料であることを特徴とする（1)ないし (8)のいずれか 1 項に記載の核酸検出方法。

[0023] (10)上記生体由来試料はヒト由来であることを特徴とする（9)に記載の核酸検出方法。

[0024] (11) (1)ないし（10)のいずれ力 1項に記載の核酸検出方法を実施するためのキットであって、試料中の標的遺伝子を検出するために使用する遺伝子検出キット。

[0025] (12) (10)に記載の核酸検出方法を実施するためのキットであって、ヒトの疾病関連遺伝子を検出するために使用する遺伝子検出キット。

[0026] (13)上記ヒトの疾患関連遺伝子はヒトに感染した感染症原因微生物の遺伝子である（ 12)に記載の遺伝子検出キット。

[0027] (14)上記ヒトに感染した感染症原因微生物の遺伝子は薬剤耐性遺伝子である（1

3)に記載の遺伝子検出キット。

[0028] (15)上記ヒトに感染した感染症原因微生物の遺伝子は薬剤感受性遺伝子である（

13)に記載の遺伝子検出キット。

[0029] (16)上記ヒトの疾患関連遺伝子は癌マーカー遺伝子である（12)に記載の遺伝子検出キット。

[0030] (17)上記ヒトの疾患関連遺伝子は遺伝性疾患関連遺伝子である（12)に記載の遺伝子検出キット。

[0031] (18)少なくとも、標的遺伝子増幅プライマー、 PCR反応用緩衝液、デォキシヌタレオシド三リン酸混合液、標識デォキシヌクレオシド三リン酸、耐熱性 DNA合成酵素、試料固定化用支持体、増幅核酸検出用指示薬を含むことを特徴とする（11)ないし（ 17)のいずれ力 1項に記載の遺伝子検出キット。

[0032] 上記の構成によれば、試料中に含まれる標的核酸が非常に微量であっても核酸の抽出に起因する核酸のロスがほとんど生じず、高感度、高精度で再現性よく標的確酸を検出することが可能となる。また、簡便かつ迅速に実施でき、結果の判定に熟練を要しない。

[0033] 本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるだろう。

図面の簡単な説明

[0034] [図 1]本発明に係る核酸検出方法の一例を示した図である。

[図 2]試料に貪食サンプルを用いて、本発明の核酸検出方法により白血球に貪食された微生物を検出した結果を示す電気泳動画像である。

[図 3]試料に敗血症患者の臨床検体を用いて、本発明の核酸検出方法により白血球に貪食された微生物を検出した結果を示す電気泳動画像である。

[図 4]試料に敗血症血液モデルを用いて、本発明の核酸検出方法により白血球における IL6の発現増加を検出した結果を示す電気泳動画像である。

発明を実施するための最良の形態

[0035] 本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。

[0036] 1.本発明に係る核酸検出方法

本発明に係る核酸検出方法は、細胞を含む試料を支持体に固定する試料固定化工程と、試料中の核酸を支持体上で増幅する核酸増幅工程と、増幅された核酸が標的の核酸であるか否かを判定する判定工程とを含むことを特徴としており、さらに、核酸増幅工程の前段に、試料に含まれる核酸を露出させる核酸露出工程が含まれてレ、てもよい。図 1に、本発明に係る核酸検出方法の 1つの実施形態を示した。図 1に示した実施形態では、生体由来試料を支持体に固定 (試料固定化工程)し、疾病関連遺伝子由来のプライマーを含む PCRミクスチヤ一を加えて PCRを行う（核酸増幅工程)。この核酸増幅工程において核酸増幅と同時に、または核酸増幅後に増幅された核酸を標識する（詳細は後述する。）。そして最後に、電気泳動（ァガロースゲル電気泳動、キヤピラリー電気泳動等）、定量 PCR、ドットハイブリダィゼーシヨン (マクロアレイ、マイクロアレイ等）等の核酸検出手段を用いて、増幅された核酸が標的の核酸であるか否かを判定する（判定工程)。なお、本発明に係る核酸検出方法は、図 1 に示した実施形態に限定されるものではない。以下に本核酸検出方法について、その特徴を詳細に説明する。

[0037] (1)試料固定化工程

試料固定化工程は、試料を支持体に固定化する工程である。試料を支持体に固定化することにより、核酸増幅や標識の際に一般的に行なわれる核酸精製工程を省くことができる。また、試料溶液に核酸の増幅反応を阻害する物質 (例えば、へパリン、 EDTA_2Na、陽イオン、高蛋白溶液、高塩濃度溶液、界面活性剤含有溶液、タンパク変性溶液 (尿素、グァニジン塩酸等）、有機溶媒等）が含まれている場合に、これらの増幅阻害物質は通常細胞内に滞留することがないため、試料を支持体に固定化することにより容易に除去することができる。さらに、試料を支持体に固定化することにより、核酸を安定に保存することも可能となる。

[0038] 〔試料〕

本発明に係る核酸検出方法（以下、適宜「本検出方法」と略記する。）に用いる試料は、細胞を含む試料であればよい。本検出方法により検出する標的核酸は、 DNA ( デォキシリボ核酸）および RNA (リボ核酸）のいずれでもよい。細胞にはこれらの核酸 (DNAおよび RNA)が含まれているため、その中の標的核酸を本検出方法で検出すること力 S可能となる。細胞の種類は限定されるものではなぐ動物細胞、植物細胞、微生物細胞等のあらゆる細胞を対象とすることができる。また、試料の細胞以外の部分は、後述する核酸露出工程において化学処理、酵素処理、加熱処理等により消化可能であって、含まれる細胞の核酸が露出できるものであればよい。本検出方法に用レ、る試料としては、細胞を含む生体由来試料が好適であるが、これに限定されるものではなぐ生体に由来しない試料にも本検出方法を適用することは可能である。 [0039] 生体に由来しなレ、試料としては、例えば、細胞を含む食品材料、土、水、繊維、埃等を挙げることができる。生体由来試料としては、動物および植物の生体構成成分を好適に用いることができる。ヒトを含む動物由来の試料としては、例えば血液、組織液、リンパ液、脳脊髄液、膿、粘液、鼻水、喀痰、尿、糞便、腹水等の体液類、皮膚、肺、腎、粘膜、各種臓器、骨等の組織、鼻腔、気管支、皮膚、各種臓器、骨等を洗浄した後の洗浄液を挙げることができる。さらにヒトの場合は透析排液も試料とすることが可能である。

[0040] また、本検出方法の標的とする核酸は試料に含まれる細胞固有の核酸に限定されず、細胞に感染したウィルスの核酸や、細胞が貪食した微生物等の核酸にも適用すること力 S可能である。したがって、感染症患者の貪食細胞（白血球等）を含む生体由来試料は、本検出方法の試料として好適である。

[0041] 〔支持体〕

支持体は、その表面に試料を固定化するとともに、当該支持体上で試料中の標的核酸を増幅するために用いるものである。したがって、このような目的を達成できる支持体であれば、材質、形状等は特に限定されるものではない。材質としては、例えば、ガラス、金属、合成樹脂（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニノレ、ポリエステル、ポリアクリル酸エステル、ナイロン、ポリアセタール、フッ素樹脂等）、多糖類 (セルロース、ァガロース等）、濾紙等を挙げることができる。また、形状としては、例えば、板状、盆状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、管状等の種々の形状とすることができ、本検出方法を実施する条件に合わせて適宜好ましレ、形状のものを選択すればよい。

[0042] 一つの支持体に対して 1試料を固定化し、試料数に応じた数の支持体を用いてもよいが、作業を効率的に行うためには一つの支持体に複数の試料を固定化できることが好ましい。また、本検出方法では、試料固定化工程→核酸増幅工程、または試料固定化工程→核酸露出工程→核酸増幅工程を同一支持体上で一連の操作として行うため、一つの支持体に複数の試料を固定化した場合に、隣接する試料が混じり合わないようにする必要がある。したがって、本検出方法に用いる支持体としては一つの支持体上に複数の分離した区画を有するものが好ましい。さらに、本検出方法の核酸増幅工程において、 PCR法を用いて核酸を増幅する場合には、耐熱性素材であることが好ましい。さらに、市販されている PCR用遺伝子増幅機器 (サーマルサイクラ一）に適合する形状であることが特に好ましレ、。

[0043] 〔固定〕

本発明に係る核酸検出方法において、固定とは、試料を何らかの方法により支持体に固着、保持させることを意味する。本検出方法に用いる固定方法は特に限定されるものではなぐ従来公知の固定方法を適宜選択して用いればよい。公知の固定方法としては、共有結合やイオン結合などで不溶性の担体に結合させる担体結合法、架橋試薬により共有結合で結び付け不溶化する架橋法、高分子ゲルや半透膜などで包み込む包括法、脱水によりタンパクを急速に変性させ担体に固着させる方法等を挙げることができる。より具体的には、カルノア固定、アルコール固定、火焰固定、ダルタルアルデヒド固定、乾燥固定、アセトン固定、メタノーノレ固定、ホルマリン固定等を挙げることができる。

[0044] また、支持体の表面に試料を接着させることも固定に含まれる。したがって、支持担体の表面に接着性を高める物質、例えば、 3—ァミノプロピルトリエトキシシラン (APS )、ポリ- L-リジン、ゼラチン等をコートしておくことも可能である。このような処理を施した支持体を用いれば、試料の種類によっては十分に支持体に固着、保持させることができる。また、支持体に接着固定した上に、上記例示した固定方法を併用することも可能である。

[0045] (2)核酸露出工程

核酸増幅工程において試料中に含まれる核酸を増幅するためには、プライマーや核酸合成酵素が標的核酸に到達できることが必須である。試料によっては標的核酸が試料表面に露出している場合もあり、このような試料については試料固定化工程力直接核酸増幅工程に進むことができる。したがって、本核酸露出工程は、本検出方法の必須の工程ではない。し力、しながら、標的核酸が試料表面に露出していない場合には、核酸露出工程を設けて標的核酸を露出させることが必要となる。

[0046] 核酸露出工程に用いる方法としては、界面活性剤処理法（SDS、 TRITON-X,

TWEEN_20、 BRIJ、 NP_40、 CHAPS等）、プロテアーゼ等の酵素処理、加熱処理法等を挙げることができる。ただし、これらに限定されるものではなぐ用いる試料および標的核酸に応じて、適宜最適な方法を選択すればよい。例えば、細菌感染に起因する敗血症で、白血球に貪食された細菌の遺伝子を検出する場合、細菌の細胞壁を消化させる酵素としてリゾスタフイン、リゾチーム、 N—ァセチルムラミダーゼ、ザィモラ一ゼ等を使用することにより細菌、真菌等の微生物の遺伝子を露出させることができる

[0047] (3)核酸増幅工程

核酸増幅工程は、試料が固定化された支持体上で標的核酸を増幅する工程である。ここで、本発明に係る核酸検出方法は、試料中の核酸を抽出、精製することなぐ試料が固定化された支持体上で標的核酸の増幅を行うことに最大の特徴がある。これにより、標的核酸が試料中に微量しか存在しない場合においても、抽出および精製過程のロスが生じないため、検出感度の低下を招くことなく微量の標的核酸を検出すること力 S可能となる。また、作業の簡便化を図ることができ、作業時間を短縮することが可能となる。

[0048] 核酸増幅とは、標的核酸の任意の配列に対し特異的なプライマーまたはランダムな配列のプライマーと、 DNAポリメラーゼまたは RNAポリメラーゼとを用いて、試料中の核酸を増幅させることを意味する。増幅方法としては、従来公知の増幅方法を好適に用いることができる。具体的には、例えば、 PCR法、 Nested— PCR法、 RT— PCR 法、 ICAN法、 UCAN法、 LAMP法、プライマーエクステンション法、転写（トランスクリプシヨン）、複製（レプリケーシヨン)等を挙げることができる。

[0049] 上記例示した増幅方法の中でも PCR法は、本検出方法に用いる増幅方法として好適である。以下に、本検出方法の核酸増幅工程に PCR法を用いた場合について説明する。

[0050] PCR法とは、特定の DNA領域を挟んだ 2種類のプライマーと DNA合成酵素（耐熱性 DNAポリメラーゼ、以下適宜「Taqポリメラーゼ」と表記する。）による DNA合成反応の試験管内における繰り返しで、その特定 DNA領域を増幅する方法であり、遺伝子工学分野において一般的に用いられている周知技術である。 PCR法には Nested —PCR法、 RT—PCR法等も含まれる。 [0051] Nested— PCR法とは、外側のプライマーと内側のプライマーを使って 2段階の PC Rを行う方法であり、目的とする領域からの最初の増幅産物を铸型にして、最初に使用したプライマー位置より両側とも内側にプライマーを設定して行う方法である。 Nes ted— PCRを用レ、ることにより、 1回目の PCRで標的核酸が検出可能な量まで十分増幅しない場合でも、 2回目の PCRにより検出可能な量に増幅させることが可能となる。また、 1回目の PCRで非特異的な増幅産物が生じた場合、これらの非特異的増幅産物は 2回目の PCRにおけるプライマーに類似した配列を持つ確率が極めて低くなる。したがって、 2回目の PCRでは標的の配列を有する断片のみを増幅する確率が高くなるため、非特異的増幅産物の発生による弊害を解消し、より正確に標的核酸を検出することが可能となる。

[0052] RT— PCR法とは、 mRNAに対して PCRを適用するための変法であり、 PCRの前段階として、逆転写酵素を用いて逆転写反応を行う工程を含む PCR法である。本検出方法に RT— PCR法を用いれば、標的核酸を mRNAとすることが可能となる。すなわち、本検出方法を遺伝子発現の検出に応用することが可能となる。

[0053] 上記〔支持体〕の項で述べたように、本検出方法では試料を固定化した支持体上で PCRを行うため、支持体は複数の分離した区画を有するものが好ましい。複数の分離した区画を有する支持体を用いた場合の具体的な PCRの手順としては、 PCRミクスチヤー（緩衝液、 dNTPmix, Taqポリメラーゼ等を混合したもの）を支持担体上の各区画の試料に添加し、さらにプライマーをカ卩えて PCR用遺伝子増幅機器 (サーマルサイクラ一）等を用いて PCRを行えばよい。プライマーについては、 1つの PCRにつレ、て様々な標的核酸を特異的に増幅するプライマーセットを用いる。 PCRの条件 (反応液の量、酵素や基質の濃度、反応温度等）は特に限定されるものではなぐ用いる試料および標的核酸に応じて、適宜最適な条件を選択すればょレ、。

[0054] Nested_PCRを行う場合には、 1回目の PCRを支持体上で行レ、、 2回目の PCRは PCRチューブ等を用いて行えばよい。なお、 2回目の PCRに用いるプライマーは、両側とも最初に使用したプライマー位置と同じ、または内側に設計しなければならない

[0055] PCRにより増幅される断片は、標的核酸が特異的に有する配列部分であることが好ましい。試料に含まれる核酸は標的部分以外の部分が大多数であるため、標的微生物に特異的な配列部分にプライマーを設計しなければ、非特異的な増幅産物が生じる可能性が高くなる。したがって、標的核酸の特異的配列をあら力じめ調べておき、その配列部分を増幅するようにプライマーを設計することが重要である。

[0056] 増幅される断片の長さは 50bp— 5，000bpの範囲内であることが好ましぐ lOObpp 2，000bpの範囲内であることがより好ましレ、。この範囲を外れると、特異的な増幅産物を有効に得ることができなくなるおそれがある。

[0057] 核酸増幅工程においては、増幅された核酸を標識することが好ましい。これにより、後段の判定工程を効率的に実施することができる。核酸の標識は増幅と同時または増幅後に行うことができる。標識手段としては、放射性標識、ハプテン (ピオチン、ジゴキシゲニン等)標識、蛍光標識等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

[0058] 核酸増幅方法として、核酸の増幅と同時に行う場合は、前述の PCR法、 Nested - PCR法、 RT— PCR法、 ICAN法、 UCAN法、 LAMP法、プライマーェクステンション法、転写（トランスクリプション）、複製 (レプリケーシヨン)等の増幅反応を行う際に、例えばジゴキシゲニンやピオチン等のハプテン、 FITC、放射性同位体で標識されたヌクレオチドアナログを基質とすれば、増幅反応中に標的核酸を標識することができる。また、増幅反応の際、末端を標識したプライマーを使用することによつても、標的核酸を標識することができる。増幅反応後に標識する場合は、ニックトランスレーション法ゃランダムプライム法、プライマーエクステンション法、 TdT法、 5'カイネーシヨン法等を用いることができる。この場合も標識されたヌクレオチドアナログを基質としたり、末端を標識したプライマーを使用することによって標識することができる。

[0059] 核酸増幅工程において、標的核酸の任意の配列に対し特異的なプライマーを用いた場合には、既知の塩基配歹 [Jを有する核酸断片を増幅することができる。一方、ランダムな配列のプライマーを用いた場合には、非特異的に核酸が増幅されるため、どのような塩基配列を有する核酸断片が生じるかは予想できなレ、。核酸増幅工程において既知の塩基配列を有する核酸断片を増幅するように設計されたプライマーを用いた場合には、後述する判定工程において、塩基配列の確認や既知の塩基配列を有する核酸断片とのハイブリダィゼーシヨンにより、標的の核酸であるか否かを判定すること力 Sできる。ランダムな配列のプライマーを用いた場合には、後述する判定ェ程において、 DNAマイクロアレイ等を用いることにより、試料中に標的の核酸が含まれてレ、るか否かを判定することができる。

[0060] (4)判定工程

判定工程は、核酸増幅工程で増幅された核酸が標的の核酸断片であるか否かを判定する工程である。本発明に係る核酸検出方法は、核酸を増幅した後に検出を行うため、標的核酸が微量であるため検出が困難となる問題は生じない。また、公知の方法を適宜選択して用いることができるので、判定に熟練を要することもない。

[0061] 判定には増幅された核酸断片の長さや塩基配列を確認することが含まれることはいうまでもないが、増幅された DNA断片の転写産物である RNAを確認することや、増幅された核酸断片に基づいて発現させたタンパク質を確認することも含まれる。判定工程で用いる方法の具体例としては、核酸（DNAまたは RNA)を確認する方法として、ァガロースゲル電気泳動、定量 PCR、シークェンス、ドットハイブリダィゼーシヨン、 DNAマイクロアレイ、サザン 'ノヽイブリダィゼーシヨン、ノーザン 'ハイブリダィゼーシヨン等を挙げることができ、タンパク質を確認する方法として、 SDS-PAGE、ゥエスタン.ブロッテイング、質量分析法（MALDト TOF_MS、 LC_MS、 LC-MS/MS等）等を挙げること力 Sできる。ただし、これらの方法に限定されるものではなぐ適宜適当な方法を選択して使用すればよい。

[0062] もっとも簡便な判定方法としては、ァガロースゲル電気泳動を挙げることができる。

し力しながら、この方法は、試料から増幅された核酸断片の長さと、標的核酸のみを铸型として増幅した場合の核酸断片の長さとを比較して、一致するか否かを確認するものであるため、非特異的な増幅産物が偶然類似する長さである場合に誤った結果 (擬陽性)を導くことがあり得る。増幅された核酸が標的核酸と一致するか否力 ^正確に判定するために最も信頼性が高レ、方法は、増幅核酸の塩基配列を確認する方法（シークェンス）である。この方法を用いれば、 SNP (single nucleotide polymorphism) を検出することも可能となる。

[0063] 標的核酸が増幅されているか否力、を簡便かつ正確に判定する方法として、標識された増幅核酸をプローブとし、当該プローブと既知の遺伝子断片との相補的なハイブリダィゼーシヨンを指標として標的核酸であるか否力を判定する方法を用いることが好ましレ、。また、この方法を用いる場合、プローブとする核酸は、ハイブリダィゼーションの対象とする上記既知の遺伝子断片の塩基配列を有するように設定されたプライマーを用いて増幅されることが好ましい。さらに、ハイブリダィゼーシヨンの対象とする上記既知の遺伝子断片はあら力、じめ支持体に固定されていることが好ましい。あらかじめ既知の遺伝子断片を支持体に固定することにより、プローブとのハイブリダィゼーシヨンを正確に捕捉できる。また、既知の遺伝子断片に位置情報を持たせることが可能となり、様々な既知の遺伝子断片を整列させることにより、一度に多数の遺伝子を検出し得る。

[0064] 具体的には、例えば標的核酸をあらかじめナイロンメンブレン等にスポット（固定）しておき、増幅された核酸をプローブとしてハイブリダィゼーシヨンさせる。スポットされた核酸と増幅された核酸との間にハイブリダィゼーシヨンが成立すれば、試料中に標的の核酸が存在していたと判定することができる。一方、核酸増幅工程において核酸が増幅されてレ、なレ、場合や、標的の核酸でなレ、核酸が非特異的に増幅されてレ、た場合はハイブリダィゼーシヨンが成立せず、試料中に標的の核酸が存在していたと判定することができる。

[0065] ハイブリダィゼーシヨンの対象とする上記既知の遺伝子断片は、核酸増幅工程により増幅される予定の塩基配列部分を含んでいれば特に限定されるものではないが、増幅される予定の塩基配列部分のみ、または増幅される予定の塩基配列部分の一部であることが好ましレ、。増幅される予定の塩基配列部分以外の塩基配列配列を含んでいる場合には、増幅された核酸が目的の配列を有しない非特異的増幅産物であった場合に、ハイブリダィズする可能性があるからである。

[0066] ハイブリダィゼーシヨンは、既知の遺伝子断片に対して標識された増幅核酸をプローブとして、公知の方法により行えばよレ、。公知の方法としては、例えば、 J.

bambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, i，hird Edition,し old Spring Harbor Laboratory (2001)に記載されている方法等を挙げることができる力これ限定されるものではない。 [0067] また、核酸増幅工程で増幅かつ標識された核酸をプローブとし、 DNAマイクロアレィを用いて標的核酸の存在の有無を判定する方法を用いることもできる。ここで、 DN Aマイクロアレイには、いわゆるオリゴ DNAタイプのものと cDNAタイプのものとのレヽずれをも含むものとする。また、 DNAマイクロアレイは市販のものを用いてもよぐ自製のものを用いてもょレ、。判定工程にぉレ、て DNAマイクロアレイを用いる場合には、上述したように、核酸増幅工程においてランダムな配列のプライマーを用いて非特異的に増幅された核酸中に標的核酸が存在するか否力、を判定することができる。

[0068] (5)本発明に係る核酸検出方法の適用範囲

本検出方法の適用範囲としては、従来の遺伝子診断と言われる分野すべてに適用可能である。例示すれば以下のとおりであるが、これらに限定されるものではない。 a)病原微生物 (細菌、真菌、ウィルス、寄生虫等）の検出、すなわち感染症の分子診断

b)がんの分子診断

c)出生前の遺伝性疾患等の分子診断

d)薬物代謝に関与する遺伝子の分子診断

e)法医学サンプルからの分子診断

f)疾病マーカー遺伝子の分子診断

g)移植時の組織タイピング

h)適合性テスト

i) SNPs検出

本発明に係る核酸検出方法は、上記 a)に示した感染症の分子診断に用いることが最適であると考えられる。その理由を以下に説明する。

[0069] 病原微生物は血液中または体液中に浮遊して存在している可能性は低ぐ宿主細胞に侵入してはじめて感染症を発症させる。したがって、感染症の病原微生物を検出するための試料としては白血球等の免疫系細胞が好適であるといえる。そして、細胞に貪食された細菌や細胞に侵入したウィルス等を検出する手段としては、試料から核酸を抽出した後に増幅する従来の PCR法や、核酸を増幅することなく標的核酸の検出を行う ISH法では十分な検出感度、再現性、簡便性等を実現できない場合がある。一方、本発明に係る核酸検出方法では、細菌を貪食した細胞やウィルス等が侵入した細胞を直接支持体に固定化し、そのままの状態で細胞中の細菌やウィルス等の核酸を増幅して検出するものであるため、上記従来の方法と比較して顕著に検出感度および精度が向上することは明らかである。

[0070] また、従来細胞内の病原微生物等を検出する方法として in situ PCR法がある。この方法は、細胞をスライドグラスに固定化し、細胞内で PCRを行レ、、細胞内で増幅した産物を ISH法によりプローブをハイブリダィゼーシヨンさせて視覚化し、顕微鏡で検出するものである。したがって、 in situ PCR法は本発明に係る核酸検出方法と同等の検出感度が期待できるが、条件設定が難しぐ再現性に乏しいという問題点がある。さらに、非特異的反応が多ぐ非特異的増幅産物を標的の特異的増幅産物と細胞内で区別することは困難であるという問題点がある。

[0071] 以上より、本発明に係る核酸検出方法は、細胞に貪食された細菌や細胞に侵入したウィルス等を検出する手段として非常に優れた方法であるといえる。

[0072] 2.本発明に係る遺伝子検出キット

本発明に係る遺伝子検出キット（以下、適宜「本キット」と略記する。）は、本発明に係る核酸検出方法を用レ、て試料中の標的遺伝子を検出するために用レ、るキットである。本検出方法に用いる試薬、器具類をキット化することにより、本検出方法を簡便に実施することが可能となり、一層短時間で正確な検出結果を得ることが可能となる。なお、遺伝子には DNAおよび RNAが含まれる。

[0073] (1)本キットの構成

本キットには、少なくとも試料固定化工程で使用する試料固定化用支持体、核酸増幅工程で使用するプライマー、核酸合成酵素、基質 (ヌクレオシド三リン酸）、緩衝液等の試薬、判定工程で使用する増幅核酸検出用指示薬等の試薬および器具等が含まれていることが好ましい。また、用いる試料を特定したキットとすることにより核酸露出工程が必要である場合には、核酸露出用の試薬 (界面活性剤やタンパク質分解酵素等）を含ませることができる。また、用レ、る試料に適した固定用試薬を含ませること力 Sできる。例えば、白血球を含む生体由来試料に特定し、白血球に貪食された細菌等の微生物のゲノムを標的核酸とするキットの場合には、固定用試薬 (例えば、カルノア固定液等）および核酸露出用試薬 (微生物の細胞壁分解酵素等）を含ませることが好ましい。

[0074] さらに、核酸増幅方法および判定方法を特定することにより、キットに含まれる試薬の構成を具体化することが可能となる。例えば、核酸増幅方法を PCR法とする場合は、核酸増幅工程で用いる試薬は PCR反応用緩衝液、デォキシヌクレオシド三リン酸混合液、耐熱性 DNA合成酵素 (Taqポリメラーゼ）となる。また、 PCRにより核酸を標識することが必要であれば、さらに標識デォキシヌクレオシド三リン酸を含ませればよい。

[0075] 判定方法をァガロースゲル電気泳動法とする場合は、ァガロースゲル、電気泳動用緩衝液、分子量マーカー、核酸染色用試薬等をキットに含ませればよい。判定方法をドットハイブリダィゼーシヨンとする場合は、標的核酸をスポット（固定）したメンブレン、ハイブリダィゼーシヨン用緩衝液、核酸の標識に応じた検出用指示薬 (例えば、ジゴキシゲニン標識を用いた場合には酵素標識した抗ジゴキシゲニン抗体、標識した酵素を発色させるための基質等）、ハイプリバッグ、その他必要な試薬、器具等をキットに含ませればよい。核酸検出方法を DNAマイクロアレイとする場合は、標的核酸に応じた DNAマイクロアレイおよび必要な試薬、器具等をキットに含ませればよい

[0076] すなわち、本発明に係る核酸検出方法に用いる試料、標的遺伝子、核酸増幅方法、核酸検出方法を具体的に特定することにより、用いる試薬、器具等を様々に組み合わせてキットを構成することが可能となる。なお、本キットの構成は上記例示した試薬、器具等に限定されるものではなぐ目的に応じて適当な公知の試薬、器具等を適宜選択して用いればよい。

[0077] (2)標的遺伝子

一つのキットに含まれる標的遺伝子は 1遺伝子に限定する必要はなぐ複数のブライマ一セットをキットに含ませることにより、複数の標的遺伝子を検出可能なキットとすること力 Sできる。例えば、疾病関連遺伝子を標的とするキットには、同一の試料から検出することが可能な複数の疾病関連遺伝子を標的とできる。より具体的には、感染症の原因微生物の遺伝子を標的とする場合には、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、緑膿菌、腸球菌、大腸菌等を特異的に検出可能なプライマーセットをキットに含ませればよい。このような感染症の原因微生物の標的遺伝子としては、薬剤耐性遺伝子や感受性遺伝子であることが好ましレ、。

[0078] また、癌マーカー遺伝子を標的とする場合には、 p53、 MDM2、 H_ras、 K_ras、

N-ras、 APC、 Myc、 HER2/neu、 BRCA1、 BRCA2、 erbB、 src、 fos、 jun、 raf、 fes、 erb-A 、 fms、 sis、 Rb、 WT1等を特異的に検出可能なプライマーセットをキットに含ませればよい。また、遺伝性疾患関連遺伝子を標的とする場合には、例えば、色素性乾皮症関連遺伝子（XPA、 XPB、 XPC、 XPD、 XPE、 XPF/ERCC1、 XPV)、家族性大腸癌関連遺伝子 (APC)、アルツハイマー病関連遺伝子 (apoE4)、冠状動脈性疾患関連遺伝子（apoE2)、 Von Hippe卜 Lindau病関連遺伝子 (VHL)、筋ジストロフィー関連遺伝子（ジストロフィン)等を特異的に検出可能なプライマーセットをキットに含ませればよレ、。

[0079] なお、本キットの適用範囲は上記「1. (5)本発明に係る核酸検出方法の適用範囲」と同一であり、従来の遺伝子診断と言われる分野すべてに適用可能である。したがつて、本キットの標的遺伝子はあらゆる遺伝子診断の分野から選択することが可能であり、上記例示したものに限定されるものではない。

[0080] 以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

[0081] <実施例 1.貪食サンプルを用いた核酸の検出 >

〔試料調製〕

予め外来微生物（黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus,以下 SA) ATCC 126000 、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis,以下 SE) ATCC 14990、緑膿菌（ Pseudomonas aeruginosa^ 卜 PA) ATCC 10145、月 ®球] kl (Enterococcus faecalis、以下 EF) ATCC 19433、大月昜菌（Escherichia coli、以下 EC) ATCC 11775)をブレインノヽートインフュージョン（BHI)培養液 (DIFCO)に植菌し、 37°Cで 8時間以上培養した。

[0082] 培養した菌液を、 4°C、 2,000 X gで 10分間遠心分離して集菌した。上清を捨てた後、菌のペレットを PBS 5mLを用いて懸濁し、再度 4°C、 2,000 X gで 10分間遠心分離して集菌した。集菌した菌を PBS 5mLで懸濁した後、 PBSにて希釈して吸光度計により菌液の濁度（OD=600nm)を、 0.01— 0.03に調整したものを 15mL作製した。作製した菌液を別々の 175cm²の培養用フラスコに移し、約 30分間室温にて静置した。

[0083] へパリン加健常ヒト血液 50mLを採取し、血液分離試薬 (塩化ナトリウム 225mgおよびデキストラン（MW200, 000— 300,000) 1.5gを滅菌精製水で溶解し、 25mLにメスアップしたもの）を約 4 : 1の割合でカ卩え、 37°C (20 40°C)で 30分間静置し、白血球画分を分取した。分取した白血球画分を PBSにて 50mLにした。

[0084] 上記菌液を入れて静置した培養用フラスコの上清を静かに捨て、上記 PBSで希釈した白血球画分を lOmLずつフラスコに加え、室温で約 10分間静置した。フラスコ内の上清を捨て、フラスコの底に付着した白血球を 0.02%EDTA含有 PBSlOmLで 15mL の遠沈管に回収し、 4°Cにて、 140 X g— 180 X gで 10分間遠心分離し、白血球を収集した。収集した白血球中に赤血球の混入が認められる場合には、滅菌精製水 ImLにて白血球の沈渣を穏やかに懸濁して溶血させた後、 PBS14mLをカ卩えて等張化した後、再度 4°Cにて、 140 X g— 180 X gで 10分間遠心分離を行い、白血球を収集した。

[0085] 収集した白血球を PBSで懸濁し、血球計算盤にて細胞数を計測し、 1 X 10⁴個/ μ L 一 5 X 10⁴個/ μ Lに調整した。このサンプルを貪食サンプルと称し、本実施例の試料とした。

[0086] 〔試料固定化工程〕

上記各食食サンプルを支持体として用いた TopYield strips (NUNC : 248909)の各ゥエルにそれぞれ 5 μ Lずつスメアーし、風乾した。各ゥエルに 100 μ Lの 75%エタノールを注ぎ 5分間固定および脱塩した。その後、 75%エタノールを廃棄し、サーマルサイクラーを用いて風乾した。

[0087] 〔核酸増幅工程〕

Nested_PCR法を用いて標的核酸の増幅を行った。まず、各貪食サンプノレが固定化されたゥエルに PCR関連試薬（1ゥヱルあたり TaKaRa Ex Taq (5units/ μ L)： 0.5 μ L(fmal 2.5U)、 10 X Ex Taq Buffer : 5 μ L、 dNTP mixture (各 2·5πιΜ) : 4 μ L、各細菌識別プライマー 2種： 0.4 μ Μ、滅菌精製水： up to 50 μ L)をカロえた。 1回目の PCR用プライマ一には、 SA識別プライマーとして以下に示す SA1T (配列番号 1 )および SA1B (配列番号 2)を使用した。 SE識別プライマーとして以下に示す SE1T (配列番号 5)および SE1B (配列番号 6)を使用した。

PA識別プライマーとして以下に示す PA1T (配列番号 9)および PA1B (配列番号 10 )を使用した。

EF識別プライマーとして以下に示す EF1T (配列番号 13)および EF1B (配列番号 1 4)を使用した。

EC識別プライマーとして以下に示す EC1T (配列番号 17)および EC1B (配列番号 1 8)を使用した。

サーマルサイクラ一は GeneAmp PCR System9700(PE Applied Biosystems)を使用し、 94°Cで 1分間保持した後、 94°Cで 1分間、 68°Cで 3分間の反応を 50サイクル繰り返し、 72°Cで 1分保持して 1回目の PCRを終了した。

2回目の PCR (Nested-PCR)は、上記組成の PCR関連試薬の入った PCRチューブに、 1回目の PCR反応液 5 μ Lを加えて行った。 2回目の PCR用プライマーには、 SA識別プライマーとして以下に示す SA2T (配列番号 3)および SA2B (配列番号 4)を使用した。

SA2T： 5 -TGTTCAACGCTTGATTAGTTTTATT-3'

SA2B： 5'-TCAATGAGGCCAAACGCACGGCTAT-3'

SE識別プライマーとして以下に示す SE2T (配列番号 7)および SE2B (配列番号 8)を使用した。

SE2T： 5'- ATTCTAGTAATTATGCAAGGGTTTC-3'

SE2B： 5 -TTTTCTGGTTCCTCGATATGTGGTG-3'

PA識別プライマーとして以下に示す PA2T (配列番号 11)および PA2B (配列番号 1 2)を使用した。

PA2T： 5'-AGTTCCGCCGAGAGGGCGAACATCG-3'

PA2B： 5'-TACTTCATGCAGTATTCCGCGCAAT-3'

EF識別プライマーとして以下に示す EF2T (配列番号 15)および EF2B (配列番号 1 6)を使用した。

EF2T： 5，— GTTCGATTATCCCACAAGATTATAT— 3'

EF2B： 5 -CTACTGAAACATCGTCTTAAAAAAA-3'

EC識別プライマーとして以下に示す EC2T (配列番号 19)および EC2B (配列番号 2 0)を使用した。

EC2T： 5 -AATTGGCCCCCAACTGGTGTACCCC-3'

EC2B： 5 -CCATTGCCTGGGCGCGAATTTTCCC-3'

サーマルサイクラ一は 1回目と同様に GeneAmp PCR System9700(PE Applied Biosystems)を使用し、 94°Cで 1分間保持した後、 94°Cで 1分間、 68°Cで 1分間の反応を 30サイクル繰り返し、 72°Cで 1分保持して 2回目の PCRを終了した。

[0089] 〔判定工程〕

1 %ァガロースゲル電気泳動（ァガロース： Agarose-RE for≥lKbp fragment, for Restriction and Ligation(nacalai tesque))により、増幅した PCR産物を分離し、ェチジゥム 'ブロマイドにより染色した。使用した各細菌を铸型として同一のプライマーを用いて行った PCRの結果と比較することにより、標的核酸が増幅されているか否かを確認した。

[0090] 〔結果〕

結果を図 2に示した。左側が各細菌を铸型として PCRを行った結果を示したものであり、右側が各貪食サンプルを試料として本発明にかかる核酸検出方法を用いて各細菌の標的核酸を増幅した結果を示したものである。図中の Mは分子量マーカーを表し、左端の数値は分子量 (bp)を示している。図 1から明らかなように、貪食サンプルの 2回目の PCR (2 ND-PCR(nested))のバンドの位置は、各細菌を铸型として PCR を行った場合の 2回目の PCR (2 ND-PCR(nested))のバンドの位置と同一であり、標的の核酸が検出されたことを示してレ、る。

[0091] <実施例 2.敗血症患者からの起因菌の判定 >

〔試料調製〕

敗血症が疑われる患者より、血液 5mLを採取し、へパリンを加えた（へパリン加血液 )。へパリン加血液に血液分離試薬（塩化ナトリウム 225mg、デキストラン (MW200,000 一 300,000)1.5gを滅菌精製水で溶解し、 25mLにメスアップしたもの）を約 4 : 1の割合で加え、 37°C(20— 40°C)で 30分間静置し、白血球画分を分取した。 4°Cにて 140— 180 X gで 10分間遠心分離し、白血球を収集した。収集した白血球中に赤血球の混入が認められる場合には、滅菌精製水 lmLにて白血球の沈さを穏やかに懸濁して溶血させた後、 PBS 14mLを加えて等張化した後、再度 4°Cにて 140— 180 X gで 10分間遠心分離し、白血球を収集した。収集した白血球を PBS 150 しで懸濁した。これを臨床検体と称し、試料とした。

[0092] 〔試料の固定化〕

上記試料を支持体として用いた TopYield strips(NUNC:248909)の各ゥエルにそれぞれ 5 μ Lずつスメアーし、サーマルサイクラ一 (GeneAmp PCR System9700(PE Appleid Biosystems))を用いて 42°Cで風乾した。各ゥエルに 100 μ Lの 75%エタノールを注ぎ 5分間固定および脱塩した。その後、 75%エタノールを廃棄し、サーマルサイクラーを用いて 42°Cで風乾した。

[0093] 〔試料の前処理 (核酸露出工程)〕

各ゥエルに酵素試薬（サポニン 125 μ g、 t -ォクチルフエノキシポリエトキシエタノール (比重 1.068— 1.075(20/4°C), pH(5w/v%)5.5— 7.5) 125nL、 N -ァセチルムラミダーゼ（生化学工業社製） 50単位、リゾチーム（生化学工業社製） 5000単位、リゾスタフイン（ SIGMA社製） 5単位を滅菌精製水 lmLに溶力、して調製したもの） 10 x Lを入れ、サーマルサイクラ一を用いて、 37°Cにて 10分処理後、 95°Cにて 10分間処理し酵素の失活およびゥヱルを風乾させた。 [0094] ただし、 N-ァセチルムラミダーゼは、 S. salivarius IF03350の熱処理細胞を 37°C、 pH7.0で 1分間に l g溶菌する酵素活性を 1単位とした。リゾチームは、 M. luteusを 35 °C、 pH6.2で 1分間に 540nmの吸収を 0.001下げるときの酵素活性を 1単位とした。リゾスタフィンは、 S. aureusを 37。C、 ρΗ7· 5で 10分間に 620nmの吸収を 0.240から 0.125に下げるときの酵素活性を 1単位とした。

[0095] 〔核酸増幅工程〕

Nested_PCR法を用いて標的核酸の増幅を行った。まず、試料が固定化されたゥ工ルに PCR関連試薬（1ゥエルあたり TaKaRa LA Taq： 0.2 μ L、 10 X LA Taq Buffer： 2 μ L、 25mM MgC12 : 2 μ L 、 dNTP mixture (各 2.5mM)： 3.2 μ L、各細菌識別プライマー 2種：各 0.16 μ M、滅菌精製水で 20 μ Lに調整した)を加えた。

[0096] 1回目の PCR用プライマーには、上記実施例 1で使用したプライマーと同一のプライマーを使用した。すなわち、 SA識別プライマーとして SA1T (配列番号 1 )および SA1B (配列番号 2)を使用した。 SE識別プライマーとして SE1T (配列番号 5)および SE1B ( 配列番号 6)を使用した。 PA識別プライマーとして PA1T (配列番号 9)および PA1B (配列番号 10)を使用した。 EF識別プライマーとして EF1T (配列番号 13)および EF1B ( 配列番号 14)を使用した。 EC識別プライマーとして EC 1T (配列番号 17)および EC 1B (配列番号 18)を使用した。

[0097] サーマルサイクラ一は GeneAmp PCR System9700(PE Appleid Biosystems)を使用し、 94°Cで 1分間保持した後、 98°Cで 20秒、 68°Cで 3分間の反応サイクルを 30サイクル繰り返し、 72°Cで 5分保持して 1回目の PCR反応を終了した。

[0098] 2回目の PCR (Nested-PCR)は、上記組成の PCR関連試薬の入った PCRチューブに、 1回目の PCR反応液 1 μ Lを加えて行った。 2回目の PCR反応には以下のプライマ一を使用した。

SA識別プライマー

SA3T： 5 ' -ACTGTTCGTACAAACTTTTGTAATAGTTGGTCATG-3 ' (配列番号 2 1 )

SA3B： 5 ' -CTCGCCATCTTTCAAAGTTGGATCCATTGATTCAC-3 ' (配列番号 22) SE識別プライマー 3)

SE3B： 5 ' -GCAATGCACGTACTGCAATTGCACTTTCTTCCGGAG-3 ' (配列番号 24)

PA識別プライマー

PA3T： 5 ' -ATTCGATCGTCCTCTTGTTGTCGTTATCGGCATCG-3 ' (配列番号 2 5)

PA3B： 5 ' -TGGTGGAGCGTTCGATCCACGACGAGTTCGTCGAG-3 ' (配列番号 26)

EF識別プライマー

EF3T： 5 ' -ATCAGGCGTATCCATTATTGGATTAACCACGATTG-3 ' (配列番号 2 7)

8)

EC識別プライマー

9)

30)

サーマルサイクラ一は 1回目と同様に GeneAmp PCR System9700(PE Appleid Biosystems)を使用し、 94°Cで 1分間保持した後、 98°Cで 20秒、 68°Cで 1分間の反応サイタルを 30サイクル繰り返し、 72°Cで 5分保持して 2回目の PCR反応を終了した。

〔判定工程〕

1 %ァガロースゲル電気泳動（ァガロース： Agarose-RE for≥lKbp fragment, for Restriction and Ligation(nacalai tesque))により、増幅した PCR産物を分離し、ェチジゥム 'ブロマイドにより染色した。使用したプライマーに対応した各細菌を錡型として PCR反応を行レ、、標的核酸が増幅されていることを確認した（ポジティブ 'コントロール)。また、試料をスメアーしない状態で PCR反応を行レ、、標的核酸が非特異的に増幅してヽなレ、ことを確認した（ネガティブ 'コントロール）。

[0100] 〔結果〕

電気泳動の結果を図 3に示した。図中の左端の数値は分子量 (bp)を示している。図 3から明らかなように、レーン 13およびレーン 15に特異的な核酸の増幅が認められるため、この臨床検体は SA (黄色ブドウ球菌）および PA (緑膿菌）に感染している（陽性）と判定した。

[0101] なお、この臨床検体（臨床検体 1)を含めて 4例の臨床検体について、上記と同一の方法で起因菌を判定した結果を表 1に示す。

[0102] [表 1]

表 1から明らかなように、本発明の核酸検出方法は、敗血症患者の起因菌の判定に有効であることが示された。

[0103] <実施例 3.敗血症血液モデルからの生体因子（RNA)の検出 >

〔敗血症血液モデルの調製〕

予め外来微生物（大腸菌（Escherichia coli、以下 EC) ATCC11775)をブレインハートインフュージョン（BHI)培養液（DIFCO)に植菌し、 37°Cで 8時間以上培養した。培養した菌液を 4°C、 2000 X gで 10分間遠心分離して集菌した。上清を捨てた後、菌のペレットを PBS 5mLを用いて懸濁し、再度 4°C、 2000 X gで 10分間遠心分離して集菌した。集菌した菌を PBS 5mLで懸濁した後、 PBSにて希釈して吸光度計により菌液の濁度（OD=600nm)を、 0.1— 0.15に調整したものを 5mL作製した。へパリン加健常ヒト血液 8mLを採取し、 15mLの遠沈管 2本に 4mLずつ分注した。へパリン加血液 4mLに作製した菌液及び PBSを 400 Lカ卩え、 37°Cで 3時間静置し、炎症性サイト力インの発現を誘導した。

[0104] 上記へパリン加血液に血液分離試薬 (塩化ナトリウム 225mg、デキストラン (MW200, 000— 300,000)1.5gを滅菌精製水で溶解し、 25mLにメスアップしたもの）を約 4 : 1の割合でカ卩え、 37°C(20— 40°C)で 30分間静置し、白血球画分を分取した。 4°Cにて 140— 180 X gで 10分間遠心分離し、白血球を収集した。収集した白血球中に赤血球の混入が認められる場合には、滅菌精製水 lmLにて白血球の沈さを穏やかに懸濁して溶血させた後、 PBS14mLを加えて等張化した後、再度 4°Cにて 140— 180 X gで 10分間遠心分離し、白血球を収集した。収集した白血球を PBS150 z Lに懸濁した。これを敗血症血液モデルとし、試料とした。

[0105] 〔試料の固定化〕

上記試料を支持体として用いた TopYield strips(NUNC:248909)の各ゥヱルにそれぞれ 5 μ Lずつスメアーし、サーマルサイクラ一 (GeneAmp PCR System9700(PE Appleid Biosystems))を用いて 70°Cで風乾した。各ゥエルに 100 μ Lの 75%エタノールを注ぎ 5分間固定および脱塩した。その後、 75%エタノールを廃棄し、サーマルサイクラーを用いて 42°Cで風乾した。

[0106] 〔試料の前処理〕

各ゥエルに DNA分解酵素（DNaseI，RNase-free (Roche Diagnostics GmbH社製） 0·1 単位/ β L、 Tris-HCl 10mM、 MgC12 10mM、 DTT lmM、滅菌蒸留水） 10 μ Lを入れ、サーマルサイクラ一を用いて 37°Cにて 10分処理し白血球ゲノム DNAを分解した後、 70°Cにて 10分間処理し酵素の失活およびゥエルを風乾させた。

[0107] ただし、仔牛胸腺 DNAを基質として、 25°C、 pH5.0において反応液の 260nmの吸光度を 1分間に 0.001増加させる酵素活性を 1単位とした。

[0108] 〔核酸増幅工程〕

RT-PCR法を用いて標的核酸の増幅を行った。まず、逆転写反応（reverse transcription;RT)を行った。逆転写反応にはスーパースクリプトファーストストランドシステム（RT- PCR用）（Invitrogen)を使用した。試料が固定化されたゥエルに〇ligo(dT)12- 18(0.5 μ g/ μ L):l μ Lと滅菌蒸留水: 9 μ Lとを加え 70°Cで 10分間処理後、 4。Cにて 1分間静置した。次に 10 X PCR buifer[200mM Tris- HCl(pH 8.4), 500mM KCl]: 2 μ L、 25mM MgC12: 2 μ L、 lOmM dNTP mix: 1 μ L、 0.1M DTT: 2 μ Lをカロえて 25。Cにて 5分間静置した。その後、 Superscript II RT: 1 μ L(50 units)を加えて 25。C にて 10分、 42°Cで 50分、 70°Cで 15分間処理後、 4°Cにて 5分間静置した。逆転写反応終了後、 E.coli RNaseH (2 units/ /i L): 1 /i Lを加え 37°Cにて 20分間処理し、 RNAを完全に分解した。

[0109] PCR反応は、 PCR関連試薬（1ゥヱルあたり TaKaRa LA Taq： 0.2 μ L、 10 X LA Taq Buffer : 2 μ L、 25mM MgC12 : 2 μ L、 dNTP mixture (各 2.5mM)： 3.2 μ L、 IL6識另' Jプライマー：各 0.16 M、滅菌精製水で 18 μ Lに調整した）の入った PCRチューブに、逆転写反応液 2 μ Lを加えて行った。

[0110] なお、 PCR反応には以下のインターロイキン 6 (IL6)用プライマーを使用した。

IL6識別プライマー

IL6-T： 5 ' -ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGCCTTCGG-3 ' (配列番号 31) IL6-B： 5 ' -ATTCTTTGCCTTTTTCTGCAGGAACTGGAT-3 ' (配列番号 32) サーマルサイクラ一は GeneAmp PCR System9700(PE Appleid Biosystems)を使用し、 94°Cで 1分間保持した後、 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 30秒間の反応サイクルを 50サイクル繰り返し、 72°Cで 5分保持して PCR反応を終了した。

[0111] 〔判定工程〕

2%ァガロースゲル電気泳動（ァガロース： Agarose-RE for≥lKbp fragment, for Restriction and Ligation(nacalai tesque))により、増幅した PCR産物を分離し、ェチジゥム'ブロマイドにより染色した。電気泳動で特異的バンドが得られることにより、標的核酸が増幅されてレ、ることを確認した。

[0112] 〔結果〕

電気泳動の結果を図 4に示した。図中の左端の数値は分子量 (bp)を示している。図 4から明らかなように、レーン 3に IL6由来の特異的な核酸の増幅が観察されるため、大腸菌に感染した血液での IL6の発現上昇が、本発明の核酸検出方法により検出可能であることが証明された。

[0113] なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなぐ本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。産業上の利用の可能性

[0114] 本発明に係る核酸検出方法は、細胞を含む試料を支持体に固定する試料固定化工程と、試料中の核酸を支持体上で増幅する核酸増幅工程と、増幅された核酸を検出する核酸検出工程とを含むものであり、試料力核酸を抽出する工程を必要としなレ、。したがって、核酸の抽出に起因する核酸のロスがほとんど生じず、試料中に含まれる標的核酸が非常に微量であっても増幅するための錡型として必要な量の標的核酸が含まれていれば検出することができるという効果を奏し、それに伴レ、、再現性および検出精度が向上するという効果を奏する。また、試料力核酸を抽出する工程を必要としないため、操作が簡便となり、結果を得るまでに要する時間を短縮できるという効果を奏する。

[0115] 本発明に係る核酸検出方法は、試料を支持体に固定するため、試料溶液中に増幅阻害物質が含まれている場合でも、細胞外に存在する増幅阻害物質は容易に除去すること力 Sできる。したがって、増幅効率の低下に伴う検出感度の低下を招かないという効果を奏する。

[0116] 本発明に係る核酸検出方法は、試料を支持体に固定し、当該支持体上で核酸を増幅するため、試料を PCRチューブ等の別の容器等に移す必要がない。したがって、試料の移動に起因する核酸のロスが生じないため、検出感度の低下を招かないとレ、う効果を奏する。また、操作が簡便となり、要する時間を短縮できるという効果を奏する。

[0117] 本発明に係る核酸検出方法は、核酸を増幅した後に検出を行うため、検出対象の標的核酸が微量であるために検出が困難であるという問題は生じない。したがって、再現性および検出精度が向上するという効果を奏する。また、検出方法に特別なェ夫を必要としないため、公知の検出方法を適宜選択して用いることができるという効果を奏する。さらに、結果の判定に熟練を必要としないという効果を奏する。

[0118] 本発明に係る遺伝子検出キットは、本発明に係る核酸検出方法を用いて試料中の標的遺伝子を検出するためのキットである。したがって、当該キットを用いることにより、本発明に係る核酸検出方法を非常に簡便かつ迅速に実施することができるという効果を奏する。以上のように本発明は、従来の遺伝子診断と言われる分野すべてに適用可能である。したがって、本発明は医療、製薬、試薬分野をはじめ、広く生物関連産業に利用すること力 Sできる。特に、本発明を医療分野における臨床検査で利用することにより、的確な治療方針の選択に貢献できる。また、生物関連分野の基礎研究に利用することができ、生物学の発展に大いに貢献することが期待される。

Claims

請求の範囲

[I] 細胞を含む試料を支持体に固定する試料固定化工程と、

試料中の核酸を支持体上で増幅する核酸増幅工程と、

増幅された核酸が標的の核酸であるか否力、を判定する判定工程とを含むことを特徴とする核酸検出方法。

[2] 上記核酸増幅工程の前段に、試料に含まれる核酸を露出させる核酸露出工程を含むことを特徴とする、請求項 1に記載の核酸検出方法。

[3] 上記核酸露出工程における核酸露出方法として、界面活性剤処理法、酵素処理法または加熱処理法のいずれか 1の方法、あるいは 2以上の方法を組み合わせて用レ、ることを特徴とする請求項 2に記載の核酸検出方法。

[4] 上記核酸増幅工程における核酸増幅方法として、 PCR (ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いることを特徴とする請求項 1ないし 3のいずれ力 1項に記載の核酸検出方法。

[5] 上記核酸増幅工程において増幅された核酸を標識することを特徴とする請求項 1 ないし 4のいずれ力 1項に記載の核酸検出方法。

[6] 上記判定工程における判定方法として、核酸増幅工程で増幅かつ標識された核酸をプローブとし、当該プローブと既知の遺伝子断片との相補的なハイブリダィゼーシヨンを指標として標的の核酸であるか否力、を判定することを特徴とする請求項 5に記載の核酸検出方法。

[7] 上記既知の遺伝子断片は、あらかじめ支持体に固定されていることを特徴とする請求項 6に記載の核酸検出方法。

[8] 上記判定工程における判定方法として、核酸増幅工程で増幅かつ標識された核酸をプローブとし、 DNAマイクロアレイを用いて標的の核酸であるか否かを判定することを特徴とする請求項 5に記載の核酸検出方法。

[9] 上記試料は生体由来試料であることを特徴とする請求項 1ないし 8のいずれ力 4項に記載の核酸検出方法。

[10] 上記生体由来試料はヒト由来であることを特徴とする請求項 9に記載の核酸検出方法。

[II] 請求項 1ないし 10のいずれ力 1項に記載の核酸検出方法を実施するためのキットであって、試料中の標的遺伝子を検出するために使用する遺伝子検出キット。

[12] 請求項 10に記載の核酸検出方法を実施するためのキットであって、ヒトの疾病関連遺伝子を検出するために使用する遺伝子検出キット。

[13] 上記ヒトの疾患関連遺伝子はヒトに感染した感染症原因微生物の遺伝子である請求項 12に記載の遺伝子検出キット。

[14] 上記ヒトに感染した感染症原因微生物の遺伝子は薬剤耐性遺伝子である請求項 1

3に記載の遺伝子検出キット。

[15] 上記ヒトに感染した感染症原因微生物の遺伝子は薬剤感受性遺伝子である請求項 13に記載の遺伝子検出キット。

[16] 上記ヒトの疾患関連遺伝子は癌マーカー遺伝子である請求項 12に記載の遺伝子検出キット。

[17] 上記ヒトの疾患関連遺伝子は遺伝性疾患関連遺伝子である請求項 12に記載の遺伝子検出キット。

[18] 少なくとも、標的遺伝子増幅プライマー、 PCR反応用緩衝液、デォキシヌクレオシド三リン酸混合液、標識デォキシヌクレオシド三リン酸、耐熱性 DNA合成酵素、試料固定化用支持体、増幅核酸検出用指示薬を含むことを特徴とする請求項 11ないし 1 7のいずれ力 1項に記載の遺伝子検出キット。