KR102286565B1 - 소변에서 결핵균 trDNA 추출용 올리고머 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는 소변에서 결핵균의 trDNA를 특이적으로 추출하기 위한 비오틴이 결합된 올리고뉴클레오티드로 이루어진 올리고머, 이 올리고머를 포함하는 소변에서 결핵균 trDNA 추출용 키트, 및 이 올리고머 또는 키트를 이용하는 소변에서 결핵균 trDNA를 특이적으로 추출하는 방법이 개시된다.
본 발명에 따른 올리고머를 이용하면 소변시료에서 결핵균 trDNA를 특이적이면서 고농도로 추출할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 올리고머는 민감도가 높아 소변 시료 내에 존재하는 매우 낮은 농도의 결핵균 trDNA까지도 특이적이고 고농도로 추출하고 할 수 있어서, 결핵균 핵산증폭검사를 위한 양질의 고농도의 주형 DNA를 제공할 수 있다. 결과적으로 본 발명에 따른 올리고머를 사용시, 결핵 감염 초기의 정확한 진단이 가능하도록 정보를 제공할 수 있으며, 결핵의 약물 치료의 모니터링을 통한 결핵균의 약물 내성 확인 및 치료 효과 확인에도 활용성이 높다.

Description

소변에서 결핵균 trDNA 추출용 올리고머 {Oligomer for extracting trDNA of Mycobacterium tuberculosis in urine sample}

본 발명은 소변에서 결핵균 trDNA 추출용 올리고머에 관한 것으로, 더 상세하게는 소변에서 결핵균의 trDNA를 특이적으로 추출하기 위한 비오틴이 결합된 올리고뉴클레오티드로 이루어진 올리고머, 이 올리고머를 포함하는 소변에서 결핵균 trDNA 추출용 키트, 및 이 올리고머 또는 키트를 이용하는 소변에서 결핵균 trDNA를 특이적으로 추출하는 방법에 관한 것이다.

전 세계적으로 결핵은 한 해 870만 명의 신환이 발생하고, 140만명이 사망하는 중요한 질병이다. 특히 우리나라는 결핵 발생률이 인구 10만명 당 80명으로 OECD 국가 중 단위 인구 당 결핵발생률이 가장 높은 국가로 결핵의 조기 진단 및 치료는 국가적으로도 매우 중요하다 (등록특허 10-1568736호).

결핵 진단을 위해서는 임상양상 및 흉부엑스레이에 더불어, 항산균 도말검사, 결핵균 핵산증폭검사, 항산균 배양검사 등 다양한 방법이 있다. 도말검사의 경우 민감도가 25~80% 정도로 낮고, 배양검사의 경우 2~4주간의 시간이 걸리는 등 실제 임상에서 결핵 확진이 쉽지 않은 경우가 종종 발생한다. 최근 PCR 기기의 발달로 결핵균 핵산증폭검사가 유용성이 증가하고 있는데, 이 경우 시료에서 PCR의 주형 DNA로 사용될 결핵균 DNA를 특이적으로 고농도로 추출하는 것이 요구되고 있다.

결핵의 치료 모니터링을 위한 방법으로는 도말검사의 음전여부, 배양검사에서 균 검출여부, 흉부 방사선사진의 호전 여부 등이 이용되지만, 도말검사가 처음부터 음성이었던 경우, 흉부 방사선 사진의 호전이 애매한 경우 등 다양한 임상적 상황에서 치료 모니터링이 쉽지 않은 경우가 있다.

결핵의 치료에서 다제내성결핵 환자를 빠르게 찾아내는 것 또한 중요한 부분이다. 이를 위해서 신속내성 검사를 시행하고, 균 배양결과를 통해서 약제감수성 검사를 시행하지만, 신속내성 검사의 경우 모든 다재내성결핵 균주를 찾아낼 수 없으며, 결핵균 배양을 이용하는 약제감수성 검사의 경우 추가로 2~4주의 시간이 소요된다. 그러므로 결핵치료 초기에 치료 반응에 대한 정량적 모니터링이 가능하다면, 그 정량 값이 줄어들지 않을 경우, 다제내성 균주의 빠른 발견에 도움이 될 수 있다.

Tr-DNA(Transrenal DNA; trDNA)는 비교적 최근에 발견된, 몸 전체에 걸쳐 죽어가는 세포에서 유래한 세포외(extracellular) 소변 DNA(urinary DNA)의 한 부류이다. 세포사멸 DNA(Post-apoptotic DNA)는 순환혈장(circulating plasma)에서 관찰되는 것으로 알려져 있지만, DNA 조각들의 일부는 신장장벽(kidney barrier)을 넘어서 90~200bp 크기의 파편 형태로 소변에서 검출되고 있다.

태아의 염기서열을 포함한 trDNA가 임신한 여성의 소변에서 분리되고, 종양 관련 돌연변이(tumor-specific mutations)들이 대장과 췌장암 환자들을 비롯한 여러 암환자의 소변에서 발견되고 있으며, 장기이식 기증자의 DNA가 이식받은 수여자의 소변에서 trDNA가 발견되고 있다. 게다가, 프로바이럴(proviral) HIV DNA, 박테리아와 기생충 DNA 등이 이들에 감염된 환자의 소변에서 trDNA로 검출되고 있다. 따라서 trDNA를 기반 분석의 잠재적 적용범위는 태아의 유전질환 검사, 종양검사, 치료경과 모니터링, 감염성 물질 검출 등 분자진단과 유전검사 분야에서 폭넓게 활용될 수 있을 것으로 기대되고 있다.

이에 본 발명자들은 종래 기술에서의 요구에 부응하기 위해 지속적으로 연구한 결과, 소변에서 결핵균의 trDNA의 존재를 확인하고, 이 trDNA를 특이적으로 추출할 수 있는 비오틴이 결합된 올리고뉴클레오티드(올리고머)를 설계하였고 이들을 이용할 경우, 놀랍게도 소변에서 아주 극소량으로 존재하는 trDNA 만을 고농도로 추출할 수 있어서, 결과적으로 추출된 trDNA를 주형으로 하여 핵산증폭검사를 통하여 결핵을 신속하고 높은 특이도와 민감도로 정확하게 진단할 수 있고, 소변 시료를 이용하여 환자-편이성도 높다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 소변에서 결핵균 trDNA 추출용 올리고머 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 올리고머 조성물을 포함하는, 소변에서 결핵균 trDNA 추출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 올리고머 조성물 또는 키트를 이용하는 소변에서 결핵균 trDNA를 특이적으로 추출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소변에서 결핵균 trDNA 추출용 올리고머 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 결핵균 trDNA는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 IS6110 유전자 염기서열 (서열번호 1)에서 2075번째부터 2173번째까지의 99 bp의 염기서열(서열번호 2)을 포함하는 99~200 bp 크기의 DNA로서, 결핵환자의 소변에서 발견된다.

본 발명자들은 결핵환자의 소변에서 상기 결핵균 trDNA가 존재한다는 것을 최초로 확인하였다.

본 발명에서, 용어 '올리고머'는 비오틴이 5' 말단에 결합된 단일가닥의 올리고뉴클레오티드로서, 추출 대상의 trDNA의 이중가닥 중 어느 하나의 가닥의 DNA에 상보적으로 결합하여 추출할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 올리고머는 30 내지 40 bp의 염기서열을 포함하고, 보다 바람직하게는 30 내지 35 bp의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서 올리고머의 올리고뉴클레오티드는, 서열번호 1에서 2075번째부터 2173번째까지의 99 bp의 염기서열로 이루어진 결핵균 trDNA를 온전히 추출할 수 있도록, 상기 결핵균 trDNA의 각 말단 부위의 연속되는 염기서열에 동일하거나 상보적인 염기서열을 포함하는 30 내지 40 bp의 염기서열로 이루어지는 것이 바람직하다.

구체적으로는 올리고머는 서열번호 1의 2065번째부터 2109번째까지의 염기서열에서 연속되는 30 내지 40 bp의 염기서열과 동일한 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다 (정방향 올리고머).

또한 올리고머는 서열번호 1에서 2183번째부터 2139번째까지의 염기서열에서 연속되는 30 내지 40 bp의 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다 (역방향 올리고머).

가장 바람직하게는 본 발명에서 올리고머는, 서열번호 3의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 (정방향 올리고머), 또는 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 (역방향 올리고머)를 포함할 수 있다 (표 1 참조).

본 발명에서 올리고머는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 비오틴이 결합되어 있다(biotinylated).

비오틴의 결합은 당업계의 통상의 방식으로 수행할 수 있다. 비오틴은 올리고뉴클레오티드에 직접 결합되거나 링커를 통하여 결합될 수 있다.

본 발명에서 올리고머는 비오틴이 결합된 올리고뉴클레오티드로 구성되어서 마그네틱 비드 상에 고착된 스트렙토아비딘 (또는 아비딘)과 특이적으로 결합함으로써 결과물에서 비오틴이 결합된 DNA만을 선택적으로 포집할 수 있다.

서열번호 3의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하고 비오틴이 결합된 올리고머 (정방향 올리고머) 및 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하고 비오틴이 결합된 올리고머 (역방향 올리고머)는 본 발명자들이 발견한 상기 결핵균 trDNA의 염기서열을 기초하여 합성한 것으로 (도 1), 소변 시료에서 결핵균 trDNA를 특이적이고 고농도로 추출할 수 있다 (도 2, 도 3, 도 6 참조).

본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 상기 올리고머 조성물을 포함하는, 소변에서 결핵균 trDNA 추출용 키트를 제공한다.

본 발명에서 키트는 본 발명의 올리고머 조성물 외에, 상기 결핵균 trDNA를 특이적으로 핵산증폭할 수 있는 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는 프라이머 세트는 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머들이다.

또한 본 발명에서 키트는 본 발명의 올리고머 조성물 외에, 스트렙토아비딘 (또는 아비딘)이 고착된 마그네틱 비드, 세척용 완충용액, 사용설명서 등을 추가적으로 포함할 수 있다. 또한 액상 또는 건조 타입으로 제공될 수 있고, 반응에 영향이 없는 경우에 한하여 목적에 따라 추가적인 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 본 발명은

i) 개체의 소변 시료를 히팅 블록으로 처리하는 단계;

ii) 상기 올리고머 조성물을 첨가하고 실온에서 반응시키는 단계;

iii) 스트렙토아비딘 또는 아비딘이 고착된 마그네틱 비드를 첨가하여 실온에서 반응시키는 단계; 및

iv) 마그네틱 스탠드를 사용하여 캡처하여 세척한 후 용리시키는 단계를 포함하는 소변에서 결핵균 trDNA를 특이적으로 추출하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 '개체'는 결핵 환자 또는 결핵이 의심되는 인간을 의미한다.

단계 i)에서 소변 시료의 히팅 블록 처리는 92℃에서 10분 인큐베이션 후 65℃에서 1분 인큐베이션하는 것이 바람직하다.

단계 ii)에서 올리고머는 상기에서 정의된 바와 같다.

본 발명에서 결핵균 trDNA의 추출 방법에 의하면, 통상의 DNA 추출방법에 비하여 평균 약13배 이상의 고농도이면서 특이적으로 결핵균 trDNA를 추출할 수 있다 (도 2 내지 6 참조).

본 발명에 따른 올리고머를 이용하면 소변시료에서 결핵균 trDNA를 특이적이면서 고농도로 추출할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 올리고머는 민감도가 높아 소변 시료 내에 존재하는 매우 낮은 농도의 결핵균 trDNA까지도 특이적이고 고농도로 추출하고 할 수 있어서, 결핵균 핵산증폭검사를 위한 양질의 고농도의 주형 DNA를 제공할 수 있다. 결과적으로 본 발명에 따른 올리고머를 사용시, 결핵 감염 초기의 정확한 진단이 가능하도록 정보를 제공할 수 있으며, 결핵의 약물 치료의 모니터링을 통한 결핵균의 약물 내성 확인 및 치료 효과 확인에도 활용성이 높다.

또한 본 발명의 올리머고를 이용하는 방법은 소변에 존재하는 trDNA를 기반으로 하여 비침습성으로 환자 편이성이 우수하며, 별도의 시료에 대한 사전 처리가 필요없어 간편하고 활용성이 높다.

도 1은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 IS6110 유전자 염기서열과 이 중에서 2075번째부터 2173번째까지의 99bp 크기의 trDNA의 위치 (형광펜으로 하일라이트)와 본 발명에 따른 올리고머 부위의 일례(붉은색)를 표시한 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 올리고머를 사용하여 추출한 결핵균 trDNA의 농도를 드롭렛 디지털 PCR로 증폭한 후 QuantaSoft 분석프로그램으로 분석한 결과 그래프이다. 분홍색 임계값(Threshold Value) 선을 기준으로 위쪽에 있는 파란 점들은 양성 드롭렛을 나타내고 아래쪽의 회색들은 음성 드롭렛을 나타낸다. x축은 형광진폭을 나타내고, y축의 번호는 소변 시료 번호이다.
도 3은 도 2의 결과로부터 QuantaSoft 프로그램을 사용하여 웰에 대한 농도 및 포아송 신뢰구간을 계산한 결과를 나타낸 그래프이다. x축의 농도(copies/㎕)는 각 소변 시료에서 결핵균 trDNA의 농도 값을 나타내고, 오차막대는 각 값에 대한 포아송 95% 신뢰구간을 나타낸다.
도 4는 종래 자동화 추출장비를 사용하여 추출한 결핵균 trDNA의 농도를 드롭렛 디지털 PCR로 증폭한 후 QuantaSoft 분석프로그램으로 분석한 결과 그래프이다. 분홍색 임계값(Threshold Value) 선을 기준으로 위쪽에 있는 파란 점들은 양성 드롭렛을 나타내고 아래쪽의 회색들은 음성 드롭렛을 나타낸다. x축은 형광진폭을 나타내고, y축의 번호는 소변 시료 번호이다.
도 5는 도 4의 결과로부터 QuantaSoft 프로그램을 사용하여 웰에 대한 농도 및 포아송 신뢰구간을 계산한 결과를 나타낸 그래프이다. x축의 농도(copies/㎕)는 각 소변 시료에서 결핵균 trDNA의 농도 값을 나타내고, 오차막대는 각 값에 대한 포아송 95% 신뢰구간을 나타낸다.
도 6은 도 3과 도 5의 결과를 종합하여 비교한 그래프이다 (우측 - 본 발명의 올리고머 사용한 경우; 죄측 - 종래 자동화 추출장비를 사용한 경우).

다음의 실시예들에 의해 본 발명이 더 상세히 설명된다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되어서는 안된다.

실시예 1. 올리고머 설계 및 제작

본 발명자들이 최초로 발견한 결핵균 trDNA에 기초로 하여 표 1에 나타낸 바와 같은 5’말단에 비오틴이 결합된 정방향 올리고머와 역방향 올리고머를 각각 외부기관((주)바이오니아)에 의뢰하여 합성하였다.

구체적으로는 정방향 올리고머와 역방향 올리고머가 포함하는 올리고뉴클레오티는 각각 서열번호 1의 염기서열에서 2071번째부터 2105번째까지의 염기서열과 동일한 염기서열, 및 서열번호 1의 염기서열에서 2178번째부터 2144번째까지의 염기서열에 상보적인 염기서열을 기초하여 합성하였다.

올리고뉴클레오티드 서열번호	Forward oligomer (정방향 올리고머)
3	5‘-비오틴-GCGTTCGCCCTTCGCAATTCGGCGTTGTCCCGCCG-3’
	Reverse oligomer (역방향 올리고머)
4	5‘-비오틴-GCGCCAGGCGCAGGTCGATGCCGGCGCACGGCCCG-3’

실시예 2. 프라이머 설계 및 제작

추출된 결핵균 trDNA에 대한 PCR 증폭 시험을 위하여, 표 2와 같이, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 설계하여 합성하였다.

구체적으로는 정방향 프라이머는 서열번호 1의 염기서열에서 2073번째부터 2086번째까지의 염기서열에 기초하여, 그리고 역방향 프라이머는 서열번호 1의 염기서열에서 2156번째부터 2169번째까지의 염기서열에 기초하여, Tm 값은 52.5℃ 내지 56.3℃가 되도록 각각 염기서열을 선택하여 합성하였다.

서열번호	Forward Primer(정방향)	서열번호	Reverse Primer(역방향)
5	GTTCGCCCTTCGCA	6	GCAGGTCGATGCCG

참고예. 소변시료

국립마산병원의 결핵환자 19명으로부터 오전 8시에 각각 수집한 소변(Urine) 20ml에 Cell-Free DNA urine preserve (streck) 2.5ml을 첨가하여 최대 1주일 동안 -4 ℃ 냉장고에 저장한 후 하기 trDNA 추출 시료로 사용했다.

실시예 3. 본 발명에 따른 올리고머를 이용한 소변에서 결핵균 trDNA 추출

참고예에서 준비한 각각의 소변시료 5ml과 ddH2O 5ml을 15ml 튜브에서 잘 혼합한 후, 히팅 블록으로 92℃에서 10분 인큐베이션 하고 65℃에서 1분 인큐베이션하였다. 257㎕ 20X SSC 버퍼(Saline-Sodium Citrate buffer, Sigma)와 실시예 1에서 제조된 표 1의 정방향 올리고머와 역방향 올리고머를 각각 7㎕ (50pmol/㎕)를 첨가한 후, 실온에서 15분 쉐이커를 이용해 천천히 혼합하여 반응시켰다.

스트렙타비딘이 고착된 비드(Streptavidin MagneSphere^ⓡ Paramagnetic Particles; SA-PMP, promega, USA)를 사용설명서에 따라서 세척한 후, 상기에서 올리고머와 반응시킨 소변시료 각각에 50㎕씩를 넣어준 뒤, 실온에서 15분간 쉐이커를 이용해 1~2분마다 천천히 섞어주며 인큐베이션한 후, 마그네틱 스탠드를 사용하여 결핵균 trDNA와 결합된 올리고머를 포집하였다.

상층액을 주의깊게 제거한 후 100~500㎕의 잔여물을 0.1X SSC 500㎕으로 부드럽게 세척한 후 동일한 세척 과정을 추가 4번 반복하였다. 상층액을 모두 제거 한 뒤, 뉴클레아제-프리 ddH2O 40㎕를 첨가하여 2분간 강력하게 볼텍싱한 후, 마그네틱 스탠드로 SA-PMP를 포집하고 용리된 결핵균 trDNA를 함유하는 상층액을 새로운 튜브로 옮겨서 추출을 완료하였다.

실시예 4. 자동화추출 장비를 이용한 소변에서 trDNA 추출

비교를 위하여, 각각의 소변시료에서 종래 기술에서와 같이 Apintech MX-8L 핵산자동추출기 및 Apintech 핵산자동추출키트를 사용하여 trDNA를 추출하였다.

구체적으로는 라이시스 용기(Lysis container)에 각각의 소변시료를 최대 8ml 첨가하고, 동일한 양의 cfDNA 결합 완충액를 첨가하였다. anti-foam 2㎕와 Proteinase K 120㎕를 추가로 첨가하였다. Catridge #8 웰에 bore를 첨가하고, 용리 튜브(Elution tube)에 40~100㎕ 용리 완충액(elution buffer)를 첨가하였다. 상기 추출기에 소변시료와 bore가 들어간 카트리지와 용리 튜브를 장착한 후, LCD화면에서 RUN → DNA → cfDNA를 순차적으로 선택하고, 시료의 수와 볼륨을 입력하고 프로토콜 실행을 완료후, 추출기에서 용리 튜브를 빼낸 다음, 최고속도(12,000rpm 이상)로 3분간 원심분리한 후 마그네틱 비드가 딸려오지 않도록 상등액을 조심스럽게 새 튜브로 옮겨서 추출을 완료하였다.

시험예 1. 드롭렛 디지털 PCR에 의한 유전자 증폭 시험

실시예 3 및 실시예 4에서 각각 추출한 trDNA, 및 대조군으로서 DNA가 없는 공시료를 각각 주형으로 하고, 실시예 2에서 제작된 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트와 ddPCR supermix (No UTP)(Bio-Rad, USA)를 혼합하여 QX200 Droplet Generator로 드롭렛을 생성한 후 C1000 Touch Thermal Cycler(QX200™ Droplet Digital™ PCR, Bio-Rad, 미국)를 사용하여 드롭렛 디지털 중합효소 연쇄반응을 진행하였다.

반응조건은 95℃에서 10분간 변성 후, 94℃에서 30초, 60℃에서 1분씩 40 사이클, 98℃에서 10분을 반응시켰다. QuantaSoft™ 분석 프로그램(QX200 Droplet Reader and Quanta Soft)를 사용하여 반응이 끝난 드롭렛의 형광값을 읽고 서열번호 2의 결핵균 trDNA에 대한 증폭값을 일차원산점도(one-dimensional scatter plot)으로 분석하였고, 그 결과를 각각 도 2 및 도 4에 나타냈다.

또한 QuantaSoft™ 분석 프로그램를 사용하여 각각의 웰(동일 샘플로 2번 반복한 실험값을 merged하여 계산)에 대한 결핵균 trDNA 농도 및 포아송신뢰 구간을 계산하여 그 결과를 각각 도 3 및 도 5에 나타냈다.

또한 도 3과 도 5의 결과를 종합하여 추출된 결핵균 trDNA 농도의 분포도를 비교하여 도 6에 나타냈다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 올리고머를 사용하여 소변에서 결핵균 trDNA를 추출한 경우, 19개의 소변시료의 대부분에서 임계값을 훨씬 넘는 형광 진폭을 나타내어 모두 안정적으로 증폭될 정도로 주형인 결핵균 trDNA의 농도가 높다는 것을 알 수 있다. 또한 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 올리고머를 사용한 경우, 추출된 결핵균 trDNA의 농도는 최대 41.3 copies/㎕였으며 평균 약13 copies/㎕ 이상의 고농도임을 확인할 수 있다.

이에 비하여 도 4에 나타낸 바와 같이, 종래 자동화 추출장비를 사용하여 추출한 경우, 19개의 소변시료의 대부분에서 임계값 보다 낮은 형광진폭을 나타내어 주형인 결핵균 trDNA의 농도가 낮다는 것을 알 수 있다. 또한 도 5에 나타낸 바와 같이, 종래 자동화 추출장비를 사용하여 추출한 경우, 추출된 결핵균 trDNA의 농도는 최대 6.3 copies/㎕였으며 평균 약1.4 copies/㎕ 이하로 농도가 낮음을 확인할 수 있다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 올리고머를 사용하여 추출한 경우와 종래 자동화 추출장비를 사용하여 추출한 경우의추 출된 결핵균 trDNA 농도의 분포도를 비교해 보면, 본 발명에 따른 올리고머를 사용한 경우가 종래에 비하여 약 13배 이상 증진됨을 확인할 수 있다.

<110> Masan National Tuberculosis Hospital <120> Oligomer for extracting trDNA of Mycobacterium tuberculosis in urine sample and uses thereof <130> p10391 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2645 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 1 gtggtttcct gcgtgggcat gatctgtgga tcaggaaccc gatacgggat tccacggttt 60 atcgtgccca gcgccgcgtt gggcacgcac tgcggcaccg ttgatagcgc gtgcagcccg 120 ggataatcca ggttgggcca tgatgagttg ggcgggacag cgaagttgaa cgttgacgtc 180 atgtcgccgg tcacactgcg ccgccaagcc gtgaggttgg gaactggcac cccgaaccga 240 gtttcgagca atctcagctg tgaggtgtgg tcaaacgtgt cgtgaaccat ctgcgggcca 300 cggctgtacg gcgaaatgac gaagcaggga acgcgaaagc ccaaaccgat cggcccgcgt 360 attccgccgg agcccggcac ctgatcgatg tcaggcaccg tgacatattc gccgggagtc 420 ccggccggcg cggtagcagg aacaacgtgg tcgaaaaagc cgccgttttc gtcgtagctg 480 acgatcagcg ccgtcttttc ccacaccgca ggattggcaa gcaatattct taagatgttg 540 acgattgcga aagccccggc cgcggctgga accgcaggat gttcggattc gagaacattg 600 ggaatcaccc aggagacccg cggcagtcta ttggctaaga cgtcggccgc gaagctcgcg 660 ggatagcttg gtgccacgcc aaagcggaca agatctgacc tgggatcggc tgactgtttg 720 aaagacgtca caagcgagcc gtaagtaaga accgaggaga tgggcccgag tgtcttgttg 780 cgatacacct tccagctgac gccggcatcg ctaaggttct gcggcatgat gcgccaaccg 840 aatctccgca ccggttggaa agtgggactc tgcagctccg gcccaccatt ttggccgtcg 900 gggtcgatgg tggcgctcag ccaataaagg cggttgggca gggtgggacc caataccgag 960 caaaagtagc ggtcgcagac ggtgaacgcg tcggccaaca gatagtggat cggaatgtct 1020 tggcgcgtgt agtagtgaac cgccccggtg agtccggaga ctctctgatc tgagacctca 1080 gccggcggct ggtctctggc gttgagcgta gtaggcagcc tcgagttcga ccggcgggac 1140 gtcgccgcag tactggtaga ggcggcgatg gttgaaccag tcgacccagc gcgcggtggc 1200 caactcgaca tcctcgatgg accgccaggg cttgccgggt ttgatcagct cggtcttgta 1260 taggccgttg atcgtctcgg ctagtgcatt gtcataggag cttccgaccg ctccgaccga 1320 cggttggatg cctgcctcgg cgagccgctc gctgaaccgg atcgatgtgt actgagatcc 1380 cctatccgta tggtggataa cgtctttcag gtcgagtacg ctttcttgtt ggcgggtcca 1440 gatggcttgc tcgatcgcgt cgaggaccat ggaggtggcc atcgtggaag cgacccgcca 1500 gcccaggatc ctgcgagcgt aggcgtcggt gacaaaggcc acgtaggcga accctgccca 1560 ggtcgacaca taggtgaggt ctgctaccca cagccggtta ggtgctggtg gtccgaagcg 1620 gcgctggacg agatcggcgg gacgggctgt ggccggatca gcgatcgtgg tcctgcgggc 1680 tttgccgcgg gtggtcccgg acaggccgag tttggtcatc agccgttcga cggtgcatct 1740 ggccacctcg atgccctcac ggttcagggt tagccacact ttgcgggcac cgtaaacacc 1800 gtagttggcg gcgtggacgc ggctgatgtg ctccttgagt tcgccatcgc gcagctcgcg 1860 gcggctgggc tcccggttga tgtggtcgta gtaggtcgat ggggcgatcg gcacacccag 1920 ctcggtcagc tgtgtgcaga tcgactcgac accccaccgc aaaccatcgg ggccctcgcg 1980 gtggccctga tgatcggcga tgaaccgggt aattagcgtg ctggccggtc gagctcggcc 2040 gcgaagaaag ccgacgcggt ctttaaaatc gcgttcgccc ttcgcaattc ggcgttgtcc 2100 cgccgcaagc gcttcagctc agcggattct tcggtcgtgg tcccgggccg tgcgccggca 2160 tcgacctgcg cctggcgcac ccacttacgc accgtctccg cgcagccaac accaagtaga 2220 cgggcgacct cactgatcgc tgcccactcc gaatcgtgct gaccgcggat ctctgcgacc 2280 atccgcaccg cccgctcacg cagctccggc gggtacctcc tcgatgaacc acctgacatg 2340 accccatcct ttccaagaac tggagtctcc ggacatgccg gggcggttca gagaggactt 2400 catcgatgcg ctgcgttcca agattggcga gaagtctatg ggcgtttatg gggtcgacta 2460 cccggcgacc acggatttcc cgacagcgat ggccggtatt tacgacgcgg gcacccatgt 2520 cgaacagacg gcggcgaact gtccccaaag caagctggtg ctcggcggat tttcccaagg 2580 tgcggccgtg atgggctttg ttaccgcggc ggcgattccg gatggggcgc cgttggacgc 2640 gccca 2645 <210> 2 <211> 99 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 2 tcgcccttcg caattcggcg ttgtcccgcc gcaagcgctt cagctcagcg gattcttcgg 60 tcgtggtccc gggccgtgcg ccggcatcga cctgcgcct 99 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide of forward oligomer <400> 3 gcgttcgccc ttcgcaattc ggcgttgtcc cgccg 35 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide of reverse oligomer <400> 4 gcgccaggcg caggtcgatg ccggcgcacg gcccg 35 <210> 5 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 5 gttcgccctt cgca 14 <210> 6 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 6 gcaggtcgat gccg 14

Claims (10)

1. 소변에서 결핵균 trDNA 추출용 올리고머 조성물로,
   서열번호 1의 2065번째부터 2109번째까지의 염기서열에서 연속되는 30 내지 40 bp의 염기서열과 동일한 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드와
   서열번호 1에서 2183번째부터 2139번째까지의 염기서열에서 연속되는 30 내지 40 bp의 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 포함하고,
   상기 올리고뉴클레오티드들은 5’말단에 비오틴이 결합되어 있는 것인, 올리고머 조성물.
   
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 소변에서 결핵균 trDNA 추출용 올리고머 조성물.
   
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 30 내지 35 bp의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 소변에서 결핵균 trDNA 추출용 올리고머 조성물.
   
6. 삭제
7. 제 1항에 따른 올리고머 조성물을 포함하는, 소변에서 결핵균 trDNA 추출용 키트.
   
8. 제 7항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 소변에서 결핵균 trDNA 추출용 키트.
   
9. 제 7항에 있어서, 상기 키트는 스트렙토아비딘 또는 아비딘이 고착된 마그네틱 비드, 세척용 완충용액, 및 사용설명서를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 소변에서 결핵균 trDNA 추출용 키트.
   
10. i) 개체의 소변 시료를 히팅 블록으로 처리하는 단계;
    ii) 제 1항에 따른 올리고머 조성물을 첨가하고 실온에서 반응시키는 단계;
    iii) 스트렙토아비딘 또는 아비딘이 고착된 마그네틱 비드를 첨가하여 실온에서 반응시키는 단계; 및
    iv) 마그네틱 스탠드를 사용하여 캡처하여 세척한 후 용리시키는 단계를 포함하는,
    소변에서 결핵균 trDNA를 추출하는 방법.

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