CN108034721B - 检测白血病nup98系列融合基因寡核苷酸、检测方法和试剂盒 - Google Patents

检测白血病nup98系列融合基因寡核苷酸、检测方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明是一种用于检测白血病NUP98系列融合基因引物、试剂盒及检测方法，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT Kit、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。利用实时荧光PCR中的Taqman探针技术检测患者体内NUP98/HOXD11、NUP98/HOXD13、NUP98‑KDM5A、NUP98/HOXA11、NUP98/HOXA9和NUP98‑NSD16种融合基因的表达情况以及对高危人群进行较为准确的筛查和鉴定，具有特异性好，灵敏度高，方法简便高效的特点。

Description

检测白血病NUP98系列融合基因寡核苷酸、检测方法和试剂盒
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，具体涉及一种检测白血病NUP98系列融合基因检测试剂盒。
背景技术
核孔复合物(nucleoporin gene,NPC)贯穿于核膜，作为细胞核与细胞质物质交换的惟一通道，在细胞正常的生长与分化中发挥着重要作用。研究表明核孔蛋白的结构和功能异常会引发多种人类疾病，其中因染色体易位产生的核孔蛋白NUP98系列融合基因已被证实和多种白血病关系密切。
在易位产生的融合基因中，较为普遍的是NUP98与同源框基因(homebox gene,HOX)的异常融合，其中NUP98/HOXA9、NUP98/HOXA11因t(7；11)(p15；p15)易位所致，与人类急性粒细胞性白血病(acute myelognous leukemia，AML)、慢性粒细胞白血病(chronicmyelocytic leukemia，CML)和骨髓异常增生综合症(myelodysplastic syndromes，MDS)密切相关，而NUP98/HOXD11和NUP98/HOXD11由t(2；11)(q31；p15)易位所致，最终可致AML。由于NUP98/HOX融合基因中，NUP98均断裂于12号内含子或附近，且融合后的HOX羧基端均含HD同源域，这样NUP98/HOX融合基因就保留了NUP98蛋白的N端的FG重复序列和HOX蛋白C端的同源盒结构域。因此各NUP98/HOX融合蛋白有着类似的致病机制，即通过NUP98代替HOX N端的转录抑制区域，利用其N端FG重复序列转录激活一系列HOX应答基因，从而导致HOX靶细胞表达失调，干扰粒细胞的正常终末分化而不断增殖，最终产生白血病表型。此外，研究还发现分别由t(5；11)(q35；p15)与t(11；12)(p15；p13)易位导致的融合基因NUP98/NSD1、NUP98/KDM5A亦可上调HOX基因表达，抑制髓系母细胞分化，引发AML。NUP98系列融合基因在AML中发生率只占1％-2％，在CML以及MDS中发生率更低，但是检测这些融合基因对正确诊断及治疗方案制定具有重要的意义。
实时荧光PCR综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在封闭状态下的PCR反应管中进行，其结果用Ct值表示，与普通PCR比较，具有特异度好，灵敏度高，操作简单，结果更直观等优点，被认为是目前微量融合基因检测的首选方法。实时荧光PCR中常见的方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性，而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本试剂盒采用实时荧光PCR结合Taqman探针检测NUP98系列融合基因。
发明内容
为解决上述问题，本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针，采用实时荧光PCR技术，检测内参基因ABL、NUP98系列融合基因的表达情况。试剂盒通过调整内参/目的基因的引物探针比例，以及PCR反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳。
用于NUP98系列融合基因的检验试剂盒中包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、实时荧光PCR混合液、阴性对照和阳性对照，其特征在于：
检测目的基因用上下游引物分别为：NUP98/HOXD11-F、NUP98/HOXD11-R、NUP98/HOXD13-F、NUP98/HOXD13-R、NUP98/KDM5A-F、NUP98/KDM5A-R、NUP98/HOXA11-F、NUP98/HOXA11-R、NUP98/HOXA9-F、NUP98/HOXA9-R、NUP98/NSD1-F、NUP98/NSD1-R，探针为NUP98/HOXD11-Probe、NUP98/HOXD13-Probe、NUP98/KDM5A-Probe、NUP98/HOXA11-Probe、NUP98/HOXA9-Probe和NUP98/NSD1-Probe，检测内参基因ABL用引物为ABL-F，ABL-R，探针为ABL-Probe。其中，NUP98/HOXD11-F:TGGCACAAATACCAGTGGGAATNUP98/HOXD11-R:AAACTCGCGTTCCAGTTCGNUP98/HOXD11-Probe:FAM-ATCCTGCACCAAGCCCAGTTCCA-BHQ1NUP98/HOXD13-F:ATTTAATACTACGACAGCCACTTTGNUP98/HOXD13-R:CCCTCTTCGGTAGACGCACNUP98/HOXD13-Probe:FAM-CTTTGGAGCCCCCCAGGC-BHQ1NUP98-KDM5A-F:AATCCGATGTCAGACCCTAANUP98-KDM5A-R:TTTCTAGCTTCCGTTTCCGNUP98-KDM5A-Probe:FAM-TTTCTCTTCCATGCTGTCATCCTC-BHQ1NUP98/HOXA11-F:GGATTTAATACTACGACAGCCACTNUP98/HOXA11-R:TGTAGACGCTGAAGAAGAACTCCNUP98/HOXA11-Probe:FAM-CTGCCCCTATACCAAGTACCAGATCCGA-TAMRANUP98/HOXA9-F:CTACGACAGCCACTTTGGGNUP98/HOXA9-R:TTGTCTCCGCCGCTCTNUP98/HOXA9-Probe:FAM-CCAGGCCCCAGTAGTTGATAGAGAA-BHQ1NUP98-NSD1-F:ATTTAATACTACGACAGCCACTTTGNUP98-NSD1-R:CCTAAGGCGTTTCTTCTCTGANUP98-NSD1-Probe:FAM-CTTTGGAGCCCCCCAGGC-BHQ1ABL-F:GATACGAAGGGAGGGTGTACCAABL-R:CTCGGCCAGGGTGTTGAAABL-Probe:FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA
进一步地，所述cDNA第一链合成试剂采用ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO公司)，所述实时荧光PCR混合液采用THUNDERBIRD qPCR MIX(TOYOBO，QPS-101)，所述阳性对照品分别为含有NUP98系列融合基因质粒；所述阴性对照品为去离子水。
本发明的优点和效果如下：
敏感度高：可检测低至10copies/μl融合基因。特异性强：使用特异性探针识别融合基因序列，准确性高，同时使用探针和引物双重控制，特异性好且假阳性低。全程监控：实时监测全程扩增信号，引入内参、阳性对照和阴性对照有效保证样本质量，降低假阴性和假阳性。安全简便：操作简单安全，自动化程度高而且防止污染。快速：快速而且高通量，完成检测时间为100min
本发明采用实时荧光PCR技术结合Tapman探针，检测受测者体内NUP98系列融合基因和内参基因ABL的表达情况，对于白血病诊断、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。
附图说明
图1使用本发明所述核酸检测试剂盒检测NUP98/HOXD11的结果图例
图2使用本发明所述核酸检测试剂盒检测NUP98/HOXA9的结果图例
图3使用本发明所述核酸检测试剂盒检测NUP98-KDM5A的结果图例
图4使用本发明所述核酸检测试剂盒检测NUP98/HOXD13的结果图例
图5使用本发明所述核酸检测试剂盒检测NUP98/NSD1的结果图例
图6使用本发明所述核酸检测试剂盒检测NUP98/HOXA11的结果图例
具体实施方式
为本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施方式作进一步具体说明。
实施例1试剂盒的制备
1.特异性的引物和探针的设计
根据基因序列(ABL基因序列、NUP98基因序列以及其伙伴基因序列均来自于美国国家生物技术信息中心核酸数据库，ABL基因ID，基因参考序列NM_005157.5；NUP98基因ID4928，基因参考序列NM_005387.6；HOXD11基因ID3237，基因参考序列NM_021192.2；HOXD13基因ID3239，基因参考序列NM_000523.3；KDM5A基因ID5927，基因参考序列NM_001042603.2；HOXA11基因ID3207，基因参考序列NM_005523.5；HOXA9基因ID3205，基因参考序列NM_152739.3；NSD1基因ID64324，基因参考序列NM_022455.4)设计特异性探针和引物。
2.试剂盒组分配制
cDNA第一链合成试剂：ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO公司)；
检测体系PCR反应液：THUNDERBIRD qPCR MIX(TOYOBO，QPS-101)；
引物和探针：包括检测NUP98系列融合基因和内参ABL引物以及与引物相对应的探针，具体如下：
NUP98/HOXD11-F:TGGCACAAATACCAGTGGGAAT
NUP98/HOXD11-R:AAACTCGCGTTCCAGTTCG
NUP98/HOXD11-Probe:FAM-ATCCTGCACCAAGCCCAGTTCCA-BHQ1
NUP98/HOXD13-F:ATTTAATACTACGACAGCCACTTTG
NUP98/HOXD13-R:CCCTCTTCGGTAGACGCAC
NUP98/HOXD13-Probe:FAM-CTTTGGAGCCCCCCAGGC-BHQ1
NUP98-KDM5A-F:AATCCGATGTCAGACCCTAA
NUP98-KDM5A-R:TTTCTAGCTTCCGTTTCCG
NUP98-KDM5A-Probe:FAM-TTTCTCTTCCATGCTGTCATCCTC-BHQ1
NUP98/HOXA11-F:GGATTTAATACTACGACAGCCACT
NUP98/HOXA11-R:TGTAGACGCTGAAGAAGAACTCC
NUP98/HOXA11-Probe:
FAM-CTGCCCCTATACCAAGTACCAGATCCGA-TAMRA
NUP98/HOXA9-F:CTACGACAGCCACTTTGGG
NUP98/HOXA9-R:TTGTCTCCGCCGCTCT
NUP98/HOXA9-Probe:FAM-CCAGGCCCCAGTAGTTGATAGAGAA-BHQ1
NUP98-NSD1-F:ATTTAATACTACGACAGCCACTTTG
NUP98-NSD1-R:CCTAAGGCGTTTCTTCTCTGA
NUP98-NSD1-Probe:FAM-CTTTGGAGCCCCCCAGGC-BHQ1
ABL-F:GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
ABL-R:CTCGGCCAGGGTGTTGAA
ABL-Probe:FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA
阳性对照品：含NUP98系列融合基因质粒；阴性对照品：去离子水。
实施例2本试剂盒的操作流程
1.抽提血液中的总RNA:在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀。室温静置10min；5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；再次加入0.5ml红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入1ml TRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静置5min；加入0.2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm 4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；14000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；14000rpm 4℃离心5min，弃乙醇；室温干燥10-15min，加入20μlRNase-free水溶解沉淀。
2.参考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将RNA反转为cDNA。
3.试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，X＝23μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)每人份23μl分装，每23μl组成如下：
Figure GDA0003055883770000061
4.加样：加入检测体系PCR反应液中2μlcDNA；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。
5.检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35s，反应40个循环，荧光信号于56℃35s时采集。
6.结果判断：若无目的基因扩增信号曲线，内参、阳性对照以及阴性对照检测均正常时，结果为阴性；若有目的基因扩增信号曲线，内参、阳性对照以及阴性对照检测均正常时，结果为阳性。若内参、阳性对照以及阴性对照出现异常，则需查明原因，做出调整后重新检测。
实施例3检测白血病标本以及临床体检标本
1.取送检的白血病患者抗凝血标本共10例，按实施例2所述方法提取基因组RNA、配制试剂并检测。每份标本加入检测体系PCR反应液中2μl。同时做阳性，阴性，空白对照，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。检测时间仅为100分钟。在内参、阳性对照、阴性对照以及空白对照均正常的情况下，由于NUP98系列融合基因在白血病患者当中较为罕见，10例白血病样本均为阴性结果，结果如下表：
Figure GDA0003055883770000062
Figure GDA0003055883770000071
Figure GDA0003055883770000072
2.随机取待检的临床体检样本10例，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品加入检测体系PCR反应液中2μl。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用荧光PCR仪检测，时间为100分钟。实验结果如预期，均为阴性。
实验结果如下表
Figure GDA0003055883770000073
Figure GDA0003055883770000081
Figure GDA0003055883770000082
综上结果表明，本试剂盒可高通量、快速、准确地检测样本，同时具有良好的特异性和可重复性，可有效避免假阳性和假阴性结果。
序列表
<110> 南昌艾迪康医学检验实验室有限公司
<120> 检测白血病NUP98系列融合基因寡核苷酸、检测方法和试剂盒
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggcacaaat accagtggga at 22
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaactcgcgt tccagttcg 19
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atcctgcacc aagcccagtt cca 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atttaatact acgacagcca ctttg 25
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccctcttcgg tagacgcac 19
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctttggagcc ccccaggc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aatccgatgt cagaccctaa 20
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<211> 19
<212> DNA
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<400> 8
tttctagctt ccgtttccg 19
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tttctcttcc atgctgtcat cctc 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggatttaata ctacgacagc cact 24
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<212> DNA
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<400> 11
tgtagacgct gaagaagaac tcc 23
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ctgcccctat accaagtacc agatccga 28
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ccaggcccca gtagttgata gagaa 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cctaaggcgt ttcttctctg a 21
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
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ctttggagcc ccccaggc 18
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gatacgaagg gagggtgtac ca 22
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ctcggccagg gtgttgaa 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gcttctgatg gcaagctcta cgtctcct 28

Claims (4)

1.检测白血病NUP98系列融合基因的寡核苷酸，包括检测NUP98/HOXD11、NUP98/HOXD13、NUP98-KDM5A、NUP98/HOXA11、NUP98/HOXA9和NUP98-NSD1 6种融合基因的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针序列分别为：
NUP98/HOXD11-F: TGGCACAAATACCAGTGGGAAT，
NUP98/HOXD11-R: AAACTCGCGTTCCAGTTCG，
NUP98/HOXD11-Probe: FAM-ATCCTGCACCAAGCCCAGTTCCA-BHQ1，
NUP98/HOXD13-F: ATTTAATACTACGACAGCCACTTTG，
NUP98/HOXD13-R: CCCTCTTCGGTAGACGCAC，
NUP98/HOXD13-Probe: FAM-CTTTGGAGCCCCCCAGGC-BHQ1，
NUP98-KDM5A-F: AATCCGATGTCAGACCCTAA，
NUP98-KDM5A-R: TTTCTAGCTTCCGTTTCCG，
NUP98-KDM5A-Probe: FAM-TTTCTCTTCCATGCTGTCATCCTC-BHQ1，
NUP98/HOXA11-F: GGATTTAATACTACGACAGCCACT，
NUP98/HOXA11-R: TGTAGACGCTGAAGAAGAACTCC，
NUP98/HOXA11-Probe: FAM-CTGCCCCTATACCAAGTACCAGATCCGA-TAMRA，
NUP98/HOXA9-F: CTACGACAGCCACTTTGGG，
NUP98/HOXA9-R: TTGTCTCCGCCGCTCT，
NUP98/HOXA9-Probe: FAM- CCAGGCCCCAGTAGTTGATAGAGAA-BHQ1，
NUP98-NSD1-F: ATTTAATACTACGACAGCCACTTTG，
NUP98-NSD1-R: CCTAAGGCGTTTCTTCTCTGA，
NUP98-NSD1- Probe: FAM-CTTTGGAGCCCCCCAGGC-BHQ1。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，还包括检测内参基因ABL的扩增引物和探针，
ABL-F: GATACGAAGGGAGGGTGTACCA，
ABL-R: CTCGGCCAGGGTGTTGAA，
ABL-Probe: FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
3.检测白血病NUP98系列融合基因的检测试剂盒，其特征在于，包括用于检测白血病NUP98系列融合基因的寡核苷酸，包括检测NUP98/HOXD11、NUP98/HOXD13、NUP98-KDM5A、NUP98/HOXA11、NUP98/HOXA9和NUP98-NSD1 6种融合基因的引物和探针，所述引物和探针序列分别为：
NUP98/HOXD11-F: TGGCACAAATACCAGTGGGAAT，
NUP98/HOXD11-R: AAACTCGCGTTCCAGTTCG，
NUP98/HOXD11-Probe: FAM-ATCCTGCACCAAGCCCAGTTCCA-BHQ1，
NUP98/HOXD13-F: ATTTAATACTACGACAGCCACTTTG，
NUP98/HOXD13-R: CCCTCTTCGGTAGACGCAC，
NUP98/HOXD13-Probe: FAM-CTTTGGAGCCCCCCAGGC-BHQ1，
NUP98-KDM5A-F: AATCCGATGTCAGACCCTAA，
NUP98-KDM5A-R: TTTCTAGCTTCCGTTTCCG，
NUP98-KDM5A-Probe: FAM-TTTCTCTTCCATGCTGTCATCCTC-BHQ1，
NUP98/HOXA11-F: GGATTTAATACTACGACAGCCACT，
NUP98/HOXA11-R: TGTAGACGCTGAAGAAGAACTCC，
NUP98/HOXA11-Probe: FAM-CTGCCCCTATACCAAGTACCAGATCCGA-TAMRA，
NUP98/HOXA9-F: CTACGACAGCCACTTTGGG，
NUP98/HOXA9-R: TTGTCTCCGCCGCTCT，
NUP98/HOXA9-Probe: FAM- CCAGGCCCCAGTAGTTGATAGAGAA-BHQ1，
NUP98-NSD1-F: ATTTAATACTACGACAGCCACTTTG，
NUP98-NSD1-R: CCTAAGGCGTTTCTTCTCTGA，
NUP98-NSD1- Probe: FAM-CTTTGGAGCCCCCCAGGC-BHQ1。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照采用含NUP98系列融合基因序列的质粒，阴性对照采用去离子水。
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