JP4933458B2 - シグナル増幅による核酸の検出および分析のための方法および組成物 - Google Patents

シグナル増幅による核酸の検出および分析のための方法および組成物 Download PDF

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Description

本出願は、参照により全体が本明細書に組み込まれている、2005年3月3日に出願した米国仮出願第60/657717号の優先権を主張するものである。
本発明は、試料中の核酸の検出および分析のための方法、製品および組成物に関する。より具体的には、特異的受容体、光学トランスデューサーおよび増幅機構を組み合わせた新規な統合された、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用しないシグナル増幅ポリヌクレオチド検出システムに関する。本発明のシステムは高感度であり、少量存在する(すなわち、僅か約20コピーほど)オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの特異的検出を可能にする。
簡単で超高感度の配列特異的DNAバイオセンサーは、感染症および遺伝的疾患の迅速診断ならびに環境および法医学用途にとって必要である1。この目的のために、種々の光学的および電気化学的DNAセンサーが提案されてきた2〜8。しかし、これらの提案されたDNAセンサーの大部分は、PCRなどある種の化学的増幅に依存しており9、そのため、複合混合物および必要な酵素反応を実施するために精巧な機器の使用が必要となる可能性がある。
より最近、水溶性共役カチオンポリマーに基づく蛍光による迅速なDNA検出方法が記載された10〜14,23〜26。ここで、ポリカチオン性ポリマーは、集光性マルチ発色団として使用されている(例えば、米国特許仮出願第2004/0219556A1号(2004年11月4日)(Bazanら)を参照されたい)。中性のペプチド核酸(PNA)に基づくセンサーであって、対象とする標的ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するシグナル発信(signaling)発色団を有するセンサーが提供される。試料中の標的ポリヌクレオチドと接触すると、ポリカチオン性マルチ発色団は、標的ポリヌクレオチドとの静電気的相互作用の力によってシグナル発信発色団に近接する。それに続いて、マルチ発色団の励起により、シグナル発信発色団からの発光が生ずる。この方法は、試料中のポリヌクレオチドの量を測定する迅速で信頼性ある方法を提供するが、その一方、それ自体によっては、試料中の非常に微量のヌクレオチドの検出は可能にならない。
米国仮出願第60/657717号 米国特許仮出願第2004/0219556A1号(2004年11月4日)(Bazanら) 米国特許第5780610号(Collinsら) Switzerら(1993)、Biochemistry 32、10489〜10496頁 Torら(1993)、J. Am. Chem. Soc. 115:4461〜4467頁 Mantschら(1993)、Biochem. 14:5593〜5601頁 Piccirilliら(1990)、Nature 343:33〜37頁 Leachら(1992)、J. Am. Chem. Soc. 114:3675〜3683頁
したがって、PCRなどのヌクレオチド増幅に頼らない、試料中のポリヌクレオチドの迅速で高感度の検出を可能にする方法に対する必要性が残されている。それに加えて、そのような方法において有用な組成物および製品に対する必要性も残されている。
本発明は、これらのおよびその他の必要とされるものを探究する。
本発明は、単鎖または2本鎖オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの迅速で特異的な検出を提供する方法ならびにそのような方法を実施するために有用な組成物および製品に関する。
本発明は、さらに、試料中の単鎖または2本鎖オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの迅速で特異的な検出を提供する方法ならびにそのような方法を実施するために有用な組成物および製品に関する。
一実施形態において、本発明は、アニオン性オリゴヌクレオチドプローブ、水溶性共役カチオンポリマートランスデューサーおよび固有のフォトニック増幅機構(intrinsic photonic amplification mechanism)を含む核酸検出システムに関する。水溶性共役カチオンポリマートランスデューサーは、特異的ハイブリダイゼーションを促進する局在化対イオンとしても役立つ。その上、ポリマートランスデューサーは、蛍光体で標識された捕捉プローブと組み合わせたとき、シグナル増幅および改良された検出限界を提供する。
本発明の核酸検出システムは、20個の単鎖オリゴヌクレオチドのような少量を特異的に迅速に検出することができる。本発明の一実施形態において、検出されるべき単鎖オリゴヌクレオチドは、臨床試料から抽出することができる。
有利には、本発明の核酸検出システムは、核酸増幅の必要なしに、一塩基多型(SNP)、遺伝子および病原体の一致性を迅速に評価するのに適している。
一実施形態において、本発明は、水溶性アフィニティクロミック性(affinitychromic)カチオン性ポリチオフェンと、水溶性アフィニティクロミック性カチオン性ポリチオフェンと二重鎖を形成するための、蛍光体で標識されたアニオン性オリゴヌクレオチド捕捉プローブと、相補的な標的オリゴヌクレオチドを含むと疑われる試料とを含む、核酸検出システムに関する。
一実施形態において、本発明は、水溶性アフィニティクロミック性カチオン性ポリチオフェンを供給する工程、水溶性アフィニティクロミック性カチオン性ポリチオフェンと蛍光体で標識されたアニオン性オリゴヌクレオチド捕捉プローブとを接触させて二重鎖を形成させる工程、および二重鎖を相補的な標的オリゴヌクレオチドを含むと疑われる試料と接触させる工程を含む、短鎖長核酸分子を検出する方法に関する。
さらなる適用範囲および応用の可能性は、後述の詳細な説明から明らかとなろう。しかし、この詳細な説明は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、種々の変形および改変は当業者には明らかになるであろうから、単に例として示したものと理解されたい。
(定義および用語)
本明細書において使用する用語は、個々の実施形態を説明する目的のために過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図していない。
単数形「a」、「an」および「the」は、出現箇所で明確に断らない限り複数を表わすことを含む。したがって、例えば、「a target polynucleotide」と称した場合複数の標的ポリヌクレオチドを含む。
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、「含む」(comprising)(および「comprise」、「comprises」などのcomprisingの如何なる形も)、「有する」(having)(および「have」、「has」などのhavingの如何なる形も)、「含む」(including)(および「include」、「includes」などのincludingの如何なる形も)、または「含む」(containing)(および「contain」、「contains」などのcontainingの如何なる形も)という用語は、包含的すなわち拡張可能で、追加の未記載の要素または工程段階を排除しない。
「約」という用語は、値が、値を決定するために使用される装置または方法による誤差の固有な変動を含むことを示すために使用される。
「接続された」、「結合された」および「連結された」は、本明細書においては、互換可能に使用され、出現箇所で明確に断らない限り、直接的ならびに間接的な接続、結合、連結または複合を包含する。
値が明確に挙げられているところでは、挙げられた値とおよそ同じ数量または量も、それに基づく範囲と同様に本発明の範囲内であると理解すべきである。
特に断るかまたは出現箇所で明確に断らない限り、本明細書で使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当該技術における当業者により共通的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様なまたは等価の如何なる方法および材料も、本発明の実施または試験において使用することができるが、ここでは好ましい方法および材料を記載する。
本明細書中で言及した全ての出版物は、その参考文献が引用された目的の特定の方法および材料を開示し説明する目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において論ずる出版物は、本出願の出願日に先立つ開示に対してのみ提供される。本発明においては、本発明が、先行発明によるそのような開示に先行して権利を与えられないという了解として解釈されることは何もない。
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、本明細書においては、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形を指すために互換的に使用され、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの類似体またはそれらの混合物を含むことができる。これらの用語は、分子の1次構造のみを指す。したがって、この用語は、3本鎖、2本鎖および単鎖のデオキシリボ核酸(「DNA」)ならびに3本鎖、2本鎖および単鎖のリボ核酸(「RNA」)を含む。それらは、ポリヌクレオチドの修飾(例えば、アルキル化および/またはキャッピングにより)形および非修飾形も含む。
より具体的に、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド(2-デオキシ-D-リボースを含む)、tRNA、rRNA、hRNAおよび、スプライスされたまたはされていないmRNAを含むポリリボヌクレオチド(D-リボースを含む)、プリンまたはピリミジンのN-またはC-グリコシドである任意の他の型のポリヌクレオチド、および、リン酸エステルもしくは他のポリアニオン性骨格を含む他のポリマー、ならびに、DNAおよびRNAに見出されるような塩基対形成および塩基の積み重ねを可能にする立体配置で核酸塩基を含むことを前提とした他の合成の配列特異的核酸ポリマーを含む。「ポリヌクレオチド」「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語の間に意図的な長さの区別はなく、これらの用語は、本明細書において互換的に使用される。したがって、これらの用語は、例えば、3'-デオキシ-2',5'-DNA、オリゴデオキシリボヌクレオチドN3'P5'ホスホロアミデート、2'-O-アルキル置換RNA、2本鎖および単鎖DNA、ならびに2本鎖および単鎖RNA、および例えば、DNAとRNAとのハイブリッドを含むそれらのハイブリッドを含み、また、非修飾形のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドだけでなく、既知タイプの修飾、例えば、標識、アルキル化、「キャップ」、1つまたは複数のヌクレオチドの類似体による置換;ヌクレオチド間修飾、例えば、負荷電連結部(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートその他)を有するもの、例えばタンパク質(酵素(例えば、ヌクレアーゼ)、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンその他を含む)などの側鎖部分を含むもの、インターカレーターを有するもの(例えば、アクリジン、ソラーレンその他)、キレートを含むもの(例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属その他)、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結部を含むもの(例えば、αアノマー状核酸その他)なども含む。
本明細書で使用する場合、「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」という用語は、既知のプリンおよびピリミジン塩基だけでなく、修飾された他の環状複素環塩基も含むことができる。そのような修飾されたものには、メチル化プリンもしくはピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジンまたは他の複素環が含まれる。修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドには、例えば、1つもしくは複数のヒドロキシル基が、ハロゲン、脂肪族基で置換され、またはエーテル、アミン等として官能化された糖部分の修飾も含まれる。「ヌクレオチド単位」という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドを包含することを意図している。
それに加えて、ヌクレオチド単位に対する修飾は、それぞれ相補的なピリミジンまたはプリンと水素結合するプリンまたはピリミジン塩基に対する転位、付加、置換または他の方法で官能基を変化させることを含む。その結果生成する修飾されたヌクレオチド単位は、他のそのような修飾されたヌクレオチド単位と場合により塩基対を形成することができるが、A、T、C、GまたはUと塩基対を形成することはできない。ポリヌクレオチドの機能を妨げない非塩基部位を導入することはできるが、ポリヌクレオチドは非塩基部位を含まないことが好ましい。ポリヌクレオチドの残基の一部または全部を、1つまたは複数の方法で場合により修飾することができる。
標準的なA-TおよびG-C塩基対は、チミジンのN3-HおよびC4-オキシとそれぞれアデノシンのN1およびC6-NH2との間で、ならびにシチジンのC2-オキシ、N3およびC4-NH2とそれぞれグアノシンのC2-NH2、N1-HおよびC6-オキシとの間で、水素結合の形成を可能にする条件下で形成される。したがって、例えば、グアノシン(2-アミノ-6-オキシ-9-β-D-リボフラノシル-プリン)を修飾して、イソグアノシン(2-オキシ-6-アミノ-9-β-D-リボフラノシル-プリン)を形成することができる。そのような修飾の結果、シトシンと標準的な塩基対をもはや効果的に形成しないと見込まれるヌクレオシド塩基が生ずる。しかし、イソシトシン(1-β-D-リボフラノシル-2-アミノ-4-オキシ-ピリミジン)を形成するシトシン(1-β-D-リボフラノシル-2-オキシ-4-アミノ-ピリミジン)の修飾の結果、グアノシンと塩基対を効果的に形成することはないが、イソグアノシンと塩基対を形成すると見込まれる修飾ヌクレオチドが生ずる。イソシトシンはSigma Chemical Co. (ミズーリ州St. Louis所在)から市販されている。イソシチジンはSwitzerら(1993)、Biochemistry 32、10489〜10496頁およびその中で引用されている参考文献に記載されている方法によって調製することができる。2'-デオキシ-5-メチル-イソシチジンは、Torら(1993)、J. Am. Chem. Soc. 115:4461〜4467頁およびその中で引用されている参考文献に記載されている方法によって調製することができる。また、イソグアニンヌクレオチドは、Switzerら(1993)前掲、およびMantschら(1993)、Biochem. 14:5593〜5601頁に記載されている方法を使用して、または米国特許第5780610号(Collinsら)に記載されている方法により調製することができる。他の非天然塩基対は、2,6-ジアミノピリミジンおよびその相補体(1-メチルピラゾロ-[4,3]ピリミジン-5,7-(4H,6H)-ジオン)の合成のために、Piccirilliら(1990)、Nature 343:33〜37頁に記載されている方法により合成することができる。独特の塩基対を形成する他のそのような修飾ヌクレオチド単位、例えば、Leachら(1992)、J. Am. Chem. Soc. 114:3675〜3683頁およびSwitzerら(前掲)に記載されているものが知られている。
ハイブリダイゼーション条件には、通常約1M未満、より普通には約500mM未満、好ましくは約200mM未満の塩濃度が含まれよう。ハイブリダイゼーション温度は、5℃のように低くすることができるが、通常22℃を超え、より典型的には約30℃を超え、好ましくは約37℃を超える。特異的ハイブリダイゼーションのためには、フラグメントが長いほど高いハイブリダイゼーション温度が必要となり得る。相補鎖の塩基組成および長さ、有機溶媒の存在ならびに塩基ミスマッチの程度を含む他の要因は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響し得るが、使用されるパラメーターの組合せがいずれか1つ単独の絶対的尺度より重要である。当業者は、所与のアッセイ様式に対する適当なハイブリダイゼーション条件を決定することができる。調節し得る非限定的パラメーターは、アッセイ成分濃度、使用される塩およびその濃度、イオン強度、温度、緩衝剤の種類および濃度、溶液pH、反復配列またはブロッキングタンパク質溶液などのバックグラウンド結合を減少させるためのブロッキング試薬の有無および濃度、洗浄剤の種類および濃度、ポリヌクレオチドの相対濃度を増加させるポリマーなどの分子、金属イオンおよびその濃度、キレート剤およびその濃度、および当該技術において知られている他の条件を含む。
「マルチパラメーター定量」は、本明細書においては、複数の分析物を同時にアッセイすることができるアッセイまたは他の分析方法を指す。
標的ポリヌクレオチドを含むかまたは含むと疑われる試料は、細胞、組織または体液を含めて生きた生物から直接または間接的に、およびウイルス、マイコプラズマを含むその生物が残した沈積物、および化石から得ることができる、ポリヌクレオチドを含む如何なる供給源の生体物質であってもよい。試料は全部または一部合成的手段により調製された標的ポリヌクレオチドを含むことができる。通常、試料は、そのままで、または主として水性媒質中に分散して得られる。試料の例は、限定するものではないが、血液、尿、精液、乳汁、喀痰、粘液、頬側スワブ、膣スワブ、直腸スワブ、吸引液、針生検、例えば外科手術または剖検により得られた組織の切片、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚、呼吸管、腸管、泌尿生殖管の外分泌物、涙液、唾液、腫瘍、器官、インビトロ細胞培養構成成分(細胞培養培地中に細胞の増殖により生じた培養上製、ウイルスに感染したと推定される細胞、組換え細胞および細胞成分を含むが、これらに限定はされない)の試料、およびポリヌクレオチド配列を含む組換えライブラリーを含む。
試料は、存在する任意の標的ポリヌクレオチドを可溶化および/もしくは純化するために、または増幅スキームで使用される試薬もしくは検出試薬に試料が接触できるように、希釈、溶解、懸濁、抽出または他の方法で処理することができる。試料が細胞を含む場合は、細胞を溶解するかまたは透過可能にして、細胞内のポリヌクレオチドを遊離させることができる。ワンステップ透過処理用緩衝液を使用して細胞を溶解することができ、それにより、溶解後直ちにさらなる工程、例えばポリメラーゼ連鎖反応を実施することが可能になる。
標的ポリヌクレオチドは単鎖、2本鎖またはさらに高次であってもよく、また線状であっても環状であってもよい。例となる単鎖標的ポリヌクレオチドには、MRNA、rRNA、tRNA、hnRNA、ssRNAまたはssDNAウイルスゲノムが含まれるが、これらのポリヌクレオチドは内部的に相補配列および有意な2次構造を含んでいてよい。例となる2本鎖標的ポリヌクレオチドには、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、クロロプラストDNA、dsRNAまたはdsDNAウイルスゲノム、プラスミド、ファージ、ウイロイドが含まれる。標的ポリヌクレオチドは、合成的に調製するか、または生物供給源から精製することができる。標的ポリヌクレオチドは、精製して、試料の1つまたは複数の望ましくない成分を除去するかもしくは減少させるか、または標的ポリヌクレオチドを濃縮することができる。逆に、標的ポリヌクレオチドが特定のアッセイにとって濃厚過ぎる場合、標的ポリヌクレオチドを希釈することができる。
(実験)
材料。ポリマー1は、先に出版された研究10,13に従って合成した。単分散ポリピリジニウム試料で較正したサイズ排除クロマトグラフィ測定を基準にして、ポリマーは数平均分子量11000および多分散指数2.0を有していた。標識および非標識オリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies, Inc.から購入した。20量体オリゴヌクレオチドの検討のために、プローブ(X1)および標的(Y1、Y2およびY3)を、カンジダ酵母種の検出のために設計されたプローブ10から誘導した。チロシン血症I型 IVS12+5 G-Aスプライス変異21の検出について、ゲノム中の変異した配列に相補的な15量体の捕捉プローブ配列は(TAN 100) 5'-CCG GTG AAT ATC TGG-3'であり、野生型DNAに相補的な捕捉プローブは(TAN 101) 5'-CCG GTG AGT ATC TGG-3'であった。これらのオリゴヌクレオチドプローブの5'-末端にAlexa Fluor 546を結合させた。全てのオリゴヌクレオチド溶液は無菌水で希釈し、全ての希釈液および溶液の取扱いはプラスチック器具で実施した。
血液からのDNA抽出および精製。先に記載されたようにして22、患者血液からヒトゲノムDNAを抽出し、使用するまで-20℃で凍結して保存した22。
光学測定の一般的手順。UV-可視吸収スペクトル(図1A)は、Hewlett-Packard(モデル8452A)分光光度計を使用して記録した。蛍光スペクトル(図1B)は、Varian Cary Eclipse分光蛍光光度計を使用して記録した。蛍光較正曲線(図2および4)は、Alexa Fluorの572nmの発光の測定用に改良した特注の携帯用蛍光光度計13を使用して得た。全ての場合、励起は420nmで実施し、較正曲線上の蛍光データの点は、572nmでの5つの光学測定値の平均から得た。各光学測定値は、10秒間の蛍光シグナルの積分により得た。全ての光学測定に対して、光路長1.0cmの3mL石英セルを使用した。検出限界は、ブランクシグナルの光学測定値を較正曲線の勾配で除した値の標準偏差の3倍であるとして計算した。二重鎖は、2.14μMの濃度になるように、ポリマーとオリゴヌクレオチド捕捉プローブとの化学量論量を混合することにより調製した(原液)。次に、その結果生じた複合体を、所望の濃度に調製した。ハイブリダイゼーション実験は、20量体オリゴヌクレオチドのためには55℃で、チロシン血症SNP検出のためには65℃で実施した。チロシン血症検討のためには、試料を最初に100℃で変性した。
C. albicansおよびC. dubliniensisからのEF-1a遺伝子の一部分の150bpアンプリコンの調製 50mM KCl、10mM Tris-HCl (pH 9.1)、0.1% Triton X-100、2.5mM MgCl2、濃度0.4μMのプライマーECal61 [5'-CAAGAAGGTTGGTTACAACCCAAAGA-3']およびEcal184 [5'-AGGTCTTACCAGTAACTTTACCGGAT-3'])、200μMデオキシヌクレオシド三リン酸(Amersham Biosciences、ニュージャージー州、Piscataway所在)、μl当たり3.3μgのウシ血清アルブミン(Sigma-Aldrich Canada Ltd.、カナダ、オンタリオ州Oakville所在)、およびTaqStart抗体(BD Biosciences Clontech、カリフォルニア州、Palo Alto所在)と配合した0.025UのTaq DNAポリメラーゼ(Promega、ウィスコンシン州Madison所在)を含む19μlのPCR混合物に、350pg/μlの濃度に調製した350pgのゲノムDNAを移した。PCR混合物を、サーマルサイクラーPTC-200 (MJ Research Inc.マサチューセッツ州Watertown所在)で、熱サイクル(95℃で3分間の後、変性工程として95℃で30秒間、アニーリング工程として55℃で30秒間および伸長工程として72℃で30秒間を40サイクル)にかけた。PCR増幅生成物は、アンプリコンを溶出させるために、脱イオン水を使用してQlAquick Gel Extraction Kit (Qiagen Inc.、カナダ、オンタリオ州Mississauga所在)により精製した。
ヒト健常志願者血液からのDNAの精製。(K3)EDTA (Lavender caps、注文番号366450、Becton Dickinson)を含むVacutainerTMチューブを使用して、健常志願者から7mlの血液を採った。この血液200μLを、PromegaのMagneSil KF Genomic System (カタログ番号MD1460)を使用して、DNA抽出および精製のために使用した。試料調製は、メーカーの指示(MagneSilTM KF Genomic System、MD1460rev01)に従って実施したが、1つ細かい修正を行った:すなわち、Promegaのプロトコルの工程IVbにおいて、200μlの核酸を含まない水の代わりに200μLのTEを使用した。磁性粒子は、「PromegaGenomic」プログラムのバージョン1.0 (MagneSilTM KF Genomic System、Promegaのウェブサイトから「KfmLMagGenomvl_0」としてダウンロードされるプログラム)により駆動されるThermo LabsystemsのKingFisherTM mL磁性粒子プロセッサーを使用して取り扱った。
（詳細な記載）
本発明は、特異的受容体、光学トランスデューサーおよび増幅機構を組み合わせた新規な統合された、PCRを使用しないシグナル増幅DNA検出システムに関する。この新規な検出システムは、カチオン性ポリチオフェン(すなわちポリマー1)とss-DNAまたはds-DNAとの間の異なった静電気的相互作用およびコンホメーション、ならびに、三重鎖(カチオン性ポリチオフェンとds-DNAとの間の複合体形成)とss-DNAまたはds-DNAプローブに結合した近接する蛍光体との間の効率的エネルギー移動に基づく。ss-DNAの場合、三重鎖形成は、カチオン性ポリチオフェンとの複合体形成と組み合わさった、相補ss-DNAのハイブリダイゼーションにより起こると理解すべきである。本発明の検出システムは、核酸増幅を必要とせずに、僅か2ないし3分で、臨床試料から一塩基多型(SNP)を検出することを可能にする。本発明のさらなる実施形態において、このポリマー検出システムは、ss-DNAプローブに結合した異なる蛍光体を使用して、または固体支持体上のマイクロアレイを使用して、溶液におけるマルチパラメーター検出に容易に適合させることができる。
一実施形態において、本発明は、アニオン性オリゴヌクレオチドプローブ、水溶性共役アフィニティクロミック性カチオン性ポリマートランスデューサー、および固有のフォトニック増幅機構を含む新規な核酸検出システムに関する。水溶性共役アフィニティクロミック性カチオン性ポリマートランスデューサーは、特異的ハイブリダイゼーションを促進する局在化した対イオンとしても役立つ。本発明の一実施形態において、カチオン性ポリマートランスデューサーは、水溶性共役アフィニティクロミック性カチオン性ポリチオフェンを含む(図1、ポリマー1)。そのようなカチオン性ポリチオフェンは、先に記載されており、次の知られた文献の手順10,13に従って調製した。
本明細書で使用する水溶性共役カチオン性ポリチオフェンは、単鎖(ss)または2本鎖(ds)核酸の存在下に置いたときに、アフィニティクロミック性の性質(結合したときにコンホメーション変化により生ずるUV-可視吸収スペクトルの変化)を示す10,13。例えば、水性媒体中のポリマー1は、ポリチオフェンのランダムコイルの不十分な共役コンホメーションに対応する黄色の溶液(λmax=397nm)を呈する。化学量論量(反復単位を基準にして)の20量体非標識捕捉プローブ(すなわちX1:5'-CATGATTGAACCATCCACCA-3')を添加したとき、混合物は、ポリチオフェンの平面的な高度に共役化し凝集した形態に対応する赤色(λmax=527nm)に変化する。このことは、カチオン性ポリチオフェンとアニオン性オリゴヌクレオチドプローブとの間の中性のいわゆる「二重鎖」(捕捉鎖)の形成を示す。相補オリゴヌクレオチド(すなわちY1:3'-GTACTAACTTGGTAGGTGGT-5')を捕捉鎖に加えると、三重鎖が形成される。三重鎖の形成は、混合物のさらなる色変化を生じさせ、混合物は黄色(λmax=421nm;図1A、a)に戻る。2つのミスマッチ(すなわち、Y2:3'-GTACTAACTTCGAAGGTGGT-5')または僅か1つのミスマッチ(すなわち、Y3:3'-GTACTAACTTCGTAGGTGGT-5')を有するオリゴヌクレオチドの添加では、吸収スペクトルに微小な変化が観察される(データは示さず)。
核酸の蛍光分析による検出も、本発明の新規なDNA検出システムを使用して可能である。ポリ(3-アルコキシ-4-メチルチオフェン)の蛍光は、平面凝集形(二重鎖)では消光されるが、黄色の三重鎖形は、420nmで励起されたときに、530nmに発光極大(図1B、a)を有する蛍光性であるので、蛍光分析による検出が可能である。
ポリマートランスデューサーの特異性および感度は、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)を誘発する目的で、それを蛍光体(例えばAlexa Fluor 546)で標識した捕捉プローブと組み合わせることによりさらに改良された。この改良されたトランスデューサーを使用して、化学量論量の二重鎖はそれでもなお赤色を示し(図1A、b)、蛍光を消光した(図1B、b)。この二重鎖をその相補オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせると、三重鎖形成に対応する新しい吸収帯を420nmに観察することができる(図1A、c)。その結果生じた三重鎖の蛍光極大(530nm)は、516nmおよび556nmに吸収帯(図1A、c)を有し続いてそれより長波長(572nmで発光極大;図1B、c)で蛍光を発する蛍光体(Alexa Fluor 546)の吸収スペクトルときれいに重なる。非相補的またはミスマッチのDNAが二重鎖に加えられたときには、色変化は検出されないで、二重鎖溶液は赤色のままである。これはFRET機構の阻害を示している。その結果、完全な相補ss-DNA鎖で測定された蛍光強度(同一実験条件)は、1つまたは2つのミスマッチを有する標的について得られた蛍光強度に比較して常に高い。
驚いたことに、本発明の新規なDNA検出システムを使用して、大量の化学量論量の二重鎖プローブ(約1010コピー)を用いて、僅か30コピーの20量体オリゴヌクレオチドを、試料(3mL)中で容易にかつ特異的に検出することができた。その上、完全に相補的な標的を、そのような低濃度で、2つまたはただ1つのミスマッチを有する配列から、さらに識別することができた。特注の青色LED蛍光光度計を使用したこれらのデータから計算した検出限界は、3mLの容積中僅か5コピーであったが、これは3zM (3×10-21M)の濃度に相当する。市販の分光蛍光光度計(Varian Cary Eclipse)を使用すると、若干それより高い検出限界(3mLの容積中30コピー;18zM)が得られた。本発明のDNA検出システムにおける蛍光体で標識した捕捉プローブの使用は、「スーパーライティング」プロセスまたは「蛍光連鎖反応」(FCR)と称することができる「ターンオン」増幅シグナル15を提供する。図3に例示したように、この高度に効率的なエネルギー移動は、標的の導入に先立つ溶液中における二重鎖の凝集形成に主として基づくと信ぜられる10,13。これらの凝集は、続いて所与の三重鎖と多数の近接するAlexa Fluor発色団との間の非常に効率的なエネルギー移動を起こさせる。実際、この発色団は僅か16nmのストークスシフトおよび3.6nsecの蛍光寿命と共に95%の蛍光量子収率を示す。これらは、凝集した複合した分子間の高効率の分子間エネルギー移動の優れたパラメーターである16〜20。
本発明の一実施形態において、新規な核酸検出システムは、ds-DNAの超高感度検出のために使用することもできる。蛍光体で標識された捕捉プローブを、シグナル増幅を誘発するために使用するとき、極度に低濃度レベルのds-DNAを検出することができる。プローブと標的のハイブリダイゼーション反応はds-DNAの再ハイブリダイゼーションと競合するので、大部分のこれまでに報告された直接的DNA検出技法は、ss-DNAとしての標的配列の利用度に依存している。本発明で使用するポリチオフェントランスデューサーの場合に、先の研究では、ポリチオフェントランスデューサーがss-DNAプローブに比較してds-DNAに対して高い親和性を有するので、非相補的ds-DNAの存在は、偽陽性シグナルに通じる可能性があることが示された10,13。
DNA捕捉プローブとDNA標的との間の認識反応を選択的に増強する実験条件を念入りに作成した。具体的には、純水中65℃で、全ての変性したDNA材料は変性したままであり、ハイブリダイゼーションは、リン酸エステル部分の負電荷に対して局在化対イオンとしても作用する、静電結合したカチオン性ポリチオフェントランスデューサーにより促進されて、本質的に、二重鎖中の標識ss-DNAプローブだけと起こる。
本発明の一実施形態において、新規な核酸検出システムは、増幅していないヒトゲノムDNA試料中の一塩基多型(SNP)を識別するために使用することもできる。さらなる実施形態において、新規な核酸検出システムは、増幅していないヒトゲノムDNA試料中の疾患に関連したSNPを識別するために使用することもできる。(FRET)-増感検出の高い特異性および感度は、他の反応では好ましくない条件におけるハイブリダイゼーションを促進するというポリチオフェントランスデューサーの性能と組み合わされて、増幅していないヒトゲノムDNA試料中の疾患に関連したSNPが識別されることを可能にする。図4Aは、正常(すなわち野生型)ヒトゲノムDNAを、野生型(TAN 101: 5'-CCG GTG AGT ATC TGG-3')に相補的なプローブ配列で、および変異した(TAN 100: 5'-CCG GTG AAT ATC TGG-3')配列21で試験することにより得た較正曲線を示す。同様に、図4Bは、変異したヒトゲノムDNA(病気の患者から)を、野生型(TAN 101: 5'-CCG GTG AGT ATC TGG-3')に相補的なプローブ配列で、および変異した配列(TAN 100: 5'-CCG GTG AAT ATC TGG-3')で試験することにより得た較正曲線を示す。このデータは約5分で得られ、このことは、本発明の核酸検出システムが野生型DNAを変異したDNAから近似的に識別することを可能にする容易さおよび迅速性を示している。本発明の核酸検出システムは、標的を予め増幅または濃縮することなく、20量体オリゴヌクレオチドで到達されたレベル(図2)と同様な濃度レベルで、全ゲノム中の一塩基多型(SNP)を検出することを可能にする。例えば、2つの15量体オリゴヌクレオチドが、ヒトゲノム中のチロシン血症を探索するために特異的に設計されたが、これらのプローブとただ1つのミスマッチを示す多くの遺伝子座が天然に、特に遺伝子の先端に存在することが知られている。驚いたことに、これらの非特異的標的配列を使用して、顕著なハイブリダイゼーションシグナルを検出することができなかった。
非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、純水中65℃でハイブリダイゼーション反応を実施することにより得られる。これらのストリンジェントな条件下で、捕捉プローブ上に局在化したカチオン性ポリチオフェントランスデューサーは、核酸のリン酸エステル骨格を中和するために利用し得る唯一の対イオンであり、したがって優れた特異性を可能にする。これらの特徴は、本発明の核酸検出システムの広範な適用性を示唆する。一実施形態において、この核酸検出システムは、複合混合物中の核酸配列を選択的に検出するために使用することができた。
図2に関して説明したものと同様な実験を、市販分光蛍光光度計(Varian Cay Eclipse)で実施した。図5に示したように、ss-オリゴヌクレオチドの高感度で高選択性の検出がやはり得られた。この場合、検出限界は、55℃で3mLの純水中約30コピーである。
多くの種類の遺伝子材料、すなわち、PCR生成物(アンプリコン)およびヒトゲノムDNAに対するこの方法の適用可能性も試験した。本発明の方法は、PCR増幅の必要性を排除すること目標としているが、アンプリコン生成物は、それらがバイオテクノロジー研究で広く使用されているので、自明の選択項目である。さらに、それらは2本鎖DNAのモデルでもあり、したがって、オリゴヌクレオチドと完全なヒト遺伝子との間の良い中間形態として役立つ。この研究のために、プローブX1+AF546をC.albicansおよびC.dubliniensisのアンプリコンと共に使用した(図2を参照されたい)。
図6は、上で説明したのと同じ手順を使用して得られた。この図は、本発明の方法が、150ヌクレオチドの長さのds-DNA中の僅か2ヌクレオチドだけ相違するものから、完全合致したアンプリコンを容易に識別することができることを示す。この高度の選択性は、上で説明した固有のシグナル増幅プロセスおよび最適化した実験条件(65℃の純水)を使用して得られた。
ヒトDNAについて、および実験の項で説明したものと同様な計算およびデータベースを使用して、本発明の方法を、今回は、遺伝的チロシン血症を起こすと報告されているE357X変異[本文中のref 21]に特異的な、もう1つのプローブ配列を使用して試験した。E357X変異に特異的な新しいプローブ、すなわち、TAN 102a:5'-/5Alex546N/AGGAGCCAGAAAACTTCG-3およびTAN 103a:5'-/5Alex546N/AGGAGCCATAAAACTTCG-3が特に設計され、IDT DNA technologies Inc.により合成された。種々の抽出技法を使用して抽出されたヒトゲノムDNAに対する本発明の方法の適用可能性を試験するために、他の広く使用される方法、すなわち、Promegaプロトコルを使用して抽出されたヒトゲノムDNAを選んだ。
図7は、上で説明したのと同じ実験プロトコルを使用して得られた。E357X変異に特異的なTAN102aおよびTAN103aプローブで得られた曲線は、IVSI2変異について得られたもの(図4)と非常に類似している。この場合における高い検出感度は、(IVSI2変異に対して使用した15量体プローブと比較して)長い18量体プローブで操作したときのポリマー発色団ユニットの増加した数に基づく。全体の、増幅していないヒトゲノムDNA中のSNP検出のこのさらなる例は、少数コピーのDNA鎖を、それよりずっと多い非特異的DNA材料の存在下で、選択的かつ特異的に検出する本発明の方法の能力を立証する。
本発明を、その好ましい実施形態によって上で説明したが、それは、付記した請求項で規定した本発明の趣旨、範囲および性質から逸脱することなく改良することができる。
(参考文献)
Figure 0004933458
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図1Aは、ポリマー1の化学構造、ならびに、(a)ポリマー1/X1/Y1三重鎖(完全一致)、(b)ポリマー1/[X1+Alexa Fluor (AF)546]二重鎖、および(c)ポリマー1/X1+AF546/Y1三重鎖(完全一致)の水中における55℃でのUV〜可視吸収スペクトルを例示する図である。図1Bは、(a)ポリマー1/X1/Y1三重鎖(完全一致)、(b)ポリマー1/[X1+AF546]二重鎖、(c)ポリマー1/X1+AF546/Y1三重鎖(完全一致)の水中55℃における、420nmでの励起による蛍光スペクトルを例示する図である。 420nmで励起して55℃の水中572nmで測定し補正した蛍光強度(初期二重鎖に基づくシグナルを差引き後)を、20量体オリゴヌクレオチド標的コピー数の関数として示す図である。(正方形)完全一致、(円形)2つミスマッチ、(三角形)1つミスマッチ。 超高感度、選択的および迅速なDNA検出のための、カチオン性ポリチオフェンのコンホメーション変化およびエネルギー移動に基づく、本発明のシグナル増幅機構の模式的説明を例示する図である。 図4Aは、ゲノムDNAコピー数の関数としての、420nmで励起して572nmで測定した補正蛍光強度(初期二重鎖に基づくシグナル差引き後)を示す図である。(濃い線)TAN101+野生型ゲノムDNA(完全一致)、(薄い線)TAN100+野生型ゲノムDNA(1つミスマッチ)。図4Bは、ゲノムDNAコピー数の関数としての、420nmで励起して572nmで測定した補正蛍光強度(初期二重鎖に基づくシグナル差引き後)を示す図である。(濃い線)TAN101+変異ゲノムDNA(完全一致)、(薄い線)TAN100+変異ゲノムDNA(1つミスマッチ)。 55℃の純水中420nmで励起して、572nmで測定した補正蛍光強度(初期二重鎖に基づくシグナル差引き後)を、20量体オリゴヌクレオチド標的コピー数の関数として示す図である。(濃い線)完全一致、(薄い線)2つミスマッチ。 65℃の純水中420nmで励起して、572nmで測定した補正蛍光強度(初期二重鎖に基づくシグナル差引き後)を、150bpアンプリコン標的コピー数の関数として示す図である。(濃い線)完全一致(C.albicansアンプリコン)、(薄い線)2つミスマッチ(C.dubliniensisアンプリコン)。 65℃の純水中420nmで励起して、572nmで測定した補正蛍光強度(初期二重鎖に基づくシグナル差引き後)を、ゲノムDNAコピー数の関数として示す図である。(濃い線)TAN102a+野生型ゲノムDNA(完全一致)、(薄い線)TAN103a+野生型ゲノムDNA(1つミスマッチ)。

Claims (20)

  1. 蛍光体で標識されたアニオン性オリゴヌクレオチドプローブ、および
    前記プローブと相互作用して、中性二重鎖を形成する水溶性アフィニティクロミック性カチオン性ポリチオフェン
    を含む核酸検出システムであって、
    前記中性二重鎖が、標的ポリヌクレオチドの存在下で吸収スペクトルの変化を示す核酸検出システム。
  2. 蛍光体で標識されたアニオン性オリゴヌクレオチドプローブ、および
    前記プローブと相互作用して、中性二重鎖を形成する、水溶性アフィニティクロミック性カチオン性ポリチオフェン
    を含有する1つまたは複数の容器を含むキットであって、
    前記中性二重鎖が、標的ポリヌクレオチドの存在下で吸収スペクトルの変化を示すキット。
  3. 蛍光体で標識されたアニオン性オリゴヌクレオチドプローブを含み、かつ前記プローブと相互作用して、中性二重鎖を形成するアフィニティクロミック性カチオン性ポリチオフェンを含むバイアルであって、前記中性二重鎖が、標的ポリヌクレオチドの存在下で吸収スペクトルの変化を示すバイアル、または
    蛍光体で標識されたアニオン性オリゴヌクレオチドプローブを含むバイアル、および、前記プローブと相互作用して、中性二重鎖を形成するアフィニティクロミック性カチオン性ポリチオフェンを含むバイアルの同梱であって、前記中性二重鎖が、標的ポリヌクレオチドの存在下で吸収スペクトルの変化を示す同梱
    を含む製品。
  4. 標的ポリヌクレオチドの存在を測定する方法であって、
    蛍光体で標識されたアニオン性オリゴヌクレオチドプローブ、および、前記プローブと相互作用して、中性二重鎖を形成するアフィニティクロミック性カチオン性ポリチオフェンを供給する工程であって、前記中性二重鎖が、標的ポリヌクレオチドの存在下で吸収スペクトルの変化を示す工程、
    標的ポリヌクレオチドを前記中性二重鎖と接触させる工程、ならびに
    前記標的ポリヌクレオチドの前記プローブに対する相補性を定量または分析する目的で、前記標的ポリヌクレオチドの存在下で前記中性二重鎖の吸収スペクトルの変化を測定する工程
    を含む方法。
  5. 複合混合物中の核酸を選択的に測定する核酸検出システムであって、
    蛍光体で標識されたアニオン性オリゴヌクレオチドプローブ、および
    前記プローブと相互作用して、中性二重鎖を形成する水溶性アフィニティクロミック性カチオン性ポリチオフェン
    を含み、前記中性二重鎖が、標的ポリヌクレオチドの存在下で吸収スペクトルの変化を示すシステム。
  6. 1つまたは複数の容器を含む複合混合物中の核酸を選択的に測定するためのキットであって、
    蛍光体で標識されたアニオン性オリゴヌクレオチドプローブ、および
    前記プローブと相互作用して、中性二重鎖を形成する水溶性アフィニティクロミック性カチオン性ポリチオフェン
    を含み、前記中性二重鎖が、標的ポリヌクレオチドの存在下で吸収スペクトルの変化を示すキット。
  7. 複合混合物中の核酸を選択的に測定するための製品であって、
    蛍光体で標識されたアニオン性オリゴヌクレオチドプローブを含み、かつ前記プローブと相互作用して、中性二重鎖を形成するアフィニティクロミック性カチオン性ポリチオフェンを含むバイアルであって、前記中性二重鎖が、標的ポリヌクレオチドの存在下で吸収スペクトルの変化を示すバイアル、または
    蛍光体で標識されたアニオン性オリゴヌクレオチドプローブを含むバイアル、および、前記プローブと相互作用して、中性二重鎖を形成するアフィニティクロミック性カチオン性ポリチオフェンを含むバイアルの同梱であって、前記中性二重鎖が、標的ポリヌクレオチドの存在下で吸収スペクトルの変化を示す同梱
    を含む製品。
  8. 核酸の複合混合物中の標的ポリヌクレオチドの存在を測定する方法であって、
    蛍光体で標識されたアニオン性オリゴヌクレオチドプローブ、および、前記プローブと相互作用して、中性二重鎖を形成するアフィニティクロミック性カチオン性ポリチオフェンを供給する工程であって、前記中性二重鎖が、標的ポリヌクレオチドの存在下で吸収スペクトルの変化を示す工程、
    標的ポリヌクレオチドを前記中性二重鎖と接触させる工程、ならびに
    前記標的ポリヌクレオチドの前記プローブに対する相補性を定量または分析する目的で、前記標的ポリヌクレオチドの存在下で前記中性二重鎖の吸収スペクトルの変化を測定する工程
    を含む方法。
  9. 前記標的ポリヌクレオチドが、ヒトゲノム、細菌源またはウイルス源に由来するか、あるいはアンプリコンである、請求項1または5に記載の核酸検出システム。
  10. 前記標的ポリヌクレオチドが、システムにおける使用に先立って変性される、請求項9に記載の核酸検出システム。
  11. 一塩基多型を同定するための、請求項10に記載の核酸検出システムの使用。
  12. 前記標的ポリヌクレオチドが、ヒトゲノム、細菌源またはウイルス源に由来するか、あるいはアンプリコンである、請求項2または6に記載のキット。
  13. 前記標的ポリヌクレオチドが、システムにおける使用に先立って変性される、請求項12に記載のキット。
  14. 一塩基多型を同定するための、請求項13に記載のキットの使用。
  15. 前記標的ポリヌクレオチドが、ヒトゲノム、細菌源またはウイルス源に由来するか、あるいはアンプリコンである、請求項3または7に記載の製品。
  16. 前記標的ポリヌクレオチドが、システムにおける使用に先立って変性される、請求項15に記載の製品。
  17. 一塩基多型を同定するための、請求項16に記載の製品の使用。
  18. 前記標的ポリヌクレオチドが、ヒトゲノム、細菌源またはウイルス源に由来するか、あるいはアンプリコンである、請求項4または8に記載の方法。
  19. 前記標的ポリヌクレオチドが、方法における使用に先立って変性される、請求項18に記載の方法。
  20. 一塩基多型を同定するための、請求項19に記載の方法の使用。
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