CN107022641B

CN107022641B - 一种检测耳聋基因的引物及其应用

Info

Publication number: CN107022641B
Application number: CN201710429926.6A
Authority: CN
Inventors: 王力刚; 王景
Original assignee: Beijing Boao Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Beijing Boao Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2017-06-09
Filing date: 2017-06-09
Publication date: 2020-06-19
Anticipated expiration: 2037-06-09
Also published as: CN107022641A

Abstract

本发明公开了一种检测耳聋基因的引物及其应用，具体的涉及SNP位点35delG的改进的高特异性的单碱基延伸引物，本发明同时提供了一种可以同时检测多个耳聋基因的试剂盒，该试剂盒采用多重PCR扩增引物和单碱基延伸引物，可在同管中同时检测多个热点突变，诊断快速、操作简单、成本低，有助于耳聋致病基因筛查的推广。

Description

一种检测耳聋基因的引物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种检测耳聋基因的引物及其应用。

背景技术

听觉系统中外耳、中耳、内耳结构异常及听觉传导信号通路中的听神经和各级中枢发生病变，导致听功能障碍，表现出不同程度的听力下降，统称为耳聋。耳聋的致病因素有很多，主要包括环境因素、遗传因素及环境-遗传相互作用。30％的遗传性耳聋除了耳聋外，还伴有其他异常，称为综合征型耳聋(SHI)。70％的遗传性耳聋可单独发生，称为非综合征型耳聋(NSHI)，但是往往伴有前庭功能障碍。

已知遗传性非综合征型耳聋有多种遗传方式，最常见的是常染色体隐性遗传(AR)，占75％～80％。虽然耳聋致病基因具有较高的基因和位点异质性，但大部分的耳聋是由少数几个基因的热点突变引起的，包括GJB2、GJB3、SLC26A4、线粒体基因(mtDNA12SrRNA)等，这使遗传性耳聋的基因诊断和筛查成为可能。

传统耳聋基因诊断方法包括限制性片段长度多态性分析(RFLP)、限制性内切酶酶切指纹-单链构象多态性分析(REF-SSCP)、变性高效液相色谱法(DHPLC)、实时荧光定量探针法、PCR结合Sanger测序。但是限制性内切酶的识别位点有限，针对特定的基因能检出的位点很少，导致检出率低，且反应条件严格，操作繁琐。DHPLC检测率高，对未知突变的检测准确率达95％以上，对已知突变大于99％，灵敏度高，但是不能检测纯合突变，且无法得出具体的突变类型和突变位点。实时荧光定量探针则价格昂贵，费时费力，灵敏度低。PCR结合Sanger测序被认为是突变检测的金标准，但是一般一次只能对一个基因或一个位点进行检测，导致耳聋患者的检出率不高。基因芯片是近年来发展起来的一种高通量、自动化的基因检测方法，让多基因、多位点同时检测成为可能，但基因芯片成本昂贵，技术要求高。因此，寻找一种能一次性检测多个基因热点突变、可靠、经济、快速的技术尤为重要。

随着生物技术的发展，多重PCR的应用使得同时检测多个突变位点成为可能，而引物的设计就尤为重要。但是采用常规方式进行引物设计时可能面对GC含量高引起错配的问题，现有技术中主要是采用避开GC含量高区域或者直接使用高GC含量区域的方法进行，但是避开高GC含量区域的方法不能解决某些位点没有调整的空间，直接使用容易引起引物非特异性结合，干扰检测。因此寻找一种有效设计引物的方法具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种引物，该引物可以特异性、灵敏的结合靶序列。

本发明的目的之二是提供一种设计引物的方法，使用该方法设计引物能够降低GC含量，提高引物的结合特异性。

本发明的目的之三是提供一种检测耳聋基因多态性的试剂盒，使用该试剂盒可以准确、快速、高通量、低成本的实现多个耳聋多态位点的的一次性检测。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种检测耳聋基因GJB2点突变的引物，所述突变点为35delG，所述引物包括PCR扩增引物和单碱基延伸引物，其中，PCR扩增引物的序列如SEQ ID NO.1～2所示，单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了一种设计引物的方法，使用A/T碱基替换连续G/C序列中的G/C。

进一步，所述的替换位于连续G/C的第三或第四个位置。在对相应的G/C替换后要保证引物3’端有2～3个碱基与模板链互补配对，并且分析替换后的引物扩增分析序列的特异性。

本发明提供了序列SEQ ID NO.1～3所示的引物在制备检测耳聋基因多态性的产品中的应用。

进一步，所述产品包括芯片、核酸膜条、试剂盒。所述芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的针对上述SNP的寡核苷酸探针；所述核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针；所述试剂盒包括容器和针对上述SNP的芯片或核酸膜条或PCR扩增引物序列。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

本发明提供了一种检测耳聋基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括序列SEQ IDNO.1～3所示的引物。

进一步，所述试剂盒还包括PCR反应体系、SAP反应体系和单碱基延伸反应体系；其中，PCR反应体系包括PCR缓冲液、25mM dNTPs、25mM MgCl₂、5U/μl PCR酶；单碱基延伸反应体系包括IPLEX缓冲液、IPLEX终止混合物、iPLEX酶。

进一步，所述试剂盒还包括DNA提取试剂、阴性质控品、阳性质控品、纯化树脂、质谱检测芯片。

在本发明的具体实施方式中，所述试剂盒还包括检测其他耳聋基因SNP位点的引物，所述耳聋基因包括(但不限于)SLC26A4、GJB2、mtDNA、GJB3c。

进一步，所述SLC26A4、GJB2、mtDNA、GJB3c的SNP位点包括下述的一种或几种：

SLC26A4基因上的1226G>A、1229C>T、1174A>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G、919-2A>G、1707+5G>A、281C>T、589G>A；

GJB2基因上的299_300delAT、235delC、176_191del16、167delT、109G>A、508_511insAACG；

mtDNA基因上的1494C>T、1555A>G；

GJB3基因上的538C>T、547G>A中的一种或几种。

在本发明的具体实施方式中，针对上述SNP位点的引物序列如SEQ ID NO.4～48所示。其中，

针对1226G>A、1229C>T、1174A>T的扩增引物序列如SEQ ID NO.4～5所示，针对1226G>A的单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.6所示，针对1229C>T的单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.7所示，针对1174A>T的单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.8所示；

针对1975G>C、2027T>A的扩增引物序列如SEQ ID NO.9～10所示，针对1975G>C的单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.11所示，针对2027T>A的单碱基延伸引物序列如SEQ IDNO.12所示；

针对2162C>T、2168A>G的扩增引物序列如SEQ ID NO.13～14所示，针对2162C>T的单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.15所示，针对2168A>G的单碱基延伸引物序列如SEQ IDNO.16所示；

针对919-2A>G的扩增引物序列如SEQ ID NO.17～18所示，针对919-2A>G的单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.19所示；

针对1707+5G>A的扩增引物序列如SEQ ID NO.20～21所示，针对1707+5G>A的单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.22所示；

针对281C>T的扩增引物序列如SEQ ID NO.23～24所示，针对281C>T的单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.25所示；

针对589G>A的扩增引物序列如SEQ ID NO.26～27所示，针对589G>A的单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.28所示；

针对299_300delAT、235delC、176_191del16、167delT的扩增引物序列如SEQ IDNO.29～30所示，针对299_300delAT的单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.31所示，针对235delC的单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.32所示，针对176_191del16的单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.33所示；针对167delT的单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.34所示；

针对109G>A的扩增引物序列如SEQ ID NO.1～2所示，针对109G>A的单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.35所示；

针对508_511insAACG的扩增引物序列如SEQ ID NO.36～37所示，针对508_511insAACG的单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.38所示；

针对1494C>T的扩增引物序列如SEQ ID NO.39～40所示，针对1494C>T的单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.41所示；

针对1555A>G的扩增引物序列如SEQ ID NO.42～43所示，针对1555A>G的单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.44所示；

针对538C>T、547G>A的扩增引物序列如SEQ ID NO.45～46所示，针对538C>T的单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.47所示，针对547G>A的单碱基延伸引物序列如SEQ IDNO.48所示。

在本发明的具体实施方式中，还使用普通方法设计了35delG的单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.49所示，通过与改进后的引物(SEQ ID NO.3)进行对比，发现改进后的引物具有能在较低的浓度产生较明显的峰值，具有较高的结合特性。

在本发明中，PCR扩增引物为根据所选择的待检测的耳聋易感基因设计的特异性针对每种耳聋易感基因的引物，所述扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列，由5’端的Tag序列和针对目标区域的特异性引物序列组成，5’端Tag序列优选5-15个碱基。优选的，Tag序列选用序列ACGTTGGATG。

本发明采用多重PCR-单碱基延伸反应-质谱检测相结合的方法检测耳聋基因多态性位点的基因型。

多重PCR即是在同一PCR反应体系中加入2对或2对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。自1988年将多重PCR技术首先用以诊断杜氏肌营养不良征(DMD)以来，在许多相关领域尤其是核酸诊断方面，得到了广泛深入的研究及应用。在此基础上，进一步发展了诸如巢式多重PCR、荧光定量多重PCR、差异显示多重PCR等系列相关技术。由于多重PCR实验设计较单一PCR要复杂得多，技术难度大，因而在建立多重PCR反应体系时，必须对其中的主要成分和反应条件进行繁琐的优化。影响多重PCR扩增效果的因素主要可分反应体系和反应条件二大类，其中反应体系包括引物、缓冲液、模板和Taq DNA聚合酶、dNTP和Mg²⁺等，反应条件包括退火温度、循环数、辅助剂等。多重PCR反应的优化要比常规PCR复杂，通常情况是先进行单一的PCR反应，分别设定各引物对的最佳反应条件，然后选择公共的反应条件进行2重、3重……设定，在此过程中不断调整反应条件，直至所有的引物都能同时在这一条件下正确扩增。

基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)利用过量的低分子量有机酸作为基质吸收激光能量，再将能量传给分析的样本，基质-样本之间发生电荷转移使样本气化、离子化，从而形成单个负离子或正离子，离子在电场作用下，飞过自由漂移区到达质谱仪，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即质谱仪根据样本的质荷比来检测离子，并测得样品的分子量。

由于质谱技术与多引物扩增技术和单碱基延伸技术结合使用，可以在一个反应体系中同时检测多个突变位点，大大减轻了工作量，提高了检测通量，并降低了检测费用。

在本发明中，遗传性耳聋基因检测产品的样本包括(但不限于)胎儿羊水、人外周血样本、脐血、口腔拭子等。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了一种低GC含量的引物，使用该引物可以解决因GC含量高而引起的引物非特异性结合的问题。

本发明提供了一种设计引物的方法，该方法为将第三或第四个连续的G/C替换为A/T，并同时保证3’端有2～3个左右碱基与模板链互补配对。

本发明提供了一种检测遗传性耳聋基因的试剂盒，包括高效特异性的扩增引物和单碱基延伸引物，这些扩增引物和延伸引物经过精心设计，检测准确性和灵敏度高；在位置比较接近的SNP位点，设计一对引物，提高了扩增效率，降低了成本。

本发明的试剂盒可以一次性检测遗传性耳聋基因上的多个SNP位点，多个SNP位点的检测在同一管中完成，检测时间短，操作简单，成本低，便于耳聋基因筛查的推广。

附图说明

图1是采用新引物检测样本中35delG的质谱峰图，其中，图A是采用1倍引物用量检测样本1的质谱峰图，图B是采用1倍引物用量检测样本2的质谱峰图。

图2是采用常规引物检测样本中35delG的质谱峰图，其中，图A是采用1倍用量引物检测样本1的质谱峰图，图B是采用1倍引物用量检测样本2的质谱峰图，图C是采用5倍引物用量检测样本1的质谱峰图，图D是采用5倍引物用量检测样本2的质谱峰图。

图3是采用一代测序检测样本中35delG的质谱峰图，其中，图A是样本1的质谱峰图，图B是样本2的质谱峰图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1、多态位点的选择

本发明选择的多态性位点均具有很高的多态性信息含量，包含中国人群中耳聋基因热点突变位点，整体上使单倍型多样性大大提升。通过大规模的测序筛查，以及现有技术中报道的耳聋致病基因在中国人群中的多态性调查和文献研究，入选本发明的22个位点见表1。

表1本发明涉及的所有20个多态性位点

2、样本的采集

在被检测者知情同意的情况下，使用血斑采集卡收集35delG阳性和阴性的样本2例，晾干备用。

3、样本的检测

(1)针对选定的耳聋基因的SNP位点，通过引物的设计原则与实际情况结合，设计对应区域特异性的扩增引物和位点特异性的单碱基延伸引物，并在扩增引物5’端增加通用tag序列。本发明设计了大量检测遗传性耳聋基因突变的相关位点的引物，然后通过大量的实验筛选出特异性强、灵敏度高的引物，最终筛选出相关DNA突变效果最佳的引物，引物序列如下：

针对35delG的引物序列：

正向引物序列：ACGTTGGATGTCTTTTCCAGAGCAAACCGC(SEQ ID NO.1)，

反向引物序列：ACGTTGGATGACAAAGTCGGCCTGCTCATC(SEQ ID NO.2)，

单碱基延伸引物序列：TGCAGACGATCCTGAGGG(SEQ ID NO.3)，

单碱基延伸引物序列：TGCAGACGATCCTGGGGG(SEQ ID NO.49)；

针对1226G>A、1229C>T、1174A>T的引物序列：

正向引物序列：ACGTTGGATGCTGTTGTTCCTACCTGTGTC(SEQ ID NO.4)，

反向引物序列：ACGTTGGATGGTAGGATCGTTGTCATCCAG(SEQ ID NO.5)，

1226G>A的单碱基延伸引物序列：CACCACTGCTCTTTCCC(SEQ ID NO.6)，

1229C>T的单碱基延伸引物序列：CTCCTGGACGGCC(SEQ ID NO.7)，

1174A>T的单碱基延伸引物序列：TTGCCTTTGGGATCAGC(SEQ ID NO.8)；

针对1975G>C、2027T>A的引物序列：

正向引物序列：ACGTTGGATGCAGAAAACCAGAACCTTACC(SEQ ID NO.9)，

反向引物序列：ACGTTGGATGACGTTCCCAAAGTGCCAATC(SEQ ID NO.10)，

1975G>C的单碱基延伸引物序列：GTGCCAATCCATAGCCTT(SEQ ID NO.11)，

2027T>A的单碱基延伸引物序列：AGAACCTTACCACCCGC(SEQ ID NO.12)；

针对2162C>T、2168A>G的引物序列：

正向引物序列：ACGTTGGATGCCCTCTTGAGATTTCACTTG(SEQ ID NO.13)，

反向引物序列：ACGTTGGATGAATGCGGGTTCTTTGACGAC(SEQ ID NO.14)，

2162C>T的单碱基延伸引物序列：AAGGACACATTCTTTTTGA(SEQ ID NO.15)，

2168A>G的单碱基延伸引物序列：CTGTAGATAGAGTATAGCATCA(SEQ ID NO.16)；

针对919-2A>G的引物序列：

正向引物序列：ACGTTGGATGATTTGGTTGACAAACAAGG(SEQ ID NO.17)，

反向引物序列：ACGTTGGATGGGCTCCATATGAAATGGCAG(SEQ ID NO.18)，

单碱基延伸引物序列：GGCAGTAGCAATTATCGTC(SEQ ID NO.19)；

针对1707+5G>A的引物序列：

正向引物序列：ACGTTGGATGGAAGTCTCAAAAGAGGTTAG(SEQ ID NO.20)，

反向引物序列：ACGTTGGATGTTCTATGGCAATGTCGATGG(SEQ ID NO.21)，

单碱基延伸引物序列：AATGTATCAAGTCCACAGTAA(SEQ ID NO.22)；

针对281C>T引物序列：

正向引物序列：ACGTTGGATGCAACATCTTACCTTGCAGCG(SEQ ID NO.23)，

反向引物序列：ACGTTGGATGATACCGAGTCAAGGAATGGC(SEQ ID NO.24)，

单碱基延伸引物序列：GAAGTCATTTCGGGAGTTAGTA(SEQ ID NO.25)；

针对589G>A的引物序列：

正向引物序列：ACGTTGGATGACAGCTAGAGTCCTGATTGC(SEQ ID NO.26)，

反向引物序列：ACGTTGGATGCTTGTAAGTTCATTACCTG(SEQ ID NO.27)，

单碱基延伸引物序列：GTAAGTTCATTACCTGTATAATTC(SEQ ID NO.28)；

针对299_300delAT、235delC、176_191del16、167delT的引物序列：

正向引物序列：ACGTTGGATGTGATCTCCTCGATGTCCTTA(SEQ ID NO.29)，

反向引物序列：ACGTTGGATGAGGCCGACTTTGTCTGCAAC(SEQ ID NO.30)，

299_300delAT的单碱基延伸引物序列：TGATGAACTTCCTCTTCTTCTC(SEQ IDNO.31)，

235delC的单碱基延伸引物序列：CGAAGATCAGCTGCAGG(SEQ ID NO.32)，

176_191del16的单碱基延伸引物序列：GGGAAGTAGTGATCGTAGC(SEQ ID NO.33)

167delT的单碱基延伸引物序列：CGACTTTGTCTGCAACACCC(SEQ ID NO.34)；

针对109G>A的引物序列：

正向引物序列：ACGTTGGATGTCTTTTCCAGAGCAAACCGC(SEQ ID NO.1)，

反向引物序列：ACGTTGGATGACAAAGTCGGCCTGCTCATC(SEQ ID NO.2)，

单碱基延伸引物序列：ACAACTCCTTTGCAGCCACAA(SEQ ID NO.35)；

针对508_511insAACG的引物序列：

正向引物序列：ACGTTGGATGATGTCATGTACGACGGCTTC(SEQ ID NO.36)，

反向引物序列：ACGTTGGATGAAGCAGTCCACAGTGTTGGG(SEQ ID NO.37)，

单碱基延伸引物序列：AGTGTTGGGACAAGGCCAGGCGTT(SEQ ID NO.38)；

针对1494C>T的引物序列：

正向引物序列：ACGTTGGATGAGTTGAACAGGGCCCTGAAG(SEQ ID NO.39)，

反向引物序列：ACGTTGGATGCCTCTATATAAATGCGTAGGG(SEQ ID NO.40)，

单碱基延伸引物序列：CTACTTTGAAGTATACTTGAGGAG(SEQ ID NO.41)；

针对1555A>G的引物序列：

正向引物序列：ACGTTGGATGCACTTTCCAGTACACTTACC(SEQ ID NO.42)，

反向引物序列：ACGTTGGATGACCCTCCTCAAGTATACTTC(SEQ ID NO.43)，

单碱基延伸引物序列：AACCCCTACGCATTTATATAGAGGAG(SEQ ID NO.44)；

针对538C>T、547G>A的引物序列：

正向引物序列：ACGTTGGATGATGGTGAGTACGATGCAGAC(SEQ ID NO.45)，

反向引物序列：ACGTTGGATGCTGGTGCAGTGTGCCAACGT(SEQ ID NO.46)，

538C>T的单碱基延伸引物序列：CGTGGACTGCTACATTGCC(SEQ ID NO.47)，

547G>A的单碱基延伸引物序列：GGTAGGTGAAGATTTTCTTCT(SEQ ID NO.48).

(2)实验步骤

a.样品DNA的提取(使用tiangen血斑DNA提取试剂盒提取DNA)

1)向样品中分别加入200μl缓冲液GA和20μl蛋白酶K，涡旋震荡10s混匀后，放入预热至56℃的恒温震荡器中，900rpm恒温震荡1h。

2)短暂离心后，加入200μl缓冲液GB，震荡10s充分混匀。将离心管放入预热至70℃的恒温震荡器中，900rpm恒温震荡10min。

3)短暂离心后，加入100μl无水乙醇，充分颠倒混匀。

4)将尽可能多的裂解液转移到对应放置的离心柱中(已标记样本编号)。转移后的原离心管盖好盖子暂放回原位，不可立即丢弃。全部样本转移完毕，核对对应位置的离心柱和原离心管编号是否一致，确保分柱准确无误。

5)短暂离心后，将离心管中的所得溶液和絮状沉淀全部加入吸附柱中，12,000rpm离心30s。弃废液，将吸附柱放回收集管中。

6)向吸附柱中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

7)加入700μl漂洗液PW，12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

8)加入500μl漂洗液PW，12,000rpm离心30s，弃废液，最后12,000rpm离心2min。

9)将吸附柱置于新的1.5ml离心管(标记样品编号)中，室温放置5min，向膜中央加入50μl TB缓冲液。室温放置5min，之后12,000rpm离心2min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA备用。

b.多重PCR反应

1)PCR反应体系配制

PCR反应体系按照表2进行配制，然后每孔加入3μl，将PCR反应MIX分加到384孔板的样本孔中。

表2多重PCR扩增反应体系

2)将配制好的PCR反应体系上PCR仪进行扩增，反应条件如表3所示。

表3多重PCR扩增反应条件

c.PCR产物处理

通过SAP酶处理PCR产物，SAP酶处理体系按照表4进行配制，然后按照每孔2μl，将反应体系加到PCR产物中(注意：PCR产物使用前请轻微震荡离心)，然后瞬时离心并按照表4中的反应程序进行反应。

表4 SAP反应体系及反应条件

d.延伸反应

延伸反应体系按照表5进行配制，然后按照每孔2μl，将延伸反应体系加到经SAP处理的产物中(注意：处理产物使用前请轻微震荡离心)，然后瞬时离心并按照表6中的反应程序进行反应。

表5延伸反应体系

成分	终浓度	试剂体积(μl)
			Nanopure H<sub>2</sub>O		0.619
iPLEX GOLD Buffer	0.222×	0.2
			iPLEX Termination mix	1×	0.2
延伸引物混合物		0.94
			iPLEX Enzyme	1×	0.041
总体积(μl)		2

表6延伸反应条件

e.延伸产物纯化(树脂脱盐处理)

1)每反应孔添加洁净树脂(Resin)6mg和16μl ddH₂O。

2)用膜把板封好，放在旋转器上颠倒摇匀15min，以3200g(标准板离心机的2000rpm)将板离心5min。

f.上机检测

1)使用基纳公司MassARRAY^TMRS1000点样仪转移至检测芯片。

2)使用基纳公司MassARRAY^TM分析仪进行检测。

4、使用基因检测金标准一代测序法对样本1和2进行检测。

5、结果

结果如图1-3所示，使用新引物检测与基因检测金标准一代测序结果一致。使用普通方法设计的常规引物(SEQ ID NO.49)特异性较差，在正常用量的情况下，产物峰较低，增加至5倍使用量后，效果明显改善；而改进后的引物(SEQ ID NO.3)则具有较好的特异性，正常用量就具有较明显的产物峰。

实施例2一种遗传性耳聋基因检测试剂盒

根据SNP位点与遗传性耳聋的相关性，本发明提供了一种基于检测SNP位点的基因型来诊断耳聋的试剂盒，试剂盒组分包括多重PCR反应体系、SAP酶处理体系、单碱基延伸反应体系、DNA提取试剂、阴性质控品，阳性质控品，纯化树脂，质谱检测芯片、使用说明书或标签。多重PCR体系包括PCR扩增引物、PCR缓冲液、25mM dNTPs、25mM MgCl₂、5U/μl PCR酶，PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.1～2、SEQ ID NO.4～5、SEQ ID NO.9～10、SEQ ID NO.13～14、SEQ ID NO.17～18、SEQ ID NO.20～21、SEQ ID NO.23～24、SEQ ID NO.26～27、SEQ IDNO.29～30、SEQ ID NO.36～37、SEQ ID NO.39～40、SEQ ID NO.42～43、SEQ ID NO.45～46所示；SAP酶处理体系包括SAP缓冲液、SAP酶；单碱基延伸反应体系包括单碱基延伸引物、iPLEX缓冲液、iPLEX终止混合物、iPLEX酶，单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.6～8、SEQ ID NO.11～12、SEQ ID NO.15～16、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.22、SEQ IDNO.25、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.31～35、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.47～48所示；DNA提取试剂包括提取缓冲液、蛋白酶、漂洗液。

实施例3一种遗传性耳聋基因检测试剂盒

根据SNP位点与遗传性耳聋的相关性，本发明提供了一种基于检测SNP位点的基因型来诊断耳聋的试剂盒，试剂盒组分包括多重PCR反应体系、SAP酶处理体系、单碱基延伸反应体系、DNA提取试剂、阴性质控品，阳性质控品，纯化树脂，质谱检测芯片、使用说明书或标签。多重PCR体系包括PCR扩增引物、PCR缓冲液、25mM dNTPs、25mM MgCl₂、5U/μl PCR酶，PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.1～2、SEQ ID NO.4～5、SEQ ID NO.9～10、SEQ ID NO.13～14、SEQ ID NO.17～18、SEQ ID NO.20～21、SEQ ID NO.23～24、SEQ ID NO.26～27、SEQ IDNO.29～30、SEQ ID NO.36～37、SEQ ID NO.39～40、SEQ ID NO.42～43；SAP酶处理体系包括SAP缓冲液、SAP酶；单碱基延伸反应体系包括单碱基延伸引物、iPLEX缓冲液、iPLEX终止混合物、iPLEX酶，单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6～8、SEQ ID NO.11～12、SEQ ID NO.15～16、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.28、SEQID NO.31～35、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.44所示；DNA提取试剂包括提取缓冲液、蛋白酶、漂洗液。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京博奥医学检验所有限公司

<120> 一种检测耳聋基因的引物及其应用

<160> 49

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acgttggatg tcttttccag agcaaaccgc 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acgttggatg acaaagtcgg cctgctcatc 30

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgcagacgat cctgaggg 18

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acgttggatg ctgttgttcc tacctgtgtc 30

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acgttggatg gtaggatcgt tgtcatccag 30

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<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caccactgct ctttccc 17

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<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctcctggacg gcc 13

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<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

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ttgcctttgg gatcagc 17

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acgttggatg cagaaaacca gaaccttacc 30

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acgttggatg acgttcccaa agtgccaatc 30

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

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gtgccaatcc atagcctt 18

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<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

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agaaccttac cacccgc 17

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

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acgttggatg ccctcttgag atttcacttg 30

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

acgttggatg aatgcgggtt ctttgacgac 30

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

aaggacacat tctttttga 19

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctgtagatag agtatagcat ca 22

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<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

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acgttggatg atttggttga caaacaagg 29

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

acgttggatg ggctccatat gaaatggcag 30

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ggcagtagca attatcgtc 19

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

acgttggatg gaagtctcaa aagaggttag 30

<210> 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

acgttggatg ttctatggca atgtcgatgg 30

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

aatgtatcaa gtccacagta a 21

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

acgttggatg caacatctta ccttgcagcg 30

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

acgttggatg ataccgagtc aaggaatggc 30

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gaagtcattt cgggagttag ta 22

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

acgttggatg acagctagag tcctgattgc 30

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

acgttggatg cttgtaagtt cattacctg 29

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gtaagttcat tacctgtata attc 24

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

acgttggatg tgatctcctc gatgtcctta 30

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

acgttggatg aggccgactt tgtctgcaac 30

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

tgatgaactt cctcttcttc tc 22

<210> 32

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

cgaagatcag ctgcagg 17

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gggaagtagt gatcgtagc 19

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

cgactttgtc tgcaacaccc 20

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

acaactcctt tgcagccaca a 21

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

acgttggatg atgtcatgta cgacggcttc 30

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

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acgttggatg aagcagtcca cagtgttggg 30

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<212> DNA

<213> 人工序列

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agtgttggga caaggccagg cgtt 24

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

acgttggatg agttgaacag ggccctgaag 30

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<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

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acgttggatg cctctatata aatgcgtagg g 31

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ctactttgaa gtatacttga ggag 24

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 47

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

cgtggactgc tacattgcc 19

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

ggtaggtgaa gattttcttc t 21

<210> 49

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

tgcagacgat cctggggg 18

Claims

1.一种检测耳聋基因GJB2点突变的引物，其特征在于，所述引物包括PCR扩增引物和单碱基延伸引物，其中，PCR扩增引物的序列如SEQ ID NO.1~2所示，单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种设计权利要求1所述的引物的方法，其特征在于，使用A/T碱基替换连续G/C序列中的G/C。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的替换位于连续G/C的第三或第四个位置。

4.权利要求1所述的引物在制备检测耳聋基因多态性的产品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、核酸膜条、试剂盒。

6.一种检测耳聋基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应体系、SAP反应体系和单碱基延伸反应体系；其中，PCR反应体系包括PCR缓冲液、25mM dNTPs、25mMMgCl2、5U/µl PCR酶；单碱基延伸反应体系包括IPLEX缓冲液、IPLEX终止混合物、iPLEX酶。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测耳聋基因SLC26A4、GJB2、mtDNA、GJB3 的SNP位点的引物。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述SNP位点包括：

SLC26A4基因上的1226G>A、1229C>T、1174A>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G 、919-2A>G、1707+5G>A、281C>T、589G>A，GJB2基因上的299_300delAT、235delC、176_191del16、167delT、109G>A、508_511insAACG，mtDNA基因上的1494C>T、1555A>G，GJB3基因上的538C>T、547G>A中的一种或几种。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，针对上述SNP位点的引物序列如SEQ IDNO.4~48所示。