CN110373486B - 用于检测科氏葡萄球菌的pcr引物、pcr方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本申请属于病原微生物的检测领域，涉及用于检测科氏葡萄球菌的PCR引物、检测方法、和该检测方法的应用，具体地，本申请提供了一对针对科氏葡萄球菌特异性好、灵敏度高的检测引物、荧光定量PCR方法和检测试剂盒。所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示序列，所述PCR方法至少包括根据科氏葡萄球菌热激蛋白HSP60基因，通过Primer Premier 5设计获得所述上游引物和下游引物，所述试剂盒至少提供所述上游引物和下游引物，或者采用所述PCR方法。

Description

用于检测科氏葡萄球菌的PCR引物、PCR方法及其试剂盒

技术领域

本申请属于病原微生物的检测领域，涉及科氏葡萄球菌的检测，尤其涉及用于检测科氏葡萄球菌的PCR引物、检测方法和该检测方法的应用。具体地，本申请提供了一对针对科氏葡萄球菌特异性好、灵敏度高的检测引物、荧光定量PCR方法和检测试剂盒。

背景技术

葡萄球菌感染是由葡萄球菌属内有致病菌作用的细菌导致的人畜共患的传染病。该属细菌广泛存在于哺乳动物的皮肤和呼吸道、上消化道、泌尿生殖道黏膜，一般经伤口侵入机体，大多会引起机体不同部位的化脓性疾病和全身败血症；此外，葡萄球菌毒素也能引起人或动物食物中毒。

科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)是一种凝固酶阴性葡萄球菌，最早于1957年由Schleifer和Kloos发现，随后由德国细菌学家ferdinand Cohn命名。它是一种条件致病菌，可以对人类和动物的健康以及动物养殖业等造成危害，因此引起重视。目前分离株多数来自于人类和其他猿类动物，近年来也有从其它种动物例如猪或鸭体内分离出该菌的报道。科氏葡萄球菌引起的感染的报道日益增多，主要从医院、实验动物中心、家畜养殖场等环境或动物体内分离出该菌。

现有技术中，目前该菌的鉴定方法大多为细菌分离培养进行生化鉴定，同时根据细菌的形态特征、生化特性进行确定，而采用这种先培养再鉴定的方法周期长，通常至少需要4-7个工作日；对实验员的操作要求高，需要实验人员判断并识别菌落大小、形状、颜色、形态等；再者，葡萄球菌属内细菌形态特征相似不易区分等特点，因此传统的检测方法不利于早期鉴定、快速发现或控制该菌的感染。而且，该方法灵敏度低，可能存在漏检；需要结合生化鉴定结果才能确定是否存在菌株。

随着生物技术的发展，分子生物学技术越来越多的应用于病原微生物的检测，现有方法中也包含PCR方法，该PCR方法是针对细菌16s rDNA基因扩增并结合测序进行确定，但是目前还未出现针对科氏葡萄球菌的特异性PCR方法。所以，迫切需要一种简单、快捷且适于推广的检测方法或检测工具，以避免科氏葡萄球菌感染对人类或动物等带来的健康威胁。

而荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)因其快速、简便、特异度强、灵敏度高等诸多优点在病原体检测领域得到广泛应用。考虑到现有技术中在葡萄球菌检测方面的不足和需求，本申请的发明人旨在采取SYBR GreenⅠ染料法，无需设计探针，由此可以减低成本，同时分析熔解曲线来评价扩增反应的特异性，为科氏葡萄球菌的早期诊断提供依据。

考虑到上述现有技术中在葡萄球菌检测方面的不足和需求，尤其是科氏葡萄球菌，本申请的发明人旨在采取SYBR GreenⅠ染料法，同时分析熔解曲线来评价扩增反应的特异性，无需设计探针，由此不仅减低成本，还为科氏葡萄球菌的早期诊断提供一种准确、快速、灵敏度高的检测方法。

发明内容

为了达到上述目的，第一方面，本申请提供了一种用于检测科氏葡萄球菌的特异性好、灵敏度高的PCR引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示序列。

进一步地，所述引物是根据科氏葡萄球菌热激蛋白HSP60基因，通过引物设计软件设计获得的。

进一步地，所述引物是根据科氏葡萄球菌热激蛋白HSP60基因的保守区域设计的。

进一步地，所述上游引物和所述下游引物浓度优选为20μM。

进一步地，所述引物在反应体系中最终使用浓度为2μM。

第二方面，本申请提供了一种用于检测科氏葡萄球菌的PCR方法，所述PCR方法至少提供一对引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为SEQID NO.1所示序列，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示序列。

进一步地，所述PCR方法包括以下步骤：

S1、DNA提取：取待测样品提取其中的DNA，保存备用；

S2、提供引物：所述根据科氏葡萄球菌热激蛋白HSP60基因，通过Primer Premier5设计获得所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示序列；

S3、建立PCR反应体系：所述反应体系至少包括2×Premix Ex Taq(SYBR)、ROX、所述上游引物、所述下游引物、分子级水、所提取的DNA模板。

S4、设置PCR仪扩增反应中的参数：在荧光定量PCR反应系统中设置95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火延伸34s，进行40个循环；以及

S5、采集信号，收集溶解曲线步骤。

进一步地，所述PCR方法中不包括探针设计。

进一步地，以所提取的DNA为模板，所述引物扩增，获得扩增片段为92bp。

进一步地，所述PCR方法中Tm值为77.0℃±0.5℃，并且溶解峰单一。

进一步地，所述PCR方法能够检测的目标DNA最低检测下限为250CFU/ml。

第三方面，本申请提供了所述PCR引物在检测科氏葡萄球菌方面的应用。其中，所述应用至少包括一种用于检测科氏葡萄球菌的试剂盒，所述试剂盒至少提供上述上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示序列。

进一步地，所述试剂盒还包括2×Premix Ex Taq(SYBR)、ROX、探针；

进一步地，所述试剂盒还包括DNA模板提取试剂，或者组合DNA提取试剂盒使用。

进一步地，所述试剂盒的反应体系为20μL，包含2×Premix Ex Taq(SYBR)10μL、ROX(50×)0.4μL、所述上下游引物(20μM)各0.2μL、分子级水4.2μL、5μL DNA模板。

进一步地，所述反应体系在PCR仪中95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火延伸34s，进行40个循环。其中所述反应体系进行实时荧光定量PCR(qPCR)反应。

进一步地，所述试剂盒能够检测的目标DNA浓度最小值为250CFU/ml，PCR方法检测质粒的最低检测下限为24copies/reaction。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、采用本申请设计的PCR引物检测科氏葡萄球菌，不仅特异性好、灵敏度高，检测时间短，而且，无需设计引物，无需对PCR扩增产物进行测序、比对，这样降低了成本，且极大地缩短检测时间，避免了采用传统检测方法繁琐、耗时、成本高等的缺点。

2、由于采用本申请所述PCR引物、PCR方法及其应用针对目标DNA特异性强，灵敏度高，检测结果特异性强，不容易产生误判，相应地，检测方法及试剂盒操作步骤简单，耗时短，结果分析简单易操作，便于推广应用各种场所。

附图说明

图1A为根据本申请的一种实施方式采用本申请所述引物进行荧光定量PCR方法的扩增曲线。

图1B为根据本申请的一种实施方式采用本申请所述引物进行荧光定量PCR方法的溶解曲线。

图2A为根据本申请的一种实施方式采用所述一对引物进行荧光定量PCR方法的扩增曲线。

图2B为根据本申请的一种实施方式采用本申请所述一对引物进行荧光定量PCR方法的溶解曲线。

图2C为根据本申请的一种实施方式采用本申请所述一对引物进行荧光定量PCR方法的标准曲线。

具体实施方式

为更清楚的了解本申请的发明构思和技术方案，下文将通过具体实施例和附图进一步解释本申请，其中关于实施方式中的技术方案仅是优选的实施方式，不应被解释为限制本申请的范围。对于本领域技术人员来说，在不脱离本申请的技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为落入本申请的保护范围之中。

除非另有定义或说明，本文使用的所有科技术语应视为具有本领域普通技术人员所理解的相同含义，所使用的实验方法均为常规方法；步骤中所使用的材料、试剂等均可从商业途径中获得。

在一种实施方式中，本申请提供了一对用于检测科氏葡萄球菌的特异性好、灵敏度高的PCR引物，该对引物包括上游引物和下游引物，该上游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示序列，该下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示序列。

SEQ ID NO.1:5’-GTAGAAGGTATGCAATTCGAC-3’

SEQ ID NO.2:5’-GGATATGGTCTTTCTAACTCT-3’

进一步地，该对引物是根据科氏葡萄球菌热激蛋白H S P6 0基因，通过PrimerPremier 5 5设计获得的。

进一步地，该对引物是根据科氏葡萄球菌热激蛋白HSP60基因的保守区域设计的。

进一步地，该上游引物和该下游引物浓度优选为20μM。

进一步地，该引物在反应体系中最终使用浓度优选为2μM。

在另一种实施方式中，本申请提供了一种用于检测科氏葡萄球菌的PCR方法，该PCR方法包括以下步骤：

S1、DNA的提取：取待测样品提取其中的DNA，保存备用；

S2、引物设计：根据科氏葡萄球菌热激蛋白HSP60基因，通过Primer Premier 5设计获得一对引物，包括上游引物和下游引物，该上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，该下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示序列；

S3、建立PCR反应体系：该反应体系至少包括2×Premix Ex Taq(SYBR)、ROX、该上游引物、该下游引物、探针、所提取的DNA模板。

S4、设置PCR仪扩增反应程序的参数：在荧光定量PCR反应系统中设置95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火延伸34s，进行40个循环；以及

S5、采集信号，收集溶解曲线步骤。

进一步地，该PCR方法中不包括探针设计。

进一步地，以所提取的DNA为模板，该引物扩增，获得扩增片段为92bp。

进一步地，该PCR方法中Tm值为77.0℃±0.5℃，并且溶解峰单一。

进一步地，该PCR方法能够检测的最低检测下限为24copies/reaction。

在再一种实施方式中，本申请提供了上述PCR引物在检测科氏葡萄球菌方面的应用。其中，该应用至少包括一种用于检测科氏葡萄球菌的试剂盒，该试剂盒至少提供上述上游引物和下游引物，该上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，该下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示序列。

进一步地，该试剂盒还包括2×Premix Ex Taq(SYBR)、ROX、分子级水、DNA模板提取试剂。

进一步地，所述试剂盒的反应体系为20μL，包含2×Premix Ex Taq(SYBR)10μL、ROX(50×)0.4μL、该上下游引物(20μM)各0.2μL、分子级水4.2μL、5μL DNA模板。

进一步地，该反应体系在PCR仪(例如，ABI 7500Real Time PCR System)中95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火延伸34s，进行40个循环。

进一步地，该试剂盒能够检测的目标DNA最低检测下限为24copies/reaction。

以下通过具体实施例进一步说明本申请提供的用于检测科氏葡萄球菌的PCR引物、检测方法、和检测试剂盒。

1.材料与方法

实施例1常见细菌标准菌株及DNA样本

标准菌株科氏葡萄球菌解脲亚种(ATCC 49330)1株、科氏葡萄球菌分离株14株、木糖葡萄球菌3株、表皮葡萄球菌和松鼠葡萄球菌各3株、缓慢葡萄球菌2株、马胃葡萄球菌2株、沃氏葡萄球菌葡1株、头状葡萄球菌1株、溶血葡萄球菌1株、克氏葡萄球菌1株，共计32株，及其其他7株菌株如：金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、生孢梭菌、蜡样芽孢杆菌、鼠棒状杆菌等，所有菌株均-70℃保存于本实验室。

用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，DP302)提取菌株基因组核酸，用于PCR方法的特异性实验。

实施例2临床样本DNA提取

无菌环境下采集20份小鼠粪便样本(每份约50mg)，用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，DP302)提取核酸，操作严格按照试剂盒说明书进行，DNA用60μLTE洗脱后-20℃保存待用。

实施例3引物设计与合成

根据科氏葡萄球菌的HSP60基因序列，利用Primer Premier 5引物设计软件来设计引物。

上游引物SEQ ID NO.1：

5’-GTAGAAGGTATGCAATTCGAC-3’

下游引物SEQ ID NO.2：

5’-GGATATGGTCTTTCTAACTCT-3’

扩增片段大小为92bp。所有引物均由苏州金唯智生物技术有限公司合成，如SEQIDNO.3所示。

SEQ ID NO.3：

GTAGAAGGTATGCAATTCGACAGAGGTTATCAATCTCCATATATGGTCACAGATTCAGATAAAATGGTTGCAGAGTTAGAAAGACCATATCC

实施例4质粒合成

方法：将目的片段装入PUC57质粒载体中，构建质粒。质粒由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成。

实施例5荧光定量PCR反应

反应体系为20μL，包含：2×Premix Ex Taq(SYBR)(Takara，RR420A)10μL，ROX(50×)0.4μL，上下游引物(20μM)各0.2μL，分子级水4.2μL，5μL DNA模板。在PCR仪(ABI7500Real Time PCR System)中95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火延伸34s，进行40个循环。分别采集信号，收集溶解曲线步骤。

2.PCR方法检测

实施例6特异性检测试验

以提取的39株菌株基因组DNA为模板分别进行PCR扩增，检验PCR方法的特异性。

实施例7敏感性检测试验

以科氏葡萄球菌解脲亚种ATCC 49330(2.5×107CFU/ml)为模板，做一系列梯度稀释，检测PCR方法的检测下限。

以含科氏葡萄球菌PCR目的片段质粒(2.4×10¹⁰copies/reaction)为模板作为标准品，做一系列梯度稀释，编号S4～S10，浓度分别为2.4×10⁶copies/reaction、2.4×10⁵copies/reaction、2.4×10⁴copies/reaction、2.4×10³copies/reaction、2.4×10²copies/reaction、2.4×10¹copies/reaction和2.4copies/reaction的阳性标准品，每个梯度的标准品3孔重复，同时检测方法的检测本发明方法的准确性和稳定性，NC为ddH₂O，用于PCR方法的敏感性测试。

实施例8临床样本的检测

将上述实验例2提取的20份DNA采用已建立的科氏葡萄球菌PCR方法进行检测。

3.PCR方法检测结果

实施例9特异性检测结果

以上述34株细菌的基因组DNA为模板，采用本申请所提供的科氏葡萄球菌引物，通过荧光定量PCR方法，检测上述34株细菌，以验证该方法的特异性，结果见表1。如表1所示，当其他病原菌株的核酸检测却均无阳性结果的情况下，科氏葡萄球菌菌株均检测到阳性结果。由此，可以看出，本申请提供的PCR引物对科氏葡萄球菌有较好的特异性。

表1科氏葡萄球菌PCR方法的特异性测试

图1A为根据本申请的一种实施方式采用本申请所述的一对引物进行荧光定量PCR方法的扩增曲线。图1B示出了如图1A所示的实施方式中采用本申请所述引物进行荧光定量PCR方法的溶解曲线。从图1A-1B可以确认，该方法仅特异性的检出科氏葡萄球菌，其余病毒株均为阴性，阳性样本扩增曲线典型(图1A)，且有特异性的溶解峰(图1B)。由此，可以看出，本申请提供的PCR引物对科氏葡萄球菌有较好的特异性。本申请提供的PCR引物的Tm值为77.0℃±0.5℃，而且溶解峰单一。

实施例10敏感性检测结果

以科氏葡萄球菌标准菌株的核酸为模板，做系列梯度稀释，通过所述PCR方法能够检测其最小值为250CFU/ml。如图2A-2C所示，以上述质粒S4～S10为模板作为标准品，通过所述PCR方法能够检测质粒的最低检测下限为24copies/reaction。3次重复荧光定量PCR检测均可检出S4～S9梯度浓度的重组质粒，Ct(threshold cycle)值组内重复测定相对标准偏差在可接受范围内，说明本方法重复性好、稳定性高。

图2B的所示结果表明，本申请提供的PCR引物的Tm值为77.0℃±0.5℃，而且溶解峰单一。

实施例11临床样本培养菌的检测结果

以科氏葡萄球菌提取核酸作为提取阳性对照，采用现有技术中已建立的科氏葡萄球菌PCR方法对20份临床样本的DNA进行检测，检测结果均为阴性。而通过本申请所描述的针对科氏葡萄球菌的PCR方法检测，来自临床样本的科氏葡萄球菌株则均为阳性。

通过本申请上文描述的一对用于检测科氏葡萄球菌的引物、其检测方法及其应用，提供了快速、准确、特异性好、灵敏度高的检测手段，通过扩增曲线与溶解曲线判断结果保证了检测结果的准确，同时减少时间成本和人工成本。

除非另有说明，本发明的实施方式和实验例采用了在本领域普通技术人员能力范围内的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术和化学方法的常规技术。尽管已经在此详细公开了本申请的特定实施方式，但是这仅是通过示例的方式实施，并且仅出于说明的目的。上述实施方式并非旨在限制所附权利要求的范围，也不意味着本申请必须依赖上述详细结构特征才能实施。

本领域技术人员应该知晓，对本申请的任何等同替换或改进，例如对本申请所选用方法、序列、试剂等的任何等效替换或改进以及辅助部分的增加、具体方式的选择等，均落在本申请的保护范围和公开范围之内。上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本申请对各种可能的组合方式不再另行说明。

序列表

<110> 苏州西山生物技术有限公司

<120> 用于检测科氏葡萄球菌的PCR引物、PCR方法及其试剂盒

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtagaaggta tgcaattcga c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggatatggtc tttctaactc t 21

<210> 3

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtagaaggta tgcaattcga cagaggttat caatctccat atatggtcac agattcagat 60

aaaatggttg cagagttaga aagaccatat cc 92

Claims (9)

1.一种用于检测科氏葡萄球菌的PCR引物，其特征在于：所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示序列。

2.根据权利要求1所述的PCR引物，其特征在于：所述引物是根据科氏葡萄球菌热激蛋白HSP60基因，通过引物设计软件设计获得的。

3.一种用于检测科氏葡萄球菌的PCR方法，其特征在于：所述PCR方法包括以下步骤：

S1、DNA提取：取待测样品提取其中的DNA，保存备用；

S2、提供引物：根据科氏葡萄球菌热激蛋白HSP60基因，通过引物设计软件设计获得一对引物，其包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示序列；

S3、建立PCR反应体系：所述反应体系至少包括2×Premix Ex Taq、ROX、所述上游引物、所述下游引物、分子级水、所提取的DNA模板；

S4、设置PCR仪扩增反应中的参数：在荧光定量PCR反应系统中设置95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火延伸34s，进行40个循环；以及

S5、采集信号，收集溶解曲线步骤；

以所提取的DNA为模板，通过所述引物扩增，获得扩增片段为92bp。

4.根据权利要求3所述的PCR方法，其特征在于：所述PCR方法中不包括探针设计。

5.根据权利要求3所述的一种用于检测科氏葡萄球菌的PCR方法，其特征在于：所述PCR方法中Tm值为77.0℃±0.5℃，并且溶解峰单一。

6.根据权利要求3所述的一种用于检测科氏葡萄球菌的PCR方法，其特征在于：以科氏葡萄球菌标准菌株的核酸为模板，通过所述PCR方法能够检测的最小值为250CFU/ml，PCR方法检测质粒的最低检测下限为24copies/reaction。

7.一种用于检测科氏葡萄球菌的试剂盒，所述试剂盒至少提供一对上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示序列。

8.根据权利要求7所述的一种用于检测科氏葡萄球菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括2×Premix Ex Taq、ROX。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：反应体系在PCR仪中95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火延伸34s，进行40个循环，以及采集信号，收集溶解曲线步骤，其中反应体系进行实时荧光定量PCR(qPCR)反应。

Images