KR101795773B1

KR101795773B1 - 내부 스페이서를 포함하는 올리고뉴크레오타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101795773B1
Application number: KR1020160061405A
Authority: KR
Inventors: 박영석; 황병오; 권나영; 신예은
Original assignee: 주식회사 팍스젠바이오
Priority date: 2016-05-19
Filing date: 2016-05-19
Publication date: 2017-11-08

Abstract

본 발명은 PCR 증폭산물과 인위적으로 합성한 올리고 프로브와 교잡반응을 시킬 때 편리하게 진행을 할 수 있는 기술에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 한쪽 primer의 중간에 내부 스페이서를 삽입하여 DNA 중합효소가 PCR 등의 중합반응을 더 이상 진행하지 못하게 하여 증폭된 유전자의 바깥쪽 부위와 인위적인 올리고 프로브와의 교잡 반응을 손쉽게 일으키게 하는 기술에 관한 것이다. 본 발명은 2중 구조의 PCR 증폭산물 말단에 단일 구조의 올리고를 만들게 하고, 이 부분을 상보적인 올리고 프로브와 결합시켜 2중구조의 DNA를 변성시키지 않고도 교잡반응을 시킬 수 있는 장점이 있다.

Description

내부 스페이서를 포함하는 올리고뉴크레오타이드 및 이의 용도{A OLIGONUCLEOTIDE COMPRISING INTERNAL SPACER AND USE OF THE SAME}

본 발명은 내부 스페이서를 포함하는 올리고뉴크레오타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 한쪽 primer의 중간에 내부 스페이서를 삽입하여 DNA 중합효소가 PCR 등의 중합반응을 더 이상 진행하지 못하게 하여 증폭된 유전자의 바깥쪽 부위와 인위적인 올리고 프로브와의 교잡 반응을 손쉽게 일으키게 하는 기술에 관한 것이다.

분자진단은 DNA 또는 RNA 등 이용하여 질병의 근본을 진단하는 것으로 감염질환, 암진단, 유전질환 및 맞춤진단 등 다양한 분야에서 사용되고 있다. 대표적인 분자진단 기술로는 단시간 내에 DNA를 증폭시키는 PCR 기술이 있다 (Saiki, R., et. al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, 487-91. 1998).

그러나, 일반적인 PCR 기술은 증폭된 DNA를 확인하기 위해서 전기영동 방법을 사용하여야 한다. 이러한 전기영동을 수행하기 위해서는 아가로즈 젤 (Agarose gel)을 만들고 DNA를 염색하여 확인해야 하는 번거로움이 있다. 또한 전기영동 방법은 multiplex-PCR 시에는 각각 다른 크기의 PCR 증폭산물이어야 만하기 때문에 한번에 많은 여러 종류의 증폭산물을 확인하는 것은 쉽지가 않다.

이러한 이유 때문에 PCR 증폭산물을 확인하는 방법 중에 DNA-DNA를 교잡시키는 방법이 있는데, 일반적으로 Southern blot이라고 한다. (Southern E1. Southern blotting. Nat Protoc. 1, 518-25. 2006). 이 방법은 Southern blot의 원리에서 발전을 하여 NC membrane에서 반응 시키는 DNA line probe assay (Kleter, B., er. al. Development and Clinical Evaluation of a Highly Sensitive PCR-Reverse Hybridization Line Probe Assay for Detectionand Identification of Anogenital Human Papillomavirus. J. Clin. Micro. 37, 25082517. 1999.)와 유리 슬라이드나 플라스틱 슬라이드에서 반응 시키는 DNA chip (An. HJ., et. al. Correlation of cervical carcinoma and precancerous lesions with human papillomavirus (HPV) genotypes detected with the HPV DNA chip microarray method. Cancer 97, 16721680. 2003) 등에서 많이 사용하고 있다.

그러나 이 방법을 사용하기 위해서는 교잡 전에 반드시 가열이나 염기를 사용하여 이중염기 구조를 단일 염기 구조로 바꾸어 주어야 하는데, 이것을 한 번에 여러 검체를 취급해야 하는 임상 검사실 등에서는 매우 불편한 상황이다. 즉, 교잡반응 직전에 일반적으로 가열과 순간 냉각으로 핵산 변성을 시켜 PCR 증폭산물과 프로브 간에 교잡이 원활하도록 하게 하는 것인데, 이 방법은 가열과 얼음 등이 필요하여 한번에 많은 수의 샘플을 처리하기에는 적합하지가 않다.

또 다양한 유전자 형과 분석을 하는 방법으로 멤브레인을 사용하여 확인하는 핵산 측면 흐름 어세이 (Nucleic Acid Lateral Flow Assay)가 있다 (Aveyard, J., et. al., One step visual detection of PCR products with gold nanoparticles and a nucleic acid lateral flow (NALF) device. Chem. Commun., 41, 4251-4253,2007). 그러나, 이런 방법은 젤 전기영동 기술에 비해 복잡하여 실험실에서 제조하여 사용하기는 불가능하며, 멤브레인에 부착된 프로브의 시퀀스는 PCR 증폭 산물에 따라서 특이적으로 결합할 수 있도록 사용하여야 하는 기술의 한계 때문에 범용으로 사용하는 데는 한계점이 있다.

이런 문제를 해결하기 위하여 증폭된 산물의 종류와 상관없이 인위적으로 합성된 PCR 프라이머의 핵산 올리고머와 멤브레인의 핵산 올리고머에 상응하는 프로브가 반응하도록 함으로써, 한 종류의 멤브레인으로 다양한 PCR 산물을 범용적으로 확인할 수 있는 기술을 개발하고 특허출원을 하였다. (출원번호: 10-2015-0071945, 팍스젠바이오)

[선행 특허 문헌]

대한민국 특허공개번호 제1020140111224호

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 PCR의 증폭 산물과 부착 올리고 간에 교잡반응을 시행할 때 변성 과정을 거치지 않고 편리하게 수행하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 이러한 방법에 사용되는 수단을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 5' 말단에서부터 3' 말단 방향으로, 교잡 부위, 내부 스페이서 부위 및 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머 부위로 이루어진 단일 가닥 DNA 올리고뉴크레오타이드를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 내부 스페이서는 C3-C12 알킬기를 포함하는 화합물 또는 RNA 또는 triethylene glycol spacer 또는 18-atom hexa-ethyleneglycol spacer 또는 1’,2’-Dideoxyribose (dSpacer) 또는 PNA 또는 LNA 등으로, 이들 구조에 의해 증폭반응이 더 이상 진행이 되지 않으면 어떠한 구조의 내부 스페이서라도 가능하며,

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 내부 스페이서는 하기 화학식 1의 화합물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

[화학식 1]

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 내부 스페이서를 제외한 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머 부위, 및 교잡 부위 서열은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지거나 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 단일 가닥 DNA 올리고뉴크레오타이드를 유효성분으로 포함하는 성매개 질환 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 성매개 질환은 가드넬라균 질염(gardnerella vaginalis) 또는 마이코플라즈마 호미니스(Mycoplasma hominis)에 의하여 유발되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 단일 가닥 DNA 올리고뉴크레오타이드를 프라이머로 이용하여 증폭할 유전자 주형 부위의 한 말단에 사용하고, 증폭할 유전자 주형 부위의 다른 말단에 다른 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는 변성이 필요없는 교잡가능한 중합효소 연쇄반응 증폭산물을 얻는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의하여 얻어진 증폭 산물의 교잡 가능한 부위와 상기 교잡가능 부위와 상보적인 서열 부위의 올리고뉴크레오타이드를 가지는 고체 서포트(support)를 교잡화시켜서 얻어진 고체 서포트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 고체 서포트는 막(membrane) 또는 슬라이드인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 핵산 측면 흐름 어세이를 실시할 시에 일반적으로 실시하는 핵산분리를 시행하지 않고도 핵산 교잡을 할 수 있는 기술이다. 즉, PCR 프라이머를 합성할 때 한쪽 primer의 중간에 C3 spacer와 같은 내부 스페이서를 삽입한다. 이는 Taq polymerase 등과 같은 DNA 중합효소가 DNA를 합성해 나갈 때 C3 spacer를 만나게 되면 더 이상 진행을 하지 못하고 멈추게 되는 것이다. 이런 결과로 바깥쪽에 인위적으로 합성된 올리고머는 single strand DNA로 남게 되는데, 이 끝 부위에 붙은 곳과 인위적으로 합성하여 부착시킨 올리고와 상보적인 시퀀스로 교잡반응을 시킬 때 변성반응 없이 바로 결합을 시킬 수 있게 하는 것이다.

본 발명은 멤브레인 뿐만 아니라 DNA chip과 같은 슬라이드에서의 교잡 반응에서도 이용할 수가 있다.

본 발명은 PCR 프라이머의 한쪽 말단에 인위적으로 디자인한 15-35bp의 oligomer와 DNA 중합효소가 반응할 수 없는 내부 스페이서(internal spacer)를 붙이고, 다른 한쪽 말단에는 바이오틴을 부착시킨다. 이렇게 하여 증폭된 PCR 증폭산물은 인위로 디자인한 프로브가 단일 염기 구조로 형성되는데 이것이 멤브레인이나 슬라이드에 부착된 올리고머와 반응을 하게 된다. 이때 바이오틴이 부착된 프라이머는 골드 파티클이나 형광이 부착된 streptavidine과 반응하여 발색 또는 형광 반응이 일어나게 하여 결과를 확인할 수 있게 된다.

이하 본 발명을 도면 등을 통하여 상세하게 설명한다.

첫 번째로, 도 1a의 그림과 같이 프라이머의 한쪽에 중합반응을 저해시키는 내부 스페이서를 넣는다. 내부 스페이서는 C3, C6, C9, C12 spacer 또는 RNA spacer, triethylene glycol spacer, 18-atom hexa-ethyleneglycol space, 1’,2’-Dideoxyribose (dSpacer) 또는 PNA, LNA 등이 가능하다. 또 도 1a의 그림에서 알 수 있는 바와 같이, 다른 한쪽의 프라이머에는 Biotin이나 형광을 부착시켜 교잡반응을 확인할 수 있는 표식자로 활용을 한다.

두 번째로, 도 1b의 그림에서 알 수 있는 바와 같이, PCR 반응시에 중합반응이 일어날 때에 Taq polymerase가 internal spacer 전의 PCR primer region 까지만 합성을 하게 된다. 이것은 한쪽 끝에 single strand DNA 만이 만들어 지게 된다.

세 번째로, 도 1c의 그림에서 알 수 있는 바와 같이, 교잡반응을 시킬 때 변성을 시키지 않고 바로 반응을 시킨다. 이렇게 반응하여 만들어진 구조에서 dye를 이용하여 반응의 결과를 확인할 수 있다.

즉, 바이오틴이 경우는 streptavidine-gold나 streptavidine-형광으로 확인 할 수 있다.

이상에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 인위적으로 첨가된 내부 스페이서에 의해 남겨진 단일 염기서열에 의해 상보성이 있는 프로브와의 반응시 변성반응 없이 손쉽게 결합을 시킬 수 있고 이것으로 증폭 산물의 결과를 확인할 수 있다. 이로써 일반 실험실용이나 병원 검사실에서 이 기술을 사용한 제품을 쓰게될 때 편리성과 시간을 단축 시킬 수가 있다.

본 발명은 PCR 반응시에 사용하는 프라이머의 한쪽 말단과 인위적으로 디자인한 15-35 bp의 oligomer를 붙일 때 중간에 특정 내부 스페이서를 결합시켜 합성한다. 이때 사용할 수 있는 internal spacr는 C3/C6/C9/C12 또는 RNA 염기를 사용하면 DNA 중합효소가 염기로 인식할 수 없게 되어 더 이상 DNA 중합반응 (DNA polymerization)이 일어나지 못하게 한다. 이로 인하여 중합반응이 일어난 부분의 맨 끝에는 인위적인 single-strand DNA가 나오게 되는데, 이 ssDNA가 membrane 또는 slide 등에 부착된 상보적인 올리고와 결합하게 된다. 이는 교잡반응 (hybridization) 시에 보통 사용하는 double-strand DNA의 열변성 반응을 시키지 않아도 되므로 매우 편리하게 실험을 진행할 수 있다.

도 1은 본 발명의 PCR 프라이머의 한쪽 말단에 인위적으로 디자인한 15-35bp의 oligomer와 DNA 중합효소가 반응할 수 없는 내부 스페이서(internal spacer)를 붙인 구조 및 이러한 올리고뉴크레오타이드를 사용하여 수행하는 PCR 과정 및 그 증폭된 PCR 증폭산물은 인위로 디자인한 프로브가 단일 염기 구조로 형성되는데 이것이 멤브레인이나 슬라이드에 부착된 올리고머와 반응을 하게 되는 구조 등을 설명한 그림.
도 2는 본 발명의 실시예의 전기영동 결과와 측면 흐름 멤프레인 결과의 비교 그림. mutiplex PCR 을 실시한 후에 반응 산물의 10 ul는 2% 아가로즈젤 상에서 30분 동안 전기영동을 시켜서 확인을 하였고, 10u를 전개가 쉽게 일어나도록 전개액 100 ul를 혼합하여 변성반응없이 즉시 측면흐름 멤브레인 상에서 15분 동안 반응시켜 결과를 확인하였다.
즉, Multiplex PCR을 수행한 후에 전기영동을 수행한 결과 Gardnerella vaginalis에서는 123 bp와 Mycoplasma hominis에서는 184 bp의 크기를 확인할 수 있었으며, 카트리지에 전개시킨 것은 내부 스페이서(internal spacer)가 존재하는 것에서만 두 종류의 균에 대한 밴드를 확인할 수 있었다.
도 3은 Mycoplasma hominis 프라이머에서 내부 스페이서의 하나는 C3를 붙이고 다른 하나는 C6를 붙여서 비교 실험을 진행한 결과를 나타낸 사진, 도면에서 알 수 있는 것과 같이 젤 전기영동에서 확인한 결과 PCR에서는 C3와 C6 내부 스페이서에서 거의 같은 증폭도를 보였고 이를 멤브레인에 반응시킨 결과도 C3와 C6 내부 스페이서에서 동일하였다.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1. Gardnerella vaginalis와 Mycoplasma hominis의 동시진단 설계

성병을 일으키는 균을 성매개 질환 (Sexually transmitted disease, STD)이라고 한다. 이중에서 대체로 양성율이 높은 Gardnerella vaginalis의 cas5 유전자와 Mycoplasma hominis의 gap 유전자를 동시진단 할 수 있도록 프라이머를 설계하였다.

표1은 PCR을 위해서 사용한 프라이머 시퀀스인데, 각각의 유전자에 특이적으로 반응하여 증폭을 하기 위한 부위와 프로브가 결합할 수 있는 부위, 그리고 사이에 내부 스페이서(internal spacer)인 C3로 구성되어 있다. 이때, Forward(1)은 내부 스페이서가 없이 합성을 하였고, Forward(2)는 내부 스페이서를 사이에 넣어서 합성하였다. Probe는 측면 흐름 멤브레인에 결합되어 있어서 PCR 증폭 산물과 반응해야 하는 프로브 시퀀스인데, 각각의 프라이머 시퀀스와 반응하는 시퀀스로 구성되어 있다.

Primer		Sequence (5’->3’)
Gardnerella vaginalis	Forward (1)서열번호 1	CGAGGACGACGAGGACTCCCACCAGG-GCTTAGAGATTATCATATTGCTGC (hybridization region) (PCR primer region)
	Forward (2)	CGAGGACGACGAGGACTCCCACCAGG-C3-GCTTAGAGATTATCATATTGCTGC (hybridization region)(internal spacer)(PCR primer region)
	Reverse 서열번호2	TCATTATCGGATCCTATTGCAAC-Biotin
	Probe 서열번호 3	CCTGGTGGGAGTCCTCGTCGTCCTCG
Mycoplasma hominis	Forward (1)서열번호 4	CGAGGTAGGCACGCAGCTCCACCAG-ACAACAGTCCACTCATATACAGC (hybridization region) (PCR primer region)
	Forward (2)	CGAGGTAGGCACGCAGCTCCACCAG-C3-ACAACAGTCCACTCATATACAGC (hybridization region)(internal spacer) (PCR primer region)
	Reverse 서열번호 5	TTGTTGGAACTCTTAAAGATAGTCC-Biotin
	Probe 서열번호 6	CTGGTGGAGCTGCGAGCCTACCTCG

표 1은 본 발명에 사용된 유전자 올리고 염기서열

실시예 2. 전기영동 결과와 측면 흐름 멤프레인 결과의 비교

상기 프라이머를 이용하여 mutiplex PCR 을 실시한 후에 반응 산물의 10 ul는 2% 아가로즈젤 상에서 30분동안 전기영동을 시켜서 확인을 하였고, 10u를 전개가 쉽게 일어나도록 전개액 100 ul를 혼합하여 변성반응없이 즉시 측면흐름 멤브레인 상에서 15분 동안 반응시켜 결과를 확인하였다.

즉, Multiplex PCR을 수행한 후에 전기영동을 수행한 결과 Gardnerella vaginalis에서는 123 bp와 Mycoplasma hominis에서는 184 bp의 크기를 확인할 수 있었으며, 카트리지에 전개시킨 것은 내부 스페이서(internal spacer)가 존재하는 것에서만 두 종류의 균에 대한 밴드를 확인할 수 있었다.

이 결과로 보아 내부 스페이서가 존재하는 것은 PCR 증폭에는 아무런 영향을 끼치지 않지만, 내부 스페이서가 없는 PCR 증폭산물은 single-strand DNA가 만들어지지 못하여 membrane의 올리고 프로브와 결합할 수 없는 것이다. 즉, 내부 스페이서가 존재하는 PCR 증폭산물 만이 single-strand DNA가 존재하여 변성 반응없이 교잡반응을 시킬 수가 있다.

실시예 3. 내부 스페이서로 사용한 C3와 C6 결과의 비교

상기 Mycoplasma hominis 프라이머에서 내부 스페이서의 하나는 C3를 붙이고 다른 하나는 C6를 붙여서 비교 실험을 진행하였다. 도면과 같이 젤 전기영동에서 확인한 결과 PCR에서는 거의 같은 증폭도를 보였고 이를 멤브레인에 반응시킨 결과도 동일하였다. 이것으로 보아 중합효소의 반응을 제어만 시킬 수 있으면 내부 스페이서에서 C의 개수와는 별 차이가 없는 것으로 나타났다.

<110> PaxGenBio Co.,Ltd <120> A OLIGONUCLEOTIDE COMPRISING INTERNAL SPACER AND USE OF THE SAME <130> P16-0243HS <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 1 cgaggacgac gaggactccc accagggctt agagattatc atattgctgc 50 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcattatcgg atcctattgc aac 23 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 cctggtggga gtcctcgtcg tcctcg 26 <210> 4 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 4 cgaggtaggc acgcagctcc accagacaac agtccactca tatacagc 48 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ttgttggaac tcttaaagat agtcc 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 6 ctggtggagc tgcgagccta cctcg 25

Claims

5' 말단에서부터 3' 말단 방향으로, 교잡 부위, 내부 스페이서 부위 및 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머 부위로 이루어지고,
상기 내부 스페이서는 C3-C12 알킬기를 포함하는 화합물, RNA,트리에틸렌 글라이콜, 헥사-에틸렌글라이콜, 1’,2’-다이데옥시리보스(Dideoxyribose), 펩타이드 핵산 복합체(Peptide Nucleic Acid;PNA), 또는 잠금 핵산(LNA; Locked Nucleic Acid)인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 DNA 올리고뉴크레오타이드.
삭제
제1항에 있어서, 상기 내부 스페이서는 하기 화학식 1의 화합물인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 DNA 올리고뉴크레오타이드.
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 내부 스페이서를 제외한 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머 부위, 및 교잡 부위 서열은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지거나 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 단일 가닥 DNA 올리고뉴크레오타이드.
5' 말단에서부터 3' 말단 방향으로, 교잡 부위, 내부 스페이서 부위 및 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머 부위로 이루어진 단일 가닥 DNA 올리고뉴크레오타이드를 유효성분으로 포함하고,상기 내부 스페이서를 제외한 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머 부위, 및 교잡 부위 서열은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지거나 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지고,
상기 내부 스페이서는 C3-C12 알킬기를 포함하는 화합물, RNA,트리에틸렌 글라이콜, 헥사-에틸렌글라이콜, 1’,2’-다이데옥시리보스(Dideoxyribose), 펩타이드 핵산 복합체(Peptide Nucleic Acid;PNA), 또는 잠금 핵산(LNA; Locked Nucleic Acid)인 것을 특징으로 가드넬라균 질염(gardnerella vaginalis) 또는 마이코플라즈마 호미니스(Mycoplasma hominis)에 의하여 유발되는 성매개 질환 진단용 조성물.
삭제
제1항 및 제3항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단일 가닥 DNA 올리고뉴크레오타이드를 프라이머로 이용하여 증폭할 유전자 주형 부위의 한 말단에 사용하고, 증폭할 유전자 주형 부위의 다른 말단에 다른 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는 변성이 필요없는 교잡가능한 중합효소 연쇄반응 증폭산물을 얻는 방법.
제7항의 방법에 의하여 얻어진 증폭 산물의 교잡 가능한 부위와 상기 교잡가능 부위와 상보적인 서열 부위의 올리고뉴크레오타이드를 가지는 고체 서포트(support)를 교잡화시켜서 얻어진 고체 서포트.
제8항에 있어서, 상기 고체 서포트는 막(membrane) 또는 슬라이드인 것을 특징으로 하는 고체 서포트.