KR20070003883A

KR20070003883A - 핵산 검출방법 및 그 이용

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Publication number: KR20070003883A
Application number: KR1020067017467A
Authority: KR
Inventors: 아끼오 마츠히사; 세이지 야마모토; 소우지 에다; 신지 야마사키
Original assignee: 후소 야쿠힝 고교 가부시끼가이샤
Priority date: 2004-02-09
Filing date: 2005-02-08
Publication date: 2007-01-05
Also published as: EP1721991A1; JPWO2005075680A1; JP4974528B2; CA2555346C; AU2005210362A1; CN1918305A; EP1721991A4; CA2555346A1; AU2005210362B2; EP1721991B1; US8187805B2; CN1918305B; WO2005075680A1; US20070111212A1; HK1101414A1; AU2005210362B8

Abstract

종래의 방법보다 검출감도를 높이는 동시에, 정확하고 신속하게 표적 핵산을 검출하는 것이 가능한 핵산 검출 방법 및 당해 방법을 이용하는 유전자 검출 키트를 제공한다. 세포를 포함하는 시료를 지지체에 고정하고, 그대로 지지체 상에서 핵산을 증폭하고, 증폭된 핵산을 검출한다. 시료에서 핵산을 추출하지 않으므로 핵산추출과정의 핵산의 손실에 따르는 검출감도의 저하를 방지할 수 있다. 또, 증폭 후의 핵산을 검출하므로 시료에 포함되는 표적 핵산이 미량이더라도 검출이 가능하게 된다.

표적 핵산, 유전자 검출 키트, 핵산, 핵산 검출 방법

Description

핵산 검출방법 및 그 이용{METHOD OF DETECTING NUCLEIC ACID AND UTILIZATION THEROF}

본 발명은 핵산 검출방법 및 그 이용에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 시료 중의 미량의 핵산을 효율적으로 증폭하여 정확하고 신속하게 검출하는 방법 및 그 방법을 이용한 유전자 검출 키트에 관한 것이다.

어떤 특정한 핵산이나 유전자 존재의 유무를 조사하고자 하는 경우, 표적의 핵산이나 유전자를 증폭하여 그 증폭산물을 검출하는 방법이 이용된다. 표적의 핵산이나 유전자를 특이적으로 증폭시키는 방법으로서는, PCR법(예를 들어, 비특허문헌 1, 2 참조), RT-PCR법(예를 들어, 비특허문헌 1, 2 참조), ICAN법(예를 들어, 특허문헌 1 참조), LAMP법(예를 들어, 비특허문헌 3 참조), RCA법(예를 들어, 비특허문헌 4 참조), 플라이머 익스텐션법(예를 들어, 비특허문헌 5 참조) 등이 알려져 있다. 그 중에서도 PCR법, RT-PCR법이 가장 자주 사용되고 있다. 이들 방법은, 목적으로 하는 핵산의 염기배열을 포함하는 짧은 핵산을 프라이머로서 이용하여 DNA 폴리머라아제 또는 RNA 폴리머라아제에 의한 주형 특이적인 핵산합성반응을 in vitro에서 행하는 방법이다.

또, 상기 핵산증폭방법에 있어서, 증폭반응중 또는 증폭반응 후에, 증폭된 핵산단편을 적당한 수단을 이용하여 표식함으로써, 시료중에 약간밖에 존재하지 않는 핵산을 검출할 수 있게 된다. 또, 랜덤한 염기배열의 프라이머를 사용하여 비특이적으로 핵산을 증폭 및 표식하고, 그것을 이용하여 핵산을 검출하는 DNA 마이크로어레이(마크로 어레이)법이나 디퍼런셜 디스플레이법 등도 알려져 있다. 최근, 다양한 질병에 관련되는 유전자를 망라적으로 검출하는 DNA 마이크로 어레이가 매우 주목받고 있다.

또, 어떤 특정한 핵산이나 유전자를 조사하고자 하는 경우, 상기 핵산증폭방법 이외의 방법으로서, 조직이나 세포 중의 표식이 되는 핵산을, 그것과 상보적인 염기배열을 포함하는 표식한 핵산을 프로브로 하여 하이브리다이제이션시키는 ISH법(in situ 하이브리다이제이션법)이나 FISH법(fluorescein in situ 하비브리다이제이션법)이 있다(예를 들어, 비특허문헌 1 참조). ISH법은 조직 내의 특정한 유전자의 발현의 유무나 양의 비교에 널리 이용되고 있다. FISH법은 염색체 상의 특정한 유전자 영역의 판별에 널리 이용되고 있다.

또, PCR법으로 표적 핵산을 증폭하고, ISH법으로 프로브를 이용하여 하이브리다이제이션시키고, 최종적으로 현미경으로 검출하는 in situ PCR법(예를 들어, 비특허문헌 2 참조)도 존재하지만, 반응에 최적의 조건을 내기가 어렵기 때문에 재현성이 부족하고, 일반화되어 있지 않다.

본 출원인은 ISH법에 기초하여 말초혈에서의 백혈구 중의 세균검출 키트 「하이브리젭(등록상표)」을 체외진단용 의약품(승인번호:AMZ00620000)으로서 판매하고 있다. 「하이브리젭(등록상표)」을 이용한 경우, 종래 이용되고 있는 혈액배양 법과 비교하여 약 4배의 감도로 균을 검출하는 것이 가능하게 되고, 적어도 3일 이상 걸리던 검사시간을 1일 이내에 행할 수 있게 되었기 때문에, 감염증 분야에서 각광을 받고 있다(예를 들어, 비특허문헌 6 참조). 또, 본 출원인은 식세포에 탐식된 외래미생물을 ISH법에 기초하여 검출 및 동정하기 위한 방법(특허문헌 2 참조) 및 그 개량방법(특허문헌 3 참조)을 제안하고 있고, 「하이브리젭(등록상표)」은 이들 방법에 기초하여 개발된 상품이다.

[특허문헌 1] 특허제3433929호 공보(등록일:2003년 5월 30일, 발행일 2003년 8월 4일)

[특허문헌 2] 국제공개WO89/10411(국제공개일:1989년 11월 2일, 대응공고공보:특공평 07-40호)

[특허문헌 3] 국제공개WO02/099133(국제공개일:2002년 12월 12일)

[비특허문헌 1] J. Sambrook et al. 「MolecμLar Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition」 Cold Spring Harbor Laboratory(2001)

[비특허문헌 2] 감수:마키 쥬지(眞木壽治), 「PCR Tips~익숙하게 사용하기 위한 핵심과 힌트」 수윤사(秀潤社)(1999)

[비특허문헌 3] Tsugunori Notomi et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research, vol. 28, No. 12:e63(2000)

[비특허문헌 4] Lizardi PM et al. Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nature Genetics, jul;19(3):225-32.(1998)

[비특허문헌 5] B.D.Hames, S.J.Higgins:저, 호리고시 마사요시(掘越正美):역 「유전자 발현과 전사인자」 메디컬

사이언스

인터내셔널(1996)

[비특허문헌 6] 마츠히사 아키세이(松久明生), 아라키 히로마사(荒木宏昌), 「In Situ Hybridization법에 의한 패혈증 진단의 임상적 유용성」, BIO Clinica, 북륭관(北隆館), 1999년, 14권, 1호, p.97-101

여기에서 어떤 특정한 핵산이나 유전자 존재의 유무를 조사하고자 하는 경우에 이용하는, 상기 PCR법 등의 핵산증폭방법이나, ISH법 등의 하이브리다이제이션을 이용하는 방법에서는, 표적으로 하는 핵산이나 유전자가 시료 중에 미량밖에 존재하지 않는 경우에, 충분한 검출감도, 재현성, 간편성 등을 실현할 수 없는 경우가 있다는 과제를 갖고 있다.

우선, PCR법 등의 핵산증폭방법을 이용하는 방법에서는, 시료에서 핵산을 추출할 필요가 있다. 이 핵산을 추출하는 과정에서, 핵산의 손실이 생기는 것을 피하기가 어렵다. 예를 들어, 시료 중에 증폭하기 위한 주형으로서 필요한 양의 표적 핵산이 포함되어 있었다고 해도, 핵산추출과정의 손실에 의해 주형으로서 필요한 양이 회수되지 않은 경우에는 증폭효율이 저하하기 때문에 표적 핵산을 충분히 증폭할 수 없고, 시료 중의 표적 핵산을 검출할 수 없는 경우가 생길 수 있다. 이러한 경우는, 위음성이 되어 정확한 결과가 얻어지지 않는다. 또, 동일한 시료를 이용한 경우라도, 핵산추출과정의 손실 정도에 따라 다른 결과가 얻어질 가능성이 있고, 재현성이 부족하게 된다. 즉, 핵산의 추출을 필요로 하는 핵산증폭방법에 있어서는, 시료 중에 포함되는 표적의 핵산이 매우 미량인 경우에, 핵산추출과정의 핵 산의 손실에 의해 증폭효율의 저하에 기인하는 검출감도의 저하를 초래한다는 문제가 있다.

또, 증폭반응을 저해하는 물질(예를 들어, 헤파린, 계면활성제, 단백질 변성제, 유기용매 등)이 시료 용액 내에 포함되어 있는 경우가 있고, 상기와 마찬가지로 증폭효율의 저하에 기인하는 검출감도의 저하를 초래한다는 문제도 있다.

이어서, ISH법 등의 하이브리다이제이션을 이용하는 방법에서는, 시료에서 핵산을 추출할 필요가 없기 때문에, 핵산의 손실은 생기지 않지만, 시료에 포함되는 표적의 핵산이 매우 미량인 경우에는 표적 핵산과 하이브리드를 형성하고 있는 프로브 핵산을 검출하기가 어렵다는 문제가 있다.

또, 본 출원인이 개발한 「하이브리젭(등록상표)」은 ISH법에 기초하여 말초혈에서의 백혈구 중의 세균을 고감도이고 신속하게 검출하는 것을 가능하게 하였느나, 극복해야 할 과제로서 다음 2가지를 들 수 있다.

1) 균의 시그널의 유무는 현미경에 의한 육안적 관찰에 맡겨져 있기 때문에 어느 정도의 숙련을 요하는 것.

2) 백혈구에 탐식된 세균만이 검출표식이기 때문에 백혈구 수가 감소한 환자의 임상검체에 대해서는 검출율이 저하하는 것.

본 발명은 상기 문제점을 감안하여 이루어진 것이며, 그 목적은 시료 중에 포함되는 표적 핵산이 매우 미량이더라도 정확하고 신속하게 표적 핵산을 검출할 수 있는 핵산 검출 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 시료를 지지체에 고정하고, 시료에서 핵산을 추출하지 않고 그대로 지지체 상에서 핵산을 증폭함으로써 시료 중의 핵산의 손실에 따르는 검출감도의 저하를 초래하지 않고, 간편하고 신속하게 시료 중의 표적 핵산의 검출이 가능하다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다. 즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.

(1) 세포를 포함하는 시료를 지지체에 고정하는 시료 고정화 공정과, 시료 중의 핵산을 지지체 상에서 증폭하는 핵산 증폭 공정과, 증폭된 핵산이 표적의 핵산인지의 여부를 판정하는 판정공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.

(2) 상기 핵산 증폭 공정의 전단에, 시료에 포함되는 핵산을 노출시키는 핵산 노출 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 (1)에 기재된 핵산 검출 방법.

(3) 상기 핵산 노출 공정에서의 핵산노출방법으로서, 계면활성제 처리법, 효소처리법 또는 가열처리법 중 어느 한가지 방법, 혹은 2가지 이상의 방법을 조합시켜서 이용하는 것을 특징으로 하는 (2)에 기재된 핵산 검출 방법.

(4) 상기 핵산 증폭 공정에서의 핵산증폭방법으로서, PCR(폴리머라아제 연쇄반응)법을 이용하는 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 핵산 검출 방법.

(5) 상기 핵산 증폭 공정에 있어서, 증폭된 핵산을 표식하는 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (4) 중 어느 한 항에 기재된 핵산 검출 방법.

(6) 상기 판정공정에서의 판정방법으로서, 핵산 증폭 공정에서 증폭되고 표식된 핵산을 프로브로 하고, 당해 프로브와 기지(旣知)의 유전자 단편과의 상보적인 하이브리다이제이션을 지표로 하여 표적의 핵산인지의 여부를 판정하는 것을 특징으로 하는 (5)에 기재된 핵산 검출 방법.

(7) 상기 기지의 유전자 단편은 미리 지지체에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 (6)에 기재된 핵산 검출 방법.

(8) 상기 판정공정에서의 판정방법으로서, 핵산 증폭 공정에서 증폭되고 표식된 핵산을 프로브로 하고, DNA 마이크로 어레이를 이용하여 표적의 핵산인지의 여부를 판정하는 것을 특징으로 하는 (5)에 기재된 핵산 검출 방법.

(9) 상기 시료는 생체유래 시료인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (8) 중 어느 한 항에 기재된 핵산 검출 방법.

(10) 상기 생체유래 시료는 인간유래인 것을 특징으로 하는 (9)에 기재된 핵산 검출 방법.

(11) (1) 내지 (10) 중 어느 한 항에 기재된 핵산 검출 방법을 실시하기 위한 키트로서, 시료 중의 표적 유전자를 검출하기 위해 사용하는 유전자 검출 키트.

(12) (10)에 기재된 핵산 검출 방법을 실시하기 위한 키트로서, 인간의 질병관련 유전자를 검출하기 위해 사용하는 유전자 검출 키트.

(13) 상기 인간의 질병관련 유전자는 인간에게 감염된 감염증 원인 미생물의 유전자인 (12) 에 기재된 유전자 검출 키트.

(14) 상기 인간에게 감염된 감염증 원인 미생물의 유전자는 약제 내성 유전자인 (13)에 기재된 유전자 검출 키트.

(15) 상기 인간에게 감염된 감염증 원인 미생물의 유전자는 약제 감수성 유전자인 (13)에 기재된 유전자 검출 키트.

(16) 상기 인간의 질환관련 유전자는 암 마커 유전자인 (12)에 기재된 유전자 검출 키트.

(17) 상기 인간의 질환관련 유전자는 유전성 질환관련 유전자인 (12)에 기재된 유전자 검출 키트.

(18) 적어도 표적 유전자 증폭 프라이머, PCR 반응용 완충액, 디옥시뉴클레오시드3인산 혼합액, 표식 디옥시뉴클레오티드3인산, 내열성 DNA 합성효소, 시료고정화용 지지체, 증폭핵산검출용 지시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 (11) 내지 (17) 중 어느 한 항에 기재된 유전자 검출 키트.

상기 구성에 의하면, 시료 중에 포함되는 표적 핵산이 매우 미량이더라도 핵산의 추출에 기인하는 핵산의 손실이 거의 생기지 않고, 고감도, 고정밀도로 재현성이 좋게 표적 핵산을 검출할 수 있게 된다. 또, 간편하고 신속하게 실시할 수 있으며, 결과의 판정에 숙련을 요하지 않는다.

본 발명의 또 다른 목적, 특징 및 우수한 점은 이하에 나타내는 기재에 의해 충분히 알 수 있을 것이다. 또, 본 발명의 이익은 첨부 도면을 참조한 다음의 설명에서 명백하게 될 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 핵산 검출 방법의 일례를 도시한 도면이다.

도 2는 시료에 탐식 샘플을 이용하여, 본 발명의 핵산 검출 방법에 의해 백 혈구에 탐식된 미생물을 검출한 결과를 나타내는 전기영동 화상이다.

도 3은 시료에 패혈증 환자의 임상 검체를 이용하여 본 발명의 핵산 검출 방법에 의해 백혈구에 탐식된 미생물을 검출한 결과를 나타내는 전기영동화상이다.

도 4는 시료에 패혈증 환자 모델을 이용하여, 본 발명의 핵산 검출 방법에 의해 백혈구에서의 IL6의 발현 증가를 검출한 결과를 나타내는 전기영동 화상이다.

본 발명의 일실시예에 대하여 설명하면 다음과 같다. 또, 본 발명은 이것에 한정되는 것은 아니다.

1. 본 발명에 따른 핵산 검출 방법

본 발명에 따른 핵산 검출 방법은, 세포를 포함하는 시료를 지지체에 고정하는 시료 고정화 공정과, 시료 중의 핵산을 지지체 상에서 증폭하는 핵산 증폭 공정과, 증폭된 핵산이 표적의 핵산인지의 여부를 판정하는 판정공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있고, 또 핵산 증폭 공정의 전단에 시료에 포함되는 핵산을 노출시키는 핵산 노출 공정이 포함되어 있어도 된다. 도 1에 본 발명에 따른 핵산 검출 방법의 하나인 실시예를 나타내었다. 도 1에 나타낸 실시예에서는 생체유래 시료를 지지체에 고정(시료 고정화 공정)하고, 질병관련 유전자 유래의 프라이머를 포함하는 PCR 믹스처를 첨가하여 PCR을 행한다(핵산 증폭 공정). 이 핵산 증폭 공정에 있어서 핵산증폭과 동시에, 또는 핵산증폭 후에 증폭된 핵산을 표식한다(상세한 내용은 후술하기로 한다). 그리고 마지막으로, 전기영동(아가로스 겔 전기영동, 캐필러리 전기영동 등), 정량 PCR, 도트 하이브라다이제이션(마크로 어레이, 마이크로 어 레이 등) 등의 핵산 검출 수단을 이용하여, 증폭된 핵산이 표적의 핵산인지의 여부를 판정한다(판정공정). 또, 본 발명에 따른 핵산 검출 방법은 도 1에 도시한 실시예로 한정되는 것은 아니다. 이하에 본 핵산 검출 방법에 대하여 그 특징을 상세히 설명한다.

(1) 시료 고정화 공정

시료 고정화 공정은 시료를 지지체에 고정화하는 공정이다. 시료를 지지체에 고정화함으로써, 핵산증폭이나 표식시에 일반적으로 행해지는 핵산 제조 공정을 생략할 수 있다. 또, 시료 용액에 핵산의 증폭반응을 저해하는 물질(예를 들어 헤파린, EDTA-2Na, 양이온, 고단백 용액, 고염농도 용액, 계면활성제 포함용액, 단백변성용액(요소, 구아니딘 염산 등), 유기용매 등)이 포함되어 있는 경우에, 이들의 증폭저해물질은 통상 세포 내에 체류하는 일이 없기 때문에 시료를 지지체에 고정화함으로써 용이하게 제거할 수 있다. 또, 시료를 지지체에 고정화함으로써 핵산을 안정되게 보존하는 것도 가능하다.

[시료]

본 발명에 따른 핵산 검출 방법(이하, 「본 검출방법」이라 기재한다)에 이용하는 시료는 세포를 포함하는 시료이면 된다. 본 검출방법에 의해 검출하는 표적 핵산은 DNA(디옥시리보핵산) 및 RNA(리보핵산) 중 어느 것이어도 된다. 세포에는 이들의 핵산(DNA 및 RNA)이 포함되어 있기 때문에, 그 중의 표적 핵산을 본 검출방법으로 검출할 수 있게 된다. 세포의 종류는 한정되는 것은 아니고, 동물 세포, 식물 세포, 미생물 세포 등의 모든 세포를 대상으로 할 수 있다. 또, 시료의 세포 이 외의 부분은 후술하는 핵산 노출 공정에서 화학처리, 효소처리, 가열처리 등에 의해 소화가 가능하고, 포함되는 세포의 핵산이 노출되는 것이면 된다. 본 검출방법에 이용하는 시료로서는, 세포를 포함하는 생체유래 시료가 적합하지만, 이것에 한정되는 것은 아니고, 생체에 유래하지 않는 시료에도 본 검출방법을 적용하는 것은 가능하다.

생체에 유래하지 않는 시료로서는, 예를 들어, 세포를 포함하는 식품재료, 흙, 물, 섬유, 먼지 등을 들 수 있다. 생체유래 시료로서는 동물 및 식물의 생체 구성성분을 적절하게 이용할 수 있다. 인간을 포함하는 동물유래의 시료로서는, 예를 들어, 혈액, 조직액, 림프액, 뇌척수액, 고름, 점액, 콧물, 객담, 소변, 대변, 복수 등의 체액류, 피부, 폐, 간, 점액, 각종 장기, 뼈 등의 조직, 비강, 기관지, 피부, 각종 장기 등을 세정한 후의 세정액을 들 수 있다. 또 인간의 경우는 투석 배액도 시료로 할 수 있다.

또, 본 검출방법의 표적으로 하는 핵산은 시료에 포함되는 세포 고유의 핵산에 한정되지 않고, 세포에 감염된 바이러스의 핵산이나, 세포가 탐식한 미생물 등의 핵산에도 적용할 수 있다. 따라서, 감염증 환자의 탐식세포(백혈구 등)를 포함하는 생체유래 시료는 본 검출방법의 시료로서 적합하다.

[지지체]

지지체는 그 표면에 시료를 고정화하는 동시에, 당해 지지체 상에서 시료 중의 표적 핵산을 증폭하기 위해 이용하는 것이다. 따라서, 이러한 목적을 달성할 수 있는 지지체라면 재질, 형상 등은 특별히 한정되는 것은 아니다. 재질로서는, 예를 들어, 유리, 금속, 합성수지(폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리염화비닐, 폴리에스테르, 폴리아크릴산에스테르, 나일론, 폴리아세탈, 불소수지 등), 다당류(셀룰로오스, 아가로오스 등), 여과지 등을 들 수 있다. 또, 형상으로서는, 예를 들어, 판형상, 쟁반형상, 구형상, 섬유상, 봉형상, 접시형상, 용기형상, 셀, 관형상 등의 각종 형상으로 할 수 있고, 본 검출방법을 실시하는 조건에 맞추어 적절히 바람직한 형상의 것을 선택하면 된다.

하나의 지지체에 대하여 1시료를 고정화하고, 시료 수에 따른 수의 지지체를 이용해도 되지만, 작업을 효율적으로 실행하기 위해서는 하나의 지지체에 복수의 시료를 고정화할 수 있는 것이 바람직하다. 또, 본 검출방법에서는 시료 고정화 공정

핵산 증폭 공정, 또는, 시료 고정화 공정

핵산 노출 공정

핵산 증폭 공정을 동일 지지체 상에서 일련의 조적으로 하여 실행하기 때문에, 하나의 지지체에 복수의 시료를 고정화한 경우에 인접하는 시료가 혼합되지 않도록 할 필요가 있다. 따라서, 본 검출방법에 이용하는 지지체로서는 하나의 지지체 상에 복수의 분리된 구획을 갖는 것이 바람직하다. 또, 본 검출방법의 핵산 증폭 공정에 있어서, PCR법을 이용하여 핵산을 증폭하는 경우에는 내열성 소재인 것이 바람직하다. 또, 시판되고 있는 PCR용 유전자 증폭기기(서멀 사이클러)에 적합한 형상인 것이 특히 바람직하다.

[고정]

본 발명에 따른 핵산 검출 방법에 있어서, 고정이란 시료를 어떤 방법으로 지지체에 고착, 유지시키는 것을 의미한다. 본 검출방법에 이용하는 고정방법은 특 별히 한정되는 것은 아니고, 종래 공지의 고정방법을 적절히 선택하여 이용하면 된다. 공지의 고정방법으로서는 공유결합이나 이온결합 등으로 불용성 담체에 결합시키는 담체결합법, 가교시약에 의해 공유결합으로 연결시켜 불용화하는 가교법, 고분자 겔이나 반투막 등으로 감싸는 포괄법, 탈수에 의해 단백을 급속하게 변성시켜 담체에 고착시키는 방법 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 카르노이(carnoy) 고정, 알콜 고정, 화염 고정, 군탈알데히드 고정, 건조 고정, 아세톤 고정, 메타놀 고정, 포르말린 고정 등을 들 수 있다.

또, 지지체의 표면에 시료를 접착시키는 것도 고정에 포함된다. 따라서, 지지담체의 표면에 접착성을 높이는 물질, 예를 들어 3-아미노프로필트리에톡시실란(APS), 폴리-L-리진, 젤라틴 등을 코트해 두는 것도 가능하다. 이와 같은 처리를 실시한 지지체를 이용하면, 시료의 종류에 따라서는 충분히 지지체에 고착, 유지시킬 수 있다. 또, 지지체에 고착 고정한 후에, 상기 예시한 고정방법을 병용하는 것도 가능하다.

(2) 핵산 노출 공정

핵산 증폭 공정에서 시료 중에 포함되는 핵산을 증폭하기 위해서는, 프라이머나 핵산합성효소가 표적 핵산에 도달할 수 있는 것이 필수적이다. 시료에 따라서는 표적 핵산이 시료 표면에 노출되어 있는 경우도 있고, 이러한 시료에 대해서는 시료 고정화 공정에서 직접 핵산 증폭 공정으로 진행할 수 있다. 따라서, 본 핵산 노출 공정은 본 검출방법의 필수 공정은 아니다. 그러나, 표적 핵산이 시료 표면에 노출되어 있지 않은 경우에는 핵산 노출 공정을 설치하여 표적 핵산을 노출 시키는 것이 필요하다.

핵산 노출 공정에 이용하는 방법으로서는, 계면활성제 처리법(SDS, TRITON-X, TWEEN-20, BRIJ, NP-40, CHAPS 등), 프로테아제 등의 효소처리, 가열처리법 등을 들 수 있다. 단, 이들에 한정되는 것은 아니고, 이용하는 시료 및 표적 핵산에 따라 적절히 최적의 방법을 선택하면 된다. 예를 들어, 세균감염에 기인하는 패혈증이고,백혈구에 탐식된 세균의 유전자를 검출하는 경우, 세군의 세포벽을 소화시키는 효소로서 리조스타핀, 리조팀, N-아세틸룸라미다아제, 자이모라아제 등을 사용함으로써 세균, 진균 등의 미생물 유전자를 노출시킬 수 있다.

(3) 핵산 증폭 공정

핵산 증폭 공정은 시료가 고정화된 지지체 상에서 표적 핵산을 증폭하는 공정이다. 여기에서, 본 발명에 따른 핵산 검출 방법은 시료 중의 핵산을 추출, 정제하지 않고, 시료가 고정화된 지지체 상에서 표적 핵산의 증폭을 행하는 것에 최대의 특징이 있다. 이로 인하여, 표적 핵산이 시료 중에 미량밖에 존재하지 않는 경우에도 추출 및 정제과정의 손실이 생기지 않기 때문에, 검출감도의 저하를 초래하지 않고, 미량의 표적 핵산을 검출하는 것이 가능하게 된다. 또, 작업의 간단화를 도모할 수 있고, 작업시간을 단축할 수 있게 된다.

핵산 증폭이란, 표적 핵산의 임의의 배열에 대하여 특이적인 프라이머 또는 랜덤한 배열의 프라이머와, DNA 폴리머라아제 또는 RNA 폴리머라아제를 이용하여 시료 중의 핵산을 증폭시키는 것을 의미한다. 증폭방법으로서는, 종래 공지의 증폭방법을 적절히 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 PCR법, Nested-PCR법, RT-PCR법, ICAN법, UCAN법, LAMP법, 프라이머 익스텐션법, 전사(트랜스크립션), 복제(레플리케이션) 등을 들 수 있다.

상기 예시한 증폭방법 중에서도 PCR법은, 본 검출방법에 이용하는 증폭방법으로서 적합하다. 이하에, 본 검출방법의 핵산 증폭 공정에 PCR법을 이용한 경우에 대하여 설명한다.

PCR법이란, 특정의 DNA 영역을 사이에 둔 2종류의 프라이머와 DNA 합성효소(내열성 DNA 폴리머라아제, 이하, 「Taq 폴리머라아제」라 표기함)에 의한 DNA 합성반응의 시험관 내에서의 반복으로 그 특성 DNA 영역을 증폭하는 방법이며, 유전자공학분야에서 일반적으로 이용되고 있는 주지기술이다. PCR법에는 Nested-PCR법, RT-PCR법 등도 포함된다.

Nested-PCR법이란, 외측의 프라이머와 내측의 프라이머를 사용하여 2단계의 PCR을 실행하는 방법이며, 원하는 영역으로부터의 최초의 증폭산물을 주형으로 하여, 최초에 사용한 프라이머 위치보다 양측모두 내측에 프라이머를 설정하여 실행하는 방법이다. Nested-PCR을 이용함으로써, 1회째의 PCR에서 표적 핵산이 검출가능한 양까지 충분히 증폭하지 않는 경우라도, 2회째의 PCR에 의해 검출 가능한 양으로 증폭시키는 것이 가능하게 된다. 또, 1회째의 PCR에서 비특이적인 증폭산물이 생긴 경우, 이들의 비특이적 증폭산물은 2회째의 PCR에서의 프라이머와 유사한 배열을 가질 확률이 매우 낮아진다. 따라서, 2회째의 PCR에서는 표적의 배열을 갖는 단편만을 증폭할 확률이 높아지기 때문에, 비특이적 증폭산물의 발생에 의한 폐해를 해소하고, 보다 정확하게 표적 핵산을 검출할 수 있게 된다.

RT-PCR법이란, mRNA에 대하여 PCR을 적용하기 위한 변법이며, PCR의 전단계로서, 역전사효소를 이용하여 역전사반응을 행하는 공정을 포함하는 PCR법이다. 본 검출방법에 RT-PCR법을 이용하면 표적 핵산을 mRNA로 하는 것이 가능하게 된다. 즉, 본 검출방법을 유전자 발현의 검출에 응용하는 것이 가능하게 된다.

상기 [지지체] 항에서 설명한 바와 같이, 본 검출방법에서는 시료를 고정화한 지지체 상에서 PCR을 행하기 때문에, 지지체에 복수의 분리된 구획을 갖는 것이 바람직하다. 복수의 분리된 구획을 갖는 지지체를 이용한 경우의 구체적인 PCR의 순서로서는, PCR 믹스처(완충액, dNTPmix, Taq 폴리머라아제 등을 혼합한 것)을 지지담체 상의 각 구획의 시료에 첨가하고, 또 프라이머를 가하여 PCR용 유전자 증폭기기(서멀 사이클러) 등을 이용하여 PCR을 행하면 된다. 프라이머에 대해서는 하나의 PCR에 대하여 다양한 표적 핵산을 특이적으로 증폭하는 프라이머 세트를 이용한다. PCR의 조건(반응액의 양, 효소나 기질의 농도, 반응온도 등)은 특별히 한정되는 것은 아니고, 이용하는 시료 및 표적 핵산에 따라 적절히 최적의 조건을 선택하면 된다.

Nested-PCR을 실행하는 경우에는 1회째의 PCR을 지지체 상에서 행하고, 2회째의 PCR은 PCR 튜브 등을 이용하여 행하면 된다. 또, 2회째의 PCR에 이용하는 프라이머는 양측모두 최초에 사용한 프라이머 위치와 동일하고, 또는 내측에 설계해야 한다.

PCR에 의해 증폭되는 단편은 표적 핵산이 특이적으로 갖는 배열부분인 것이 바람직하다. 시료에 포함되는 핵산은 표적부분 이외의 부분이 대다수이기 때문에, 표적 미생물에 특이적인 배열부분에 프라이머를 설계하지 않으면 비특이적인 증폭산물이 생길 가능성이 높아진다. 따라서, 표적 핵산의 특이적 배열을 미리 조사해 두고, 그 배열부분을 증폭하도록 프라이머를 설계하는 것이 중요하다.

증폭되는 단편의 길이는 50bp~5,000bp의 범위 내인 것이 바람직하고, 100bpp~2,000bp의 범위 내인 것이 더욱 바람직하다. 이 범위를 벗어나면 특이적인 증폭산물을 효과적으로 얻을 수 없게 될 우려가 있다.

핵산 증폭 공정에서는 증폭된 핵산을 표식하는 것이 바람직하다. 이로 인하여, 후단의 판정공정을 효율적으로 실시할 수 있다. 핵산의 표식은 증폭과 동시 또는 증폭 후에 실행할 수 있다. 표식수단으로서는 방사성 표식, 하프텐(비오틴, 디곡시제닌 등) 표식, 형광 표식 등을 들 수 있는데, 이것에 한정되는 것은 아니다.

핵산증폭방법으로서, 핵산의 증폭과 동시에 행하는 경우는, 상술한 PCR법, Nested-PCR법, RT-PCR법, ICAN법, UCAN법, LAMP법, 프라이머 익스텐션법, 전사(트랜스크립션), 복제(레플리케이션) 등의 증폭반응을 행할 때에, 예를 들어 디곡시제닌이나 비오틴 등의 하프텐, FITC, 방사성동위체로 표식된 뉴클레오티드 아날로그를 기질(基質)로 하면 증폭반응 중에 표적 핵산을 표식할 수 있다. 또, 증폭반응시에 말단을 표식한 프라이머를 사용함으로써도 표적 핵산을 표식할 수 있다. 증폭반응 후에 표식하는 경우는 니크 트랜스레이션법이나 랜덤 프라임법, 프라이머 익스텐션법, TdT법, 5'카이네이션법 등을 이용할 수 있다. 이 경우에도 표식된 뉴클레오티드 아날로그를 기질로 하거나 말단을 표식한 프라이머를 사용함으로써 표식할 수 있다.

핵산 증폭 공정에 있어서, 표적 핵산의 임의의 배열에 대하여 특이적인 프라이머를 이용한 경우에는, 기지의 염기배열을 갖는 핵산단편을 증폭할 수 있다. 한편, 랜덤한 배열의 프라이머를 이용한 경우에는 비특이적인 핵산이 증폭되기 때문에 어떠한 염기배열을 갖는 핵산단편이 생기는지는 예상할 수 없다. 핵산 증폭 공정에 있어서, 기지의 염기배열을 갖는 핵산단편을 증폭하도록 설계된 프라이머를 이용한 경우에는, 후술하는 판정공정에서 염기배열의 확인이나 기지의 염기배열을 갖는 핵산단편과의 하이브리다이제이션에 의해 표적의 핵산인지의 여부를 판정할 수 있다. 랜덤한 배열의 프라이머를 이용한 경우에는 후술하는 판정공정에서 DNA 마이크로 어레이 등을 이용함으로써 시료 중에 표적의 핵산이 포함되어 있는지의 여부를 판정할 수 있다.

(4)판정공정

판정공정은, 핵산 증폭 공정에서 증폭된 핵산이 표적의 핵산단편인지의 여부를 판정하는 공정이다. 본 발명에 따른 핵산 검출 방법은 핵산을 증폭한 후에 검출을 실행하기 때문에, 표적 핵산이 미량이기 때문에 검출한 어려워지는 문제는 발생하지 않는다. 또, 공지의 방법을 적절히 선택하여 이용할 수 있으므로 판정에 숙련을 요하는 일도 없다.

판정에는 증폭된 핵산단편의 길이나 염기배열을 확인하는 것이 포함되는 것은 물론이지만, 증폭된 DNA 단편의 전사물질인 RNA를 확인하는 것이나 증폭된 핵산단편에 기초하여 발현시킨 단백질을 확인하는 것도 포함된다. 판정공정에서 이용하는 방법의 구체예로서는 핵산(DNA 또는 RNA)를 확인하는 방법으로서, 아가로스 겔 전기영동, 정량 PCR, 시퀀스, 도트 하이브리다이제이션, DNA 마이크로 어레이, 사잔

하이브리다이제이션, 노단

하이브리다이제이션 등을 들 수 있고, 단백질을 확인하는 방법으로서, SDS-PAGE, 웨스턴

브로팅, 질량분석법(MALDI-TOF-MS, LC-MS, LC-MS/MS등)등을 들 수 있다. 단, 이들 방법으로 한정되는 것은 아니고, 적절히 적당한 방법을 선택하여 사용하면 된다.

가장 간편한 판정방법으로서는 아가로스 겔 전기영동을 들 수 있다. 그러나, 이 방법은 시료에서 증폭된 핵산단편의 길이와, 표적 핵산만을 주형으로 하여 증폭한 경우의 핵산단편의 길이를 비교하여, 일치하는지의 여부를 확인하는 것이기 때문에, 비특이적인 증폭산물이 우연히 유사한 길이인 경우에 잘못된 결과(의양성)를 유도하는 일이 있을 수 있다. 증폭된 핵산이 표적 핵산과 일치하는지의 여부를 정확하게 판정하기 위해 가장 신뢰성이 높은 방법은, 증폭핵산의 염기배열을 확인하는 방법(시퀀스)이다. 이 방법을 이용하면 SNP(single nucleotide polymorphism)을 검출하는 것도 가능하게 된다.

표적 핵산이 증폭되어 있는지의 여부를 간편하고 정확하게 판정하는 방법으로서, 표식된 증폭핵산을 프로브로 하고, 당해 프로브와 기지의 유전자 단편의 상보적인 하이브리다이제이션을 지표로 하여 표적 핵산인지의 여부를 판정하는 방법을 이용하는 것이 바람직하다. 또, 이 방법을 이용하는 경우, 프로브로 하는 핵산은, 하이브리다이제이션의 대상으로 하는 상기 기지의 유전자 단편의 염기배열을 갖도록 설정된 프라이머를 이용하여 증폭되는 것이 바람직하다. 또, 하이브리다이제이션의 대상으로 하는 상기 기지의 유전자 단편은 미리 지지체에 고정되어 있는 것이 바람직하다. 미리 기지의 유전자 단편을 지지체에 고정함으로써 프로브와의 하이브리다이제이션을 정확하게 보충할 수 있다. 또, 기지의 유전자 단편에 위치정보를 갖게 하는 것이 가능하게 되고, 다양한 기지의 유전자 단편을 정렬시킴으로써, 한번에 다수의 유전자를 검출할 수 있다.

구체적으로는, 예를 들어 표적 핵산을 미리 나일론 멤브레인 등에 스폿(고정)해 두고, 증폭된 핵산을 프로브로 하여 하이브리다이제이션시킨다. 스폿된 핵산과 증폭된 핵산 사이에 하이브리다이제이션이 성립하면, 시료 중에 표적의 핵산이 존재하고 있었다고 판정할 수 있다. 한편, 핵산 증폭 공정에서 핵산이 증폭되지 않은 경우나, 표적의 핵산이 아닌 핵산이 비특이적으로 증폭되어 있던 경우는 하이브리다이제이션이 성립하지 않고, 시료 중에 표적의 핵산이 존재하고 있었다고 판정할 수 있다.

하이브리다이제이션의 대상으로 하는 상기 기지의 유전자 단편은 핵산 증폭 공정에 의해 증폭된 예정된 염기배열부분을 포함하고 있다면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 증폭될 예정인 염기배열부분만, 또는 증폭될 예정인 염기배열부분의 일부인 것이 바람직하다. 증폭될 예정인 염기배열부분 이외의 염기배열을 포함하고 있는 경우에는 증폭된 핵산이 원하는 배열을 갖지 않는 비특이적 증폭산물이었던 경우에 하이브리다이즈할 가능성이 있기 때문이다.

하이브리다이제이션은 기지의 유전자 단편에 대하여 표식된 증폭핵산을 프로브로 하여, 공지의 방법에 의해 행하면 된다. 공지의 방법으로서는, 예를 들어, J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition」 Cold Spring Harbor Laboratory(2001)에 기재되어 있는 방법 등을 들 수 있는데, 이것에 한정되는 것은 아니다.

또, 핵산 증폭 공정에서 증폭되고 표식된 핵산을 프로브로 하고, DNA 마이크로 어레이를 이용하여 표적 핵산의 존재의 유무를 판정하는 방법을 이용할 수도 있다. 여기에서, DNA 마이크로 어레이에는, 말하자면 올리고 DNA 타입의 것과 cDNA 타입의 것 중 어느 하나를 포함하는 것으로 한다. 또, DNA 마이크로 어레이는 시판되는 것을 이용해도 되고, 자체 제작한 것을 이용해도 된다. 판정공정에서 DNA 마이크로 어레이를 이용하는 경우에는, 상술한 바와 같이, 핵산 증폭 공정에서 랜덤한 배열의 프라이머를 이용하여 비특이적으로 증폭된 핵산 중에 표적 핵산이 존재하는지의 여부를 판정할 수 있다.

(5) 본 발명에 따른 핵산 검출 방법의 적용범위

본 검출방법의 적용범위로서는, 종래의 유전자 진단이라 불리우는 분야 모두에 적용 가능하다. 예시하면 다음과 같지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.

a) 병원 미생물(세균, 진균, 바이러스, 기생충 등)의 검출, 즉 감염증의 분자 진단

b) 암의 분자 진단

c) 출생전의 유전성 질환 등의 분자 진단

d) 약물대사에 관여하는 유전자의 분자 진단

e) 법의학 샘플에서의 분자 진단

f) 질병 마커 유전자의 분자 진단

g) 이식시의 조직 타이핑

h) 적합성 테스트

i) SNPs 검출

본 발명에 따른 핵산 검출 방법은, 상기 a)에 나타낸 감염증의 분자 진단에 이용하는 것이 최적이라고 생각된다. 그 이유를 이하에 설명한다.

병원 미생물은 혈액중 또는 체액 중에 부유하여 존재하고 있을 가능성은 낮고, 숙주세포에 침입하기 시작하여 감염증을 발증시킨다. 따라서, 감염증의 병원미생물을 검출하기 위한 시료로서는 백혈구 등의 면역계 세포가 적합하다고 할 수 있다. 그리고, 세포에 탐식된 세균이나 세포에 침입한 바이러스 등을 검출하는 수단으로서는 시료에서 핵산을 추출한 후에 증폭하는 종래의 PCR법이나, 핵산을 증폭하지 않고 표적 핵산을 검출하는 ISH법에서는 충분한 검출감도, 재현성, 간편성 등을 실현할 수 없는 경우가 있다. 한편, 본 발명에 따른 핵산 검출 방법에서는 세균을 탐식한 세포나 바이러스 등이 침입한 세포를 직접 지지체에 고정화하고, 그 상태에서 세포 중의 세균이나 바이러스 등의 핵산을 증폭하여 검출하는 것이기 때문에, 상기 종래의 방법과 비교하여 현저하게 검출감도 및 정밀도가 향상되는 것은 분명하다.

또, 종래 세포 내의 병원 미생물 등을 검출하는 방법으로서, in situ PCR법이 있다. 이 방법은 세포를 슬라이드글라스에 고정화하고, 세포 내에서 PCR을 행하고, 세포 내에서 증폭한 산물을 ISH법으로 프로브를 하이브리다이제이션시켜 시각화하고, 현미경으로 검출하는 것이다. 따라서, in situ PCR법은 본 발명에 따른 핵 산 검출 방법과 동등한 검출감도를 기대할 수 있으나, 조건설정이 어렵고, 재현성이 부족하다는 문제점이 있다. 또, 비특이적 반응이 많고, 비특이적 증폭산물을 표적의 특이적 증폭산물과 세포 내에서 구별하기가 어렵다는 문제점이 있다.

이상에서, 본 발명에 따른 핵산 검출 방법은 세포에 탐식된 세균이나 세포에 침입한 바이러스 등을 검출하는 수단으로서 매우 뛰어난 방법이라고 할 수 있다.

2. 본 발명에 따른 유전자 검출 키트

본 발명에 따른 유전자 검출 키트(이하, 「본 키트」라 기재한다)는, 본 발명에 따른 핵산 검출 방법을 이용하여 시료 중의 표적 유전자를 검출하기 위해 이용하는 키트이다. 본 검출방법에 이용하는 시약, 기구류를 키트화함으로써, 본 검출방법을 간편하게 실시할 수 있게 되고, 한층 단시간에 정확한 검출결과를 얻을 수있게 된다. 또, 유전자에는 DNA 및 RNA가 포함된다.

(1) 본 키트의 구성

본 키트에는 적어도 시료 고정화 공정에서 사용하는 시료 고정화용 지지체, 핵산 증폭 공정에서 사용하는 프라이머, 핵산합성효소, 기질(뉴클레오시드3인산), 완충액 등의 시약, 판정공정에서 사용하는 증폭핵산검출용 지시약 등의 시약 및 기구 등이 포함되어 있는 것이 바람직하다. 또, 이용하는 시료를 특정한 키트로 함으로써 핵산 노출 공정이 필요한 경우에는 핵산노출용 시약(계면활성제나 단백질 분해효소 등)을 포함시킬 수 있다. 또, 이용하는 시료에 적합한 고정용 시약을 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 백혈구를 포함하는 생체유래 시료를 특정하고, 백혈구에 탐식된 세균 등의 미생물의 게놈을 표적 핵산으로 하는 키트의 경우에는, 고정용 시약(예를 들어, 카르노이 고정액 등) 및 핵산노출용 시약(미생물의 세포벽 분해효소 등)을 포함시키는 것이 바람직하다.

또, 핵산증폭방법 및 판정방법을 특정함으로써, 키트에 포함되는 시약의 구성을 구체화하는 것이 가능하게 된다. 예를 들어, 핵산증폭방법을 PCR법으로 하는 경우는, 핵산 증폭 공정에서 이용하는 시약은 PCR 반응용 완충액, 디옥시뉴클레오시드3인산 혼합액, 내열성 DNA 합성효소(Taq 폴리머라아제)로 된다. 또, PCR에 의해 핵산을 표식하는 것이 필요하다면, 더욱 표식 디옥시뉴클레오시드3인산을 포함시키면 된다.

판정방법을 아가로스 겔 전기영동법으로 하는 경우는, 아가로스 겔, 전기영동용 완충액, 분자량 마커, 핵산염색용 시약 등을 키트에 포함시키면 된다. 판정방법을 도트 하이브리다이제이션으로 하는 경우는, 표적 핵산을 스폿(고정)한 멤브레인, 하이브리다이제이션용 완충액, 핵산의 표식에 따른 검출용 지시약(예를 들어 디곡시제닌 표식을 이용한 경우에는 효소표식한 항디곡시제닌 항체, 표식한 효소를 발색시키기 위한 기질 등), 하이브리백, 기타 필요한 시약, 기구 등을 키트에 포함시키면 된다. 핵산 검출 방법을 DNA 마이크로 어레이로 하는 경우는, 표적 핵산에 따른 DNA 마이크로 어레이 및 필요한 시약, 기구 등을 키트에 포함시키면 된다.

즉, 본 발명에 따른 핵산 검출 방법에 이용하는 시약, 표적 유전자, 핵산증폭방법, 핵산 검출 방법을 구체적으로 특정함으로써, 이용하는 시약, 기구 등을 여러가지로 조합시켜 키트를 구성하는 것이 가능하게 된다. 또, 키트의 구성은 상기 예시한 시약, 기구 등에 한정되는 것은 아니고, 목적에 따라 적당한 공지의 시약, 기구 등을 적절히 선택하여 이용하면 된다.

(2) 표적 유전자

하나의 키트에 포함되는 표적 유전자는 1유전자로 한정할 필요는 없고, 복수의 프라이머 세트를 키트에 포함시킴으로써, 복수의 표적 유전자를 검출 가능한 키트로 할 수 있다. 예를 들어, 질병관련 유전자를 표적으로 하는 키트에는 동일한 시료에서 검출하는 것이 가능한 복수의 질병관련 유전자를 표적으로 할 수 있다. 보다 구체적으로는, 감염증의 원인 미생물의 유전자를 표적으로 하는 경우에는, 황색포도구균, 표피포도구균, 녹농균, 장구균, 대장균 등을 특이적으로 검출 가능한 프라이머 세트를 키트에 포함시키면 된다. 이러한 감염증의 원인 미생물의 표적 유전자로서는 약제 내성 유전자나 감수성 유전자인 것이 바람직하다.

또, 암 마커 유전자를 표적으로 하는 경우에는 p53, MDM2, H-ras, K-ras, N-ras, APC, Myc, HER2/neu, BRCA1, BRCA2, erbB, src, fos, jun, raf, fes, erb-A, fms, sis, Rb, WT1 등을 특이적으로 검출 가능한 프라이머 세트를 키트에 포함시키면 된다. 또, 유전성 질환관련 유전자를 표적으로 하는 경우에는, 예를 들어 색소성 건피증관련 유전자(XPA, XPB, XPC, XPD, XPE, XPF/ERCC1, XPV), 가족성 대장염관련 유전자(APC), 알츠하이머병관련 유전자(apoE4), 관상동맥성 질환관련 유전자(apoE2), Von Hippel-Lindau관련 유전자(VHL), 근디스트로피관련 유전자(디스트로핀) 등을 특이적으로 검출 가능한 프라이머 세트를 키트에 포함시키면 된다.

또, 본 키트의 적용범위는, 상기 「1. (5) 본 발명에 따른 핵산 검출 방법의 적용범위」와 동일하며, 종래의 유전자 진단이라 불리우는 분야 모두에 적용 가능 하다. 따라서, 본 키트의 표적 유전자는 모든 유전자 진단 분야에서 선택하는 것이 가능하며, 상기 예시한 것으로 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명하겠지만, 본 발명은 이것에 한정되는 것은 아니다.

＜실시예 1. 탐식 샘플을 이용한 핵산의 검출＞

[시료 조제]

미리 외래 미생물(황색포도구균(Staphylococcus aureus ; 이하, SA) ATCC 126000, 표피포도구균(Staphylococcus epidermidis ; 이하, SE)ATCC 14990, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa ; 이하, PA)ATCC 10145, 장구균(Enterococcus faecalis ; 이하, EF)ATCC 19433, 대장균(Escherichia coli ; 이하, EC)ATCC 11775)을 브레인 하트 인퓨젼(BHI) 배양액(DIFCO)에 식균하고, 37℃에서 8시간 이상 배양하였다.

배양한 균액을 4℃, 2,000×g으로 10분간 원심분리하여 집균하였다. 상청을 버린 후, 균의 팰릿을 PBS 5mL을 이용하여 현탁하고, 다시 4℃, 2,000×g으로 10분간 원심분리하여 집균하였다. 집균한 균을 PBS 5mL로 현탁한 후, PBS로 희석하여 흡광도계에 의해 균액의 탁도(OD=600nm)를, 0.01~0.03으로 조정한 것을 15mL 제작하였다. 제작한 균액을 별개의 175㎠의 배양용 플라스코로 옮기고, 약 30분간 실온에서 정치하였다.

헤파린부가 정상인의 혈액 50mL을 채취하고, 혈액분리시약(염화나트륨 225mg 및 덱스트란(MW200,000~300,000)1.5g을 멸균정제수로 용해하고, 25mL로 메스 업한 것)을 약 4:1의 비율로 첨가하고, 37℃(20~40℃)에서 30분간 정치하고, 백혈구 획분을 분취하였다. 분취한 백혈구 획분을 PBS에서 50mL로 하였다.

상기 균액을 넣어 정치한 배양용 플라스코의 상청을 천천히 버리고, 상기 PBS로 희석한 백혈구 획분을 10mL씩 플라스코에 첨가하고, 실온에서 약 10분간 정치하였다. 플라스코 내의 상청을 버리고, 플라스코의 바닥에 부착된 백혈구를 0.02%EDTA 포함 PBS 10mL로 15mL의 원심관에 회수하고, 4℃에서 140×g~180×g으로 10분간 원심분리하고, 백혈구를 수집하였다. 수집한 백혈구 중에 적혈구의 혼입이 인정되는 경우에는 멸균정제수 1mL로 백혈구의 침사를 잔잔하게 현탁하여 용혈시킨 후, PBS 14mL를 첨가하여 등장화한 후, 다시 4℃에서 140×g~180×g으로 10분간 원심분리하고, 백혈구를 수집하였다.

수집한 백혈구를 PBS로 현탁하고, 혈구계산반으로 세포수를 계측하고, 1×10⁴개/μL~5×10⁴개/μL로 조정하였다. 이 샘플을 탐식 샘플이라 칭하고, 본 실시예의 시료로 하였다.

[시료 고정화 공정]

상기 각 탐식 샘플을 지지체로서 이용한 TopYield strips(NUNC:248909)의 각 웰에 각각 5μL씩 스메어하고, 풍건하였다. 각 웰에 100μL의 75% 에탄올을 부어 5분간 고정 및 탈염하였다. 그 후, 75% 에탄올을 폐기하고, 서멀 사이클러를 이용하여 풍건하였다.

[핵산 증폭 공정]

Nested-PCR법을 이용하여 표적 핵산을 증폭하였다. 우선, 각 탐식 샘플이 고정화된 웰에 PCR 관련 시약(1웰당 TaKaRa Ex Taq(5units/μL):0.5μL(final 2.5U), 10×Ex Taq Buffer:5μL, dNTP mixture(각 2.5mM):4μL, 각 세균식별 프라이머 2종:0.4uM, 멸균정제수:up to 50μL)을 가하였다. 1회째의 PCR용 프라이머에는 SA 식별 프라이머로서 이하에 나타내는 SA1T(배열번호 1) 및 SA1B(배열번호 2)를 사용하였다.

SA1T:5'-GAGGATGCAGCGAATTAAACAACGTACTGCTGTTCAACGC-3'

SA1B:5'-AATGAAACTTTACCAACAATTTGGTCTTCATCAATGAGGC-3'

SE 식별 프라이머로서 이하에 나타내는 SE1T(배열번호 5) 및 SE1B(배열번호 6)를 사용하였다.

SE1T:5'-ACTGGAATAATCATTGGTATTATTGCTTTAATTCTAGTAA-3'

SE1B:5'-CTAACAAAATCTAAGTAGAGTTTCAGGAATTTTTCTGGTT-3'

PA 식별 프라이머로서 이하에 나타내는 PA1T(식별번호 9) 및 PA1B(배열번호 10)를 사용하였다.

PA1T : 5'-ACCTTGCCGATGATCAGGTCGAGCAGCAGCAGTTCCGCCG-3'

PA1B : 5'-GTGTTCACCGGCTCCACCGAGGTCGGCAAGTACTTCATGC-3'

EF 식별 프라이머로서 이하에 나타내는 EF1T(배열번호 13) 및 EF1B(배열번호 14)를 사용하였다.

EF1T : 5'-CTTTTGCTAGTTCATGTTTATTGATTTTTCGTTCGATTAT-3'

EF1B : 5'-TACCATTTCTTGCATGCTCATTTCTCCTTACTACTGAAAC-3'

EC 식별 프라이머로서 이하에 나타내는 EC1T(배열번호 17) 및 EC1B(배열번호 18)를 사용하였다.

EC1T : 5'-CATTTGTGAATGAGATGCACTGACTAAATCAATTGGCCCC-3'

EC1B : 5'-CCGAGATGGGCTTCACCTGTCTGCGTATTTCCATTGCCTG-3'

서멀 사이클러는 GeneAmp PCR System9700(PE Applied Biosystems)을 사용하고, 94℃에서 1분간 유지한 후, 94℃에서 1분간, 68℃에서 3분간의 반응을 50사이클 반복하고, 72℃에서 1분간 유지하여 1회째의 PCR을 종료하였다.

2회째의 PCR(Nested-PCR)은 상기 조성의 PCR관련 시약이 들어간 PCR 튜브에 1회째의 PCR 반응액 5μL을 첨가하여 행하였다. 2회째의 PCR용 프라이머에는 SA 식별 프라이머로서 이하에 나타내는 SA2T(배열번호 3) 및 SA2B(배열번호 4)를 사용하였다.

SA2T : 5'-TGTTCAACGCTTGATTAGTTTTATT-3'

SA2B : 5'-TCAATGAGGCCAAACGCACGGCTAT-3'

SE 식별 프라이머로서 이하에 나타내는 SE2T(배열번호 7) 및 SE2B(배열번호 8)를 사용하였다.

SE2T : 5'-ATTCTAGTAATTATGCAAGGGTTTC-3'

SE2B : 5'-TTTTCTGGTTCCTCGATATGTGGTG-3'

PA 식별 프라이머로서 이하에 나타내는 PA2T(배열번호 11) 및 PA2B(배열번호 12)를 사용하였다.

PA2T : 5'-AGTTCCGCCGAGAGGGCGAACATCG-3'

PA2B : 5'-TACTTCATGCAGTATTCCGCGCAAT-3'

EF 식별 프라이머로서 이하에 나타내는 EF2T(배열번호 15) 및 EF2B(배열번호 16)를 사용하였다.

EF2T : 5'-GTTCGATTATCCCACAAGATTATAT-3'

EF2B : 5'-CTACTGAAACATCGTCTTAAAAAAA-3'

EF 식별 프라이머로서 이하에 나타내는 EC2T(배열번호 19) 및 EC2B(배열번호 20)를 사용하였다.

EC2T : 5'-AATTGGCCCCCAACTGGTGTACCCC-3'

EC2B : 5'-CCATTGCCTGGGCGCGAATTTTCCC-3'

서멀 사이클러는 1회째와 마찬가지로 GeneAmp PCR System9700(PE Applied Biosystems)을 사용하고, 94℃에서 1분간 유지한 후, 94℃에서 1분간, 68℃에서 1분간의 반응을 30사이클 반복하고, 72℃에서 1분 유지하여 2회째의 PCR을 종료하였다.

[판정공정]

1% 아가로스 겔 전기영동(아가로스 : Agarose-RE for

1Kbp fragment, for Restriction and Ligation(nacalai tesque))에 의해 증폭한 PCR 산물을 분리하고, 에치듐

브로마이드에 의해 염색하였다. 사용한 각 세균을 주형으로 하여 동일한 프라이머를 이용하여 행한 PCR의 결과와 비교함으로써 표적 핵산이 증폭되어 있는지의 여부를 확인하였다.

[결과]

결과를 도 2에 도시하였다. 좌측이 각 세균을 주형으로 하여 PCR을 행한 결과를 나타낸 것이며, 우측이 각 탐식 샘플을 시료로 하여 본 발명에 관한 핵산 검출 방법을 이용하여 각 세균의 표적 핵산을 증폭한 결과를 나타낸 것이다. 도면 중의 M은 분자량 마커를 나타내고, 좌단의 수치는 분자량(bp)을 나타내고 있다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 탐식 샘플의 2회째의 PCR(2 ND-PCR(nested))의 밴드의 위치는 각 세균을 주형으로 하여 PCR을 행한 경우의 2회째의 PCR(2 ND-PCR(nested))의 밴드의 위치와 동일하며, 표적의 핵산이 검출된 것을 나타내고 있다.

＜실시예 2. 패혈증환자로부터의 기인균의 판정＞

[시료 조제]

패혈증이 의심되는 환자에게서 혈액 5mL를 채취하고, 헤파린을 첨가하였다(헤파린첨가 혈액). 헤파린첨가 혈액에 혈액분리시약(염화나트륨 225mg, 덱스트란(MW200,000~300,000)1.5g을 멸균정제수로 용해하고, 25mL로 메스 업한 것)을 약 4:1의 비율로 첨가하고, 37℃(20~40℃)에서 30분간 정치하고, 백혈구 획분을 분취하였다. 4℃에서 140~180×g으로 10분간 원심분리하고, 백혈구를 수집하였다. 수집한 백혈구 중에 적혈구의 혼입이 인정되는 경우에는 멸균정제수 1mL로 백혈구의 침전을 침착하게 현탁하여 용혈시킨 후, PBS 14mL를 첨가하여 등장화한 후, 다시 4℃에서 140~180×g으로 10분간 원심분리하여 백혈구를 수집하였다. 수집한 백혈구를 PBS 150μL로 현탁하였다. 이것을 임상검체라 하고, 시료로 하였다.

[시료의 고정화]

상기 시료를 지지체로 하여 이용한 TopYield strips(NUNC:248909)의 각 웰에 각각 5μL씩 스메어하고, 서멀 사이클러(GeneAmp PCR System9700(PE Applied Biosystems))를 이용하여 42℃에서 풍건하였다. 각 웰에 100μL의 75% 에탄올을 부어 5분간 고정 및 탈염하였다. 그 후, 75% 에탄올을 폐기하고, 서멀 사이클러를 이용하여 42℃에서 풍건하였다.

[시료의 전처리(핵산 노출 공정)]

각 웰에 효소시약(사포닌 125ug, t-옥틸페녹시폴리에콕시에탄올(비중 1.068~1.075(20/4℃), pH(5w/v%)5.5~7.5) 125nL, N-아세틸룸라미다아제(생화학공업사 제)50단위, 리조팀(생화학공업사 제)5000단위, 리조스타핀(SIGMA사 제) 5단위를 멸균정제수 1mL로 용해하여 조제한 것)10μL를 넣고, 서멀 사이클러를 이용하여 37℃에서 10분 처리후, 95℃에서 10분간 처리하여 효소의 실활 및 웰을 풍건시켰다.

단, N-아세틸룸라미다아제는 S.salivalius IF03350의 열처리세포를 37℃, pH7.0으로 1분간에 1ug 용균하는 효소활성을 1단위로 하였다. 리조팀은 M.luteus를 35℃, pH6.2로 1분간에 540nm의 흡수를 0.001 내릴 때의 효소활성을 1단위로 하였다. 리조스타핀은 S.aureus를 37℃, pH7.5로 10분간에 620nm의 흡수를 0.240에서 0.125로 내릴 때의 효소활성을 1단위로 하였다.

[핵산 증폭 공정]

Nested-PCR법을 이용하여 표적 핵산을 증폭하였다. 우선, 시료가 고정화된 웰에 PCR 관련 시약(1웰당 TaKaRa LA Taq:0.2μL, 10×LA Taq Buffer:2μL, 25mM MgCl2:2μL, dNTP mixture(각 2.5mM):3.2μL, 각 세균식별 프라이머 2종:각 0.16uM, 멸균정제수로 20μL로 조정하였다)를 첨가하였다.

1회째의 PCR용 프라이머에는 상기 실시예 1에서 사용한 프라이머와 동일한 프라이머를 사용하였다. 즉, SA 식별 프라이머로서 SA1T(배열번호 1) 및 SA1B(배열번호 2)를 사용하였다. SE 식별 프라이머로서 SE1T(배열번호 5) 및 SE1B(배열번호 6)를 사용하였다. PA 식별 프라이머로서 PA1T(배열번호 9) 및 PA1B(배열번호 10)를 사용하였다. EF 식별 프라이머로서 EF1T(배열번호 13) 및 EF1B(배열번호 14)를 사용하였다. EC 식별 프라이머로서 EC1T(배열번호 17) 및 EC1B(배열번호 18)를 사용하였다.

서멀 사이클러는 GeneAmp PCR System9700(PE Applied Biosystems)을 사용하고, 94℃에서 1분간 유지한 후, 98℃에서 20초, 68℃에서 3분간의 반응을 30사이클 반복하고, 72℃에서 5분 유지하여 1회째의 PCR 반응을 종료하였다.

2회째의 PCR(Nested-PCR)은 상기 조성의 PCR 관련 시약이 들어간 PCR 튜브에 1회째의 PCR 반응액 1μL을 첨가하여 행하였다. 2회째의 PCR 반응에는 이하의 프라이머를 사용하였다.

SA 식별 프라이머

SA3T : 5'-ACTGTTCGTACAAACTTTTGTAATAGTTGGTCATG-3'(배열번호 21)

SA3B : 5'-CTCGCCATCTTTCAAAGTTGGATCCATTGATTCAC-3'(배열번호 22)

SE 식별 프라이머

SE3T : 5'-GGTATATAAATGACTAAAGGGAGGTGCCAAGATGA-3'(배열번호 23)

SE3B : 5'-GCAATGCACGTACTGCAATTGCACTTTCTTCCGGAG-3'(배열번호 24)

PA 식별 프라이머

PA3T : 5'-ATTCGATCGTCCTCTTGTTGTCGTTATCGGCATCG-3'(배열번호 25)

PA3B : 5'-TGGTGGAGCGTTCGATCCACGACGAGTTCGTCGAG-3'(배열번호 26)

EF 식별 프라이머

EF3T : 5'-ATCAGGCGTATCCATTATTGGATTAACCACGATTG-3'(배열번호 27)

EF3B : 5'-TTGCTCCTGACGATATTCACGATTCCCTAAAATCC-3'(배열번호 28)

EC 식별 프라이머

EC3T : 5'-AGATGCGGATTGGGGATCATATTCAGTATGTTGCC-3'(배열번호 29)

EC3B : 5'-GATCACTTCGAACATTACGCCCGCACGGTCTTTAC-3'(배열번호 30)

서멀 사이클러는 1회째와 마찬가지로 GeneAmp PCR System9700(PE Applied Biosystems)을 사용하고, 94℃에서 1분간 유지한 후, 98℃에서 20초, 68℃에서 1분간의 반응사이클을 30사이클 반복하고, 72℃에서 5분 유지하여 2회째의 PCR을 종료하였다.

[판정공정]

1% 아가로스 겔 전기영동(아가로스:Agarose-RE for

브로마이드에 의해 염색하였다. 사용한 프라이머에 대응한 각 세균을 주형으로 하여 PCR 반응을 행하고, 표적 핵산이 증폭되어 있는 것을 확인하였다(포지티브

컨트롤). 또, 시료를 스메어하지 않는 상태에서 PCR 반응을 행하고, 표적 핵산 이 비특이적으로 증폭하고 있지 않은 것을 확인하였다(네가티브

컨트롤).

[결과]

전기영동의 결과를 도 3에 도시하였다. 도면 중의 좌단의 수치는 분자량(bp)을 나타내고 있다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 레인 13 및 레인 15에 특이적인 핵산의 증폭이 인정되기 때문에 이 임상검체는 SA(황색포도구균) 및 PA(녹농균)에 감염되어 있다고(양성) 판정하였다.

또, 이 임상검체(임상검체 1)를 포함하여 4예의 임상검체에 대하여 상기와 동일한 방법으로 기인균을 판정한 결과를 표 1에 나타낸다.

[표 1]

	SA	SE	PA	EF	EC	혈액배양
임상검체1	양성	음성	양성	음성	음성	음성
임상검체2	음성	음성	양성	음성	음성	음성
임상검체3	음성	음성	양성	음성	음성	음성
임상검체4	양성	음성	양성	음성	음성	음성

표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 핵산 검출 방법은 패혈증환자의 기인균의 판정에 유효하다는 것이 나타났다.

＜실시예 3. 패혈증 혈액 모델로부터의 생체인자(RNA)의 검출＞

[패혈증 혈액 모델의 조제]

미리 외래 미생물(대장균(Escherichia coli ; 이하, EC) ATCC11775)을 브레인 하트 인퓨젼(BHI) 배양액(DIFCO)에 식균하고, 37℃에서 8시간 이상 배양하였다. 배양한 균액을 4℃, 2,000×g으로 10분간 원심분리하여 집균하였다. 상청을 버린 후, 균의 팰릿을 PBS 5mL을 이용하여 현탁하고, 다시 4℃, 2,000×g으로 10분간 원심분리하여 집균하였다. 집균한 균을 PBS 5mL로 현탁한 후 PBS로 희석하여 흡광도 계에 의해 균액의 탁도(OD=600nm)를, 0.1~0.15로 조정한 것을 5mL 제작하였다. 헤파린 부가 정산인의 혈액 8mL을 채취하고, 15mL의 원침관 2개에 4mL씩 나누어 주입했다. 헤파린 부가 혈액 4mL로 제작한 균액 및 PBS를 400μL 첨가하고, 37℃에서 3시간 정치하고, 염증성 사이트카인의 발현을 유도하였다.

상기 헤파린 부가 혈액에 혈액분리시약(염화나트륨 225g, 덱스트란(MW200,000~300,000)1.5g을 멸균정제수로 용해하고, 25mL로 메스 업한 것)을 약 4:1의 비율로 첨가하고, 37℃(20~40℃)에서 30분간 정치하고, 백혈구 획분을 분취하였다. 4℃에서 140×g~180×g으로 10분간 원심분리하여 백혈구를 수집하였다. 수집한 백혈구 중에 적혈구의 혼입이 인정되는 경우에는 멸균정제수 1mL로 백혈구의 가라앉은 것을 잔잔하게 현탁하여 용혈시킨 후, PBS 14mL를 첨가하여 등장화한 후, 다시 4℃에서 140×g~180×g으로 10분간 원심분리하여 백혈구를 수집하였다. 수집한 백혈구를 PBS 150μL로 현탁하였다. 이것을 패혈증 혈액 모델로 하고, 시료로 하였다.

[시료의 고정화]

상기 시료를 지지체로서 이용한 TopYield strips(NUNC:248909)의 각 웰에 각각 5μL씩 스메어하고, 서멀 사이클러(GeneAmp PCR System 9700(PE Applied Biosystems))를 이용하여 70℃에서 풍건하였다. 각 웰에 100μL의 75% 에탄올을 부어 5분간 고정 및 탈염하였다. 그 후, 75% 에탄올을 폐기하고, 서멀 사이클러를 이용하여 42℃에서 풍건하였다.

[시료의 전처리]

각 웰에 DNA 분해효소(DNasel, RNase-free(Roche Diagnostics GmbH사 제) 0.1단위/μL, Tris-HCl 10mM, MgCl2 10mM, DTT 1mM, 멸균증류수)10μL을 넣고, 서멀 사이클러를 이용하여 37℃에서 10분 처리하고, 백혈구 게놈 DNA를 분해한 후, 70℃에서 10분간 처리하여 효소의 실활 및 웰을 풍건시켰다.

단, 자우흉선 DNA를 기질로 하여 25℃, pH5.0에서 반응액의 260nm의 흡광도를 1분간에 0.001 증가시키는 효소활성을 1단위로 하였다.

[핵산 증폭 공정]

RT-PCR법을 이용하여 표적 핵산의 증폭을 행하였다. 우선, 역전사반응(reverse transcription;RT)을 행하였다. 역전사 반응에는 슈퍼 스크립트 퍼스트 스트랜드 시스템(RT-PCR용)(Invitrogen)을 사용하였다. 시료가 고정화된 웰에 Oligo(dT)12-18(0.5ug/μL):1μL과 멸균증류수:9μL을 첨가하여 70℃에서 10분간 처리후, 4℃에서 1분간 정치하였다.이어서, 10×PCR buffer[200mM Tris-Hcl(pH 8.4), 500mM KCl]:2μL, 25mM MgCl2:2μL, 10mM dNTP mix:1μL, 0.1M DTT:2μL을 첨가하여 25℃에서 5분간 정치하였다. 그 후, SuperScript II RT:1μL(50 units)을 첨가하여 25℃에서 10분, 42℃에서 50분, 70℃에서 15분간 처리후, 4℃에서 5분간 정치하였다. 역전사반응 종료후 E.coli RNaseH(2units/μL):1μL을 첨가하여 37℃에서 20분간 처리하고, RNA를 완전하게 분해하였다.

PCR 반응은 PCR관련 시료(1웰당 TaKaRa LA Taq:0.2μL, 10×LA Taq Buffer:2μL, 25mM MgCl2:2μL, dNTP mixture(각 2.5mM):3.2μL, IL6 식별 프라이머:각 0.16μM, 멸균정제수로 18μL로 조정하였다)가 들어간 PCR 튜브에 역전사반응액 2 μL을 첨가하여 행하였다.

또, PCR 반응에는 이하의 인터로이킨 6(IL6)용 프라이머를 사용하였다.

IL6 식별 프라이머

IL6-T : 5'-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGCCTTCGG-3'(배열번호 31)

IL6-B : 5'-ATTCTTTGCCTTTTTCTGCAGGAACTGGAT-3'(배열번호 32)

서멀 사이클러는 GeneAmp PCR System9700(PE Applied Biosystems)을 사용하고, 94℃에서 1분간 유지한 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 7℃에서 30초간의 반응 사이클을 50사이클 반복하고, 72℃에서 5분간 유지하여 PCR 반응을 종료하였다.

[판정공정]

2% 아가로스 겔 전기영동(아가로스 : Agarose-RE for

브로마이드에 의해 염색하였다. 전기영동으로 특이적 밴드가 얻어짐으로써 표적 핵산이 증폭되어 있는 것을 확인하였다.

[결과]

전기영동의 결과를 도 4에 도시하였다. 도면 중의 좌단의 수치는 분자량(bp)을 나타내고 있다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 레인 3에 IL6 유래의 특이적인 핵산의 증폭이 관찰되기 때문에, 대장균에 감염된 혈액에서의 IL6의 발현상승이 본 발명의 핵산 검출 방법에 의해 검출가능한 것이 증명되었다.

또, 발명을 실시하기 위한 최량의 형태의 항에서 이룬 구체적인 실시형태 또 는 실시예는 어디까지나 본 발명의 기술 내용을 명확하게 하는 것으로서, 그러한 구체예로만 한정하여 협의로 해석되는 것은 아니며, 본 발명의 정신과 다음에 기재하는 청구범위 내에서 여러가지로 변경하여 실시할 수 있는 것이다.

본 발명에 따른 핵산 검출 방법은, 세포를 포함하는 시료를 지제체에 고정하는 시료 고정화 공정과, 시료 중의 핵산을 지지체 상에서 증폭하는 핵산 증폭 공정과, 증폭된 핵산을 검출하는 핵산검출공정을 포함하는 것이며, 시료에서 핵산을 추출하는 공정을 필요로 하지 않는다. 따라서, 핵산의 추출에 기인하는 핵산의 손실이 거의 생기지 않고, 시료 중에 포함되는 표적 핵산이 매우 미량이더라도 증폭하기 위한 주형으로서 필요한 양의 표적 핵산이 포함되어 있다면 검출할 수 있다는 효과를 거두고, 그에 따라 재현성 및 검출정밀도가 향상된다는 효과가 있다. 또, 시료에서 핵산을 추출하는 공정을 필요로 하지 않기 때문에 조작이 간편하게 되고, 결과를 얻기까지에 필요한 시간을 단축할 수 있다는 효과가 있다.

본 발명에 따른 핵산 검출 방법은, 시료를 지지체에 고정하기 때문에, 시료 용액 중에 증폭저해물질이 포함되어 있는 경우라도, 세포 외에 존재하는 증폭저해물질은 용이하게 제거할 수 있다. 따라서, 증폭효율의 저하에 따르는 검출감도의 저하를 초래하지 않는다는 효과가 있다.

본 발명에 따른 핵산 검출 방법은, 시료를 지지체에 고정하고, 당해 지지체 상에서 핵산을 증폭하기 때문에 시료를 PCR 튜브 등의 다른 용기 등으로 옮길 필요는 없다. 따라서, 시료의 이동에 기인하는 핵산의 손실이 생기지 않기 때문에 검출 감도의 저하를 초래하지 않는다는 효과가 있다. 또, 조작이 간편하게 되고, 시간을 단축할 수 있다는 효과가 있다.

본 발명에 따른 핵산 검출 방법은, 핵산을 증폭한 후에 검출을 행하기 때문에, 검출대상의 표적 핵산이 미량이기 때문에 검출이 어렵다는 문제는 생기지 않는다. 따라서, 재현성 및 검출정밀도가 향상된다는 효과가 있다. 또, 검출방법에 특별한 고안을 필요로 하지 않기 때문에, 공지의 검출방법을 적절히 선택하여 이용할 수 있다는 효과가 있다. 또, 결과의 판정에 숙련을 필요로 하지 않는다는 효과가 있다.

본 발명에 따른 유전자 검출 키트는 본 발명에 따른 핵산감출방법을 이용하여 시료 중의 표적 유전자를 검출하기 위한 키트이다. 따라서, 당해 키트를 이용함으로써 본 발명에 따른 핵산 검출 방법을 매우 간편하고 신속하게 실시할 수 있다는 효과가 있다.

이상과 같이 본 발명은, 종래의 유전자 진단이라고 불리는 분야에 모두 적용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 의료, 제약, 시약분야를 비롯하여 널리 생물관련 산업에 이용할 수 있다. 특히 본 발명을 의료분야에서의 임상검사에서 이용함으로써 적확한 치료방침의 선택에 공헌할 수 있다. 또, 생물관련 분야의 기초연구에 이용할 수 있고, 생물학의 발전에 크게 공헌할 것이 기대된다.

<110> FUSO PHARMACEUTICAL INDUSTRIES, LTD. <120> METHOD OF DETECTING NUCLEIC ACID AND UTILIZATION THEROF <130> JIP90171JP <140> PCT/JP2005/001840 <141> 2005-02-08 <150> JP2004-032617 <151> 2004-02-09 <160> 32 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 1 gaggatgcag cgaattaaac aacgtactgc tgttcaacgc 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequenc <400> 2 aatgaaactt taccaacaat ttggtcttca tcaatgaggc 40 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequenc <400> 3 tgttcaacgc ttgattagtt ttatt 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 4 tcaatgaggc caaacgcacg gctat 25 <210> 5 <211> 40 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Claims

세포를 포함하는 시료를 지지체에 고정하는 시료 고정화 공정과,

시료 중의 핵산을 지지체 상에서 증폭하는 핵산 증폭 공정과,

증폭된 핵산이 표적의 핵산인지의 여부를 판정하는 판정공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.
제 1항에 있어서,

상기 핵산 증폭 공정의 전단에, 시료에 포함되는 핵산을 노출시키는 핵산 노출 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.
제 2항에 있어서,

상기 핵산 노출 공정에서의 핵산노출방법으로서, 계면활성제 처리법, 효소처리법 또는 가열처리법 중 어느 한가지 방법 혹은 2가지 이상의 방법을 조합시켜서 이용하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 핵산 증폭 공정에서의 핵산증폭방법으로서, PCR(폴리머라아제 연쇄반응)법을 이용하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 핵산 증폭 공정에 있어서, 증폭된 핵산을 표식하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.
제 5항에 있어서,

상기 판정공정에서의 판정방법으로서, 핵산 증폭 공정에서 증폭되고 표식된 핵산을 프로브로 하고, 당해 프로브와 기지의 유전자 단편과의 상보적인 하이브리다이제이션을 지표로 하여 표적의 핵산인지의 여부를 판정하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.
제 6항에 있어서,

상기 기지의 유전자 단편은 미리 지지체에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.
제 5항에 있어서,

상기 판정공정에서의 판정방법으로서, 핵산 증폭 공정에서 증폭되고 표식된 핵산을 프로브로 하고, DNA 마이크로 어레이를 이용하여 표식의 핵산인지의 여부를 판정하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 시료는 생체유래 시료인 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.
제 9항에 있어서,

상기 생체유래 시료는 인간유래인 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 검출 방법을 실시하기 위한 키트에 있어서, 시료 중의 표적 유전자를 검출하기 위해 사용하는 유전자 검출 키트.
제 10항에 기재된 핵산 검출 방법을 실시하기 위한 키트에 있어서, 인간의 질병관련유전자를 검출하기 위해 사용하는 유전자 검출 키트.
제 12항에 있어서,

상기 인간의 질병관련 유전자는 인간에게 감염된 감염증 원인 미생물의 유전자인 유전자 검출 키트.
제 13항에 있어서,

상기 인간에게 감염된 감염증 원인 미생물의 유전자는 약제 내성 유전자인 유전자 검출 키트.
제 13항에 있어서,

상기 인간에게 감염된 감염증 원인 미생물의 유전자는 약제 감수성 유전자인 유전자 검출 키트.
제 12항에 있어서,

상기 인간의 질환관련 유전자는 암 마커 유전자인 유전자 검출 키트.
제 12항에 있어서,

상기 인간의 질환관련 유전자는 유전성 질환관련 유전자인 유전자 검출 키트.
제 11항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서,

적어도 표적 유전자 증폭 프라이머, PCR 반응용 완충액, 디옥시뉴클레오시드3인산 혼합액, 표식 디옥시뉴클레오티드3인산, 내열성 DNA 합성 효소, 시료 고정화용 지지체, 증폭핵산 검출용 지시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 검출 키트.