KR102315146B1 - 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물을 이용한 분자진단방법 - Google Patents

핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물을 이용한 분자진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물을 이용한 분자진단방법에 관한 것으로, 구체적으로 핵산을 추출하기 위한 용액으로 Tween 20만을 포함시키고, 중합효소 연쇄반응을 수행하기 위한 PCR 완충용액만을 첨가한 혼합물에 대하여 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써, 별도의 핵산 추출과정 없이 중합효소 연쇄반응을 수행하여 분자진단을 위한 시간을 최소화하며, 추출에 이용되는 전용장치 및 소모품을 최소화함으로써 분자진단의 비용을 절감할 수 있는 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물을 이용한 분자진단방법에 관한 것이다.

Description

핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물을 이용한 분자진단방법{MOLECULAR DIAGNOSTIC METHOD USING LYSIS COMPOUND FOR EXTRACTING NUCLEIC ACIDS}
본 발명은 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물을 이용한 분자진단방법에 관한 것으로, 구체적으로 핵산을 추출하기 위한 용액으로 Tween 20만을 포함시키고, 중합효소 연쇄반응을 수행하기 위한 PCR 완충용액만을 첨가한 혼합물에 대하여 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써, 별도의 핵산 추출과정 없이 중합효소 연쇄반응을 수행하여 분자진단을 위한 시간을 최소화하며, 추출에 이용되는 전용장치 및 소모품을 최소화함으로써 분자진단의 비용을 절감할 수 있는 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물을 이용한 분자진단방법에 관한 것이다.
최근 인간 유전체 연구 결과를 바탕으로 유전자 수준에서 질병의 원인을 해석함에 따라, 인간의 질병을 치유하거나 예방하고자 하는 목적으로 생체 시료의 조작 및 생화학적 분석에 대한 요구가 점차 증가하고 있다. 또한, 질병의 진단 외에도 신약개발, 바이러스나 박테리아 감염 여부의 사전 검사 및 법의학 등의 다양한 분야에서 생체 시료나 세포가 포함된 시료로부터 핵산을 추출, 분석하는 기술이 요구된다.
한편, 분자진단을 하기 위해서는 바이러스나 세균에 감염된 사람의 타액 또는 혈액 등에서 유전자 정보를 담고 있는 DNA 또는 RNA인 핵산을 추출하고 이를 증폭하여 질병의 감염여부를 확인하는 것이 일반적이다.
도 1은 종래기술에 따른 중합효소 연쇄반응을 나타낸 개략도이다. 종래의 경우 검체로부터 유전자 정보를 담고 있는 핵산을 추출(Extraction)하기 위하여 검체 분주를 수행한 후 검체 내에 포함된 핵산을 추출하였다. 핵산을 추출하는 과정에서 약 60분의 시간이 소요되며 이루 핵산을 수집하고 PCR 시약을 혼합하고 분주하여 핵산을 분주하고 이후 PCR 을 수행하였다.이를 통해 핵산을 증폭하여 결과를 분석하는 것이 일반적이다. 상기 핵산을 추출(Extraction)하기 위해서는 용해(Lysis), 정제(Purufication) 및 용리(Elution)하는 과정을 필요로 하였다. 다만, 핵산을 추출하기 위해 수행되는 용해, 정제 및 용리하는 과정에서는 이를 수행하기 위한 전용 추출 장비 및 추출을 위하여 소모되는 용품(플라스틱으로 된 도구, 자성 비드 또는 용액 등)이 필요로 하였다.
상술한 종래기술로 핵산을 추출하는 경우 순도가 높은 핵산을 추출할 수 있지만, 추출하는 과정에서 오랜시간이 소요되어 긴급한 상황이나 응급실에서 진단 또는 검진을 하기 적합하지 못한 문제가 있었으며, 바이러스의 급격한 확산으로 국가 방역이 필요한 상황에 이를 적용하는 것과 추출을 위한 전용기기 및 소모되는 용품을 지속적으로 사용해야 하므로 진단을 위하여 고가의 비용을 지불해야하는 문제점이 있었다.
따라서, 상술한 문제점을 해결하기 위하여 특정한 조성물을 사용함으로써 별도의 핵산 추출과정 없이 중합효소 연쇄반응에서 핵산 추출과 증폭을 동시에 수행할 수 있는 기술에 대한 개발이 시급한 실정이었다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 세포 내의 핵산을 추출하기 위하여 세포를 용해하는 과정에서 특정한 용액을 사용하고 중합효소 연쇄반응에 필요한 조성물을 한번에 혼합하여 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써, 별도의 핵산 추출과정을 생략하고, 중합효소 연쇄반응에서 핵산 추출과 증폭을 구현할 수 있는 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물을 이용한 분자진단방법을 제공하는 것이다.
다만, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시상태는 Tween 20 및 증류수를 포함하는 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물; 핵산을 포함하는 시료; 프리믹스;와 프라이머 및 프로브가 포함된 용액;을 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; 및 상기 혼합물에 대하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 핵산을 추출 및 증폭하는 단계;를 포함하는 분자진단방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시상태에 따른 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물을 이용한 분자진단방법은 별도의 핵산 추출과정을 생략하고 상기 용해된 용액을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써, 핵산의 증폭하여 분자 진단하는 과정에서 소요되는 시간을 최소할 수 있으며, 핵산 추출에 이용되는 전용장치 및 소모품을 최소화함으로써 분자진단의 비용을 절감시킬 수 있다.
본 발명의 효과는 상술한 효과로 한정되는 것은 아니며, 언급되지 아니한 효과들은 본원 명세서 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 종래기술에 따른 중합효소 연쇄반응을 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시상태에 따른 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물을 이용한 분자진단방법의 순서도이다.
도 3은 실험예 1 내지 6에 따른 중합효소 연쇄반응에서 사이클에 따른 형광 값을 나타낸 그래프이다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시상태는 Tween 20 및 증류수를 포함하는 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물; 핵산을 포함하는 시료; 프리믹스;와 프라이머 및 프로브가 포함된 용액;을 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; 및 상기 혼합물에 대하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 핵산을 추출 및 증폭하는 단계;를 포함하는 분자진단방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시상태에 따른 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물을 이용한 분자진단방법은 별도의 핵산 추출과정을 생략하고 상기 용해된 용액을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써, 핵산의 증폭하여 분자 진단하는 과정에서 소요되는 시간을 최소할 수 있으며, 핵산 추출에 이용되는 전용장치 및 소모품을 최소화함으로써 분자진단의 비용을 절감시킬 수 있다.
상기 도 1을 참고하면, 종래기술에 따른 분자진단법은 세포 내 DNA 또는 RNA 등의 핵산을 추출(Extraction)하기 위하여 용해(Lysis), 정제(Purification) 및 용리(Elution)과정을 거치고 용리된 용액에 추가적인 PCR 완충용액(buffer)을 첨가하여 PCR(중합효소 연쇄반응)을 수행한다. 이후 상기 PCR에 의하여 증폭된 핵산을 진단에 이용하는 것이 일반적이었다. 다만, 상기 방법은 용해과정, 정제과정 및 용리과정에 이용되는 전용기기가 요구되며, 상기 과정에서 이용되는 용액 또는 플라스틱 와이어와 같은 다양한 소모품을 지속적으로 사용하여야 하는 문제점이 있었다.
도 2는 본 발명의 일 실시상태에 따른 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물을 이용한 분자진단방법의 순서도이다. 상기 도 2를 참고하면, 본 발명은 세포 용해용 조성물; 핵산을 포함하는 시료; 프리믹스;와 프라이머 및 프로브가 포함된 용액;을 포함하는 혼합물을 제조하는 단계(S11)를 수행한 후 상기 혼합물에 대하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 핵산을 추출 및 증폭하는 단계(S13)을 수행하여 단순한 방법으로 핵산을 추출 및 증폭을 동시에 구현할 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 상기 세포벽 용해 과정에서 이용되는 용액을 특정한 종류로 한정하는 동시에 일반적으로 사용되는 용액을 추가하지 않으며, 단지 상기 Tween 20만을 포함한 세포 용해용 조성물을 이용하고, PCR을 수행하기 위한 PCR 완충용액, 즉, 프리믹스(Premix)와 프라이머(Primer) 및 프로브(Probe)를 추가로 첨가하여 별도의 핵산 추출과정없이 단지 PCR 을 수행함으로써 상기 핵산을 추출 및 증폭하고 이를 분자진단하는 것이 가능하다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물은 Tween 20; 및 증류수;만을 포함하는 혼합물인 것일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 상기 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물은 Tween 20(폴리소르베이트 20); 및 증류수;로 구성된 것일 수 있다. 상술한 것으로부터 상기 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물의 성분을 조절함으로써, 분자진단을 단순화시킬 수 있으며, 핵산 추출과정을 생략하고, PCR에서 핵산 추출과 증폭을 동시에 구현하여 분자진단에 소요되는 시간을 단축시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, Tween 20 및 증류수를 포함하는 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물; 핵산을 포함하는 시료; 프리믹스;와 프라이머 및 프로브가 포함된 용액;을 포함하는 혼합물을 제조하는 단계;를 포함한다. 구체적으로 상기 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물은 Tween 20 및 증류수만을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 프리믹스;와 상기 프라이머 및 프로브가 포함된 용액;은 PCR 완충용액일 수 있다. 상술한 것과 같이 상기 혼합물을 제조하는 단계를 포함함으로써, 별도의 핵산 추출과정없이 PCR 을 수행하여 핵산 추출과 증폭을 동시에 구현할 수 있으며, 이를 통하여 분자진단에 소요되는 시간을 감축시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 혼합물에 대하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 핵산을 추출 및 증폭하는 단계;를 포함한다. 상술한 것과 같이 상기 혼합물에 대하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 핵산을 추출 및 증폭함으로써, 분자진단을 위한 핵산을 확보할 수 있으며, 분자진단을 위해 소요되는 시간을 최소화할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 핵산을 포함하는 시료를 가지고 별도로 핵산을 추출하는 단계를 포함하지 않는다. 상술한 것과 같이 별도의 핵산 추출 단계를 포함하지 않음으로써, 분자진단에 소요되는 시간을 감축시킬 수 있으며, 핵산 추출을 위한 소모품이나 전용장치를 사용하지 않아 비용을 절감시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 Tween 20의 농도는 2.0 vol/vol% 이상 16.0 vol/vol% 미만인 것일 수 있다. 구체적으로 상기 Tween 20의 농도는 2.2 vol/vol% 이상 15.8 vol/vol% 이상, 2.4 vol/vol% 이상 15.6 vol/vol% 이상, 2.6 vol/vol% 이상 15.4 vol/vol% 이상, 2.8 vol/vol% 이상 15.2 vol/vol% 이상, 3.0 vol/vol% 이상 15.0 vol/vol% 이상, 3.2 vol/vol% 이상 14.8 vol/vol% 이상, 3.4 vol/vol% 이상 14.6 vol/vol% 이상, 3.6 vol/vol% 이상 14.4 vol/vol% 이상, 3.8 vol/vol% 이상 14.2 vol/vol% 이상, 4.0 vol/vol% 이상 14.0 vol/vol% 이상, 4.2 vol/vol% 이상 13.8 vol/vol% 이상, 6.0 vol/vol% 이상 12.0 vol/vol% 이상, 7.0 vol/vol% 이상 11.0 vol/vol% 이상, 8.0 vol/vol% 이상 10.0 vol/vol% 이상 또는 8.0 vol/vol% 이상 9.0 vol/vol% 이상일 수 있다. 상술한 범위에서 상기 Tween 20의 농도를 조절함으로써 상기 세포의 용해 효과를 향상시킬 수 있으며, 이를 통하여 별도의 추가과정없이 PCR을 통하여 핵산을 추출 및 증폭시킴으로써 분자진단에 소요되는 시간을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물에 핵산을 분석하기 위한 시료, 즉, 핵산을 포함하는 시료를 첨가함으로써, 시료가 포함된 혼합물의 농도는 변할 수 있다. 구체적으로 상기 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물과 상기 시료를 동일한 부피로 혼합함으로써, 상기 시료가 포함된 혼합물의 상기 계면활성제 농도는 상술한 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물의 농도의 절반으로 감소할 수 있다. 본 명세서 전체에서 “핵산을 포함한 시료”는 세포 내에 DNA 또는 RNA 핵산이 포함된 시료, 세포 내에서 용출된 상태에서 핵산을 포함한 시료 등 시료 내에 핵산을 포함하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 시료와 상기 세포 용해용 조성물의 부피비는 1:0.5 내지 1:2.0인 것일 수 있다. 상술한 범위에서 상기 시료와 상기 세포 용해용 조성물의 부피비를 조절함으로써, 상기 Tween 20의 농도를 조절하여 세포 내의 핵산의 추출을 빠른 시간에 구현할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 프리믹스;와 상기 프라이머 및 프로브가 포함된 용액;의 부피비는 1:1 내지 1:10인 것일 수 있다. 상술한 범위에서 상기 프리믹스와 상기 프라이머 및 프로브가 포함된 용액의 부피를 조절함으로써, 상기 핵산 추출 및 증폭 효과를 극대화하여 분자진단에 소요되는 시간을 감축시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 핵산이 추출된 혼합물과 상기 프리믹스의 부피비는 1:0.5 내지 1:2.0인 것일 수 있다. 상술한 범위에서 상기 핵산이 추출된 혼합물과 상기 프리믹스의 부피를 조절함으로써, 상기 핵산 추출 및 증폭 효과를 극대화하여 분자진단에 소요되는 시간을 감축시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 핵산을 추출 및 증폭하는 단계는 상기 혼합물을 60 ℃ 초과 100 ℃ 이하의 온도에서 수행되는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 핵산을 추출 및 증폭하는 단계는 61 ℃ 이상 99 ℃ 이하, 62 ℃ 이상 98 ℃ 이하, 63 ℃ 이상 97 ℃ 이하, 64 ℃ 이상 96 ℃ 이하, 65 ℃ 이상 95 ℃ 이하, 66 ℃ 이상 94 ℃ 이하, 67 ℃ 이상 93 ℃ 이하, 68 ℃ 이상 92 ℃ 이하, 69 ℃ 이상 91 ℃ 이하 또는 70 ℃ 이상 90 ℃ 이하의 온도에서 사용되는 것일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 50 ℃ 이상 100 ℃ 이하의 온도에서 수행되는 것이 바람직하다. 상술한 범위에서 상기 핵산을 추출 및 증폭하는 단계의 온도를 조절함으로써, 상기 세포의 용해 효과를 향상시킬 수 있으며, 이를 통하여 별도의 핵산 추출 과정없이 PCR을 통하여 핵산을 증폭시킴으로써 분자진단에 소요되는 시간을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 혼합물을 제조하는 단계 이후, 상기 혼합물을 인큐베이터(incubator)에 구비하여 방치하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 상술한 것과 같이 상기 혼합물을 제조하는 단계 이후, 상기 혼합물을 인큐베이터에 구비하여 방치함으로써, 핵산 추출 효과를 향상시킬 수 있다. 본 명세서에 인큐베이터는 내부에 공간이 형성된 장치로 온도, 습도 및 압력 등을 조절할 수 있는 모든 장치를 의미할 수 있으며, 상기 명칭으로 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 인큐베이터에 방치하는 단계는 1 분 이상 10 분 이하 동안 수행되는 것일 수 있다. 상술한 범위에서 상기 혼합물이 인큐베이터에 방치되는 시간을 조절함으로써, 상기 세포의 용해 효과를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 혼합물에 대하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 핵산을 추출 및 증폭하는 단계 이후에, 상기 핵산이 추출 및 증폭된 용액을 분석하는 단계:를 더 포함할 수 있다. 상술한 것과 같이 상기 분석단계를 더 포함함으로써, 핵산의 증폭하여 분자 진단하는 과정에서 소요되는 시간을 최소화하며, 핵산 추출에 이용되는 전용장치 및 소모품을 최소화함으로써 분자진단의 비용을 절감시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 기술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실험예 1
검사대상인 E-coli DH3 의 타겟 유전자인 16S rRNA를 증폭하기 위하여 스핀-컬럼(spin-column) 추출방법으로 상기 유전자를 추출하였다. 구체적으로 상기 검사대상인 E-coli DH3를 채취한 후, 종래의 Qiagen의 추출방식으로 용해과정, 정제과정 및 용리과정을 실시하여 상기 16S rRNA를 추출하였다.
이후, 추출된 혼합물에 intercalating dye(Ssofast pol. EvaGreen, Green)를 첨가하여 2 분간 95 ℃에서 예비 반응을 수행하였다. 이후 10 초간 95 ℃로 유지하고 이후 10 초간 61 ℃로 유지하는 것을 50 사이클 반복하여 타겟 유전자인 16S rRNA를 증폭하였으며, 매 사이클마다 형광 값을 측정하였고, 이 과정에서 상기 핵산을 증폭하여 결과를 확인할 수 있는 최소한의 역치 횟수인 Ct(Threshold Cycle)를 측정하여 하기 표 1에 정리하였다.
실험예 2
검사대상인 E-coli DH3 의 타겟 유전자인 16S rRNA를 증폭하기 위하여 E3 추출방법을 이용하여 상기 유전자를 추출하였다. 보다 구체적으로 E3 추출방법은 핵산 자동화 추출방법이며, 크게 추출시약(E3 NA(Nucleic acid) extraction kit)과 추출장비로 구분할 수 있다. 상기 방법은 산화철 (Iron oxide)로 코팅된 magnetic bead를 이용하여 인체유래 검체에서 핵산(DNA/RNA)을 추출하는 방법이다. Reagent tube에는 4개의 well이 구비되어 있으며, 각각 Lysis Buffer, Washing Buffer, Elution Buffer가 담겨있다. Lysis Buffer와 Washing Buffer 에 함유된 고농도의 Chaotropic salt는 세포막을 파괴하고 단백질로부터 핵산을 분리하며, 이 환경에서 magnetic bead는 음전하의 핵산과 흡착한다. Magnetic bead에 흡착된 핵산은 핵산추출기구(E3 장비)의 magnetic rod에 의해 tube의 각 컬럼에 순차적으로 이동하며 여러 번의 washing 단계를 거친다. 마지막으로 Elution buffer가 magnetic bead에 흡착되었던 핵산을 분리시키고, magnetic rod가 magnetic bead만 제거하여 Elution buffer에 순수한 핵산만 남게 된다. 상술한 방법으로 16S rRNA를 추출하였다.
이후, 추출된 혼합물에 intercalating dye(Ssofast pol. EvaGreen, Green)를 첨가하여 2 분간 95 ℃에서 예비 반응을 수행하였다. 이후 10초간 95 ℃로 유지하고 이루 10초간 61 ℃유지하는 것을 50회 반복하여 타겟 유전자인 16S rRNA를 증폭하였으며, 매 사이클마다 형광 값을 측정하였고, 이 과정에서 상기 핵산을 증폭하여 결과를 확인할 수 있는 최소한의 역치 횟수인 Ct(Threshold Cycle)을 측정하였으며, 상기 실험예 1과의 Ct 차이인 △Ct를 계산하여 하기 표 1에 정리하였다.
실험예 3
검사대상인 E-coli DH3 의 타겟 유전자인 16S rRNA를 증폭하기 위하여 Tween 20와 증류수를 포함하는 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물을 10 vol/vol% 농도인 것으로 준비하고, 상기 조성물에 검사대상을 포함한 시료를 첨가시킴으로써 상기 Tween 20의 농도를 5 vol/vol%으로 조절한 혼합물을 준비하였다. 이후 실온에서 5 분간 인규베이션(incubation)에서 위치시킨 후 상기 혼합물을 15 분간 원심분리기를 이용하여 15,000g로 원심분리하였다.
이후, 추출된 혼합물에 intercalating dye(Ssofast pol. EvaGreen, Green)를 첨가하여 2 분간 95 ℃에서 예비 반응을 수행하였다. 이후 10초간 95 ℃로 유지하고 이루 10 초간 61 ℃유지하는 것을 50회 반복하여 타겟 유전자인 16S rRNA를 증폭하였으며, 매 사이클마다 형광 값을 측정하였고, 이 과정에서 상기 핵산을 증폭하여 결과를 확인할 수 있는 최소한의 역치 횟수인 Ct(Threshold Cycle)을 측정하였으며, 상기 실험예 1과의 Ct 차이인 △Ct를 계산하여 하기 표 1에 정리하였다.
실험예 4
상기 실험예 3에서 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물의 Tween 20 농도를 20 vol/vol%으로 조절한 것과 상기 혼합물에서 상기 Tween 20의 농도가 10 vol/vol%으로 조절한 것을 제외하고 상기 실험예 3과 동일하게 매 사이클마다 형광 값 및 Ct(Threshold Cycle)을 측정하였으며, 상기 실험예 1과의 Ct 차이인 △Ct를 계산하여 하기 표 1에 정리하였다.
실험예 5
상기 실험예 3에서 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물을 Tween 20 대신 Triton X-100을 사용한 것을 제외하고 상기 실험예 3과 동일하게 매 사이클마다 형광 값 및 Ct(Threshold Cycle)을 측정하였으며, 상기 실험예 1과의 Ct 차이인 △Ct를 계산하여 하기 표 1에 정리하였다.
실험예 6
상기 실험예 4에서 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물을 Tween 20 대신 Triton X-100을 사용한 것을 제외하고 상기 실험예 4와 동일하게 매 사이클마다 형광 값 및 Ct(Threshold Cycle)을 측정하였으며, 상기 실험예 1과의 Ct 차이인 △Ct를 계산하여 하기 표 1에 정리하였다.
구분 Ct(회) △Ct(회)
실험예 1 17.5 -
실험예 2 23.5 6.0
실험예 3 29.2 11.7
실험예 4 32.8 15.3
실험예 5 50.0 이상 32.5 이상
실험예 6 44.4 26.9
도 3은 실험예 1 내지 6에 따른 중합효소 연쇄반응에서 사이클에 따른 형광 값을 나타낸 그래프이다. 상기 도 3 및 표 1을 참고하면, 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물로 농도가 10 vol/vol%인 Tween 20을 사용한 실험예 3은 종래에 핵산 추출 방법인 실험예 1 및 2와 유사한 수준에 해당함을 확인하였다. 다만, 실험예 3은 핵산 추출과정에서 정제과정 및 용리과정을 수행하지 않으므로 실험예1 및 2에 비하여 분자진단을 위하여 소요되는 시간이 적은 것을 확인하였다.
이에 비하여 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물로 Triton X-100을 사용한 실험예 5 및 6은 동일한 시간 내에 세포벽이 용해되는 시간이 늦어 동일한 형광 값(RFU)에서 Ct 값이 증가하는 것을 확인하였다.
나아가, Tween 20을 사용하였으나 농도가 20 vol/vol%인 실험예 4는 농도가 10 vol/vol%인 실험예 3에 비하여 동일한 형광 값(RFU)를 갖기 위하여 Ct 값이 증가하는 것을 확인하였다.
상기 실험예 1 내지 3을 통하여 세포 내 핵산을 추출하기 위한 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물로 Tween 20이 적합함을 확인하였다.
이하에서는 종래의 분자진단방법과 본 발명의 일 실시상태에 따른 분자진단방법의 효과를 비교하였다.
비교예 1
검사대상인 M. tuberculosis, M. avium 및 M. intracellulare에 포함된 유전자 를 증폭하기 위하여 스핀-컬럼(spin-column) 추출방법으로 상기 유전자를 추출하였다. 구체적으로 상기 검사대상인 M. tuberculosis, M. avium 및 M. intracellulare를 채취한 후, 종래의 Qiagen의 추출방식으로 용해과정, 정제과정 및 용리과정을 모두 실시하여 상기 유전자를 추출하였다.
이후, 추출된 혼합물 16 μl에 M. tuberculosis와 NTM(비결핵 항상균; M. avium 및 M. intracellulare 포함)을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머/프로브 혼합액 4μl과 Taq polymerase premix(RealhelixTM qPCR Kit, 나노헬릭스, 한국) 20μl를 첨가하여 5 분간 95 ℃에서 예비 반응을 수행하였다. 이후 10 초간 95 ℃로 유지하고 이후 40 초간 60 ℃로 유지하는 것을 40 사이클 반복하여 유전자를 증폭하였으며, 이 과정에서 상기 핵산을 증폭하여 결과를 확인할 수 있는 최소한의 역치 횟수인 Ct(Threshold Cycle)를 측정하여 하기 표 2에 정리하였다.
비교예 2
검사대상인 M. tuberculosis, M. avium 및 M. intracellulare에 포함된 유전자를 증폭하기 위하여 5.0 vol/vol%의 농도가 되도록 Tween 20의 부피와 증류수의 부피를 계량하여 혼합함으로써 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물을 제조하고, 이후 세포가 포함된 시료 20 μl와 상기 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물 20 μl를 혼합하여 Tween 20의 농도가 2.5 vol/vol%가 되도록 시료가 포함된 혼합물(detegent)을 제조하고 90 ℃ 조건에서 상기 세포를 5분간 용해시켜 세포 내에 포함된 핵산을 추출하였다.
이후, 추출된 혼합물 16 μl에 M. tuberculosis와 NTM(비결핵 항상균; M. avium 및 M. intracellulare 포함)을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머/프로브 혼합액 4 μl과 Taq polymerase premix(RealhelixTM qPCR Kit, 나노헬릭스, 한국) 20 μl를 첨가하여 5 분간 95 ℃에서 예비 반응을 수행하였다. 이후 10초간 95 ℃로 유지하고 이루 40 초간 60 ℃로 유지하는 것을 40회 반복하여 타겟 유전자인 IS6110과 ITS region을 증폭하였으며, 매 사이클마다 형광 값을 측정하였고, 이 과정에서 상기 핵산을 증폭하여 결과를 확인할 수 있는 최소한의 역치 횟수인 Ct(Threshold Cycle)을 측정하였으며, 상기 실험예 1과의 Ct 차이인 △Ct를 계산하여 하기 표 2에 정리하였다.
실시예 1
검사대상인 M. tuberculosis, M. avium 및 M. intracellulare에 포함된 유전자를 증폭하기 위하여 12.5 vol/vol%의 농도가 되도록 Tween 20의 부피와 증류수의 부피를 계량하여 혼합함으로써 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물을 제조하고, 이후 세포가 포함된 시료 20 μl와 상기 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물 20 μl를 혼합하여 Tween 20의 농도가 6.25 vol/vol%가 되도록 시료가 포함된 혼합물을 제조하였다(이후 아래의 PCR 반응액 총액 40ul에서 Tween 20의 최종 농도가 2.5 vol/vol%가 되도록 하기 위하여 농도를 조절하였다).
이후 상기 혼합물 16 μl 에 Taq polymerase premix(RealhelixTM qPCR Kit, 나노헬릭스, 한국)20 μl 및 M. tuberculosis와 NTM(비결핵 항상균; M. avium 및 M. intracellulare 포함)을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머와 프로브가 포함된 용액 4μl를 혼합하고 를 첨가하여 5 분간 95 ℃에서 예비 반응을 수행하였다. 이후 10 초간 95 ℃로 유지하고 이후 40 초간 60 ℃로 유지하는 것을 40 사이클 반복하여 유전자를 증폭하였으며, 이 과정에서 상기 핵산을 증폭하여 결과를 확인할 수 있는 최소한의 역치 횟수인 Ct(Threshold Cycle)를 측정하여 하기 표 2에 정리하였다.
검사대상 비교예 1
[단위:Ct]		 비교예 2
[단위:Ct]		 실시예 1
[단위:Ct]
M. tuberculosis 32.13 33.89 32.53
M. avium 32.83 32.02 30.44
M. intracellulare 29.98 28.87 30.40
나아가, 상기 표 1에서 확인된 각 검사대상에 대하여 비교예 1, 비교예 2 및 실시예 1의 Ct의 차인 △Ct를 구하여 하기 표 3에 정리하였다.
검사대상 △Ct(비교예1-비교예2)
[단위: Ct]		 △Ct(비교예 2-실시예1)
[단위: Ct]		 △Ct(비교예 1-실시예1)
[단위: Ct]
M. tuberculosis -1.76 1.36 -0.40
M. avium 0.81 1.58 2.39
M. intracellulare 1.11 -1.53 -0.42
평균 0.05 0.47 0.52
상기 표 2 및 표 3을 참고하면, 종래의 Qiagen의 스핀-컬럼(spin-column) 추출방법으로 핵산을 추출하고 PCR 을 수행하여 핵산을 증폭시킨 비교예 1과 본 발명의 일 실시상태인 실시예 1과는 평균적으로 0.52 Ct 차이가 나는 것을 확인하였으며, Tween 20만을 포함한 세포 용해용 조성물을 이용하여 핵산을 추출하고, 이후 PCR을 수행하여 핵산을 증폭한 비교예 2와 본 발명의 일 실시상태인 실시예 1과는 평균적으로 0.47 Ct 차이가 나는 것을 확인하였다.
결국 본 발명의 일 실시상태에 따른 실시예 1은 종래 기술인 비교예 1 및 비교예 2와 유사하거나 더 우수한 수준의 Ct 값을 나타내지만, 핵산을 추출하는 과정이 없으므로 종래기술에 비하여 분자진단에 소요되는 시간이 감축되었음을 확인하였으며, 소모품이 사용되지 않아 분자진단에 소요되는 비용이 절감됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 일 실시상태에 따른 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물을 이용한 분자진단방법은 핵산을 추출하기 위한 용액으로 Tween 20만을 포함시키고 중합효소 연쇄반응에 필요한 조성물을 한번에 혼합하여 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써, 별도의 핵산 추출과정을 생략하고, 중합효소 연쇄반응에서 핵산 추출과 증폭을 구현할 수 있다.
이상에서 본 발명은 비록 한정된 실시예에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허청구범위의 균등범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.
S11: 혼합물 제조 단계
S13: 핵산 추출 및 증폭 단계

Claims (8)

  1. Tween 20 및 증류수를 포함하는 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물; 핵산을 포함하는 시료; 프리믹스;와 프라이머 및 프로브가 포함된 용액;을 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; 및
    상기 혼합물에 대하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 핵산을 추출 및 증폭하는 단계;를 포함하며,
    상기 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물에서 상기 Tween 20의 농도는 10.0 vol/vol% 이상 12.5 vol/vol% 이하인 것인 분자진단방법.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 시료와 상기 세포 용해용 조성물의 부피비는 1:0.5 내지 1:2.0인 것인 분자진단방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 프리믹스;와 상기 프라이머 및 프로브가 포함된 용액;의 부피비는 1:1 내지 1:10인 것인 분자진단방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 핵산이 추출된 혼합물;과 상기 프리믹스;의 부피비는 1:0.5 내지 1:2.0인 것인 분자진단방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 핵산을 추출 및 증폭하는 단계는 60 ℃ 초과 100 ℃ 이하의 온도에서 수행되는 것인 분자진단방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 혼합물을 제조하는 단계 이후,
    상기 혼합물을 인큐베이터에 구비하여 방치하는 단계;를 더 포함하는 분자진단방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 인큐베이터에 방치하는 단계는 1 분 이상 10 분 이하 동안 수행되는 것인 분자진단방법.
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