CN107345254A - 耳聋相关基因snp检测用的引物系统、检测方法和应用 - Google Patents
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- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Abstract
本发明公开了一种耳聋相关基因SNP检测用的引物系统、检测方法和应用。该耳引物系统包括17组引物组合中的至少一组，且每组引物组合包括PCR扩增引物对及与该PCR扩增引物对对应的测序引物。利用本发明的耳聋相关基因SNP检测用的引物系统可广泛用于遗传性耳聋的基因突变情况的检测分析过程中，尤其是中国遗传性非综合征型耳聋人群，有助于及早发现携带耳聋基因突变的患儿，为后期的诊断及治疗提供科学依据。该引物系统可以各组引物分开使用以检测单一SNP位点的突变情况，也可以组合使用以同时检测多个SNP位点的突变情况，并且上述引物系统在组合使用时，各组之间不存在相互干扰，可以一次性同时检测多个SNP位点，检测通量高、速度快。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种耳聋相关基因SNP检测用的引物系统、检测方法和应用。
背景技术
遗传性耳聋是指由于基因和染色体异常所致的耳聋。这种疾病是由父母的遗传物质(包括染色体及位于其中的基因)发生了改变传给后代而引起的耳聋，并且在子孙后代中以一定数量出现。据统计，在每1000个新生儿中就有一位患有先天性耳聋，其中60％以上是由遗传因素引起的。在所有耳聋病人中，遗传性耳聋约占50％。遗传性耳聋分为综合征性遗传性耳聋及非综合征性遗传性耳聋两大类。前者指除了耳聋以外，同时存在眼、骨、肾、皮肤等部位的病变，这类耳聋占遗传性聋的30％；后者只出现耳聋的症状，在遗传性聋中占70％。
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。从理论上来看每一个SNP位点都可以有4种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比约为2:1。SNP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T，原因是CG中的胞嘧啶常被甲基化，而后自发地脱氨成为胸腺嘧啶。一般而言，SNP是指变异频率大于1％的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP。人类基因组上的SNP总量大概是3×106个。因此，SNP成为第三代遗传标志，人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等都可能与SNP有关。
研究表明，遗传性耳聋与其相关基因的SNP息息相关，因此，开展对遗传性耳聋相关基因SNP的检测对耳聋的分子流行病学研究和聋儿的提前筛查具有重要的意义。
发明内容
基于此，有必要提供一种耳聋相关基因SNP检测用的引物系统、检测方法和应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下。
一种耳聋相关基因SNP检测用的引物系统，包括下表中组别为1～17的17组引物组合中的至少一组：
其中，每组引物组合包括PCR扩增引物对及与该PCR扩增引物对对应的测序引物。
在其中一个实施例中，所述PCR扩增引物对的每条引物的5’端还连接有保护片段。
在其中一个实施例中，所述保护片段的序列如SEQ ID NO:61所示。
在其中一个实施例中，所述耳聋相关基因SNP检测用的引物系统包括组别为1～17的共17组引物组合。
一种耳聋检测方法，使用上述任一实施例所述的耳聋相关基因SNP检测用的引物系统，所述耳聋检测方法包括如下步骤：
使用所述PCR扩增引物对对基因组DNA进行PCR扩增；
使用所述测序引物对PCR扩增的产物进行单碱基延伸；
将单碱基延伸的产物与靶片的基质共结晶，并将得到的晶体置于质谱仪中，进行质谱检测。
在其中一个实施例中，所述耳聋检测方法还包括在进行所述单碱基延伸之前对PCR扩增的产物进行纯化，和/或在共结晶之前对所述单碱基延伸的产物进行脱盐处理的步骤。
上述耳聋相关基因SNP检测用的引物系统可应用在制备用于检测耳聋的试剂中，如：
一种耳聋检测试剂盒，含有上述任一实施例所述的耳聋相关基因SNP检测用的引物系统。
在其中一个实施例中，所述耳聋检测试剂盒还包括DNA提取试剂、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、单碱基延伸试剂和延伸产物纯化试剂中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述耳聋检测试剂盒还包括阳性对照试剂和阴性对照试剂。
本发明的耳聋相关基因SNP检测用的引物系统、试剂盒等可用于MASSARRAY SNP检测系统，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI—TOF MS)技术进行基因SNP的检测。上述引物系统可以各组引物分开使用以检测单一SNP位点的突变情况，也可以组合使用以同时检测多个SNP位点的突变情况，并且上述引物系统在组合使用时，各组之间不存在相互干扰，可以一次性同时检测多个SNP位点，检测通量高、速度快。
利用本发明的耳聋相关基因SNP检测用的引物系统、试剂盒及检测方法可广泛用于遗传性耳聋的基因突变情况的检测分析过程中，尤其是中国遗传性非综合征型耳聋人群，速度快并且节约时间，有助于及早发现携带耳聋基因突变的患儿(包括迟发性听力缺陷患儿)，为后期的诊断及治疗提供科学依据，有助于及时采取干预措施预防言语障碍的发生，有效地降低聋哑发病率。
附图说明
图1-图26为阴性对照组的各位点的质谱图；
图27-图31为部分实验组的相应位点的质谱图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
一实施方式的耳聋相关基因SNP检测用的引物系统，包括下表1中组别为1～17的17组引物组合中的至少一组，每组引物组合包括PCR扩增引物对及与该PCR扩增引物对对应的测序引物(unextension primer，UEP，又称未延伸引物)。
表1
优选的，该PCR扩增引物对的每条引物的5’端还连接有保护片段。该保护片段可含有5～25个碱基，通过增大PCR引物的分子量，可以防止引物二聚体的产生，以便于后续的扩增。该保护片段的序列可以是但不限于如SEQ ID NO:61所示(5’-acgttggatg-3’)。
进一步，在一优选的实施方式中，该耳聋相关基因SNP检测用的引物系统包括组别为1～17的共17组引物组合，其中，17对PCR引物对可以等摩尔量混合在一起构成多重PCR扩增引物系统，17组UEP也可以等摩尔量混合在一起构成UEP Mix。
一实施方式的耳聋检测方法，其使用上述耳聋相关基因SNP检测用的引物系统，该耳聋检测方法包括如下步骤：
步骤一：使用上述PCR扩增引物对对基因组DNA进行PCR扩增；
步骤二：使用上述测序引物对PCR扩增的产物进行单碱基延伸，在SNP位点上延伸1个碱基；
步骤三：将单碱基延伸的产物与靶片的基质共结晶，并将得到的晶体置于质谱仪中，进行质谱检测。
进一步，该耳聋检测方法还包括在步骤二之前对PCR扩增的产物进行纯化，和/或在步骤三之前对该单碱基延伸的产物进行脱盐处理的步骤。
在将共结晶的晶体放入质谱仪的真空管中进行质谱检测时，可以使用瞬时纳秒(10-9s)强激光激发，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，在真空管中飞行到达检测器，MALDI产生的离子常用飞行时间检测器来检测，离子质量越小，就越快到达，理论上讲，只要飞行管长度足够，飞行时间检测器可检测分子的质量数是没有上限的，如本实施方式使用的MASSARRAY SNP检测的质谱范围就可以达到5000到8500Dalton。
上述耳聋相关基因SNP检测用的引物系统可应用在制备用于检测耳聋的试剂中，如：一种耳聋检测试剂盒，其含有上述耳聋相关基因SNP检测用的引物系统。
在其中一个实施方式中，该耳聋检测试剂盒还包括DNA提取试剂、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、单碱基延伸试剂和延伸产物纯化试剂中的至少一种。其中，DNA提取试剂可以是通用的外周血或骨髓基因组DNA提取试剂，如应用QIAamp DNA Mini Kit和/或TIANamp Blood DNA kit从外周血及骨髓血等中提取DNA，并结合Thermo公司Nanodrop超微量分光光度计，检测所提取的DNA的纯度和浓度。PCR扩增试剂含有Mg2+、dNTPs、DNA聚合酶及扩增缓冲液等。PCR产物纯化试剂如SAP(人血清淀粉样蛋白P)混合液，包含有SAP buffer和SAP酶(虾碱酶，一种碱性磷酸酶)等。单碱基延伸试剂含有延伸反应缓冲液、ddNTPs以及单碱基延伸酶等。延伸产物纯化试剂可以是但不限于使用洁净树脂(Resin)，以对相应产物进行脱盐处理。
进一步，该耳聋检测试剂盒还包括阳性对照试剂和阴性对照试剂。其中，阳性对照试剂中含有已知突变情况的DNA片段，阴性对照试剂为不含有突变的已知DNA片段。
利用本发明的耳聋相关基因SNP检测用的引物系统、试剂盒及检测方法可广泛用于遗传性耳聋的基因突变情况的检测分析过程中，尤其是中国遗传性非综合征型耳聋人群，速度快并且节约时间，有助于及早发现携带耳聋基因突变的患儿(包括迟发性听力缺陷患儿)，为后期的诊断及治疗提供科学依据，有助于及时采取干预措施预防言语障碍的发生，有效地降低聋哑发病率。上述引物系统可以各组引物分开使用以检测单一SNP位点的突变情况，也可以组合使用以同时检测多个SNP位点的突变情况，并且上述引物系统在组合使用时，各组之间不存在相互干扰，可以一次性同时检测多个SNP位点，检测通量高、速度快。
以下为具体实施例部分
一、样本、试剂和仪器等
1.样本类型
本检测适用样本为双链DNA。DNA浓度在10ng/μl左右。
2.试剂
2.1引物
PCR扩增引物具有保护片段和核心片段(用于与基因组DNA匹配的片段)，其中核心片段的序列如上表1所示，保护片段的序列如SEQ ID NO:61所示。UEP的序列同上表1所示。
2.2 PCR扩增试剂
PCR Accessory Set试剂盒，生产商：AGENA，商品型号为：0000023751，储存条件：-20℃。
2.3单碱基延伸试剂
IPLEX Pro Reagent Kit，生产商：AGENA，商品型号为：0000023982，储存条件：-20℃。
2.4无水乙醇
生产商：广东光华化学厂有限公司，级别：分析纯(AR)
2.5 50％乙醇
由无水乙醇配制和水按1:1的体积比例配制而成，即配即用。
2.6 0.1M NaOH
生产商：Life，由10M NaOH和水按1:99的体积比例配制而成。
2.7 DNA提取试剂
QIAamp DNA Mini Kit或TIANamp Blood DNA kit。
其他试剂参见具体的检测流程。
3.仪器，见下表2
表2
4.质控品
空白对照(No Template Control，NTP)：即无模板对照，与样本DNA平行操作，每批次检测1个；
阴性对照(NEG)：为实验室自备标本，与样本DNA平行实验，每批次检测1个。
阳性对照(POS)：为实验室自备标本，与样本DNA平行实验，每批次检测1个。
表3质控结果判断
表4常见失控的情形及处理方法
二、操作步骤
1.DNA提取
使用DNA提取试剂提取外周血DNA，并计算其浓度，当浓度超过10ng/μl，稀释至10ng/μl。
2.PCR扩增试剂准备
从试剂盒中取出DNA聚合酶、PCR扩增引物组合(Primer Mix，含有17对PCR扩增引物对)、ddH2O等，室温融化后，短暂离心；准备好合适数量的PCR反应管。
反应体系配制如下表5。
表5
| 试剂 | 体积(μl) |
| H2O | 0.8 |
| 10×buffer | 0.5 |
| MgCl2 | 0.4 |
| dNTPs | 0.1 |
| Primer Mix | 1.0 |
| DNA聚合酶 | 0.2 |
| 总体积 | 3.0 |
震荡混匀，短暂离心后，分装3.0μl至标记好的PCR反应管。
3.加样
若样品及质控品保存在-20℃，使用前置室温解冻，并短暂离心。
将样本DNA稀释至10.0ng/μl后，向分装好的PCR反应管中加入2.0μl稀释后的样本DNA作为模板。
盖好管盖后，震荡混匀，短暂离心，以备PCR扩增。
4.PCR扩增
将PCR管置于PCR仪上，PCR反应程序设置如下：95℃、2min->(95℃、30s->56℃、30s->72℃、60s)，共44个循环->72℃、5min，20℃静置存放。
5.PCR扩增产物的纯化
SAP混合液，配方见下表6。
表7
| 试剂 | 体积(μl) |
| H2O | 1.53 |
| SAP buffer | 0.17 |
| SAP Enzyme | 0.30 |
| 总体积 | 2.0 |
将配制好的SAP混合液按每管2.0μl的体积加入到上一步PCR扩增产物中，盖好管盖后，震荡混匀，短暂离心，将PCR管置于PCR仪上，PCR反应程序设置如下：37℃、40min->85℃、5s，4℃下静置存放。
6.单碱基延伸反应
a).单碱基延伸混合液配制，见下表7。
表7
b).将配制好的单碱基延伸混合液按每管2.0μl的体积加入到上一步纯化的PCR扩增产物中。盖好管盖后，震荡混匀，短暂离心，将PCR管置于PCR仪上，PCR反应程序设置如下：95℃、30s->(95℃、5s->(52℃、5s->80℃、5s)，共4个循环->72℃、3min)，共39个循环，4℃静置存放。
7.脱盐处理
把洁净树脂(Resin)铺平在384孔/6mg dimple plate上，风干最少10分钟。
在样本板的每一个有样本的孔里加入16μl水，用膜把板封好，涡旋震荡和离心。
加入6mg洁净树脂(Resin)：轻轻将样本板凌空反转，放在已放树脂的dimpleplate上，然后将dimple plate连样本板一起反转(过程中两块板不可水平移动)，让树脂掉到孔里。
用膜把板封好，放在旋转器上颠倒摇匀1h。
以3200g(标准板离心机的2000rpm)将板离心5分钟。
8.点样
用点样仪进行体积检查(volume Check)以找出合适的点样速度(dispensingspeed)。注意，点3点标准品(3pt-calibrant)的点样速度最少要达到90mm/sec。
以板上的真正样本进行体积检查k，然后用MassARRAYTM Nanodispenser RS1000/Fusio(RS1000/Fusio点样仪)或自备点样仪将样本自动点样到芯片(SpectroCHIP)上。
9.MALDI-TOF MS基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱
将芯片放到MassARRAY Typer Workstation MA4或Compact里打质谱，FlexControl和SpectroAcquire的参数要设定为iPLEXGOLD(iPLEX.par)。
注：使用Typer 4 Plate Editor编板时样本档要以纵向导入，而且在编板前将原数据应用在样本上。
三、结果
图1-图26为测得的26个阴性对照组的各位点的质谱图，图27-图31为实验组测得的部分阳性质谱图，从质谱图可以很清楚的看出有突变的SNP位点的突变情况，如对于1555位点(对比图15和图29)，说明有A向G的纯合突变发生。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州金域医学检验中心有限公司
<120> 耳聋相关基因SNP检测用的引物系统、检测方法和应用
<160> 61
<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
cctcacgcac cgtcccc 17
<210> 43
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
gggactgcta cattgcc 17
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
gaagtaggtg aagattttct tct 23
<210> 45
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
attggcctac cggagac 17
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
cttaccatgt tacgacttg 19
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
ggcggacaca ccgcccgtca c 21
<210> 48
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
aaggacacat tctttttga 19
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
ctctagatag agtatagcat ca 22
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
tcgaaccact gctctttccc 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
taagaatcct gagaagatgt 20
<210> 52
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
aagatccagt gctctcctgg acggcc 26
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
gaggcgatga aagtgtgcag c 21
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
ttgttaagag ggcagccccc tg 22
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
tgaatggcag tagcaattat cgtc 24
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
aggtacgtca tttcgggagt tagta 25
<210> 57
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
ttgtaagttc attacctgta taattc 26
<210> 58
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
cactaaaacc agaaccttac cacccgc 27
<210> 59
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
aaggcgatat agctccacag tcaagca 27
<210> 60
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
tagaaaacaa atttctaggg ataaaata 28
<210> 61
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
acgttggatg 10
Claims (10)
1.一种耳聋相关基因SNP检测用的引物系统，其特征在于，包括下表中组别为1～17的17组引物组合中的至少一组：
其中，每组引物组合包括PCR扩增引物对及与该PCR扩增引物对对应的测序引物。
2.如权利要求1所述的耳聋相关基因SNP检测用的引物系统，其特征在于，所述PCR扩增引物对的每条引物的5’端还连接有保护片段。
3.如权利要求2所述的耳聋相关基因SNP检测用的引物系统，其特征在于，所述保护片段的序列如SEQ ID NO:61所示。
4.如权利要求1～3中任一项所述的耳聋相关基因SNP检测用的引物系统，其特征在于，包括组别为1～17的共17组引物组合。
5.一种耳聋检测方法，其特征在于，使用如权利要求1～4中任一项所述的耳聋相关基因SNP检测用的引物系统，所述耳聋检测方法包括如下步骤：
使用所述PCR扩增引物对对基因组DNA进行PCR扩增；
使用所述测序引物对PCR扩增的产物进行单碱基延伸；
将单碱基延伸的产物与靶片的基质共结晶，并将得到的晶体置于质谱仪中，进行质谱检测。
6.如权利要求5所述的耳聋检测方法，其特征在于，还包括在进行所述单碱基延伸之前对PCR扩增的产物进行纯化，和/或在共结晶之前对所述单碱基延伸的产物进行脱盐处理的步骤。
7.如权利要求1～4中任一项所述的耳聋相关基因SNP检测用的引物系统在制备用于检测耳聋的试剂中的应用。
8.一种耳聋检测试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1～4中任一项所述的耳聋相关基因SNP检测用的引物系统。
9.如权利要求8所述的耳聋检测试剂盒，其特征在于，还包括DNA提取试剂、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、单碱基延伸试剂和延伸产物纯化试剂中的至少一种。
10.如权利要求8或9所述的耳聋检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照试剂和阴性对照试剂。
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