CN116790771A

CN116790771A - 通过pcr检测样品中的支原体的方法和引物

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Publication number: CN116790771A
Application number: CN202310216021.6A
Authority: CN
Inventors: 赵建芝; 张云; 王小丰
Original assignee: Hangzhou Ruipu Chenchuang Technology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Ruipu Chenchuang Technology Co ltd
Priority date: 2023-03-01
Filing date: 2023-03-01
Publication date: 2023-09-22

Abstract

本发明涉及用于通过PCR检测样品中的支原体的方法和引物。本发明还提供包含所述引物的试剂盒。

Description

通过PCR检测样品中的支原体的方法和引物

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及通过PCR检测样品中的支原体的方法和引物。

背景技术

支原体是一种很小的原核生物，是细胞培养过程中常见污染源之一。由于支原体缺乏细胞壁，因此很多针对细胞壁的抗生素对支原体无效。另一方面，由于支原体的尺寸较小，也无法通过常用的过滤除菌方法去除。为了提高细胞产品的质量，检测产品中的支原体变得十分重要。

对于生物样品中支原体的检出，目前最常用的方法是《中华人民共和国药典》中推荐的液体培养法和指示剂法。这两种方法都需要引入阳性对照，也就是已知含有支原体的对照，这样的操作引入了污染操作环境的风险。另外，这两种测试由于需要培养，因此试验周期较长。

除此之外，也有部分快检试验会选择商业化的普通PCR或定量PCR试剂盒。具体而言，通过PCR对支原体的DNA进行特异性地扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳来分析扩增产物。当存在支原体感染时，能够观察到对应的条带，指示阳性结果；当没有支原体污染时，则没有对应条带，指示阴性结果。这些商业化试剂盒通常被设计为扩增支原体保守的16S核糖体RNA(16SrRNA)区域，从而能够在多种支原体的检测中通用。

然而，发明人发现现有技术中的PCR试剂盒存在可能未被意识到的问题。具体而言，在以16S rRNA作为生物分类的依据时，支原体和细菌被共同划分为真细菌，所以两者的16S rRNA具有很高的相似性。尽管不同的真细菌的16S rRNA会有差异，但是这种差异可能比想象的低。例如，在支原体的16S rRNA上随机选取300bp左右的序列并在NCBI上比对时，发现除了支原体，很多细菌也能与这些片段很好地匹配上。这意味着，在通过PCR检测支原体的实验中，如果扩增的目的片段较短或特异性不强，则该检测很可能缺乏特异性。特别是在很多情况下同时可能存在细菌和支原体的感染，那么细菌的存在很可能导致假阳性或非特异性结果。这一缺陷在实际应用中可能被忽略或低估，因为很多样品中都可能同时存在支原体和细菌。

另外，目前可用的商业化支原体检测PCR试剂盒的价格也很昂贵，且检测过程中的注意事项繁多。目前本领域最常用的支原体检测试剂盒主要是基于荧光定量PCR的技术手段。相对于普通PCR而言，荧光定量PCR在实施的过程中引入了更多的参数，对试剂保持条件、实验条件的控制也有更高的要求。例如，与普通PCR相比，用于荧光定量PCR的探针、引物的保存条件更为严谨，反复冻融可能影响试剂盒检测的效率。又如，荧光定量PCR的加样流程和反应程序设计相对繁琐，且往往需要严格遵照产品说明书，当任一个参数出现问题时便会导致整个实验的失败。相比之下，普通PCR对于新设计的引物一般只需要做TM值的梯度摸索，就具有很好的重复性，且不存在繁杂的参数设置。

有鉴于此，本领域对于生物样品中支原体的检测仍需要一种高效便利，且准确灵敏的方法。

发明内容

发明人通过在支原体16S rRNA的大片段保守区域设计并筛选引物，开发了一系列新的引物对。本发明的引物对能够扩增更长的保守区片段，并且经验证可以提供更高的支原体特异性和检验灵敏度，由此完成了本发明。

因此，第一方面，本发明提供在体外检测样品中支原体的存在的方法，所述方法包括：

(a)提供待检测的样品；

(b)使用引物对对步骤(a)中提供的待检测的样品进行PCR扩增，以获得扩增产物；和

(c)检测步骤(b)中获得的扩增产物中是否存在目的片段，当存在目的片段时，判定所述样品中含有支原体，

其中所述步骤(b)中使用的引物对选自如下中的任意一对：

(1)正向引物：5’-gcgttatccggaattattgggcg-3’(SEQ ID NO:1)，和

反向引物：5’-ctcgttgcaggacttgaccaaac-3’(SEQ ID NO:4)；或

(2)正向引物：5’-gcgttatccggaattattgggcg-3’(SEQ ID NO:1)，和

反向引物：5’-gacgggcggtgtgtacaagaccc-3’(SEQ ID NO:5)。

在优选的实施方案中，所述引物对优选为核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物，和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反向引物。

在一个实施方案中，所述样品可以为水样、无菌环境采样、无菌原材料、生物制剂、药物原材料、药物制剂、食品等的液体、固体或气体形式，当样品为固体或气体形式时，需要取样后溶解在溶剂中以制成液体样品。在优选的实施方案中，所述样品为液体，在具体的实施方案中，所述样品为细胞培养物的上清液。

在优选的实施方案中，在步骤(a)中对所述样品进行加热。更优选地，所述加热在90℃至100℃，例如约95℃下进行。更优选地，所述加热持续约5至15min，例如约10min。更优选地，所述加热在金属浴中进行。

在优选的实施方案中，所述PCR扩增使用25μL反应体系。在具体的实施方案中，所述PCR扩增的反应体系中，每种引物的量为约1×10^-10mol至约1×10^-12mol，例如约1×10^- ¹¹mol。

在优选的实施方案中，所述PCR扩增进行25至40个循环，优选30-40个循环，例如35个循环。

在具体的实施方案中，所述PCR扩增采用如下扩增程序：95℃预变性2min；35个循环的95℃30s，60℃30s，72℃15s；72℃延伸5min；并在4℃保持。

在优选的实施方案中，所述步骤(c)中的检测通过琼脂糖凝胶电泳进行。例如，所述琼脂糖凝胶电泳为1％琼脂糖凝胶电泳。

第二方面，本发明提供用于检测支原体的PCR引物对，所述PCR引物对包含正向引物和反向引物，并且为选自如下各组的引物对：

(1)正向引物：5’-gcgttatccggaattattgggcg-3’(SEQ ID NO:1)，和

反向引物：5’-ctcgttgcaggacttgaccaaac-3’(SEQ ID NO:4)；或

(2)正向引物：5’-gcgttatccggaattattgggcg-3’(SEQ ID NO:1)，和

反向引物：5’-gacgggcggtgtgtacaagaccc-3’(SEQ ID NO:5)。

在第三方面，本发明提供用于检测支原体的试剂盒，其包含第二方面的引物对。在优选的实施方案中，所述试剂盒还包含如下试剂中的一种或多种：缓冲液、dNTP和DNA聚合酶。

在优选的实施方案中，所述试剂分别包含在独立的容器中。

第四方面，本发明提供第二方面的引物对或第三方面的试剂盒在检测支原体中的用途。

在优选的实施方案中，所述用途为检测样品中的支原体污染。

本发明至少具有如下优点：

(1)与基于培养的方法相比，无需引入阳性对照，可以在确保不引入额外污染源的情况下进行检测；

(2)本发明的方法采用一般PCR进行，可以缩短支原体检测的试验周期和成本；

(3)PCR扩增的目的片段较长且引物特异性高，特别是在使用如SEQ ID NO:1和SEQID NO:4所示的引物对时，可以有效避免扩增出可能同时存在于细菌基因组中的高同源性片段，同时可以在电泳结果中明确区分目的片段和引物二聚体；

(4)引物灵敏度卓越，具有比文献中的常用引物更低的检出限，例如可以检出样品中低至约1.00×10⁹拷贝的支原体，甚至更最低低至约1.00×10³拷贝。

附图说明

图1为琼脂糖凝胶电泳结果的照片，显示了使用引物对P1-P10和对照引物对扩增支原体阳性样品和阴性对照无菌水的扩增产物的电泳图。对于图中的每个引物对，左侧泳道为阳性样品的扩增产物，右侧泳道为阴性对照的扩增产物。

图2为琼脂糖凝胶电泳结果的照片，显示了使用引物对P1、P2和对照引物对扩增经梯度稀释的支原体阳性样品的扩增产物的电泳图。对于图中的每个引物对，分别包含8个梯度稀释，由左至右分别所述阳性样品的10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷和10⁸倍稀释。

图3为脂糖凝胶电泳结果的照片，显示了使用引物P1、P2对水、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠埃希菌的细菌混合物(“菌基因组”)或支原体阳性样品的扩增产物的电泳图。

发明详述

除非另有说明，否则本文公开的一些方法的实践采用分子生物学、微生物学领域的常规技术。这些技术为本领域技术人员所熟知，并且可以参见例如Sambrook和Green，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，4th Edition(2012)。

术语“约”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即测量系统的局限性。

术语“多核苷酸”指任何长度的聚合形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。

术语“支原体”指支原体属(Mycoplasma)的无细胞壁结构的原核生物。

术语“PCR”指聚合酶链式反应。

术语“目的片段”在本发明的上下文中指PCR反应扩增的目标片段。

术语“16S rRNA”指原核生物的16S核糖体RNA，其为原核生物蛋白质合成所必需的核糖体RNA。

待检测样品

可通过本发明的方法检测的样品可以是任何怀疑包含支原体的样品，或怀疑受到支原体污染的样品。

例如，所述样品可以是用于培养的试剂或经过培养的培养物。所述培养可以是细菌培养、真菌培养、病毒培养、细胞培养、组织培养等。所述培养可以是细胞生产、疫苗生产过程中的培养物。

例如，所述样品可以是来自受试者的临床样品。所述受试者可以是怀疑受到支原体感染的受试者。所述临床样品可以是细胞、体液、组织样品。

适用于本发明的方法的待检测样品可以是固体、半固体或液体样品，优选液体样品。当所述样品为非液体样品时，可以通过本领域公知的手段，例如溶解、稀释等将所述样品配制为液体样品。

支原体特异性引物

本发明的方法采用了针对支原体基因组中的保守区域设计的引物，具体而言针对16S核糖体RNA的保守区设计的引物。16S rRNA的长度约为1.5kb左右，兼具保守性和变异性，常用于研究原核生物的系统发生关系研究。16S rRNA具有在不同分类水平上的特异性序列或保守序列，例如已知一些通用引物可以在不同的属中进行扩增(WEISBURG et al.,JOURNAL OF BACTERIOLOGY,Jan.1991,p.697-703)，一些引物是种特异性的，一些引物是属特异性的(李淳，国际检验医学杂志，2011年1月第21卷第1期)。本发明的引物在能够同时扩增多种支原体序列的同时，不扩增其他细菌的序列。换言之本发明的引物所结合的16SrRNA序列在多种支原体之间是保守的，而在支原体与其他原核生物之间具有特异性，因此本发明的引物在这些支原体之间具有泛用性，同时具有足够的特异性来区分目标支原体和其他原核生物。

能够通过本发明的引物和方法检测的支原体包括但不限于：肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、口腔支原体(Mycoplasma orale)、咽支原体(Mycoplasmapharyngeal)、口颊支原体(Mycoplasma Buccale)、唾液支原体(Mycoplasma Salivarium)、生殖支原体(Mycoplasma genitalium)、精氨酸支原体(Mycoplasma arginin)、印地支原体(Metamycoplasma indiense，也称为Mycoplasma indiense)、猫支原体(MycoplasmaFelis)、加拿大支原体(Mycoplasma canadense)、海豹脑支原体(Mycoplasmaphocacerebrale)、关节炎支原体(Mycoplasma arthritis)和产碱支原体(Mycoplasmaalkalescens)。

本发明的引物对包含正向引物和反向引物。在优选的实施方案中，所述正向引物和反向引物均特异性结合16S rRNA区域。

在优选的实施方案中，本发明的引物的长度为20至30bp，优选22-25bp，更优选22-23bp，最优选23bp。

在本发明中，更大的扩增产物片段有助于提高引物扩增结果的特异性。发明人发现除了引物本身的特异性之外，在扩增产物片段较短时，例如小于300bp时，有更大概率在其他物种例如细菌中存在能够被扩增出的同源片段，从而导致扩增结果特异性降低。另一方面较短的片段与引物二聚体的长度相近，在电泳时需要更久的时间才能被区分，使实验变得不那么便利。因此在保证引物特异性等其他属性的前提下，优选选择能够扩增出较长的产物的引物对。在优选的实施方案中，本发明的引物对扩增的目的片段长度为至少500bp，例如为大约550bp、600bp、650bp、700bp、750bp、800bp、850bp、900bp。

本发明的引物对特异性扩增支原体序列，且不会扩增非支原体序列。例如，本发明的引物不扩增源自非支原体的微生物的序列。

在具体的实施方案中，本发明提供如下引物对：

(1)正向引物：5’-gcgttatccggaattattgggcg-3’(SEQ ID NO:1)，和

反向引物：5’-ctcgttgcaggacttgaccaaac-3’(SEQ ID NO:4)；或

(2)正向引物：5’-gcgttatccggaattattgggcg-3’(SEQ ID NO:1)，和

反向引物：5’-gacgggcggtgtgtacaagaccc-3’(SEQ ID NO:5)。

在优选的实施方案中，所述引物对对于支原体有高灵敏度，并且由如下引物组成：

(1)正向引物：5’-gcgttatccggaattattgggcg-3’(SEQ ID NO:1)，和

反向引物：5’-ctcgttgcaggacttgaccaaac-3’(SEQ ID NO:4)；或

(2)正向引物：5’-gcgttatccggaattattgggcg-3’(SEQ ID NO:1)，和

反向引物：5’-gacgggcggtgtgtacaagaccc-3’(SEQ ID NO:5)。

在优选的实施方案中，所述引物对对于支原体有高灵敏度和高特异性，并且由正向引物：5’-gcgttatccggaattattgggcg-3’(SEQ ID NO:1)，和反向引物：5’-ctcgttgcaggacttgaccaaac-3’(SEQ ID NO:4)组成。

在本发明的上下文中，“高灵敏度”指与其他常用引物相比，在相同条件下能够检出含有更低拷贝数的支原体基因组的样品，即可以在PCR中获得具有区分性的特定条带。例如，本发明的引物对的检出限低至约1.00×10⁹个支原体基因组拷贝，约1.00×10⁸个拷贝，约1.00×10⁷个拷贝，约1.00×10⁶个拷贝，约1.00×10⁵个拷贝，约1.00×10⁴个拷贝，约1.00×10³个拷贝。在一个实施方案中，本发明的引物对能够检出样品中低至约1.25×10⁹个拷贝的支原体基因组，其检出限约为1.00×10⁹个拷贝。在一个优选的实施方案中，正向引物为由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列且反向引物为由SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，由这两条引物组成的引物对能够检出低至约1.25×10³个拷贝的支原体基因组，其检出限约为1.00×10³个拷贝。

PCR方法

本发明提供通过PCR在体外检测样品中支原体的存在的方法，所述方法包括：

(a)提供待检测的样品；

(b)使用本发明的引物对对步骤(a)中提供的待检测的样品进行PCR扩增，以获得扩增产物；和

(c)检测步骤(b)中获得的扩增产物中是否存在目的片段，当存在目的片段时，判定所述样品中含有支原体。

本发明的PCR方法的独特之处在于引物设计。在此基础上，可以使用常规的PCR体系和PCR反应条件来完成PCR反应。例如，本领域技术人员可以选择合适的，甚至是高性价比的DNA聚合酶、缓冲液、dNTP试剂。这些试剂可以单独提供，或将其中的一种或多种作为预混物提供。例如，可以使用试剂盒中的DNA聚合酶预混物，例如诺唯赞公司的Rapid TaqMaster Mix(P222)。

在进行PCR反应之前，为了使核酸从支原体内部释放，优选对待检测样品进行加热。在优选的实施方案中，在步骤(a)中对所述样品进行加热。更优选地，所述加热在90℃至100℃，例如约95℃下进行。更优选地，所述加热持续约5至15min，例如约10min。更优选地，所述加热在金属浴中进行。

在优选的实施方案中，所述PCR扩增使用25μL反应体系或50μL反应体系，优选25μL反应体系。

在优选的实施方案中，所述PCR扩增的反应体系中，每种引物的量为约1×10^-10mol至约1×10^-12mol，例如约1×10^-11mol。

在优选的实施方案中，所述PCR扩增使用DNA聚合酶，如Taq酶、Tfl酶或Tth酶。

在优选的实施方案中，所述PCR扩增的反应体系中dNTP的量为每种50-200umol/L(μM)，优选约200umol/L(μM)。每种dNTP的用量优选是相等的。

本领域技术人员也可以视需求调整反应体系的总体积和所用试剂的量。

在具体的实施方案中，所述PCR扩增采用常规PCR扩增程序进行。例如，可以采用如下扩增程序：95℃预变性2min；35个循环的95℃30s，60℃30s，72℃15s；72℃延伸5min；并在4℃保持。本领域技术人员能够根据本领域知识调整PCR的程序，例如根据引物序列调整PCR程序中的退火温度。

在优选的实施方案中，所述步骤(c)中的检测通过琼脂糖凝胶电泳进行。例如，所述琼脂糖凝胶电泳为1-3％琼脂糖凝胶电泳，例如1％琼脂糖凝胶电泳。

试剂盒

本发明还提供用于检测支原体的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的至少一个引物对。

在此基础上，所述试剂盒还可以包含PCR反应所必需的其他试剂，包括但不限于DNA聚合酶、dNTP、反应缓冲液等。上述试剂以及两条引物可以各自独立地包含在不同的容器中，也可以将其中的一种或多种作为反应预混合物提供。

所述试剂盒还可以包含用于检测PCR扩增产物时所用的试剂，例如上样缓冲液、上样染料、DNA ladder。

用途

本发明的方法可以用于工业生产、临床应用、科学研究中任何需要检测支原体是否存在的场合。

当通过本发明的方法确定了支原体的存在后，也可以进行额外的步骤来进一步确定支原体的种类。例如，通过测序方法来确定具体的支原体种类。

实施例

为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1.PCR引物对的筛选

在本实施例中，发明人通过使用阳性样品测试扩增表现，对设计的多组引物进行了评估。

发明人针对支原体16S rRNA共设计了10对引物，分别称为引物对P1-P10。每对引物均包含正向引物(F)和反向引物(R)，具体序列如下表1所示。在10对引物中，前9对引物为3种正向引物(SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3)和3种反向引物(SEQ ID NO:4，SEQID NO:5，SEQ ID NO:6)的9种排列组合，第10对为一组不同的独立引物(SEQ ID NO:7和SEQID NO:8)。

表1.引物对序列信息

分别合成了上述P1-P10引物，并使用文献报道的引物(序列示于表1，扩增片段约270bp)作为对照引物(A.A.Malakhova et al.,Generation of two induced pluripotentstem cell lines from peripheral blood mononuclear cells of a patient withWilson’s disease,Stem Cell Research,Vol 47,August 2020,101922)，该对照引物被使用在多篇涉及支原体的文献中。

对于每对引物(P1-P10以及对照引物)，使用已知含有支原体的阳性样品作为检测对象，并以灭菌水作为阴性对照。具体而言，阳性样品为经确认被支原体污染的细胞培养物的上清液，通过如下方法制备。

吸取待检测细胞的培养液200μL，转移入无菌的1.5mL EP管中，并在95℃金属浴上加热10min。然后于12,000rpm离心1min，并将上清液转移到新的1.5mL EP管中，即为制备好的阳性样品。

使用阳性样品和作为阴性对照的无菌水，按照如下表2配置25μL反应体系以进行扩增。

表2.PCR反应体系

成分	用量
		ddH₂O	8.5μL
2×Rapid Taq Master Mix(诺唯赞，P222-03)	12.5μL
		正向引物(10μM)	1μL
反向引物(10μM)	1μL
		阳性样品或阴性对照	2μL

PCR扩增程序如下：

将扩增的产物上样到1％琼脂糖凝胶中，上样量每孔约5μL，进行凝胶电泳(恒压120V)，并将电泳结果示于图1。

如图1中的结果所示，在P1～P10的10对引物中，P1、P2、P7、P8均扩增出了清晰的、与预期长度一致的目的条带(P1引物对：约560bp；P2引物对：约850bp；P7引物对：约200bp；P8引物对：约500bp)，且条带强度和长度均优于使用被文献大量引用的对照引物的扩增产物。

相对而言，引物对P1和P2的目的片段长度更长，既可以使目的片段与引物二聚体在凝胶图上被更明显地区分开，而且以灭菌水为模板时完全没有杂带，说明这两个引物对具有更高的特异性。相较而言，引物对P7、引物对P8和被文献大量引用的对照引物的目的扩增片段的大小与引物二聚体的大小更接近，其中P7的扩增产物最小。在实际操作中这可能会导致在电泳时间较短的情况下，扩增产物不易于与引物二聚体进行区分，导致误读的可能性更大。另一方面，在扩增产物长度相对较短的情况下，理论上在细菌16SrRNA上可能有更高概率存在同源片段。另外，引物对P8在阴性样品的泳道中显示出目标引物的弱条带。

因此，选择引物对P1和P2作为检测支原体的引物对，进一步进行了后续的灵敏度试验。

实施例2.PCR引物对的灵敏度试验

在本实施例中，发明人使用不同稀释程度的样品对引物对P1和引物对P2进行了灵敏度检测。

首先，将支原体阳性样品(用已知引物通过PCR确认含有支原体的细胞培养物上清液，支原体拷贝数约为1.25×10¹¹个)分别用高压灭菌的ddH₂O稀释10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷和10⁸倍。然后，使用这些梯度稀释的阳性样品作为待扩增样品，并使用引物对P1、引物对P2和文献中的对照引物(A.A.Malakhova et al.,2020，同上)，按照实施例1中的体系和PCR程序进行了扩增和凝胶电泳检测，并将结果示于图2。

如图2中的结果显示，本发明的引物对P1和引物对P2均显示出优于对照引物的检测灵敏度，具体表现为在10倍稀释时的条带强度更强，且在100倍稀释时也获得了可辨识的条带。商业化的对照引物只有在稀释比例为10的样品中显示出微弱的条带，且条带大小因与引物二聚体的条带的大小相似，所以结果显得摸棱两可，不易区分。

使用本发明的引物对P1时，在稀释100(10²)倍时虽然仍能观察到目的扩增片段的条带，但已经较为模糊。相对而言，引物对P2的灵敏度极高，即使稀释1亿倍(10⁸倍)时，仍然能够通过普通PCR流程检测到扩增样品的信号，且扩增片段条带与引物二聚体条带在琼脂糖凝胶上距离较远，结果清晰明朗，不易造成误读。

上述结果说明，本发明的引物对P1和P2均优于被大量文献引用的对照引物，且引物对P2的灵敏度更好。

实施例3.长目的片段扩增引物对的特异性试验

在本实施例中，发明人使用细菌基因组阳性样品和支原体阳性样品对引物对P1和引物对P2进行了针对支原体的特异性检测。

作为细菌类样品，本实施例中选择了含有代表性的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和革兰氏阴性菌大肠埃希菌(Escherichia coli)的样品。这样的选择参考了药典中对微生物检测的规章，在所述规章中包含七种标准菌种，并写明在进行同类型的供试品检测时只需要挑选对应的某几种菌作为阳性对照。

首先，准备了细菌基因组阳性样品、无菌水和支原体阳性样品。细菌基因组阳性样品为金黄色葡萄球菌基因组和大肠埃希菌基因组的混合物的水溶液，在每25μL反应体系中两种菌的基因组含量为各100ng。支原体阳性样品与实施例2中使用的相同。

分别使用细菌基因组阳性样品、无菌水和支原体阳性样品作为待扩增样品，并使用引物对P1、引物对P2，按照实施例1中的体系和PCR程序进行了扩增和凝胶电泳检测，并将结果示于图3。

如图3中的结果显示，本发明的引物对P1和引物对P2均显示出对支原体阳性的检测灵敏性。在特异性方面，引物对P2的灵敏性很高，但是对于细菌阳性样品也获得了扩增结果，无法将支原体与细菌区别，在特异性方面引物对P1更好。综合片段长度、对水和菌类的非特异性进行考虑，引物对P1可以作为优选的支原体检测引物对。

Claims

1.在体外检测样品中支原体的存在的方法，所述方法包括：

(a)提供待检测的样品；

其中所述步骤(b)中使用的引物对选自如下中的任意一对：

(1)正向引物：5’-gcgttatccggaattattgggcg-3’(SEQ ID NO:1)，和

反向引物：5’-ctcgttgcaggacttgaccaaac-3’(SEQ ID NO:4)；或

(2)正向引物：5’-gcgttatccggaattattgggcg-3’(SEQ ID NO:1)，和

反向引物：5’-gacgggcggtgtgtacaagaccc-3’(SEQ ID NO:5)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中对所述样品进行加热。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(b)的PCR扩增中，使用25μL反应体系，并且所述反应体系中每种引物的量为1×10^-10mol至1×10^-12mol，例如1×10^-11mol。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中待检测样品中的支原体目的片段拷贝数低至约1.00×10⁹个拷贝。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述步骤(c)中的检测通过琼脂糖凝胶电泳进行。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，进一步包括对样品进行测序以确认支原体的种属。

7.用于检测支原体的PCR引物对，所述PCR引物对包含正向引物和反向引物，并且为选自如下各组的引物对：

(1)正向引物：5’-gcgttatccggaattattgggcg-3’(SEQ ID NO:1)，和

反向引物：5’-ctcgttgcaggacttgaccaaac-3’(SEQ ID NO:4)；或

(2)正向引物：5’-gcgttatccggaattattgggcg-3’(SEQ ID NO:1)，和

反向引物：5’-gacgggcggtgtgtacaagaccc-3’(SEQ ID NO:5)。

8.用于检测支原体的试剂盒，其包含权利要求7所述的引物对。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其进一步包含如下试剂中的一种或多种：缓冲液、dNTP和DNA聚合酶。

10.根据权利要求7所述的引物对或根据权利要求8或9所述的试剂盒在检测支原体中的用途。