CN113025619B - 一种hook3-fgfr1新融合基因及其应用和检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种HOOK3‑FGFR1新融合基因及其应用和检测试剂盒，所述融合基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示。本发明中首先应用生物信息学方法发现、鉴定了骨髓异常增生综合征中存在新的融合基因HOOK3‑FGFR1，评估认为HOOK3‑FGFR1可以作为骨髓异常增生综合征的特异性分子标志物，进而开发了一款临床上可用于诊断、监测患者微小残留病(MRD)的试剂盒。试剂盒采用基于Taqman探针的实时荧光PCR技术对MDS患者体内HOOK3‑FGFR1融合基因进行绝对定量，具有检测特异性好、方法简便高效、成本低廉等优点，能够满足临床上的诊疗需求。

Description

一种HOOK3-FGFR1新融合基因及其应用和检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种HOOK3-FGFR1新融合基因及其应用和检测试剂盒。

背景技术

骨髓异常增生综合征(myelodysplastic syndromes,MDS)是一种起源于骨髓造血干细胞的恶性髓系血液病，约30％-40％的患者会进展为急性髓系白血病(AML)。由于位于染色体的8p11.2区域的FGFR1基因的重排通常也会导致骨髓增生，因此该类疾病又被称为8p11骨髓增生综合征。8p11骨髓增生综合征患者通常携带FGFR1与不同5′端伙伴基因产生的融合基因，进而导致了FGFR1内激酶结构域的组成性激活。目前，已报道的FGFR1伙伴基因有15个，分别包括：TPR(1q25)RANBP2(2q13),LRRFIP1(2q37),TFG(3q12)，SQSTM1(5q35),FGFR1OP(6q27),TRIM24(7q32-q34),CUX1(7q22),CNTRL(9q33),CPSF6(12q15),FGFR1OP2(12p12),ZMYM2(13q11-q12),MYO18A(17q11),ERVK3-1(19q13),以及BCR(22q11)。

8p11骨髓增生综合征的临床进程通常是经过一段短暂的慢性期后快速转化为AML或急性淋巴细胞白血病(ALL)，具体的临床症状可能会因为不同的伙伴基因而略有不同。8p11骨髓增生综合征也具有干细胞样的特征，虽然发生率较低，但是侵袭性高、临床预后差。8p11骨髓增生综合征患者的临床治疗主要是化疗，在条件允许的情况下，会通过异基因造血干细胞移植的方法帮助患者获得更为长期的生存。国际血液学近年来也将具有分型及预后指示意义比较明确的若干融合基因，作为重要的新的分子标志物，纳入新的血液病分子分型预后分层评估体系中，开启临床普及应用的新时期。因此，检测骨髓增生综合征相关的融合基因作为分子标志物可为患者选择治疗方案、确定移植时机、预测复发风险、评估预后提供重要依据，在造血干细胞移植疗效评价、预处理方案优化及移植后分子复发监测方面具备无可替代的重要作用。

发明内容

本发明的第一个目的在于，提供一种HOOK3-FGFR1新融合基因，作为分子标志物可为患者选择治疗方案、预测复发风险、评估预后提供重要依据。

本发明的第二个目的在于，提供HOOK3-FGFR1新融合基因在制备骨髓异常增生综合征诊断或监测试剂盒中的应用。部分骨髓异常增生综合征患者携带融合基因HOOK3-FGFR1，其可以作为患者特异性的分子标志物，并应用于临床诊断、定期监测患者的微小残留病变。

本发明的第三个目的在于，提供一种HOOK3-FGFR1新融合基因的检测试剂盒。

本发明第四个目的在于，提供一种非疾病诊断目的的检测HOOK3-FGFR1新融合基因的方法。

为了实现上述第一个目的，本发明提供了一种HOOK3-FGFR1新融合基因，所述融合基因为HOOK3-FGFR1，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

为了实现上述第二个目的，本发明提供了HOOK3-FGFR1新融合基因在制备骨髓异常增生综合征诊断或监测试剂盒中的应用。

为了实现上述第三个目的，本发明提供了检测HOOK3-FGFR1新融合基因的检测试剂盒，所述试剂盒包括上游引物、下游引物、Taqman探针、内参、PCR反应缓冲液、阳性对照和阴性对照；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

作为一个优选方案，所述Taqman探针的5’端标记有FAM基团，所述探针的3’端标记有BHQ基团。当待测样品中不存在目标DNA分子时FAM的荧光被BHQ淬灭，不发出荧光；当待测样品中存在目标DNA分子时，探针与目标DNA分子结合，随后靠Taq酶的5'→3’双链外切酶活性降解探针而释放荧光基团FAM，发出荧光。

作为一个优选方案，所述内参中包含内参上游引物，内参下游引物和内参探针；

所述内参上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述内参下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

作为一个优选方案，所述内参探针5’端标记有FAM基团，所述探针的3’端标记有TAMTRA基团。FAM基团为报告基团，TAMRA为淬灭基团。

PCR反应缓冲液为本领域常用缓冲液，一般包括cDNA第一链合成试剂(ReverTraAce qPCR RT Kit，TOYOBO公司)和实时荧光PCR混合液(THUNDERBIRD qPCR MIX，TOYOBO公司，QPS-101)，其主要成分包含DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、逆转录酶、DTT。

所述阳性对照包含有带有HOOK3-FGFR1融合基因的质粒标准品和带有ABL基因的质粒。所述阴性对照即去离子水。

为了实现上述第四个目的，本发明提供了一种非疾病诊断目的的检测HOOK3-FGFR1新融合基因的方法，包括以下步骤：

(1)提取人血液样本中的总RNA，将RNA反转为cDNA作为待测样品；

(2)配置PCR反应液，再分别加入待测样品，阳性对照和阴性对照；

(3)实时荧光PCR仪上检测，反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35s，反应40个循环，荧光信号于56℃35s时采集；

其中所述PCR反应液包括上游引物、下游引物、Taqman探针、内参、PCR反应缓冲液、阳性对照和阴性对照；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

检测实验结果成立的条件为：若无目的基因扩增信号曲线，内参、阳性对照以及阴性对照检测均正常时，结果为阴性；若有目的基因扩增信号曲线，内参、阳性对照以及阴性对照检测均正常时，结果为阳性。若内参、阳性对照以及阴性对照出现异常，则需查明原因，做出调整后重新检测。

本发明发现并验证了部分MDS患者携带新融合基因HOOK3-FGFR1，继之开发了一款实时荧光PCR和Taqman探针技术相结合的融合基因检测、定量试剂盒。实时荧光PCR其结果用Ct值表示，具有特异度好，灵敏度高，操作简单，结果更直观等优点，是目前微量融合基因检测的首选方法，因此本试剂盒采用Taqman探针实时荧光PCR检测HOOK3-FGFR1融合基因，对患者MRD进行监测。

本发明的优点在于，(1)应用生物信息学技术筛选鉴定到MDS患者携带的融合基因HOOK3-FGFR1，证明其是至今未见报道的新融合基因，并可以作为患者的分子标志物应用于临床诊断、选择合适的治疗方案、定期监测患者MRD。

(2)本发明涉及的HOOK3-FGFR1融合基因检测试剂盒具有如下优势：①同时使用探针和引物双重控制，假阳性低，准确性高。②使用特异性探针识别融合基因序列，特异性强。③实时监测全程扩增信号。④操作简单安全，快速而且防止污染。

(3)本发明采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针，检测受测者体内HOOK3-FGFR1融合基因和内参基因ABL的表达情况，能把低丰度的基因信号从复杂背景中分辨出来的，对于患者诊断、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发的监测中具有非常大的应用潜力。

附图说明

图1为HOOK3-FGFR1融合基因的FISH以及PCR验证。A：8p11区域的deletion导致HOOK3-FGFR1融合基因发生的图形化展示；B：融合基因在患者初发(primary)、未缓解(NR)、以及对照样本中的PCR验证；C：携带融合基因患者PCR验证产物的sanger测序结果图，确认了HOOK3外显子11与FGFR1外显子9的融合；D：应用FGFR1/D8Z2三色分离/扩增探针对患者中期blast细胞进行荧光原位杂交(FISH)实验，FGFR1基因(8p11)的上游5’端标记为红色，下游3’端标记为绿色，D8Z2(8p11-q11)区域标记为蓝色作为质控信号，正常信号为2F(RG)2B，阳性信号为1F(RG)1R1G和2B(G为绿色信号，R为红色信号，B为蓝色信号，F(RG)为红绿融合信号)，图中箭头标示的绿色信号代表了发生断裂的FGFR1区域的出现，多个融合信号说明患者部分细胞存在FGFR1基因扩增。

图2为HOOK3-FGFR1融合基因的质粒标准品构建结果。A：融合基因标准品质粒图谱；B：HOOK3-FGFR1阳性样本和阴性对照；C：Taqman探针法对治疗不同时间点HOOK3-FGFR1阳性患者外周血细胞中该融合基因mRNA水平进行定量测量。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例只是用于帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制；下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1.MDS患者携带HOOK3-FGFR1新融合基因

(1)应用生物信息学技术筛选20例MDS患者的融合基因，发现在3个权威的融合基因资源库均未有收录HOOK3-FGFR1融合基因。但是，我们检索文献，发现2016年一篇题为“FGFR1 and NTRK3 actionable alterations in"Wild-Type"gastrointestinal stromaltumors”的文献报道了一例胃肠道间质瘤患者携带FGFR1-HOOK3融合基因，融合形式为FGFR1的第2-17exon与HOOK3的第5-22exon发生融合形成FGFR1-HOOK3融合基因。而HOOK3-FGFR1新融合基因由HOOK3基因的第1-11外显子与FGFR1的第9-17外显子拼接形成，具体的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。经过比对，发现融合形式和序列均不相同，说明我们的HOOK3-FGFR1是未过报道的新融合基因。

(2)分别应用荧光原位杂交技术(FISH)、PCR、并对PCR产物进行sanger测序，我们确认该例MDS患者携带HOOK3-FGFR1新融合基因，验证结果如图1所示。

(3)选取合适的质粒，并将一段包含融合breakpoint的序列克隆到质粒中，从中挑选出阳性克隆进行PCR扩增和sanger测序，验证转入到质粒中序列的正确性，从而得到标准品，并应用标准品监测HOOK3-FGFR1融合基因阳性患者的MRD(图2)。

(4)设计了检测内参/目的基因用引物、探针，采用实时荧光PCR技术，检测内参基因ABL1、HOOK3-FGFR1融合基因的表达情况。试剂盒通过调整内参/目的基因的引物探针比例，以及PCR反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳。

SEQ ID NO.1：

HOOK3 exon 1-11+FGFR1 exon 9-17：Nucleotide Sequence(2307nt,768aa):

ATGTTCAGCGTAGAGTCGCTGGAGCGGGCGGAGCTGTGCGAGAGCCTCCTCACTTGGATCCAGACATTTAATGTGGATGCACCATGCCAGACCGTGGAAGATTTAACGAATGGGGTTGTGATGGCCCAGGTTCTTCAAAAGATAGATCCTGCATATTTTGATGAAAATTGGCTAAACAGAATCAAAACTGAAGTAGGAGATAATTGGAGGCTAAAGATAAGCAATTTAAAGAAAATTTTAAAAGGAATCTTGGATTATAATCATGAGATTTTAGGACAGCAAATTAATGACTTTACCCTTCCTGATGTGAACCTTATTGGGGAGCATTCTGATGCAGCAGAGCTTGGAAGGATGCTTCAGCTCATCTTAGGCTGTGCTGTGAACTGTGAACAGAAGCAAGAGTACATCCAAGCCATTATGATGATGGAGGAATCTGTTCAACATGTTGTCATGACAGCCATTCAAGAGCTGATGAGTAAAGAATCTCCTGTCTCTGCTGGAAATGATGCCTATGTTGACCTTGATCGTCAGCTGAAGAAAACTACAGAGGAACTAAATGAAGCTTTGTCAGCAAAGGAAGAAATTGCTCAAAGATGCCATGAACTGGATATGCAGGTTGCAGCATTGCAGGAAGAGAAAAGTAGTTTGTTGGCAGAGAATCAGGTATTAATGGAAAGACTCAATCAATCTGATTCTATAGAAGACCCTAACAGTCCAGCAGGAAGAAGGCATTTGCAGCTCCAGACTCAATTAGAACAGCTCCAAGAAGAAACATTCAGACTAGAAGCAGCCAAAGATGATTATCGAATACGTTGTGAAGAGTTAGAAAAGGAGATCTCTGAACTTCGGCAACAGAATGATGAACTGACCACTTTGGCAGATGAAGCTCAGTCTCTGAAAGATGAGATCGACGTGCTGAGACATTCTTCTGATAAAGTATCTAAACTAGAAGGTCAAGTAGAATCTTATAAAAAGAAGCTAGAAGACCTTGGTGATTTAAGGCGGCAGGTTAAACTCTTAGAAGAGAAGAATACCATGTATATGCAGAATACTGTCAGTCTAGAGGAAGAGTTAAGAAAGGCCAACGCAGCGCGAAGTCAACTTGAAACCTACAAGAGACAGGTGTCTGCTGACTCCAGTGCATCCATGAACTCTGGGGTTCTTCTGGTTCGGCCATCACGGCTCTCCTCCAGTGGGACTCCCATGCTAGCAGGGGTCTCTGAGTATGAGCTTCCCGAAGACCCTCGCTGGGAGCTGCCTCGGGACAGACTGGTCTTAGGCAAACCCCTGGGAGAGGGCTGCTTTGGGCAGGTGGTGTTGGCAGAGGCTATCGGGCTGGACAAGGACAAACCCAACCGTGTGACCAAAGTGGCTGTGAAGATGTTGAAGTCGGACGCAACAGAGAAAGACTTGTCAGACCTGATCTCAGAAATGGAGATGATGAAGATGATCGGGAAGCATAAGAATATCATCAACCTGCTGGGGGCCTGCACGCAGGATGGTCCCTTGTATGTCATCGTGGAGTATGCCTCCAAGGGCAACCTGCGGGAGTACCTGCAGGCCCGGAGGCCCCCAGGGCTGGAATACTGCTACAACCCCAGCCACAACCCAGAGGAGCAGCTCTCCTCCAAGGACCTGGTGTCCTGCGCCTACCAGGTGGCCCGAGGCATGGAGTATCTGGCCTCCAAGAAGTGCATACACCGAGACCTGGCAGCCAGGAATGTCCTGGTGACAGAGGACAATGTGATGAAGATAGCAGACTTTGGCCTCGCACGGGACATTCACCACATCGACTACTATAAAAAGACAACCAACGGCCGACTGCCTGTGAAGTGGATGGCACCCGAGGCATTATTTGACCGGATCTACACCCACCAGAGTGATGTGTGGTCTTTCGGGGTGCTCCTGTGGGAGATCTTCACTCTGGGCGGCTCCCCATACCCCGGTGTGCCTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTGCTGAAGGAGGGTCACCGCATGGACAAGCCCAGTAACTGCACCAACGAGCTGTACATGATGATGCGGGACTGCTGGCATGCAGTGCCCTCACAGAGACCCACCTTCAAGCAGCTGGTGGAAGACCTGGACCGCATCGTGGCCTTGACCTCCAACCAGGAGTACCTGGACCTGTCCATGCCCCTGGACCAGTACTCCCCCAGCTTTCCCGACACCCGGAGCTCTACGTGCTCCTCAGGGGAGGATTCCGTCTTCTCTCATGAGCCGCTGCCCGAGGAGCCCTGCCTGCCCCGACACCCAGCCCAGCTTGCCAATGGCGGACTCAAACGCCGCTGA

实施例2：试剂盒的制备

1、特异性的引物和探针的设计

根据基因序列(ABL基因序列、HOOK3基因序列、FGFR1基因序列均来自于美国国家生物技术信息中心核酸数据库，ABL基因Entrez Gene ID，基因参考序列NM_005157.5；HOOK3基因Entrez Gene ID 84376，基因参考序列NM_032410.4；FGFR1基因Entrez Gene ID2260，基因参考序列NM_023110.3)设计特异性探针和引物。

2、试剂盒组分配制

cDNA第一链合成试剂：ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO公司)，检测体系PCR反应液：THUNDERBIRD qPCR MIX(TOYOBO，QPS-101)，其主要成分包含DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、逆转录酶、DTT。

引物和探针：包括检测HOOK3-FGFR1融合基因和内参ABL引物以及与引物相对应的探针，具体如下：

HOOK3-FGFR1-F:GATCGACGTGCTGAGACA(SEQ ID NO.2)

HOOK3-FGFR1-R:CAACACCACCTGCCCAAA(SEQ ID NO.3)

HOOK3-FGFR1-Probe:

FAM-ACCTACAAGAGACAGGTGTCTGCTGACTCC-BHQ(SEQ ID NO.4)

ABL-F:CTAAAGGTGAAAAGCTCCG(SEQ ID NO.5)

ABL-R:GACTGTTGACTGGCGTGAT(SEQ ID NO.6)

ABL-Probe:FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-TAMRA(SEQ ID NO.7)

阳性对照品：包含有带有HOOK3-FGFR1融合基因的质粒标准品和带有ABL基因的质粒；阴性对照品：去离子水。

实施例3本试剂盒检测MDS患者标本的操作流程

1、取送检的MDS患者抗凝血标本，抽提血液中的总RNA：在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml红细胞裂解液，并加入抗凝血0.5ml混匀；室温静置10min；5,000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；再次加入0.5ml红细胞裂解液，5,000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入1ml TRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静置5min；加入0.2ml氯仿，震荡均匀；14,000rpm 4℃离心10min，吸取上清，转移至另一个新的离心管中；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；14,000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；14,000rpm4℃离心5min，弃乙醇；室温干燥10-15min，加入20μl RNase-free水溶解沉淀。

2、参考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将RNA反转为cDNA。

3、试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，X＝23μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)每人份23μl分装，每23μl组成如下：

4、加样：加入检测体系PCR反应液中2μl cDNA；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。

5、检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35s，反应40个循环，荧光信号于56℃35s时采集。

6、结果判断：若无目的基因扩增信号曲线，内参、阳性对照以及阴性对照检测均正常时，结果为阴性；若有目的基因扩增信号曲线，内参、阳性对照以及阴性对照检测均正常时，结果为阳性。若内参、阳性对照以及阴性对照出现异常，则需查明原因，做出调整后重新检测。图2A-B展示了融合基因标准品质粒图谱和HOOK3-FGFR1检测的阳性样本和阴性对照；图2C展示HOOK3-FGFR1阳性患者随治疗，HOOK3-FGFR1在mRNA水平的变化，证明试剂盒的准确可靠。

7、HOOK3-FGFR1可以作为MDS患者特异性的分子标志物：我们应用上述构建的检测试剂盒，对一例HOOK3-FGFR1阳性患者临床治疗的3个时间节点样本进行了MRD监测(图2C)。我们发现，该患者在初发(20.07)时HOOK3-FGFR1表达水平很高，随着临床给予诱导化疗疾病进入缓解状态，HOOK3-FGFR1表达变低(20.08)，并在接下来的1个月内持续维持在低水平(20.09)，说明患者疾病逐步达到分子缓解。上述结果表明，HOOK3-FGFR1可以作为患者新的分子标志物用来监测MRD，并且证明该试剂盒的准确可靠。

综上结果表明，本试剂盒可高通量、快速、准确地检测样本，同时具有良好的特异性和可重复性，可有效避免假阳性和假阴性结果。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 大连医科大学附属第二医院

上海交通大学医学院附属新华医院

<120> 一种HOOK3-FGFR1新融合基因及其应用和检测试剂盒

<130> /

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2307

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atgttcagcg tagagtcgct ggagcgggcg gagctgtgcg agagcctcct cacttggatc 60

cagacattta atgtggatgc accatgccag accgtggaag atttaacgaa tggggttgtg 120

atggcccagg ttcttcaaaa gatagatcct gcatattttg atgaaaattg gctaaacaga 180

atcaaaactg aagtaggaga taattggagg ctaaagataa gcaatttaaa gaaaatttta 240

aaaggaatct tggattataa tcatgagatt ttaggacagc aaattaatga ctttaccctt 300

cctgatgtga accttattgg ggagcattct gatgcagcag agcttggaag gatgcttcag 360

ctcatcttag gctgtgctgt gaactgtgaa cagaagcaag agtacatcca agccattatg 420

atgatggagg aatctgttca acatgttgtc atgacagcca ttcaagagct gatgagtaaa 480

gaatctcctg tctctgctgg aaatgatgcc tatgttgacc ttgatcgtca gctgaagaaa 540

actacagagg aactaaatga agctttgtca gcaaaggaag aaattgctca aagatgccat 600

gaactggata tgcaggttgc agcattgcag gaagagaaaa gtagtttgtt ggcagagaat 660

caggtattaa tggaaagact caatcaatct gattctatag aagaccctaa cagtccagca 720

ggaagaaggc atttgcagct ccagactcaa ttagaacagc tccaagaaga aacattcaga 780

ctagaagcag ccaaagatga ttatcgaata cgttgtgaag agttagaaaa ggagatctct 840

gaacttcggc aacagaatga tgaactgacc actttggcag atgaagctca gtctctgaaa 900

gatgagatcg acgtgctgag acattcttct gataaagtat ctaaactaga aggtcaagta 960

gaatcttata aaaagaagct agaagacctt ggtgatttaa ggcggcaggt taaactctta 1020

gaagagaaga ataccatgta tatgcagaat actgtcagtc tagaggaaga gttaagaaag 1080

gccaacgcag cgcgaagtca acttgaaacc tacaagagac aggtgtctgc tgactccagt 1140

gcatccatga actctggggt tcttctggtt cggccatcac ggctctcctc cagtgggact 1200

cccatgctag caggggtctc tgagtatgag cttcccgaag accctcgctg ggagctgcct 1260

cgggacagac tggtcttagg caaacccctg ggagagggct gctttgggca ggtggtgttg 1320

gcagaggcta tcgggctgga caaggacaaa cccaaccgtg tgaccaaagt ggctgtgaag 1380

atgttgaagt cggacgcaac agagaaagac ttgtcagacc tgatctcaga aatggagatg 1440

atgaagatga tcgggaagca taagaatatc atcaacctgc tgggggcctg cacgcaggat 1500

ggtcccttgt atgtcatcgt ggagtatgcc tccaagggca acctgcggga gtacctgcag 1560

gcccggaggc ccccagggct ggaatactgc tacaacccca gccacaaccc agaggagcag 1620

ctctcctcca aggacctggt gtcctgcgcc taccaggtgg cccgaggcat ggagtatctg 1680

gcctccaaga agtgcataca ccgagacctg gcagccagga atgtcctggt gacagaggac 1740

aatgtgatga agatagcaga ctttggcctc gcacgggaca ttcaccacat cgactactat 1800

aaaaagacaa ccaacggccg actgcctgtg aagtggatgg cacccgaggc attatttgac 1860

cggatctaca cccaccagag tgatgtgtgg tctttcgggg tgctcctgtg ggagatcttc 1920

actctgggcg gctccccata ccccggtgtg cctgtggagg aacttttcaa gctgctgaag 1980

gagggtcacc gcatggacaa gcccagtaac tgcaccaacg agctgtacat gatgatgcgg 2040

gactgctggc atgcagtgcc ctcacagaga cccaccttca agcagctggt ggaagacctg 2100

gaccgcatcg tggccttgac ctccaaccag gagtacctgg acctgtccat gcccctggac 2160

cagtactccc ccagctttcc cgacacccgg agctctacgt gctcctcagg ggaggattcc 2220

gtcttctctc atgagccgct gcccgaggag ccctgcctgc cccgacaccc agcccagctt 2280

gccaatggcg gactcaaacg ccgctga 2307

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gatcgacgtg ctgagaca 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

caacaccacc tgcccaaa 18

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

acctacaaga gacaggtgtc tgctgactcc 30

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ctaaaggtga aaagctccg 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gactgttgac tggcgtgat 19

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ccatttttgg tttgggcttc acaccatt 28

Claims (6)

1.一种HOOK3-FGFR1新融合基因，其特征在于，所述融合基因为HOOK3-FGFR1，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的HOOK3-FGFR1新融合基因在制备骨髓异常增生综合征诊断或监测试剂盒中的应用。

3.一种检测权利要求1所述HOOK3-FGFR1新融合基因的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上游引物、下游引物、Taqman探针、内参、PCR反应缓冲液、阳性对照和阴性对照；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求3所述的检测HOOK3-FGFR1新融合基因的检测试剂盒，其特征在于，所述Taqman探针的5’端标记有FAM基团，所述探针的3’端标记有BHQ基团。

5.根据权利要求3所述的检测HOOK3-FGFR1新融合基因的检测试剂盒，其特征在于，所述内参中包含内参上游引物，内参下游引物和内参探针；

所述内参上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述内参下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

6.根据权利要求5所述的检测HOOK3-FGFR1新融合基因的检测试剂盒，其特征在于，所述内参探针5’端标记有FAM基团，所述探针的3’端标记有TAMTRA基团。

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