JP2014522659A

JP2014522659A - 保存生成物および任意生成物の蛍光標識フラグメントを生成するための核酸の増幅方法

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Publication number: JP2014522659A
Application number: JP2014522889A
Authority: JP
Inventors: アンジャーナ・アガーワル; マーク・エー・ジェンセン
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2011-07-25
Filing date: 2012-07-19
Publication date: 2014-09-08
Also published as: EP2737080A1; US9040242B2; US20130029341A1; WO2013016129A1; BR112014001792A2; CN103703147A; AU2012287207A1

Abstract

本明細書は、微生物の種、セロタイプおよび株の同定方法を開示する。また、そのような微生物の検出に使用するためのプライマー、およびそのようなプライマーを含むキットを開示する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１１年７月２５日出願の米国仮特許出願第６１／５１１，３６７号の優先権を主張するものであり、その明細書はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

技術分野は、任意増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）ＰＣＲを使用する微生物同定方法に関する。

保存ｒＤＮＡフラグメントおよび任意増幅生成物の両者を生成するために、短い、保存リボソームプライマーを使用する実験的アプローチは、特許文献１に記載されている。属および種のレベルでの微生物の同定は、高度に保存されたｒＤＮＡ配列の間に位置するフラグメントの長さと数の変異について、その特徴を明らかにすることにより行われる。同定のレベルは、追加された微生物ゲノムの任意領域の同時増幅によって、セロタイプおよび株のレベルまで拡張されている。これらの任意増幅を行うことは、任意増幅多型ＤＮＡ法（ＲＡＰＤ）と呼ばれる。

このアプローチの利点は、増幅生成物を得るのに、全ての種の微生物に対して同一のプライマー群が使用されることである。これらのプライマーの配列は、原核微生物の間で高度に保存されているため、これらのプライマーが一般に適用される。スクリーニングまたは推定的同定の必要がなくなるため、かなりの時間と経費が節約される。

ｒＤＮＡ遺伝子座は遺伝子単位であり、それは原核細胞で見られる。保存増幅標的は、ｒＤＮＡ遺伝子座の１６Ｓ領域と２３Ｓ領域間のスペーサー領域に見出される配列である。これらの標的は、隣接する１６Ｓ領域と２３Ｓ領域の保存された配列から増幅される。この遺伝子座を形成している核酸配列のかなりの部分は、全ての原核生物に共通している（図１に一般化したこの座の模式図を示す）。原生生物の異なる種を分類するための手段として、この遺伝子座の１６Ｓ、２３Ｓおよび５Ｓの領域の全体の関連性が使用されている。

特許文献１に記載されているアプローチでは、長さが１０〜１２塩基の短いプライマーが使用される。これらのプライマーによって得られる生成物は、アガロースまたはポリアクリルアミドによる電気泳動分離法を使用して分離される。その後、フラグメントが臭化エチジウムによる染色で可視化される。ゲル添加過程で、ＰＣＲ生成物が実験室環境を汚染する可能性があるであろう。

米国特許第５，７５３，４６７号明細書

一態様は、（ａ）高度に保存されたｒＤＮＡ配列間に点在する可変配列を含むＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、かつ、長さが１３〜１５塩基の第１のプライマーと長さが１１〜１３塩基の第２のプライマーを使用して、追加のゲノム配列を任意増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）ＰＣＲにより増幅する工程であって、前記第１のプライマーが（ｉ）高度に保存された１６ＳｒＤＮＡ領域からの少なくとも１１個の連続した塩基、および（ｉｉ）蛍光標識を含む工程と、（ｂ）工程（ａ）で生成された増幅ＤＮＡを分離する工程とを含む、微生物の種、セロタイプおよび株を同定する方法に関する。

他の態様は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、およびこれらの完全長相補体からなる群から選択される単離ポリヌクレオチドに関する。

さらに他の態様は、蛍光体で標識した配列番号２、ならびに配列番号３および配列番号４の少なくとも１つをＰＣＲ用プライマーとして含むプライマーセットを含むキットに関する。

他の目的および利点は、当業者には、以下に続く詳細な説明を参照することにより明らかになるであろう。

図１は本明細書に開示されたｒＤＮＡオペロンの模式図である。図２は、サルモネラ・インファンティス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｉｎｆａｎｔｉｓ）について、６−ＦＡＭで標識した１７ｍｅｒ単独（図２Ａ）、ならびに６−ＦＡＭで標識した１３ｍｅｒおよび１１ｍｅｒプライマー群（図２Ｂ）を用いて得られたＰＣＲ生成物の電気泳動図を示す。図３は、スタフィロコッカス・エピデルミデス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）について、６−ＦＡＭで標識した１７ｍｅｒ単独（図３Ａ）、ならびに６−ＦＡＭで標識した１３ｍｅｒおよび１１ｍｅｒプライマー群（図３Ｂ）を用いて得られたＰＣＲ生成物の電気泳動図である。図４は、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ）について、６−ＦＡＭで標識した１７ｍｅｒ単独（図４Ａ）、ならびに６−ＦＡＭで標識した１３ｍｅｒおよび１１ｍｅｒプライマー群（図４Ｂ）を用いて得られたＰＣＲ生成物の電気泳動図である。

生物学的配列についての簡単な説明
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２５（“ＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒＰａｔｅｎｔＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＣｏｎｔａｉｎｉｎｇＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄ／ｏｒＡｍｉｎｏＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅＤｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｕｌｅｓ”）にしたがっており、ＷｏｒｌｄＩｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌＰｒｏｐｅｒｔｙＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＩＰＯ）ＳｔａｎｄａｒｄＳＴ．２５（１９８８）に合致しており、またＥｕｒｏｐｉａｎＰａｔｅｎｔＣｏｎｖｅｎｔｉｏｎ（ＥＰＣ）、ならびにＰａｔｅｎｔＣｏｏｐｅｒａｔｉｏｎＴｒｅａｔｙ（ＰＣＴ）Ｒｕｌｅｓ５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、Ｓｅｃｔｉｏｎｓ２０８、ＡｎｎｅｘＣｏｆｔｈｅＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅＩｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓの配列表要件に合致している。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用した記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載の規則にしたがっている。
配列番号１は、１６ＳｒＤＮＡからの１１ｂｐ配列を含む順方向プライマーである。
配列番号２は、配列番号１に加えて、５’末端に２つの追加のヌクレオチドを含む順方向プライマーである。
配列番号３は、２３ＳｒＤＮＡからの１１ｂｐを含む逆方向プライマーである。
配列番号４は、２３ＳｒＤＮＡからの１３ｂｐを含む逆方向プライマーである。
配列番号５は、１６ＳｒＤＮＡからの１７ｂｐを含む順方向プライマーである。
配列番号６は、２３ＳｒＤＮＡからの１７ｂｐを含む逆方向プライマーである。

好ましい実施形態の詳細な説明
出願人は、本開示で引用した参考文献の全内容を明確に組み込むものとする。さらに、量、濃度または他の値もしくはパラメータが、ある範囲、好ましい範囲、または好ましい上限値と好ましい下限値の一覧として与えられるとき、これは、範囲が個別に開示されているか否かにかかわらず、任意の範囲の上限値または好ましい値と任意の範囲の下限値または好ましい値との任意の対から得られる、全ての範囲の明確な開示であると理解されるべきである。本明細書である数値範囲に言及する場合、特に断らない限り、その範囲はその末端の点、ならびにその範囲内の全整数および小数を含むことが意図されている。本発明の範囲が、範囲を定義するときに言及された特定の値に限定することは意図されていない。

本開示では、多くの用語および略語が使用されている。特に断らない限り、次の定義が適用される。

本明細書では、本発明の要素または成分に前置される冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、事例（すなわち、出現）の数に関して非制限的であることが意図されている。したがって、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、１つ、または少なくとも１つを含むと読まれるべきであり、要素または成分の語の単数形もまた、明らかに単数であることを意味するのでなければ、複数を含む。

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、請求項で言及されるとき、述べられた特徴、整数、工程または成分が存在することを意味するが、１つもしくはそれ以上の他の特徴、整数、工程、成分またはこれらの群の存在または追加を排除するものではない。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「実質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」および「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」によって包含される実施形態を含むことを意図している。同様に、用語「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」は、用語「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」によって包含される実施形態を含むことを意図している。

本明細書では、使用される成分または反応物質の量を修飾する用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、例えば、現実の世界では、濃縮物または使用溶液を調製するために行う通常の測定および液体の取扱い手順から；これらの手順の不用意な間違いから；組成物の調製またはその方法を実施するために使用する製造法、原料または成分の純度の違いなどから起こり得る数値量の変動をいう。用語「約（ａｂｏｕｔ）」はまた、特定の初期混合物から得られる組成物の平衡条件の違いから生じる量の違いを包含する。用語「約（ａｂｏｕｔ）」によって修飾されているか否かによらず、請求項はその量に等価な量を含む。

含まれる場合、全ての範囲は非排他的であり、かつ組み合わせ可能である。例えば、範囲「１〜５」と言った場合、その挙げた範囲は、「１〜４」、「１〜３」、「１〜２」、「１〜２および４〜５」、「１〜３および５」などと解釈されるべきである。

本明細書では、用語「増幅」または「増幅する」は、標的核酸をコピーし、それにより選択された核酸配列のコピー数を増加させる方法を含む。増幅は、指数関数的であっても、直線的であってもよい。標的核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。この方法で増幅された配列は「アンプリコン」を形成する。

用語「核酸」は、リボ核酸またはデオキシリボ核酸のポリマーをいい、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡコポリマー、またはこれらの類似体などが挙げられる。核酸は、細胞抽出物、ゲノム（ｇＤＮＡ）もしくは非ゲノムＤＮＡ、ウイルスＲＮＡもしくはＤＮＡ、または人工／化学合成分子から得ることができる。

用語「相補的」は、標準のワトソン・クリック相補性規則にしたがって塩基対を形成することができる核酸配列、または比較的ストリンジェントな条件下で特定の核酸セグメントをハイブリダイズすることができる核酸配列をいう。核酸ポリマーは、任意選択により、その全配列の一部のみが相補的である。

用語「標的」、「標的配列」または「標的ヌクレオチド配列」は、その存在、非存在または存在量を決めるべき特定の核酸配列をいう。

本明細書では、増幅用「プライマー」は、標的ヌクレオチド配列に相補的であって、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼの存在下にプライマーの３’末端にヌクレオチドを付加させるオリゴヌクレオチドである。最適な発現および増幅のためには、プライマーの３’ヌクレオチドは、一般に、対応するヌクレオチド位置の標的配列と同一であるべきである。本明細書では、用語「プライマー」は、ペプチド核酸プライマー、固定核酸プライマー、ホスホロチオエート修飾プライマー、標識プライマーなどを含む、合成し得るあらゆる形態のプライマーを含む。本明細書では、「順方向プライマー」は、ｄｓＤＮＡのアンチセンス鎖に相補的なプライマーである。「逆方向プライマー」は、ｄｓＤＮＡのセンス鎖に相補的である。プライマーは、通常、約１０〜約１００ヌクレオチドの長さであり、好ましくは約１５〜約６０ヌクレオチドの長さであり、最も好ましくは約２０〜約３０ヌクレオチドの長さである。

標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチド（例えば、プローブまたはプライマー）が、適切な条件下で標的核酸に「ハイブリダイズする」であろう。本明細書では、「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズすること」は、一本鎖オリゴヌクレオチドが、所定のハイブリダイゼーション条件下で、塩基対形成により相補鎖とアニールする過程をいう。「特異的ハイブリダイゼーション」とは、二つの核酸配列が高い相補性を共有していることを示している。特異的ハイブリダイゼーション複合体は、アニーリング許容条件下で生成され、その後、いかなる洗浄工程を経てもハイブリダイズされた状態が維持される。核酸配列のアニーリング許容条件は、当業者であればルーチン的に決定することができ、例えば、約６×ＳＳＣの存在下に６５℃という条件が決定され得る。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、部分的には、洗浄工程の実施温度を基準にして表し得る。通常、そのような温度は、所定のイオン強度およびｐＨの条件下で、特定の配列の融点（Ｔｍ）より約５℃〜約２０℃低く選択される。好ましい条件の１セットでは、一連の洗浄として、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳによる室温で１５分間から始め、その後、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳによる４５℃で３０分間を繰り返し、その後、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳによる５０℃で３０分間を２回繰り返す。条件のより好ましいセットでは、より高い温度を使用し、洗浄の最後の２回の、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳによる３０分間の洗浄温度を６０℃に高める以外は、上記洗浄と同じである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として好ましい他のセットは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃であり、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で最終洗浄を行う。

用語「標識」は、任意の検出可能部分をいう。標識は、標識されていない、または異なる標識がなされた他のものから、特定の核酸を識別するために使用することができ、あるいは標識は検出を促進するために使用することができる。

用語「標本」は、唾液、ふん便、尿、血液、胃生検体、胃腸組織、癌細胞、粘液分泌物、歯垢、および他の生物学的組織などの生物学的試料；肉製品；食品；ならびに土壌または水などの環境試料を意味する。

核酸の検出
研究室環境が汚染される危険を避けるために、本方法は蛍光標識したプライマーの使用を必要とする。これらのプライマーから生成された生成物はキャピラリー電気泳動法により直接検出することができる。蛍光標識した１０〜１２塩基の短いプライマーの使用は、標識部分の存在によりそのようなプライマーがＤＮＡポリメラーゼにとって不十分な基質となるため、困難を伴う。保存された配列に対して相同性が１００％の、より長いプライマーは、鎖レベルの識別に重要な、任意にプライムされたパターン要素を含まないリボソームのフラグメントのみを増幅するため、代用することはできない。

蛍光標識プライマーを組み込むために必要な最小の長さは１３塩基であった。リボソーム部位に完全一致する１３塩基のプライマーはリボソームのフラグメントのみを増幅するから、蛍光標識プライマーの５’末端の２塩基を不一致にする必要があった。最後の１１個の塩基のみがリボソーム配列と一致したのであるから、そのようなプライマーはリボソームフラグメントおよび任意のゲノムフラグメントの両方を同時に増幅することができる。

さらに詳しくは、本方法は、高度に保存されたｒＤＮＡ配列間に点在する可変配列を含むＤＮＡを増幅し、かつ、長さが１３〜１５塩基の第１のプライマーと長さが１１〜１３塩基の第２のプライマーを使用して、追加のゲノム配列をＲＡＰＤＰＣＲにより増幅する工程を含む。第１のプライマーは、高度に保存された１６ＳｒＤＮＡ領域からの少なくとも１１個の連続した塩基と蛍光標識とを含む。第２の工程において、本方法は、増幅工程で生成された増幅ＤＮＡを分離することを含む。

本明細書に記載の方法は、多様な微生物の同定に有用である。本方法の使用により引き出し得る、属、種およびセロタイプを含む多様な生物の代表的なものであって、その全てではないものは、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア・ウェルシメリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｖａｎｏｖｉｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラ・ニューポート（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｎｅｗｐｏｒｔ）、サルモネラ・インファンティス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｉｎｆａｎｔｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・スクイリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｃｕｉｒｉ）、スタフィロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｗａｒｎｅｒｉ）、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミデス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｕｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、エシェリキア・ファーガソニ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ）、エシェリキア・ブラッタエ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｂｌａｔｔａｅ）、エシェリキア・ヘルマニ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｈｅｒｍａｎｉｉ）、エシェリキア・バルネリス（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｖｕｌｎｅｒｉｓ）、シトロバクテル・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ）、シトロバクター・ダイバーサス（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｄｉｖｅｒｓｕｓ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ）、およびエルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃ）である。このようなリストは、本発明の方法により電気泳動を行って可視化したフラグメント生成物と比較したとき、その種（ならびに、該当する場合、セロタイプおよび株）を同定することができる、以前に可視化された生成物のデータベースを構築し得る。

当業者であれば、多種多様な状況との関連で、本方法を微生物に適用し得ることを容易に認識する。したがって、本発明の好ましい使用は、食品中の微生物を同定することである。さらに、ヒト、他の動物および植物の微生物感染を対象にした研究では、本明細書の方法が役立つであろう。

核酸は、当業者によく知られた任意の方法により、試料から分離し得る。必要ならば、試料は遠心分離などにより回収または濃縮してもよい。試料細胞は、酵素、熱、界面活性剤、超音波照射、またはこれらの組み合わせによる処理などによって、溶解し得る。

核酸の単離には、各種の核酸抽出法が適している。適切な方法には、フェノールおよびクロロフォルム抽出が含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｄ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい。

ＲＡＰＤＰＣＲは米国特許第５，１２６，２３９号明細書に開示されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：６５３１−３４（１９９０）も参照されたい）。このアプローチには、ＤＮＡ増幅反応において、任意組成の短いオリゴヌクレオチド、すなわち７個より多いヌクレオチドを使用することが記載されている。ＤＮＡ増幅を起こすのに十分に短いゲノム上の距離で、プライマーに対する相補性および逆相補性配列を見出すことができるよう、短いプライマーが使用される。増幅過程で生成されたフラグメントは、ＲＡＰＤマーカーと呼ばれる。これらのＲＡＰＤマーカーは、増幅過程で使用したＤＮＡのゲノム構造の僅かな差に敏感なサイズ分布を示す。

米国特許第５，７５３，４６７号明細書で特に言及されているように、米国特許第５，１２６，２３９号明細書に記載の方法は、４５サイクルを必要とするもので、これは、しばしば二次増幅生成物の生成と、非特異的ＤＮＡの合成をもたらす。高濃度のそのような二次増幅生成物を含む生成物プロファイルバックグラウンドと非特異的ＤＮＡは、パターン認識ソフトウェアの、そのような生成物プロファイルを既知のデータベースと比較する能力を著しく制限し得る。しかしながら、本明細書で開示する方法は、より長いアニール時間のより少ない増幅サイクルを使用して、非特異的ＤＮＡバックグラウンドが顕著に減少した、複雑性の極めて低い生成物プロファイルを形成する。

熟練した技術者は、ＲＡＰＤＰＣＲに適した任意のプライマーを設計し調製することができる。増幅用プライマーの長さは、ヌクレオチド配列の同一性、およびこれらの核酸がインビトロでの核酸増幅過程でハイブリダイズ、または使用される温度を含む、いくつかの因子に応じて変化する。特定の配列同一性を有する増幅用プライマーの好ましい長さを決定するために考慮する必要のある事項は、当業者にはよく知られている。

核酸分子を増幅するプライマーは、例えば、ＯＬＩＧＯ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＩｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＯ）などのコンピュータープログラムを使用して設計することができる。増幅用プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドを設計するときの重要な特徴として、検出（例えば、電気泳動法による）を容易にする適切なサイズの増幅生成物、１対のプライマーの構成体の類似した融点、および各プライマーの長さ（すなわち、プライマーは、配列特異性を有するものとアニールし、合成を開始するのに十分に長くはあるが、オリゴヌクレオチド合成過程での忠実度が低下するほどには長くないことが必要である）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいプライマーを、それらの標的とともに、下記表１に示す。

米国特許第５、７５３、４６７号明細書中で考察されているように、ｒＤＮＡの遺伝子座内でかなりの程度の分子内ハイブリダイゼーションが起こることが知られている。それによって得られる二次構造体は、しばしば、増幅用プライマーがハイブリダイゼーション部位を求めて競い合うことを困難にする。ｒＤＮＡ領域内に含まれるフラグメントの増幅を促進するには、増幅温度プロファイルを変更する必要があるが、これは普通に行われていることである。主要な変更は、約３〜約７分の範囲の十分に長くしたアニール時間の使用からなる。増幅反応は、増幅サイクルの回数の減少に連動して、非常にストリンジェントな条件で行われる。ストリンジェンシーの高い増幅は、生成物が再現性良く生成される、最も高いアニール温度で反応を行うことにより達成される。最も高いアニール温度の使用は、最も安定なハイブリダイゼーション構造のみが生成され、かつプライミング部位の周囲の領域が最小量の二次構造をとるであろうことを保証する。

標的核酸の有無は、例えば、標準の方法、例えばアガロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、パルスフィールド電気泳動法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、ＤＮＡマイクロアレイ、または質量分析法を使用して、プライマーが伸長した、核酸増幅生成物のサイズによる分析から決定することができる。増幅生成物の分離には、キャピラリー電気泳動法を使用することが好ましい。

キャピラリー電気泳動法では、核酸フラグメントの長さは、ゲルが充填された細いチューブの中を通して試料を移動させ、試料が一定距離（例えば、キャピラリーの末端まで）移動するのに要した時間を測定することにより調べられる。キャピラリー電気泳動を行う場合、通常、キャピラリーの端部に具備されている蛍光信号検出器を使用して試料を検出する。

キャピラリー電気泳動を実施する装置はよく知られている。基本の装置を記述した、多くの参考文献が利用でき、数種のキャピラリー電気泳動装置が、例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）から商業的に入手可能である。キャピラリー電気泳動装置とその操作方法が記載された代表的な参考文献としては、Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ４：１７９−９０（１９９２）；Ｃｏｌｂｕｒｎｅｔａｌ．，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＲｅｓｅａｒｃｈＮｅｗｓ，ｉｓｓｕｅ１（Ｗｉｎｔｅｒ１９９０）などが挙げられる。

蛍光測定については、プライマーの５’末端を蛍光体で標識したものを使用してＰＣＲを行った場合、増幅された標的配列は検出可能な蛍光材料で標識されており、蛍光材料から放射された蛍光の強度は蛍光分光光度計を用いて測定される。好適な蛍光体としては、６−ＦＡＭ；Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４０５、４３０、４８８、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６３３、６４７または６６０；Ｃｙ２；Ｃｙ３；Ｃｙ３．５；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ヒドロキシクマリン；メトキシクマリン；アミノクマリン；フルオレセイン；ＨＥＸ；Ｒ−フィコエリスリン；ｒｈｏｄａｍｉｎｅＲｅｄ−Ｘ；ＲＯＸ；レッド６１３；ＴｅｘａｓＲｅｄ；アロフィコシアニン；トゥルーレッド；ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０；ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５；ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ；ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ；ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ；ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ；カルボキシフルオレセイン；カスケードブルー；６−ＪＯＥ；ＬｉｓｓａｍｉｎｅｒｈｏｄａｍｉｎｅＢ；ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ４８８、５００または５１４；ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ；ＲＥＧ；ＲｈｏｄａｍｉｎｅＧｒｅｅｎ；ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ；ＴＡＭＲＡ；ＴＥＴ；およびテトラメチルローダミンが挙げられるが、これらに限定されない。

上述したように、好ましいプライマーを表１に開示する。これに関連する一実施形態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択される単離ポリヌクレオチドに関する。他の実施形態は、蛍光体で標識された配列番号２、および配列番号３と配列番号４の少なくとも１つのＰＣＲプライマーを含む、プライマーセットを含むキットに関する。

そのようなキットは、チューブまたはバイアルなどの１種もしくはそれ以上の容器手段を隙間なく収容するように仕切られたキャリアを含み得る。前記容器手段の１つは、標識されていない、または検出可能に標識されたプライマーを含み得る。プライマーは凍結乾燥の状態で、または必要に応じて適当な緩衝液中に存在させ得る。１つもしくはそれ以上の容器手段は、ＰＣＲ反応で使用する１種もしくはそれ以上の酵素または試薬を含み得る。これらの酵素は、単独もしくは混合して、凍結乾燥状態で、または適当な緩衝液中に含有させ得る。キットはまた、緩衝液、抽出試薬、酵素、ピペット、プレート、ヌクレオシド三リン酸、フィルター紙、ゲル物質、移動材料、オートグラフィー用品などの、ＰＣＲおよび／またはＣＥを行うのに必要な追加要素のいくつかまたは全てを含み得る。

一般的方法
以下の実施例は、好ましい実施形態を示すために提供するものである。それらの実施例で開示する手法は、本明細書に開示された方法の実施において良好に機能するよう、本発明者によって見出された代表的な手法であり、したがって、その実施に好ましい態様を構成していると考えられ得ることを、当業者は認識すべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示された特定の実施形態には多くの変更を加えることができ、それでもなお、今開示している方法の精神と範囲から逸脱せずに、同様または類似の結果が得られることを認識すべきである。

明細書中の以下の略語は、測定、手法、特性または化合物についての単位と、次のように対応する。「ｓｅｃ」または「ｓ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」または「ｈｒ」は時間を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ］はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「Ｍ］はモルを意味し、「ｐｍｏｌ」はピコモル濃度を意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｐｇ」はピコグラムを意味し、「ＣＥ」はキャピラリー電気泳動法を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「６−ＦＡＭ」は６−カルボキシフルオレセインを意味する。

実施例１
最初に、１７ｍｅｒのプライマー対（配列番号５および６）であって、その一方が６−ＦＡＭ蛍光タグを含む（配列番号５）プライマー対を用いて増幅反応を行い、ＰＣＲ増幅リボソーム成分のサイズ分布を決定した。これらのフラグメントは、リボソームと任意の混合増幅において、リボソームパターン成分の同定を可能にする参照生成物を提供した。

リボソーム／ＲＡＰＤＤＮＡプロファイルを作成するために、３つの個別のプライマー（１つの順方向プライマーおよび２つの逆方向プライマー）を使用した。順方向プライマーは、６−ＦＡＭ染料で標識され、１６ＳｒＤＮＡからの１１ｂｐ配列（配列番号１）と、５’末端に付加された２つの追加のヌクレオチド（ＣＡ）（配列番号２）を含んだ。ＣＡ配列は、既知の保存された１６Ｓリボソーム配列とは一致せず、単に、蛍光標識されたプライマーをＤＮＡポリメラーゼにとってより良好な基質とするためにのみ働く。リボソームフラグメントおよびＲＡＰＤフラグメントを共に増幅するために、２３ＳｒＤＮＡの単一の位置から、両方の逆方向プライマーの配列を得た。逆方向プライマーの配列は次の通りである：Ｒ−２３Ｓ逆方向プライマー１：配列番号３（１１ｍｅｒ）およびＲ−２３Ｓ逆方向プライマー２：配列番号４（１３ｍｅｒ）。

ＰＣＲ反応を、ＫＡＰＡ２ＧｒｏｂｕｓｔＨｏｔＳｔａｒｔＲｅａｄｙＭｉｘ（ＫａｐａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）からの１×ＰＣＲ緩衝液、２０ｐｍｏｌの順方向プライマー（６−ＦＡＭ）−配列番号２）、２０ｐｍｏｌの逆方向プライマー１（配列番号３）、４ｐｍｏｌの逆方向プライマー２（配列番号４）、および５０ｐｇ〜１００ｎｇのｇＤＮＡを含む、３０μｌの反応混合物中で実施した。ＰＣＲフラグメントを、９５℃、２分間の初期変性の後、（９５℃−３０秒、４５℃−５分、および７２℃−３０秒）を３５サイクル行うことにより増幅した。最終の伸長は、７２℃で１０分間行った。ＧｅｎｅＳｃａｎ１２００ＬＩＺ（登録商標）（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）をＤＮＡサイズの標準として使用し、増幅後のＰＣＲ生成物に加えた。ＰＣＲフラグメントを分離し、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍの型式３７３０ＣＥ装置を用いて検出した。ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍのソフトウェアＰｅａｋＳｃａｎｎｅｒを使用して、ＣＥパターンのフラグメントピークを同定し、それらの特性を明らかにした。

３つの増幅反応例を図２に示す。反応は、上記ＰＣＲプロトコールに記載したようにして、サルモネラ・インファンティス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｉｎｆａｎｔｉｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミデス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）およびエンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ）からのゲノムＤＮＡ抽出物に対して行った。図２において、各電気泳動図がリボソームスペーサーフラグメントのみを含む電気泳動図と比較されている。これは、これらのリボソームフラグメントが、任意増幅反応の存在下に保存されることを論証するために、また任意フラグメントとリボソームフラグメントの収率が同等であったことを示すためになされている。

一方が蛍光タグを含む、１１塩基プライマーと１３塩基プライマーを組み合わせるアプローチにより、リボソームフラグメントおよびＲＡＰＤフラグメントの両者の増幅が明確に示される。特定の増幅条件では、リボソームと主要ＲＡＰＤフラグメントの収率は同等である。

得られたパターンは、キャピラリー電気泳動法により分離して、保存リボソームフラグメントと任意ＲＡＰＤフラグメントの両者を含む生成物パターンを形成することができる、蛍光標識されたフラグメントを含む。

Claims

微生物の種、セロタイプおよび株を同定する方法であって、
（ａ）高度に保存されたｒＤＮＡ配列間に点在する可変配列を含むＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、そして長さが１３〜１５塩基の第１のプライマーと長さが１１〜１３塩基の第２のプライマーを使用して、追加のゲノム配列をランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）ＰＣＲにより増幅する工程であって、該第１のプライマーが
（ｉ）高度に保存された１６ＳｒＤＮＡ領域からの少なくとも１１個の連続した塩基、および
（ｉｉ）蛍光標識、
を含む工程と、
（ｂ）工程（ａ）で生成された該増幅ＤＮＡを分離する工程と
を含む、方法。
前記第１のプライマーが順方向プライマーである請求項１に記載の方法。
前記第１のプライマーが配列番号１を含む請求項１または２に記載の方法。
前記第１のプライマーが配列番号２である請求項３に記載の方法。
前記第２のプライマーが２３ＳｒＤＮＡからの１１〜１３個の連続する塩基を含む請求項１または２に記載の方法。
前記第２のプライマーが配列番号３または配列番号４である請求項５に記載の方法。
前記増幅工程が、長さが１１〜１３個の塩基からなる第３のプライマーを使用し、該第３のプライマーが２３ＳｒＤＮＡからの１１〜１３個の連続する塩基を含む請求項１または２に記載の方法。
工程（ｂ）が、キャピラリー電気泳動法により行われる請求項１または２に記載の方法。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、およびこれらの完全長相補体からなる群から選択される単離ポリヌクレオチド。
発蛍光団で標識した配列番号２、ならびに配列番号３および配列番号４の少なくとも１つをＰＣＲ用プライマーとして含むプライマーセットを含むキット。