JP7382999B2 - 核酸抽出のための細胞溶解用組成物を用いた分子診断方法 - Google Patents
核酸抽出のための細胞溶解用組成物を用いた分子診断方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7382999B2 JP7382999B2 JP2021200055A JP2021200055A JP7382999B2 JP 7382999 B2 JP7382999 B2 JP 7382999B2 JP 2021200055 A JP2021200055 A JP 2021200055A JP 2021200055 A JP2021200055 A JP 2021200055A JP 7382999 B2 JP7382999 B2 JP 7382999B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- vol
- acid extraction
- mixture
- diagnostic method
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 132
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 132
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 132
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 77
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims description 73
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 title claims description 35
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 title claims description 19
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 40
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 35
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 28
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 28
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 28
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 27
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 claims description 13
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 241000186364 Mycobacterium intracellulare Species 0.000 claims description 4
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 9
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 3
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
Description
検査対象であるE-coli DH3のターゲット遺伝子である16S rRNAを増幅するために、スピン-カラム(spin-column)抽出方法で前記遺伝子を抽出した。具体的には、前記検査対象であるE-coli DH3を採取した後、従来のQiagenの抽出方式で溶解過程、精製過程および溶離過程を実施して前記16S rRNAを抽出した。
検査対象であるE-coli DH3のターゲット遺伝子である16S rRNAを増幅するために、E3抽出方法を利用して前記遺伝子を抽出した。より具体的には、E3抽出方法は核酸自動化抽出方法であり、大きく、抽出試薬(E3 NA(Nucleic acid)extraction kit)と抽出装置とに区分することができる。前記方法は、酸化鉄(Iron oxide)でコーティングされたmagnetic beadを用いて人体由来検体から核酸(DNA/RNA)を抽出する方法である。Reagent tubeには4つのwellが具備されており、それぞれLysis Buffer、Washing Buffer、Elution Bufferが含まれている。Lysis BufferとWashing Bufferに含有された高濃度のChaotropic saltは細胞膜を破壊しタンパク質から核酸を分離し、この環境でmagnetic beadは負電荷の核酸と吸着する。Magnetic beadに吸着された核酸は核酸抽出器具(E3装置)のmagnetic rodによってtubeの各カラムに順次に移動し、数回のwashingステップを経る。最後に、Elution bufferがmagnetic beadに吸着されていた核酸を分離させ、magnetic rodがmagnetic beadのみを除去してElution bufferに純粋な核酸だけが残るようになる。上述の方法で16S rRNAを抽出した。
検査対象であるE-coli DH3のターゲット遺伝子である16S rRNAを増幅するために、Tween20と蒸留水を含む核酸抽出のための細胞溶解用組成物を10vol/vol%の濃度のもので用意し、前記組成物に検査対象を含む試料を添加することにより、前記Tween20の濃度を5vol/vol%に調節した混合物を用意した。以後、室温で5分間インギュベーション(incubation)で放置した後、前記混合物を15分間遠心分離機を用いて15,000gで遠心分離した。
前記実験例3において、核酸抽出のための細胞溶解用組成物のTween20の濃度を20vol/vol%に調節したことと、前記混合物における前記Tween20の濃度を10vol/vol%に調節したことを除き、前記実験例3と同様に、毎サイクルごとに蛍光値およびCt(Threshold Cycle)を測定し、前記実験例1とのCtの差である△Ctを計算して、下記表1にまとめた。
前記実験例3において、核酸抽出のための細胞溶解用組成物を、Tween20の代わりにTriton X-100を用いたことを除き、前記実験例3と同様に、毎サイクルごとに蛍光値およびCt(Threshold Cycle)を測定し、前記実験例1とのCtの差である△Ctを計算して、下記表1にまとめた。
前記実験例4において、核酸抽出のための細胞溶解用組成物を、Tween20の代わりにTriton X-100を用いたことを除き、前記実験例4と同様に、毎サイクルごとに蛍光値およびCt(Threshold Cycle)を測定し、前記実験例1とのCtの差である△Ctを計算して、下記表1にまとめた。
検査対象であるM.tuberculosis、M.avium、およびM.intracellulareに含まれた遺伝子を増幅するために、スピン-カラム(spin-column)抽出方法で前記遺伝子を抽出した。具体的には、前記検査対象であるM.tuberculosis、M.avium、およびM.intracellulareを採取した後、従来のQiagenの抽出方式で溶解過程、精製過程および溶離過程をすべて実施して前記遺伝子を抽出した。
検査対象であるM.tuberculosis、M.avium、およびM.intracellulareに含まれた遺伝子を増幅するために、12.5vol/vol%の濃度となるようにTween20の体積と蒸留水の体積を計量して混合することにより、核酸抽出のための細胞溶解用組成物を製造し、以後、細胞が含まれた試料20μlと前記核酸抽出のための細胞溶解用組成物20μlとを混合してTween20の濃度が6.25vol/vol%となるように試料が含まれた混合物を製造した(以後、以下のPCR反応液総液40ulでTween20の最終濃度が2.5vol/vol%となるようにするために濃度を調節した)。
S13:核酸抽出および増幅ステップ
Claims (7)
- 10.0~12.5vol/vol%の濃度のTween20および蒸留水からなる核酸抽出のための細胞溶解用組成物;核酸を含む試料;プレミックス;ならびにプライマーおよびプローブが含まれた溶液;を含む混合物を製造するステップと、
前記混合物に対して重合酵素連鎖反応を行って核酸を抽出および増幅するステップとを含む分子診断方法であって、前記核酸が分子診断のためのものであり、前記細胞がE-coli、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium aviumまたはMycobacterium intracellulareに由来する、分子診断方法。 - 前記試料と前記細胞溶解用組成物の体積比は、1:0.5~1:2.0である、請求項1に記載の分子診断方法。
- 前記プレミックス;ならびに前記プライマーおよびプローブが含まれた溶液;の体積比は、1:1~1:10である、請求項1に記載の分子診断方法。
- 前記核酸が抽出された混合物;と前記プレミックス;の体積比は、1:0.5~1:2.0である、請求項1に記載の分子診断方法。
- 前記核酸を抽出および増幅するステップは、60℃超過100℃以下の温度で行われるものである、請求項1に記載の分子診断方法。
- 前記混合物を製造するステップの後、
前記混合物をインキュベータに具備して放置するステップをさらに含む、請求項1に記載の分子診断方法。 - 前記インキュベータに放置するステップは、1分以上10分以下の間に行われるものである、請求項6に記載の分子診断方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2023133043A JP2023156461A (ja) | 2020-12-28 | 2023-08-17 | 核酸抽出のための細胞溶解用組成物を用いた分子診断方法 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020200184288A KR102315146B1 (ko) | 2020-12-28 | 2020-12-28 | 핵산 추출을 위한 세포 용해용 조성물을 이용한 분자진단방법 |
KR10-2020-0184288 | 2020-12-28 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023133043A Division JP2023156461A (ja) | 2020-12-28 | 2023-08-17 | 核酸抽出のための細胞溶解用組成物を用いた分子診断方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022104557A JP2022104557A (ja) | 2022-07-08 |
JP7382999B2 true JP7382999B2 (ja) | 2023-11-17 |
Family
ID=78268092
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021200055A Active JP7382999B2 (ja) | 2020-12-28 | 2021-12-09 | 核酸抽出のための細胞溶解用組成物を用いた分子診断方法 |
JP2023133043A Pending JP2023156461A (ja) | 2020-12-28 | 2023-08-17 | 核酸抽出のための細胞溶解用組成物を用いた分子診断方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023133043A Pending JP2023156461A (ja) | 2020-12-28 | 2023-08-17 | 核酸抽出のための細胞溶解用組成物を用いた分子診断方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220205016A1 (ja) |
EP (1) | EP4019644A1 (ja) |
JP (2) | JP7382999B2 (ja) |
KR (1) | KR102315146B1 (ja) |
CN (1) | CN114686575A (ja) |
TW (1) | TW202229563A (ja) |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6265164B1 (en) * | 1998-03-26 | 2001-07-24 | Biochain Institute, Inc. | Compositions and methods for directly and rapidly analyzing the biochemical components of microorganisms |
KR20070003883A (ko) * | 2004-02-09 | 2007-01-05 | 후소 야쿠힝 고교 가부시끼가이샤 | 핵산 검출방법 및 그 이용 |
CA2694411A1 (en) * | 2007-07-27 | 2009-02-05 | Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. | An improved nucleic acid purification method |
CN101294221B (zh) * | 2008-06-23 | 2011-05-04 | 福建农林大学 | 一种大批量快速制备pcr模板的方法 |
-
2020
- 2020-12-28 KR KR1020200184288A patent/KR102315146B1/ko active IP Right Grant
-
2021
- 2021-11-01 TW TW110140588A patent/TW202229563A/zh unknown
- 2021-12-06 CN CN202111476159.7A patent/CN114686575A/zh active Pending
- 2021-12-07 US US17/544,285 patent/US20220205016A1/en active Pending
- 2021-12-09 JP JP2021200055A patent/JP7382999B2/ja active Active
- 2021-12-17 EP EP21215484.3A patent/EP4019644A1/en active Pending
-
2023
- 2023-08-17 JP JP2023133043A patent/JP2023156461A/ja active Pending
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
F. Guan, et al.,Food Analytical Methods,2019年,Vol.12,p.100-107 |
I. Smyrlaki, et al.,nature communications,2020年09月23日,Vol.11:4812,p.1-12 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2022104557A (ja) | 2022-07-08 |
CN114686575A (zh) | 2022-07-01 |
KR102315146B1 (ko) | 2021-10-20 |
US20220205016A1 (en) | 2022-06-30 |
JP2023156461A (ja) | 2023-10-24 |
TW202229563A (zh) | 2022-08-01 |
EP4019644A1 (en) | 2022-06-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN113166797B (zh) | 基于核酸酶的rna耗尽 | |
AU2009201529B2 (en) | Apparatus For Polynucleotide Detection and Quantitation | |
CN107660234A (zh) | 使用二代测序预测器官移植排斥的方法 | |
WO2017088169A1 (en) | Methods and systems for nucleic acid amplification | |
JP2017523772A (ja) | 液滴ソートによるヌクレオチド配列排除富化(needls) | |
US20210246499A1 (en) | Detection of short homopolymeric repeats | |
Sam et al. | Automation of genomic DNA isolation from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues | |
Khokhar et al. | Evaluation of Maxwell® 16 for automated DNA extraction from whole blood and formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue | |
US11104948B2 (en) | NGS systems control and methods involving the same | |
JP2018520706A (ja) | 試料採取からngsライブラリ調製までの自動化 | |
JP2016520330A (ja) | 改良されたngsワークフロー | |
CN106834286B (zh) | 一步法快速构建扩增子文库的引物组合 | |
CN113265452A (zh) | 一种基于Nanopore宏基因组RNA-seq的生物信息学检测病原体的方法 | |
JP7382999B2 (ja) | 核酸抽出のための細胞溶解用組成物を用いた分子診断方法 | |
EP3325697B1 (en) | Optimized clinical sample sequencing | |
US11674133B2 (en) | Methods and compositions for extracting nucleic acids using ferric oxide particles | |
US20220372464A1 (en) | System and method for automatic nucleic acid extraction and quialitative analysis | |
CN114292935A (zh) | 一种检测结核分支杆菌耐药基因的核酸组合物、试剂盒及检测结核分支杆菌耐药性的方法 | |
Jeong et al. | An efficient genomic DNA extraction from whole blood using Nextractor | |
CN111154836A (zh) | 靶向核酸捕获和检测方法 | |
CN108998512A (zh) | 免提取的用于cyp2c19基因多态性检测的试剂盒及检测方法 | |
RU2809735C1 (ru) | Способ определения бактерии вида Mycobacterium tuberculosis методом петлевой изотермической амплификации (LAMP) | |
CN110938702B (zh) | 一种实时荧光pcr检测鸟分枝杆菌的方法及其应用 | |
JP2001169778A (ja) | 迅速細菌遺伝子検査法及びキット | |
CN108034721B (zh) | 检测白血病nup98系列融合基因寡核苷酸、检测方法和试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20211210 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221219 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230317 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20230626 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20230712 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20230712 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230817 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20230823 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20231016 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20231107 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7382999 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |