CN112410420B

CN112410420B - 用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因snp位点的专用引物及应用

Info

Publication number: CN112410420B
Application number: CN202011511357.8A
Authority: CN
Inventors: 张鹏; 王瑛; 吕江宁
Original assignee: 984th Hospital Of Pla Joint Logistics Support Force
Current assignee: 984th Hospital Of Pla Joint Logistics Support Force
Priority date: 2020-12-19
Filing date: 2020-12-19
Publication date: 2022-12-06
Anticipated expiration: 2040-12-19
Also published as: CN112410420A

Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了一种用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的专用引物，包括引物组1和引物组2，引物组1为13对引物组成的特异性PCR引物，引物组2为13条引物组成的单碱基延伸引物。本发明还提供了同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的制剂，以及用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的方法。采用本发明提供的专用引物，通过一次检测即可高效的同时完成“一巴掌致聋”和“一针致聋”高危人群的精准预测，大大减少了检测时间，节约了成本，对于预防“一巴掌致聋”和“一针致聋”以及由此引起的“因聋致哑”具有非常高的应用价值。

Description

用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP 位点的专用引物及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的专用引物及应用。

背景技术

耳聋疾病在我国发病率较高。最新研究结果表明，现阶段我国人群携带遗传性耳聋致病基因突变的比例约为12％，即每100个人中有12个携带可导致遗传性耳聋的基因缺陷。2008年、2009年和2010年我国先天性耳聋发生率依次为1.99‰、2.15‰和2.19‰，即1000个新生儿中就有2-3名聋儿，其中一半以上的新生聋儿是由致聋基因突变导致的遗传性耳聋。

个体携带的基因单核苷酸多态性不同，其发病风险也不同，因此通过个体基因多态性检测，可以做到疾病的早发现、早预警、早治疗。通过“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因检测，可以有效避免和降低“一巴掌致聋”和“一针致聋”的悲剧发生，并因此避免和降低“因聋致哑”的发生。

SLC26A4纯合突变的个体，携带“一巴掌致聋”基因。通过SLC26A4基因单核苷酸多态性检测，可对SLC26A4纯合突变的个体做出如下提示和临床建议：1.在日常生活中，严格防止头部撞击及外伤，禁止进行激烈运动，不要用力擤鼻或咳嗽等。2.尽量防止感冒，不要用力擤鼻或咳嗽，勿用耳聋性药物，远离噪音。3.如在原有听力基础上发生下降，应及时就医，按照突发性耳聋治疗，应用血管扩张剂、神经营养剂，必要时使用类固醇激素。4.避免与同基因型耳聋者及杂合突变非耳聋者婚配。5.建议受检者家族内其他成员做婚前基因检测。6.建议进行颞骨CT验证是否为大前庭导水管综合征。7.建议受检者及家族内其他成员在生育时，及时做新生儿耳聋基因检测。8.通过致聋基因检测，可以帮助家庭找到耳聋病因，揭示遗传规律，并可通过科学的遗传咨询，产前诊断等干预和指导，预防“二孩”聋儿出生。9.指导有血缘关系的家族其他成员提前预防，避免后天致聋。

对于12S rRNA均质突变的个体，表明该个体及母系亲属携带药物性耳聋基因，即“一针致聋”基因。通过12S r RNA相关基因单核苷酸多态性检测，可对12S r RNA均质突变的个体做出如下提示和临床建议：1.母系遗传，受检者母亲家族存在家族遗传史，建议家族成员早做遗传性耳聋基因检测。2.该受检者及母系家族成员，尤其是尚未耳聋的亲属，必须终生禁用以下氨基糖苷类抗生素，避免“一针致聋”：链霉素、卡那霉素、妥布霉素、大观霉素、新霉素、庆大霉素、威地霉素、西索米星、小诺霉素、阿司米星、阿米卡星、奈替米星、硫酸依替米星、依克沙、小儿利宝(硫酸庆大霉素)等。3.建议受检者家族内其他成员在生育时，及时做新生儿耳聋基因检测。4.如果受检者是男性，则不会遗传给下一代。5.如果受检者是女性，则会遗传给下一代，因此，必须在生育时，及时做新生儿耳聋基因检测，避免“一针致聋”的情况发生。6.通过致聋基因检测，可以帮助家庭找到耳聋病因，揭示遗传规律，并可通过科学的遗传咨询，产前诊断等干预和指导，预防“二孩”聋儿出生。

传统的检测方法主要采用sanger测序，荧光定量PCR等方法。以上方法虽然也可能在临床上提供较好的价值，但是存在费时、经济成本高、时间成本高等原因，未能在临床上大规模推广使用。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术(MASSARRAY平台)可同时检测多个基因多态性位点，具有兼容性强、通量高、精准度高、性价比高的优点，可同时检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”的精准预防相关基因信息，成本低，操作性强，便于推广。目前尚未有将基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术应用于该领域。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的专用引物及应用。

本发明第一个方面提供了一种用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的专用引物，包括引物组1和引物组2，其中：所述引物组1为特异性PCR引物，包括引物对1-13；所述引物组2为单碱基延伸引物，包括单碱基延伸引物1-13。

本发明第二个方面提供了一种用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的制剂，所述制剂包括试剂一和试剂二；其中：所述试剂一包括根据本发明第一个方面所述的引物组1中的引物对1-引物对13，以及PCR缓冲液、MgCl2、dNTP和DNA聚合酶；所述试剂二包括根据本发明第一个方面所述的引物组2中的单碱基延伸引物1-单碱基延伸引物13，以及单碱基延伸缓冲液、单碱基延伸酶、单碱基延伸终止Mix。

本发明第三个方面提供了一种本发明第一个方面提供的用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的专用引物，或本发明第二个方面提供的用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的制剂在制备用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”的精准检测产品中的应用。

本发明第四个方面提供了一种同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的方法，该方法包括如下步骤：

1)用上述的引物组1中的引物对1-引物对13，以待测样本的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2)将所述PCR扩增产物进行碱性磷酸酶消化，得到消化产物；

3)将所述消化产物用引物组2中的单碱基延伸引物1-单碱基延伸引物13进行单碱基延伸反应，得到单碱基延伸反应产物；

4)将所述单碱基延伸反应产物经过纯化后，进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测，得到待测样本中“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点信息。

使用本发明提供的用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的专用引物，通过一次检测即可高效的同时完成“一巴掌致聋”和“一针致聋”高危人群的精准预测，根据采用的SNP位点设计的引物特异性高，准确度好；采用本发明提供的制剂和方法，大大减少了检测时间，节约了成本，对于预防“一巴掌致聋”和“一针致聋”以及由此引起的“因聋致哑”具有非常高的应用价值，适于推广应用。

附图说明

图中，横坐标的“Low Mass Height”为“低分子量高度”，纵坐标的“high massheight”为“高分子量高度”；“No call”表示“无信号”，“Other”表示“其他”。

图1为本发明实施例2的rs111033305的检测结果。

图2为本发明实施例2的rs111033318的检测结果。

图3为本发明实施例2的rs200455203的检测结果。

图4为本发明实施例2的rs201562855的检测结果。

图5为本发明实施例2的rs267606617的检测结果。

图6为本发明实施例2的rs121908363的检测结果。

图7为本发明实施例2的rs267606619的检测结果。

图8为本发明实施例2的rs111033220的检测结果。

图9为本发明实施例2的rs121908362的检测结果。

图10为本发明实施例2的rs1057516953的检测结果。

图11为本发明实施例2的rs111033380的检测结果。

图12为本发明实施例2的rs192366176的检测结果。

图13为本发明实施例2的rs111033313的检测结果。

图14为本发明对比例1中使用引物组1的rs111033305的检测结果。

图15为本发明对比例1中使用引物组1的rs201562855的检测结果。

图16为本发明对比例1中使用引物组2的rs121908363的检测结果。

图17为本发明对比例2中平行反应条件1的rs111033313的检测结果。

图18为本发明对比例2中平行反应条件2的rs267606617的检测结果。

图19为本发明对比例2中平行反应条件2的rs121908363的检测结果。

图20为本发明对比例3的rs111033313的检测结果。

图21为本发明对比例3的rs121908362的检测结果。

具体实施方式

为使本发明的技术方案、目的和优点更加清楚，下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明的第一个方面提供了一种用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的专用引物，包括引物组1和引物组2；其中：

所述引物组1为特异性PCR引物，包括引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9、引物对10、引物对11、引物对12、引物对13；

所述引物对1由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成；

所述引物对2由序列3所示的单链DNA分子和序列4所示的单链DNA分子组成；

所述引物对3由序列5所示的单链DNA分子和序列6所示的单链DNA分子组成；

所述引物对4由序列7所示的单链DNA分子和序列8所示的单链DNA分子组成；

所述引物对5由序列9所示的单链DNA分子和序列10所示的单链DNA分子组成；

所述引物对6由序列11所示的单链DNA分子和序列12所示的单链DNA分子组成；

所述引物对7由序列13所示的单链DNA分子和序列14所示的单链DNA分子组成；

所述引物对8由序列15所示的单链DNA分子和序列16所示的单链DNA分子组成；

所述引物对9由序列17所示的单链DNA分子和序列18所示的单链DNA分子组成；

所述引物对10由序列19所示的单链DNA分子和序列20所示的单链DNA分子组成；

所述引物对11由序列21所示的单链DNA分子和序列22所示的单链DNA分子组成；

所述引物对12由序列23所示的单链DNA分子和序列24所示的单链DNA分子组成；

所述引物对13由序列25所示的单链DNA分子和序列26所示的单链DNA分子组成；

所述引物组2为单碱基延伸引物(UEP)，由一系列分子量梯度递增、碱基数也梯度递增的单碱基引物组成，包括单碱基延伸引物1、单碱基延伸引物2、单碱基延伸引物3、单碱基延伸引物4、单碱基延伸引物5、单碱基延伸引物6、单碱基延伸引物7、单碱基延伸引物8、单碱基延伸引物9、单碱基延伸引物10、单碱基延伸引物11、单碱基延伸引物12、单碱基延伸引物13；该系列每条引物只做一个碱基的延伸，13条延伸产物的分子量梯度递增、碱基数也梯度递增。

所述单碱基延伸引物1为序列27所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物2为序列28所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物3为序列29所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物4为序列30所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物5为序列31所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物6为序列32所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物7为序列33所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物8为序列34所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物9为序列35所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物10为序列36所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物11为序列37所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物12为序列38所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物13为序列39所示的单链DNA分子。

上述引物组1中的引物对1-引物对13中的各条引物(序列1-26所示的单链DNA分子)为等摩尔比混合，构成扩增引物Mix。

上述引物组2中的单碱基延伸引物1-13(序列27-39所示的单链DNA分子)为等摩尔比混合，构成单碱基延伸引物Mix。

其中，所述SNP位点为rs111033305(对应使用的是引物对1和单链延伸引物1)、rs111033318(对应使用的是引物对2和单链延伸引物2)、rs200455203(对应使用的是引物对3和单链延伸引物3)、rs201562855(对应使用的是引物对4和单链延伸引物4)、rs267606617(对应使用的是引物对5和单链延伸引物5)、rs121908363(对应使用的是引物对6和单链延伸引物6)、rs267606619(对应使用的是引物对7和单链延伸引物7)、rs111033220(对应使用的是引物对8和单链延伸引物8)、rs121908362(对应使用的是引物对9和单链延伸引物9)、rs1057516953(对应使用的是引物对10和单链延伸引物10)、rs111033380(对应使用的是引物对11和单链延伸引物11)、rs192366176(对应使用的是引物对12和单链延伸引物12)和rs111033313(对应使用的是引物对13和单链延伸引物13)。

本发明的第二个方面提供了一种用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的制剂，所述制剂包括试剂一和试剂二；其中：

所述试剂一包括根据本发明的第一个方面所述的引物组1中的引物对1-引物对13，以及PCR缓冲液、MgCl₂、dNTP和DNA聚合酶。

所述试剂二包括根据本发明的第一个方面所述的引物组2中的单碱基延伸引物1-单碱基延伸引物13，以及单碱基延伸缓冲液、单碱基延伸酶、单碱基延伸终止Mix。

所述试剂一中，所述引物对1-引物对13中的26条引物在所述试剂一中的浓度均为0.5μM。所述PCR缓冲液可以商购获得，PCR缓冲液中的成分为常用的PCR缓冲组分。所述MgCl₂在所述试剂一中的浓度为2mM。所述dNTP在试剂一中的浓度为0.5mM。所述DNA聚合酶可以为Hotstar Taq DNA聚合酶，且在试剂一中的浓度为0.2U/μL。

所述试剂二中，所述单碱基延伸引物1-单碱基延伸引物13在试剂二中的浓度均为0.5μM。所述单碱基延伸缓冲液、单碱基延伸酶、单碱基延伸终止Mix均可以商购获得，例如均可以为购自Agena BIOSCIENCE的商品。

在本发明的第二个方面提供的用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的制剂中，试剂一和试剂二联合使用，即组成多重巢式PCR反应体系。

本发明的第三个方面提供了一种根据本发明的第一个方面提供的用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的专用引物，或根据本发明的第二个方面提供的用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的制剂在制备用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”的精准检测产品中的应用。

其中，所述SNP位点如上所述。

本发明的第四个方面提供了一种同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的方法，该方法包括如下步骤：

2)将所述PCR扩增产物进行碱性磷酸酶消化，得到消化产物；

其中，步骤1)中，所述PCR扩增的程序为：

先94℃2min预变性；再94℃20s、56℃30s、72℃60s进行45个循环；再72℃3min；最后4℃保存。

步骤2)中，所述碱性磷酸酶消化的条件为：37℃、40min，85℃、5min，4℃保存。

步骤3)中，所述单碱基延伸反应的程序为：94℃30s；先94℃5s，再52℃5s、80℃5s、5个循环，共进行40个循环；再72℃3min；最后4℃保存。

步骤4)中，所述纯化可以为树脂纯化。

其中，所述SNP位点如上所述。

采用本发明提供的用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的专用引物、相关制剂和方法能高效一次性地同时完成“一巴掌致聋”和“一针致聋”的检测，对于指导“一巴掌致聋”和“一针致聋”的治疗，具有非常高的应用价值，适于推广应用。

下述实施例中所使用的各种试剂、材料等，若无特别说明，均为可以从商业渠道获得的产品；下述实施例中所使用的各种测试、检测方法若无特别说明，均为本领域中的常规测试、检测方法，均可以从教科书、工具书或学术期刊中获得。

实施例1

本实施例用来说明本发明提供的用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的专用引物。

根据“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点：rs111033305、rs111033318、rs200455203、rs201562855、rs267606617、rs121908363、rs267606619、rs111033220、rs121908362、rs1057516953、rs111033380、rs192366176、rs111033313，设计特异性PCR引物及单碱基延伸引物，组成多重巢式PCR反应体系，以采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术(MASSARRAY平台)实现“一巴掌致聋”和“一针致聋”的精准预警检测。

特异性PCR引物和单碱基延伸引物包括：

序列1，即rs111033305PCR引物1：5′-ACGTTGGATGTTGTTTTGTGGCCACCACTG-3′。

序列2，即rs111033305PCR引物2：5′-ACGTTGGATGCTGTTGTTCCTACCTGTGTC-3′。

序列3，即rs111033318PCR引物1：5′-ACGTTGGATGCAGAAAACCAGAACCTTACC-3′。

序列4，即rs111033318PCR引物2：5′-ACGTTGGATGTAGCCTTGTGCTTGACTGTG-3′。

序列5，即rs200455203PCR引物1：5′-ACGTTGGATGACGTTCCCAAAGTGCCAATC-3′。

序列6，即rs200455203PCR引物2：5′-ACGTTGGATGGATCTCACTCCAACAACGTC-3′。

序列7，即rs201562855PCR引物1：5′-ACGTTGGATGGTTGTCATCCAGTCTCTTCC-3′。

序列8，即rs201562855PCR引物2：5′-ACGTTGGATGTGGTGGCCACAAAACAAGAG-3′。

序列9，即rs267606617PCR引物1：5′-ACGTTGGATGCACTTTCCAGTACACTTACC-3′。

序列10，即rs267606617PCR引物2：5′-ACGTTGGATGACCCTCCTCAAGTATACTTC-3′。

序列11，即rs121908363PCR引物1：5′-ACGTTGGATGAATGCGGGTTCTTTGACGAC-3′。

序列12，即rs121908363PCR引物2：5′-ACGTTGGATGCCCTCTTGAGATTTCACTTG-3′。

序列13，即rs267606619PCR引物1：5′-ACGTTGGATGCCTCTATATAAATGCGTAGGG-3′。

序列14，即rs267606619PCR引物2：5′-ACGTTGGATGAGTTGAACAGGGCCCTGAAG-3′。

序列15，即rs111033220PCR引物1：5′-ACGTTGGATGCTGTTGTTCCTACCTGTGTC-3′。

序列16，即rs111033220PCR引物2：5′-ACGTTGGATGTTGTTTTGTGGCCACCACTG-3′。

序列17，即rs121908362PCR引物1：5′-ACGTTGGATGAATGCGGGTTCTTTGACGAC-3′。

序列18，即rs121908362PCR引物2：5′-ACGTTGGATGCCCTCTTGAGATTTCACTTG-3′。

序列19，即rs1057516953PCR引物1：5′-ACGTTGGATGGTCAAGGAATGGCTGCTTAG-3′。

序列20，即rs1057516953PCR引物2：5′-ACGTTGGATGGCCAACATCTTACCTTGCAG-3′。

序列21，即rs111033380PCR引物1：5′-ACGTTGGATGCTTGTAAGTTCATTACCTG-3′。

序列22，即rs111033380PCR引物2：5′-ACGTTGGATGGACACTGCAGCTAGAGATAC-3′。

序列23，即rs192366176PCR引物1：5′-ACGTTGGATGGAAGTCTCAAAAGAGGTTAG-3′。

序列24，即rs192366176PCR引物2：5′-ACGTTGGATGTTCTATGGCAATGTCGATGG-3′。

序列25，即rs111033313PCR引物1：5′-ACGTTGGATGGTTCAGCATTATTTGGTTGAC-3′。

序列26，即rs111033313PCR引物2：5′-ACGTTGGATGGGCTCCATATGAAATGGCAG-3′。

序列27，即rs111033305单碱基延伸引物：5′-CCACTGCTCTTTCCC-3′。

序列28，即rs111033318单碱基延伸引物：5′-GAACCTTACCACCCGC-3′。

序列29，即rs200455203单碱基延伸引物：5′-TGCCAATCCATAGCCTT-3′。

序列30，即rs201562855单碱基延伸引物：5′-TTGCCTTTGGGATCAGC-3′。

序列31，即rs267606617单碱基延伸引物：5′-TCTTACCATGTTACGACTTG-3′。

序列32，即rs121908363单碱基延伸引物：5′-CAAGGACACATTCTTTTTGA-3′。

序列33，即rs267606619单碱基延伸引物：5′-CTTTGAAGTATACTTGAGGAG-3′。

序列34，即rs111033220单碱基延伸引物：5′-TCCATTGCTCTCCTGGACGGCC-3′。

序列35，即rs121908362单碱基延伸引物：5′-GACACATTCTTTTTGACGGTCC-3′。

序列36，即rs1057516953单碱基延伸引物：5′-TGACGTCATTTCGGGAGTTAGTA-3′。

序列37，即rs111033380单碱基延伸引物：5′-GTAAGTTCATTACCTGTATAATTC-3′。

序列38，即rs192366176单碱基延伸引物：5′-AAAACAAATTTCTAGGGATAAAATA-3′。

序列39，即rs111033313单碱基延伸引物：5′-GTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTTC-3′。

实施例2

本实施例用来说明本发明提供的用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的方法。

1、模板全基因组DNA提取

提取384例外周血基因组DNA，浓度统一稀释至20-30ng/μL。

2、PCR反应

在5μL PCR 96孔板中配制反应体系：模板DNA 1μL，扩增引物Mix1μL，PCR缓冲液(含15mM Mg²⁺)0.5μL，MgCl₂(25mM)0.4μL，dNTP(25mM)0.1μL，Hotstar Taq(5U/μL)0.2μL，用MBG(Molecular Biology Grade)水补齐到5μL。用封口膜将384孔板密封。

PCR扩增引物Mix由序列1-26所示的引物和水组成，其中，每条引物的浓度为0.5μM。

上述PCR反应程序设置如下：

3、碱性磷酸酶处理(SAP消化反应)

在上述第2步得到的PCR反应产物中加入如下组分，获得SAP消化反应体系：

SAP Buffer 0.17μL，SAP Enzyme 0.30μL，MBG水1.53μL。

将上述SAP消化反应体系按照如下消化反应程序，进行SAP消化反应：37℃，40min；85℃，5min；4℃，∞。

4、单碱基延伸反应

在上述步骤3得到的消化反应产物中加入如下组分，获得单碱基延伸反应体系：

单碱基延伸缓冲液iPLEX Buffer plus(Agena BIOSCIENCE，Ref:01431,lot:0000021844)0.2μL，单碱基延伸酶iPLEX Enzyme(Agena BIOSCIENCE，Ref:01432,lot:0000021845)0.041μL，单碱基延伸终止Mix iPLEX Terminator(Agena BIOSCIENCE，Ref:01430,lot:0000021435)0.2μL，MBG水0.619μL，单碱基延伸引物Mix 0.940μL。

上述单碱基延伸引物Mix由上述的13条特异性引物(序列27-39)和水组成，其中每条引物的浓度均为0.5μM。

将上述单碱基延伸反应体系，按照如下反应程序，进行单碱基延伸反应，得到单碱基延伸反应产物。

单碱基延伸反应程序：

5、树脂纯化

将上述步骤4得到的单碱基延伸反应产物进行树脂纯化，具体如下：

1)将上述步骤4得到的装有单碱基延伸产物的384反应板3000rpm离心2min，每孔加16μL的MBG水，封口膜将反应板封好，3000rpm瞬时离心。

2)取一张干净的A4纸，将树脂板(规格为6mg)置于其上，用小勺取适量树脂(AgenaBIOSCIENCE，产品ref:08040lot:0000022403)置于树脂板上，用塑料盖板反复左右推平树脂，压实，使每孔树脂含量均匀。

3)将离心后的384反应板倒置在已经铺好树脂的树脂板上，两块板的孔一一对应。翻转两个板，使树脂板在上，384反应板在下。均匀轻轻敲打树脂板背面，使树脂落入装有单碱基延伸产物的384反应板中。

4)用封口膜将装有单碱基延伸产物和树脂的384反应板密封，摇床低速垂直旋转30min，使树脂与反应物充分接触。

5)将反应完成后的384反应板3000rpm离心5min使树脂沉入管底，上清即为纯化产物。

6、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测：

将上述步骤5得到的纯化产物通过点样仪转移到芯片(Agena BIOSCIENCE，产品ref:01509lot:0000022421)上，放入质谱仪中，进行质谱检测(质谱检测分子量范围：4500-8000道尔顿)。

如图1-13所示，得到rs111033305、rs111033318、rs200455203、rs201562855、rs267606617、rs121908363、rs267606619、rs111033220、rs121908362、rs1057516953、rs111033380、rs192366176、rs111033313的SNP位点信息结果。由这些图可以看出，每个位点的检出率均在97％以上，说明本发明的专用引物和方法可以用于这些SNP位点的信息检测。

7、结果判读：通过质谱检测结果，参考下表1，为“一巴掌致聋”和“一针致聋”的风险进行精准预测及禁用药预警。

表1.基因的SNP位点信息指导表型分析

注释：上表中，如果出现同一个体对不同检测位点的检测结果的临床意义判读不一致的情况，临床医生将再结合该特定个体的耳聋情形(例如主诉病情病史等)，综合判断不同检测位点对该特定个体的贡献度，再进一步作出合理的判断。

实施例3

本实施例用来说明检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”SNP位点的方法及专用引物的应用。

1、模板DNA(全基因组)提取

将8例“一巴掌致聋”的受检者外周血作为待检样本1-8，8例“一针致聋”的受检者外周血作为待检样本9-16。17-24为正常对照样本。

2、PCR反应：参见实施例2步骤2。

3、碱性磷酸酶处理(SAP消化反应)：参见实施例2步骤3。

4、单碱基延伸反应：参见实施例2步骤4。

5、树脂纯化：参见实施例2步骤5。

6、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测：参见实施例2步骤6。

经检测，在本实施例的24例受检样本中，每个位点的检出率均为100％。结果如表2。

表2 24例受检样本的检测结果

根据表2的结果可以看出，样本1-8为“一巴掌致聋”风险基因型携带者；样本9-16为“一针致聋”风险基因型携带者；样本17-24为正常表型。

经过临床样本验证：

表2的检测结果与我们选择的临床样本完全一致：样本1-8为“一巴掌致聋”患者；样本9-16为“一针致聋”患者；样本17-24为正常人。

由此可见，采用本发明提供的“一巴掌致聋”和“一针致聋”SNP位点的专用引物及方法所检测得到的结果与临床表型完全一致，表明采用本发明提供的“一巴掌致聋”和“一针致聋”SNP位点的专用引物及方法可以很好地预测“一巴掌致聋”和“一针致聋”的风险。

对比例1

引物设计是该项发明的关键，引物与模板的结合率直接影响PCR扩增及单碱基延伸效率，从而影响检测结果的灵敏度和检出率，尤其是单碱基延伸引物的设计要求非常高，除了要求序列与检测位点前的序列完全碱基互补配对外，这13条单碱基延伸引物的长度设计，必须使得产物在分子量上呈梯度递增，以使产物产生分子量差异，以实现质谱检测。

针对每个SNP位点，发明人平行设计了3组PCR引物和单碱基延伸引物(实施例1-3为引物组3，表3-4中列出了引物组1-2)，按照实施例2中的方法将384例样本分别用引物组1-2分别检测(即，除了将实施例2中所采用的引物组3更换成表3中的引物组1或表4中的引物组2之外，本对比例中其他的操作参数与实施例2相同)。

表3引物组1

表4.引物组2

本对比例中的部分结果如图14-16所示，其中：

图14为rs111033305位点使用引物组1的检测结果。

图15为rs201562855位点使用引物组1的检测结果。

图16为rs121908363位点使用引物组2的检测结果。

检测结果发现，使用引物组1或引物组2均出现有位点检出率低，聚类效果差的情况。具体的检出率如下：

使用引物组1检测时，在384例受检样本中，各个位点的检出率如下：rs111033305检出率为75.2％、rs111033318检出率为35.9％、rs200455203检出率为56.2％、rs201562855检出率为81.0％、rs267606617检出率为89.9％、rs121908363检出率为92.7％、rs267606619检出率为56.1％、rs111033220检出率为92.8％、rs121908362检出率为59.2％、rs1057516953检出率为58.5％、rs111033380检出率为91.0％、rs192366176检出率为90.2％、rs111033313检出率为24.5％。

使用引物组2检测时，在384例受检样本中，各个位点的检出率如下：：rs111033305检出率为47.2％、rs111033318检出率为89.3％、rs200455203检出率为82.5％、rs201562855检出率为46.8％、rs267606617检出率为59.8％、rs121908363检出率为2.3％、rs267606619检出率为42.6％、rs111033220检出率为29.6％、rs121908362检出率为56.1％、rs1057516953检出率为89.2％、rs111033380检出率为54.5％、rs192366176检出率为86.2％、rs111033313检出率为88.7％。

由此可见，与本对比例相比，采用实施例2中的引物组3具有检出率高、灵敏度高、聚类效果好、特异性高、可信度高的有点。

对比例2

在摸索出实施例的反应体系时，做出了如下平行反应条件摸索实验：

以下为平行反应条件1：

PCR反应：每条引物终浓度为0.3μM,MgCl2的终浓度为2mM，dNTP的终浓度为0.5mM，Hotstar Taq的终浓度为0.05U/μL。PCR反应程序设置如下：

SAP酶消化：消化反应程序：37℃，45min；85℃，5min；4℃，∞

单碱基延伸反应：

以下为平行反应条件2：

PCR反应：每条引物终浓度为0.1μM,MgCl2的终浓度为2mM，dNTP的终浓度为0.5mM，Hotstar Taq的终浓度为0.07U/μL。PCR反应程序设置如下：

SAP酶消化：消化反应程序：37℃，45min；85℃，5min；4℃，∞。

单碱基延伸反应：

除了分别使用上述两个平行反应条件替换掉实施例2中的相应反应条件外，其他参照参数均与实施例2相同。

结果发现，采用平行反应条件1或者平行反应条件2检测时，均出现了有的位点检出率低，聚类效果差的问题。

其中，采用平行反应条件1检测的rs111033313位点的结果如图17所示，采用平行反应条件2检测的rs267606617的结果如图18所示，采用平行反应条件2检测的rs121908363的结果如图19所示。

具体地，采用平行反应条件1时，在384例受检样本中，各个位点的检出率如下：

rs111033305检出率为82.6％、rs111033318检出率为86.3％、rs200455203检出率为59.1％、rs201562855检出率为68.3％、rs267606617检出率为91.2％、rs121908363检出率为53.4％、rs267606619检出率为78.5％、rs111033220检出率为93.1％、rs121908362检出率为74.9％、rs1057516953检出率为75.1％、rs111033380检出率为23.8％、rs192366176检出率为53.4％、rs111033313检出率为11.2％。

采用平行反应条件2时，在384例受检样本中，各个位点的检出率如下：

rs111033305检出率为86.2％、rs111033318检出率为92.0％、rs200455203检出率为62.1％、rs201562855检出率为38.4％、rs267606617检出率为27.3％、rs121908363检出率为62.2％、rs267606619检出率为88.2％、rs111033220检出率为68.2％、rs121908362检出率为72.9％、rs1057516953检出率为62.7％、rs111033380检出率为90.4％、rs192366176检出率为74.2％、rs111033313检出率为76.1％。

对比例3

除了在实施例2中使用的所有引物的基础上另外再加入先天性遗传性耳聋相关的SNP位点rs80338943的引物之外，其他均与实施例2相同。

其中，先天性遗传性耳聋相关的SNP位点rs80338943的引物序列如下：

rs80338943-PCR引物1：5′-ACGTTGGATG AGATGAGCAGGCCGACTTTG-3′；

rs80338943-PCR引物2：5′-ACGTTGGATG TTCATCAAGGGGGAGATAAA-3′；

rs80338943-UEP引物：5′-TCCGGCTATGGGCC-3′。

结果发现，在保持实施例2的各种操作参数不变的情况下，即使增加一个前述13个位点之外的入先天性遗传性耳聋相关的SNP位点rs80338943的相关引物组，就会破坏实施例1的反应体系和反应条件的兼容性，导致前述13个SNP位点的检出率出现下降，聚类效果变差。

具体地，各个位点的检出率如下：rs111033305检出率为65.4％、rs111033318检出率为52.3％、rs200455203检出率为89.5％、rs201562855检出率为75.1％、rs267606617检出率为92.3％、rs121908363检出率为85.1％、rs267606619检出率为65.8％、rs111033220检出率为89.3％、rs121908362检出率为51.8％、rs1057516953检出率为91.5％、rs111033380检出率为84.2％、rs192366176检出率为76.3％、rs111033313检出率为33.6％。其中，图20示出了rs111033313的检测结果；图21示出了rs121908362的检测结果。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国人民解放军联勤保障部队第九八四医院

<120> 用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的专用引物及应用

<160> 39

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgttggatg ttgttttgtg gccaccactg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgttggatg ctgttgttcc tacctgtgtc 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgttggatg cagaaaacca gaaccttacc 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgttggatg tagccttgtg cttgactgtg 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgttggatg acgttcccaa agtgccaatc 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgttggatg gatctcactc caacaacgtc 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acgttggatg gttgtcatcc agtctcttcc 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acgttggatg tggtggccac aaaacaagag 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acgttggatg cactttccag tacacttacc 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acgttggatg accctcctca agtatacttc 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acgttggatg aatgcgggtt ctttgacgac 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

acgttggatg ccctcttgag atttcacttg 30

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acgttggatg cctctatata aatgcgtagg g 31

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acgttggatg agttgaacag ggccctgaag 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

acgttggatg ctgttgttcc tacctgtgtc 30

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acgttggatg ttgttttgtg gccaccactg 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

acgttggatg aatgcgggtt ctttgacgac 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

acgttggatg ccctcttgag atttcacttg 30

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

acgttggatg gtcaaggaat ggctgcttag 30

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

acgttggatg gccaacatct taccttgcag 30

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

acgttggatg cttgtaagtt cattacctg 29

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

acgttggatg gacactgcag ctagagatac 30

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

acgttggatg gaagtctcaa aagaggttag 30

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

acgttggatg ttctatggca atgtcgatgg 30

<210> 25

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

acgttggatg gttcagcatt atttggttga c 31

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

acgttggatg ggctccatat gaaatggcag 30

<210> 27

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ccactgctct ttccc 15

<210> 28

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gaaccttacc acccgc 16

<210> 29

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tgccaatcca tagcctt 17

<210> 30

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ttgcctttgg gatcagc 17

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

tcttaccatg ttacgacttg 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

caaggacaca ttctttttga 20

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ctttgaagta tacttgagga g 21

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tccattgctc tcctggacgg cc 22

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gacacattct ttttgacggt cc 22

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

tgacgtcatt tcgggagtta gta 23

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gtaagttcat tacctgtata attc 24

<210> 38

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

aaaacaaatt tctagggata aaata 25

<210> 39

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gtttttaaca tcttttgttt tatttc 26

Claims

1.一种用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的专用引物，其特征在于：

所述专用引物由引物组1和引物组2组成，其中：

所述引物组1为特异性PCR引物，由如下引物组成：引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9、引物对10、引物对11、引物对12、引物对13；

所述引物组2为单碱基延伸引物，由如下引物组成：单碱基延伸引物1、单碱基延伸引物2、单碱基延伸引物3、单碱基延伸引物4、单碱基延伸引物5、单碱基延伸引物6、单碱基延伸引物7、单碱基延伸引物8、单碱基延伸引物9、单碱基延伸引物10、单碱基延伸引物11、单碱基延伸引物12、单碱基延伸引物13；

所述单碱基延伸引物1为序列27所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物2为序列28所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物3为序列29所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物4为序列30所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物5为序列31所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物6为序列32所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物7为序列33所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物8为序列34所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物9为序列35所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物10为序列36所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物11为序列37所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物12为序列38所示的单链DNA分子；

所述单碱基延伸引物13为序列39所示的单链DNA分子。

2.根据权利要求1所述的专用引物，其特征在于：

所述引物组1中的引物对1-引物对13中的各条引物为等摩尔比混合，构成扩增引物Mix；

所述引物组2中的单碱基延伸引物1-单碱基延伸引物13为等摩尔比混合，构成单碱基延伸引物Mix。

3.根据权利要求1或2所述的专用引物，其特征在于：

所述SNP位点为：rs111033305、rs111033318、rs200455203、rs201562855、rs267606617、rs121908363、rs267606619、rs111033220、rs121908362、rs1057516953、rs111033380、rs192366176、rs111033313。

4.一种用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”相关基因SNP位点的制剂，其特征在于：

所述制剂中的引物由权利要求1所述的专用引物组成。

5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于：

所述制剂包括试剂一和试剂二；其中：

所述试剂一包括权利要求1所述的引物组1、PCR缓冲液、MgCl₂、dNTP和DNA聚合酶；

所述试剂二包括权利要求1所述的引物组2、单碱基延伸缓冲液、单碱基延伸酶、单碱基延伸终止Mix。

6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于：

所述试剂一中，所述引物对1-引物对13中的26条引物在所述试剂一中的浓度均为0.5μM；

所述MgCl₂在所述试剂一中的浓度为2mM；

所述dNTP在试剂一中的浓度为0.5mM；

所述DNA聚合酶在试剂一中的浓度为0.2U/μL；

所述试剂二中，所述单碱基延伸引物1-单碱基延伸引物13在试剂二中的浓度均为0.5μM。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的制剂，其特征在于：

8.权利要求1-3中任一项所述的专用引物、或权利要求4-6中任一项所述的制剂在制备用于同时精准检测“一巴掌致聋”和“一针致聋”的精准检测产品中的应用。