KR20210028968A - 대상포진 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 대상포진을 진단하기 위한 방법에 관한 것으로서, 피검자로부터 분리한 생물학적 시료(체액, 조직, 세포, 전혈, 혈장 또는 말초혈액단핵구)에서 잠복해있는 극소량의 대상포진바이러스를 객관적이고 정확하게 검출할 수 있고, 이를 통해 대상포진 예측 또는 진단할 수 있는 신뢰성이 있는 정보를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 대상포진을 진단하기 위한 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 정상인의 PBMC(peripheral blood mononuclear cell, 말초혈액단핵구)에 잠복하고 있는 대상포진바이러스를 예측 및 진단할 수 있는 용도로 사용될 수 있다.
대상포진은 수두대상포진바이러스(Varicella zoster virus, VZV)가 유년기에 수두를 일으키며 일차 감염된 후에 감각 신경절에 잠복하였다가, 재활성화되어 편측의 통증을 동반한 수포성 피부병변이 신경절 분포를 따라 발생하는 질환이다. 세계적으로 대상포진 발병 비율은 한해 건강한 사람 1천명당 1.2~3.4명 꼴이며, 65세 이후의 경우에는 1천명당 3.9~11.8명 꼴로 증가하고 있다.
대상포진의 진단은 피부에 나타나는 수포의 병적인 변화가 매우 특징적이므로, 이러한 병변을 관찰하여 임상적으로 진단되는데, 대상포진의 초기나 후기 혹은 무발진성 대상포진, 면역억제 환자에서는 피부 병변이 특징적이기 않기 때문에, 혈액검사나 바이러스 진단이 가능함에도 불구하고 상당수의 환자들이 대상포진이 상당히 진행된 후 진단되고 있다.
병변이 없는 경우 진단이 늦어지면, 환자 본인이 감염여부를 모르고 고통에 장기간 노출되고, 병의 진행이 깊어지는 경우 대상포진 후 동통이라고 하여 피부분절에 따라 눈, 귀, 안면, 배뇨 중추 등에 합병증이 생길 수 있고, 얼굴이나 눈에서 시작된 대상포진은 시력이나 청력 등에 위험이 생길 수 있다.
기존의 진단 방법은 피부 병변이나 발병 후 진단이 가능하므로, 보다 민감도와 특이도가 우수한 진단법의 개발을 위해 새로운 개발이 요구되고 있다.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
본 발명자들은 정상인의 말초혈액단핵구에 잠복한 극소량의 대상포진바이러스를 검출할 수 있는 신규한 진단방법을 발굴하고자 예의 노력을 하였다. 그 결과, 디지털 PCR을 활용한 대상포진 진단을 위한 정보를 제공하는 전략을 고안하였고, 이를 이용하여 정상인의 말초혈액단핵구에 잠복한 대상포진바이러스를 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 대상포진을 예측 또는 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 샘플 중에 포함된 대상포진바이러스를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 대상포진바이러스 예측 또는 진단 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 대상포진 예측 또는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
1) 피검자로부터 체외로 분리된 샘플을 취득하는 단계;
2) 상기 체외로 분리된 샘플로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
3) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 디지털 PCR용 프라이머 세트와 서열번호 3 및 6으로 표시되는 프로브 세트를 포함하는 반응액으로부터 복수의 드롭렛을 생성하는 단계;
4) 상기 생성된 드롭렛에서 다중 PCR을 통해 표적 핵산 서열을 증폭하는 단계; 및
5) 상기 증폭된 표적핵산을 갖는 드롭렛의 수를 계수하여 표적핵산의 여부 또는 표적핵산의 양을 분석하는 단계.
본 발명에서 사용되는 "디지털 PCR(digital PCR)"은 하나의 웰 당 하나의 액적(droplet) 내의 1 개의 유전자 카피를 PCR 증폭한 결과에 대해 단일 분자 계수법을 적용하여 DNA 시료를 정확하게 절대 정량할 수 있는 기술을 의미하며 당업계에서 이해되는 다양한 변형을 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명에서 "PBMC"또는 "Peripheral blood mononuclear cell"은 말초혈액단핵구, 말초혈액단핵세포, 단핵세포(Mononuclear cell) 또는 단핵구와 동일한 의미로 사용될 수 있고, 이는 당업계에서 통상적으로 사용되는 말초혈액(Peripheral Blood)으로부터 분리된 단핵세포(Mononuclear Cell)를 의미한다. 말초혈액단핵세포는 채혈한 사람의 혈액을 피콜-하이팩 밀도 구배 분리법(Ficoll-Hypaque density gradient method) 등과 같은 공지의 방법을 사용하여 수득할 수 있다.
본 발명에서 "프라이머"란 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
본 발명에서 "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA 존재 유무를 확인할 수 있다. 상기 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태일 수 있다.
본 발명자들은 정상인의 말초혈액단핵구에 잠복한 극소량의 대상포진바이러스를 검출할 수 있는 신규한 진단방법을 발굴하고자 노력한 결과, 디지털 PCR을 활용한 대상포진 진단을 위한 정보를 제공하는 전략을 고안하였고, 이를 이용하여 정상인의 말초혈액단핵구에 잠복한 대상포진바이러스를 진단할 수 있음을 확인하였다.
상기 피검자로부터 체외로 분리된 샘플을 취득하는 단계는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기에서 '체외로 분리된 샘플'은 피검자의 체액, 조직, 세포, 전혈, 혈장 또는 말초혈액단핵구일 수 있으며, 가장 바람직하게는 전혈 또는 말초혈액단핵구일 수 있다. 상기 피검자는 대상포진바이러스를 보유하고 있을 것으로 의심되는 환자일 수 있고, 바람직하게는 20세 이상의 성인일 수 있으며, 보다 바람직하게는 50세 이상의 성인일 수 있으며, 가장 바람직하게는 60세 이상의 성인일 수 있다.
상기 체외로 분리된 샘플로부터 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다.
다음으로 3) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 디지털 PCR용 프라이머 세트와 서열번호 3 및 6으로 표시되는 프로브 세트를 포함하는 반응액으로부터 복수의 드롭렛을 생성하는 단계를 수행한다.
본 발명에서는 디지털 PCR 방법으로 드롭렛 디지털 PCR 시스템을 사용하였으며, 상기 시스템은 20 ㎕의 PCR 반응액을 15,000~20,000 개의 드롭렛으로 나뉘어져 증폭된 후 표적 핵산을 계수한다. 드롭렛에서의 표적 핵산의 증폭 여부에 따라 양성 드롭렛(1)과 음성 드롭렛(0)으로 디지털 시그널처럼 받아들여 계수하고 포아송 분포를 통해 표적 핵산의 카피수를 계산해 최종적으로 샘플 부피당 카피수로 결과값을 확인할 수 있다.
상기 PCR 반응을 수행하기 위해, 체외로 분리된 샘플로부터 게놈 DNA를 분리하고, 이를 주형으로 하여 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 디지털 PCR용 프라이머 세트와 서열번호 3 및 6으로 표시되는 프로브 세트를 포함하는 반응액을 사용하여 복수의 드롭렛을 생성한다.
상기 반응액은 PCR 반응을 위하여 프라이머 세트와 프로브 세트외에 버퍼등의 PCR 수퍼믹스들을 더 포함할 수 있다. 상기 반응액은 오일을 카트리지에 분주하여 드롭렛 생성기에 정착하여 15,000~20,000 개 가량의 드롭렛을 생성할 수 있다. 상기 드롭렛은 나노크기의 드롭렛일 수 있다.
상기 PCR 수퍼믹스는 PCR 반응을 위한 DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermococcus litoralis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자, PCR 반응의 정량적 검출을 위한 염료(형광염료 등), PCR 반응을 위한 완충액, dNTP 등을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 상기 프라이머 또는 프로브는 대상포진바이러스를 검출하는데 영향을 주지 않는 범위 내에서 당해분야에 공지된 수 많은 수단을 이용하여 변형(예로 부가, 결실, 치환)될 수 있으며, 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로는 상보적이여야 한다. 이러한 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형 등이 있다.
상기 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트는 Varicella-zoster virus(VZV) open reading frame(ORF) 62 유전자를 특이적으로 증폭하며, 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 세트는 RPP30(Human ribonuclease P subunit 30)을 특이적으로 증폭한다. 즉 본 발명의 잠복해있는 대상포진바이러스를 검출하기 위하여 디지털 PCR용 프라이머 세트는 Varicella-zoster virus(VZV) open reading frame(ORF) 62 유전자를 검출하고, 이를 정량화하기 위해 RPP30(Human ribonuclease P subunit 30) 유전자를 특이적으로 검량함으로써, 잠복해있는 대상포진바이러스를 신속하고 정확하게 검출 및 정량할 수 있다,
상기 프로브 세트는 형광모이어티가 부착되고, 상기 형광모이어티는 CY3, CY5, CY5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665m Calfluor Orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670, HEX, VIC, BHQ, BHQ1, MGB, ZEN, NFQ 및 비오틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, Cy3, Cy5, MGB-NFQ, TAMRA, BHQ, ROX일 수 있다.
구체적으로 상기 프로브 세트는 5' 말단에 형광물질이 표지되고 3' 말단에 소광물질이 표지될 수 있으며, 형광물질로는 FAM(6-Carboxyfluorescein), VIC, TET(2',7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 6-JOE(6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3(Cyanine 3) 또는 Cy5일 수 있고, 상기 소광물질은 MGB-NFQ, 6-TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine), BHQ(Black Hole Quencher)-1, BHQ-2, BH3-3, 또는 ROX(carboxy-X-rhodamine)일 수 있다. 상기 MGB-NFQ는 MGB(Minor Groove Binder)와 NFQ(Non-Fluorescent Quencher)의 두가지 유닛으로 구성되어 있다.
이때, 상기 반응액에서 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트와 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 세트는 각각 최종농도가 0.1 내지 1.5 μM, 바람직하게는 0.5 내지 1.4 μM, 보다 바람직하게는 0.8 내지 1.0 μM로 포함될 수 있다.
또한 상기 반응액에서 서열번호 3 및 6으로 표시되는 프로브 세트는 각각 최종농도가 0.1 내지 0.4 μM, 바람직하게는 0.15 내지 0.35 μM, 보다 바람직하게는 0.2 내지 0.3 μM로 포함될 수 있다.
상기 생성된 드롭렛에서 표적핵산 서열을 증폭하는 단계를 포함한다. 상기 단계는 PCR 반응을 수행하여 표적핵산 서열을 증폭할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상시 생성된 드롭렛은 96-웰 PCR 플레이트에 분주한 후, PCR 반응을 진행할 수 있다.
상기 PCR 반응은 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으며, 일반적으로 프라이머/프로브 간 교차결합이 이루어지지않는 조건에서 수행되는 것이 바람직하며, 구체적으로 PCR 반응 조건은 a) 90 내지 100 ℃, 1 내지 20 분의 전처리 단계;, b) 90 내지 100 ℃, 10 내지 60 초의 변성 단계;, c) 40 내지 80 ℃, 0.5 내지 2 분의 어닐링 단계; 및 d) 90 내지 100 ℃, 1 내지 20 분의 유지 단계로 수행될 수 있다. 상기 b), c) 단계는 10 내지 70 사이클로 반복수행되는 것이 바람직하다.
상기 PCR 반응은 통상의 PCR 기기를 사용하여 실시할 수 있으며, PCR 기기는 바람직하게 실시간 PCR 기기, 열블록 PCR(Thermal Block PCR) 기기, 디지털 PCR 기기일 수 있으나, 보다 바람직하게는 디지털 PCR 기기일 수 있다. 상기 디지털 PCR 기기는 당업계에서 통상적으로 사용하는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 QX200(Bio-Rad, USA)일 수 있다.
PCR 반응 여부의 측정은 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으나, 리포터 형광 염료 및 퀀처(quencher) 형광 염료로 표지된 프로브를 사용한 광학적 정량 분석 시스템에 의해서 측정될 수 있으며 구체적으로 각 나노드롭렛의 PCR 반응에 대한 형광값을 측정하는 것에 의해서 수행될 수 있다. 구체적으로 상기 프로브에 FAM, HEX, VIC, MGB, NFQ 형광염료 또는 EvaGreen 형광염료가 결합된 형태를 사용한다면 이들에 대한 형광을 측정하는 것에 의해서 측정될 수 있다. 이와 같은 과정은 상용의 검출장치에 의해서 수행될 수 있으며 해당 장치 내에서 각각의 샘플의 형광 신호를 각각 감지하여 양성 드롭렛과 음성 드롭렛의 수를 세어 자동으로 분석할 수 있다, 이때 검출을 위해서 상기 프로브는 각각 상이한 형광물질과 결합될 수 있다.
또한 상기 증폭된 표적핵산을 포함하는 드롭렛의 수를 계수하여 표적핵산의 유무 또는 표적핵산의 양을 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다. 즉, 피검자로부터 체외로 분리된 샘플에서 증폭된 표적핵산을 갖는 드롭렛의 수를 분석하여, 잠복 대상포진바이러스 유무 또는 잠복 대상포진바이러스 양을 확인할 수 있다.
구체적으로 상기 5) 단계에서 표적핵산의 양은 아래 식을 통해 정량분석할 수 있다. 즉 상기 방법을 통해 얻은 증폭된 표적핵산의 드롭렛 수(copy number)를 통해 표적핵산(잠복 대상포진바이러스, latent VZV) 양(load)를 분석할 수 있다.
[식 1]
Latent VZV load/105 PBMCs = VZV copy number/cell number × 105
이때, cell number는 RPP30 카피수/2이다.
또한, 상기 증폭된 표적핵산을 포함하는 드롭렛의 수가 기준값(cut-off value)(20~30 copies/105 PBMC, 바람직하게는 28~29 copies/105 PBMC) 이상인 경우, 피검자는 대상포진인 것으로 예측 또는 판단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 잠복중인 대상포진바이러스의 검출 방법을 제공한다.
1) 피검자로부터 체외로 분리된 샘플을 취득하는 단계;
2) 상기 체외로 분리된 샘플로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
3) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 디지털 PCR용 프라이머 세트와 서열번호 3 및 6으로 표시되는 프로브 세트를 포함하는 반응액으로부터 복수의 드롭렛을 생성하는 단계;
4) 상기 생성된 드롭렛에서 다중 PCR을 통해 표적 핵산 서열을 증폭하는 단계; 및
5) 상기 증폭된 표적 핵산을 갖는 드롭렛의 수를 계수하여 표적핵산의 여부 또는 표적핵산의 양을 분석하는 단계.
상기 검출 방법에 대한 설명 중 상술한 본 발명의 대상포진 예측 또는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법에 대한 설명과 동일한 부분은 그 부분을 참고하기로 한다.
본 발명의 프라이머 세트와 프로브 세트를 통한 디지털 PCR 방법을 이용하면 생물학적 시료 중에 포함된 잠복중인 극미량의 대상포진바이러스를 정확하게 검출 또는 정량할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트;, 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 세트;, 서열번호 3 및 6으로 표시되는 프로브 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 대상포진바이러스 검출용 디지털 PCR 키트를 제공한다.
본 발명의 디지털 PCR 키트는 PCR 반응을 통해 시료에서 표적핵산을 특이적으로 증폭시킴으로써, 대상포진바이러스 DNA를 검출할 수 있으며, RPP30의 검출을 통해 대상포진바이러스 DNA 양을 정량할 수 있다.
상기 PCR 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 PCR 반응을 위한 DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermococcus litoralis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자, PCR 반응의 정량적 검출을 위한 염료(형광염료 등), PCR 반응을 위한 완충액, dNTP 등을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 피검자로부터 분리한 생물학적 시료(체액, 조직, 세포, 전혈, 혈장 또는 말초혈액단핵구)에서 잠복해있는 극소량의 대상포진바이러스를 객관적이고 정확하게 검출할 수 있고, 이를 통해 대상포진 예측 또는 진단할 수 있는 신뢰성이 있는 정보를 제공할 수 있다.
(ⅱ) 또한 본 발명은 대상포진 백신 대상을 구분하는데 활용할 수 있으며, 이 방법을 통해 대상포진의 오진 또는 백신의 오남용을 억제할 수 있다.
(ⅲ) 또한 본 발명은 대상포진바이러스에 의한 대상포진 발병의 예측 또는 진단에 유용한 정보를 제공함으로써 선택적, 개별적 대상포진 예방치료 전략 설정이나 치료제 개발에 매우 유용하다.
도 1은 대상포진바이러스의 검출한계를 확인한 결과를 도시한 것으로, DNA 농도 희석 농도별 형광값 변화 그래프(하)와 DNA 연속 희석 농도별 타겟의 카피수를 계산한 정량분석 데이터(상)로 나타낸 것이다.
도 2는 대상포진바이러스 ORF62와 인간 RPP30에 대한 디지털 PCR 분석 결과를 정량화한 것으로, 각 시료에서 디지털 PCR로 측정한 대상포진바이러스 ORF62에 대한 형광값 변화 그래프(a)와 각 시료에서 디지털 PCR로 측정한 인간 RPP30에 대한 형광값 변화 그래프(b)로 나타낸 것이다.
도 3은 각 연령별 100,000 말초혈액단핵구당 검출된 대상포진바이러스의 카피수를 계산한 그래프이다. 상기 건강한 자원자의 혈액내 VZV viral load는 각 연령별로 표시하였다. 도 3은 50~69세(60세 전후)를 대상으로 하여 혈액에서 잠복 대상포진바이러스를 검출한 결과이다.
도 2는 대상포진바이러스 ORF62와 인간 RPP30에 대한 디지털 PCR 분석 결과를 정량화한 것으로, 각 시료에서 디지털 PCR로 측정한 대상포진바이러스 ORF62에 대한 형광값 변화 그래프(a)와 각 시료에서 디지털 PCR로 측정한 인간 RPP30에 대한 형광값 변화 그래프(b)로 나타낸 것이다.
도 3은 각 연령별 100,000 말초혈액단핵구당 검출된 대상포진바이러스의 카피수를 계산한 그래프이다. 상기 건강한 자원자의 혈액내 VZV viral load는 각 연령별로 표시하였다. 도 3은 50~69세(60세 전후)를 대상으로 하여 혈액에서 잠복 대상포진바이러스를 검출한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실험방법
1. 실험기기
Lymphocyte Separation Medium은 Corning(Cat. No. 25-072-CV)으로부터 구입하여 사용하였고, PBS(Phosphate buffered saline)는 Sigma Aldrich(Cat. No. P4417)로부터 구매하여 사용하였으며, QIAamp DNA mini kit는 Qiagen(Cat. No. 51306)로부터 구매하여 사용하였으며, ddPCRTMSupermix for Probes는 Bio-Rad(Cat.No.1863010)로부터 구매하여 사용하였으며, QX200 Droplet Generation Oil은 Bio-Rad(Cat. No. 1864006))로부터 구매하여 사용하였으며, ddPCRTMDroplet Readear Oil은 Bio-Rad(Cat.No.1863004)로부터 구매하여 사용하였다.
또한, BD Vacutainer K2E (EDTA)(Cat. No. 367525)를 사용하였고, DG8 Cartridges and Gaskets는 Bio-Rad(Cat. No. 1864007) 것을 사용하였으며, DG8 Cartridge Holder는 Bio-Rad(Cat. No. 1863051)를 사용하였고, 96-well PCR plate는 Eppendorf(Cat. No. 0030128591) 것을 사용하였으며, PCR Plate Heat Seal과 foil, pierceable은 Bio-Rad(Cat. No. 1814040)를 사용하였다.
실시예
<실시예 1> 대상포진바이러스(VZV) DNA 표적핵산 제작
대상포진바이러스(VZV) PCR에 많이 이용되고 있는 표적 유전자 5종을 선정하였다. 그 중에서도 임상 검체에서 유전자 ORF62가 가장 잘 검출되었으므로, 이를 최종적인 표적 유전자로 선택하였다(표 1).
표적핵산 제작을 위해서, PCR로 증폭된 DNA를 전기영동으로 확인한 후, 겔을 추출(gel extraction)한 다음 순수한 DNA만을 정제하였다. 정제된 DNA를 벡터(T-blunt vector, Solgent, 한국)에 삽입하여 PCR의 표준물질이 되는 플라스미드(plasmid)를 제작하였다.
상기 표적핵산을 양성 대조군으로 사용하기 위해, 앞서 제조한 플라스미드를 대장균에 형질전환시킨 후 배양한 다음, 형질전환된 대장균으로부터 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 나노드랍(Nano-drop)으로 정량하여 플라스미드의 유전자 복제수를 확인하고 1010copies/uL로 희석하여 보관하였다.
| 서열번호 | 프라이머/프로브 | 서열 |
| 1 | ORF62-Forward | GCCCGGTTGAGCAATTGTAC |
| 2 | ORF62-Reverse | GCGGGTATCATCGGTCTCAA |
| 3 | ORF62-Probe | FAM-CTTTCGGACAGCGTTCCCGCTAAG-BHQ1 |
| 4 | RPP30-Forward | GATTTGGACCTGCGAGCG |
| 5 | RPP30-Reverse | GCGGCTGTCTCCACAAGT |
| 6 | RPP30-Probe | VIC-CTGACCTGAAGGCTCT-MGB-NFQ |
<실시예 2> 대상포진바이러스 검출한계 측정
검출한계 규정을 위해 대상포진바이러스의 게놈 DNA 농도를 연속 희석(serial dilution)하였다.
PCR 민감도를 측정하기 위하여 대상포진바이러스의 게놈 DNA 주형을 10배 희석하여 준비하였고, 다음과 같이 QX200(Bio-Rad, USA) 디지털 PCR 시스템을 이용하여 PCR을 수행하였다. 디지털 PCR을 위한 마스터 믹스(master mix)(표 2)는 총 반응액 20 uL 기준으로 10 uL의 ddPCR supermix for probe 10 uL, 0.9 uM의 프라이머, 0.25 uM의 프로브 조건에서 DNA 샘플 5 uL를 맞추어 반응 용액을 준비하고 PCR 튜브에 분배하였다. 이때 상기 마스터 믹스 내에서 사용된 프라이머와 프로브 농도는 표 3에 나타내었다. 상기 마스터 믹스를 DG droplet generator cartridge의 sample well에 20 uL씩 분주하고, oil well에 70 uL의 droplet generation oil을 분주하였다. 이후 가스켓(gasket)을 카트리지에 장착한 후 QX200 droplet generator에 장착한 후 드롭렛(droplet) 생성 반응을 진행하고, 생성된 드롭렛(droplet)을 96-well PCR plate(Eppendorf, Germany, Hamburg)에 분주한 후 다음 표 4의 조건에 맞추어 PCR을 진행하였다. 반응이 완료된 PCR plate를 QX200 droplet reader에 장착하여 각 유전자에 대한 복제수(copy number)를 계산하였다.
| No | PCR 증폭 조성 | 부피(uL) |
| 1 | ddPCR supermix for probes | 10 |
| 2 | ORF62 primer/probe | 1 |
| 3 | RPP30 primer/probe | 1 |
| 4 | PCR-grade water | 3 |
| 5 | DNA sample | 5 |
| 합계 | 20 | |
| 서열번호 | 프라이머/프로브 | 서열 | 최종농도 |
| 1 | ORF62-Forward | GCCCGGTTGAGCAATTGTAC | 0.9 uM |
| 2 | ORF62-Reverse | GCGGGTATCATCGGTCTCAA | 0.9 uM |
| 3 | ORF62-Probe | FAM-CTTTCGGACAGCGTTCCCGCTAAG-BHQ1 | 0.25 uM |
| 4 | RPP30-Forward | GATTTGGACCTGCGAGCG | 0.9 uM |
| 5 | RPP30-Reverse | GCGGCTGTCTCCACAAGT | 0.9 uM |
| 6 | RPP30-Probe | VIC-CTGACCTGAAGGCTCT-MGB-NFQ | 0.25 uM |
| No | 단계 | 온도 | 시간 | 사이클 |
| 1 | 전처리 | 95 ℃ | 10분 | |
| 2 | 변성 | 94 ℃ | 30초 | 50 사이클 |
| 3 | 어닐링 | 60 ℃ | 1분 | |
| 4 | 유지 | 98 ℃ | 10분 | |
| 5 | 유지 | 4 ℃ | ∞ |
도 1은 대상포진바이러스의 검출한계를 확인한 결과를 도시한 것으로, DNA 농도 희석 농도별 형광값 변화 그래프(하)와 DNA 연속 희석 농도별 타겟의 카피수를 계산한 정량분석 데이터(상)로 나타낸 것이다.
도 1에 따르면 대상포진바이러스 농도 희석에 의한 농도가 증가할수록, 검출된 대상포진바이러스의 농도도 증가하고 있음을 확인하였으며, 2.5(5×10-1 copies/㎕)까지 검출이 확인되었다. 즉 본 발명에 따른 대상포진바이러스의 예측 또는 진단 방법을 통해 극소량 잠복하고있는 대상포진바이러스까지 검출이 가능함을 확인하였다.
<실시예 3> 대상포진바이러스 ORF62와 인간 RPP30에 대한 디지털 PCR 분석
디지털 PCR(ddPCR)을 사용하여 대상포진바이러스 ORF62 및 인간 RPP30을 분석하였다. 먼저, 시료로 NTB(PCR 등급의 증류수), PC(ORF62 앰플리콘 함유 플라스미드, 10e5 VZV copies/㎕) 및 HD 1, 2는 건강한 공여자로부터 제공받은 PBMC 샘플로부터 추출된 DNA이다.
상기 각각의 시료에 대하여 QX200(Bio-Rad, USA) 디지털 PCR 시스템을 이용하여 PCR을 수행하였다. 다만 디지털 PCR을 위한 마스터 믹스(master mix)에 대상포진바이러스 ORF62와 인간 RPP30을 각각 첨가하여, 각각에 대한 PCR 분석을 수행하였다는 것을 제외하고 실시예 2와 동일하게 진행하였다. 반응이 완료된 PCR plate를 QX200 droplet reader에 장착하여 각 유전자에 대한 복제수(copy number)를 계산하였다.
도 2는 대상포진바이러스 ORF62와 인간 RPP30에 대한 디지털 PCR 분석 결과를 정량화한 것으로, 각 시료에서 디지털 PCR로 측정한 대상포진바이러스 ORF62에 대한 형광값 변화 그래프(a)와 각 시료에서 디지털 PCR로 측정한 인간 RPP30에 대한 형광값 변화 그래프(b)로 나타낸 것이다. 도면에서 VZV+는 혈액내 VZV가 양성인 것, VZV-는 혈액내 VZV가 음성인 것을 나타낸다.
도 2에 나타난 바와 같이, HD 1, 2와 PC(양성 대조군)에서 설정된 역치 이상으로 대상포진바이러스를 검출할 수 있음을 확인하였다. HD1은 검출 가능한 대상포진바이러스의 DNA를 가졌으나, HD 2는 대상포진바이러스의 DNA가 없음을 확인하였다.
포유 동물 세포가 2 복제수의 RPP30을 함유하고 있으므로, 잠복 대상포진바이러스의 양은 다음과 같이 계산할 수 있음을 확인하였다.
Latent VZV load/105 PBMCs = VZV copy number/cell number × 105
이때, cell number는 RPP30 카피수/2이다.
<실시예 3> 연령에 따른 PBMC에서 잠복 대상포진바이러스(latent VZV viral)의 분석
50-54세, 55-59세, 60-64세, 65-69세 건강한 자원자를 대상으로 실험을 진행하였고, 대상포진이 있거나 예방접종을 받았는지 기억이 불분명한 자원자들은 제외하였으며, 자가 면역 질환이나 면역 억제 상태를 갖는 자원자들 역시 제외하였다.
항응고제(EDTA)가 처리된 채혈 튜브에 말초혈액을 채혈하여 4시간 이내에 피콜(Ficoll)을 이용하여 말초혈액단핵세포를 분리하였다. 분리된 말초혈액단핵세포 중 5ㅧ105 개의 세포를 1.5 mL 원심분리 튜브에 덜어내었고, 200 uL로 부피를 일정하게 맞춘 후, QIAamp DNA mini kit(Qiagen, 독일)를 이용하여 총 DNA를 추출하였다. DNA 추출과정은 제조사에서 제공하는 매뉴얼에 따라 수행하였고, 최종적으로 100 uL의 AE 버퍼를 사용하여 용리하였다.
구체적으로, 200 uL로 부피를 일정하게 맞춘 5×105 개의 세포에 20 uL의 프로테이네이즈 K(proteinase K)를 처리하고, 200 uL의 AL 버퍼(buffer)를 넣어준 후 15초 이상 vortexing을 실시하여 잘 혼합하였다. 상기 혼합액을 56 ℃에서 10분간 반응시킨 후, 200 uL의 에탄올(순도 96-99%)을 넣고 다시 15초 이상 vortexing을 실시하였다. 컬럼(QIAamp mini column)을 2 mL 튜브(collection tube)에 장착하고, 컬럼에 혼합액을 옮겨 담은 후, 8000 RPM에서 1분간 원심분리하여 DNA가 컬럼 상에 존재하는 멤브레인(membrane)에 흡착되게 하였다. 흘러나온 용액과 튜브를 제거하고, 새로운 튜브에 컬럼을 장착한 다음 첫번째로 세척할 버퍼인 AW1 버퍼 500 uL를 컬럼에 넣고 8000 RPM에서 1분간 원심분리하였다. 순도 높은 DNA를 수득하기 위해 컬럼을 새로운 튜브에 장착한 후 두번째 세척 용액인 AW2 버퍼 500 uL를 컬럼에 넣고 13000 RPM에서 3분간 원심분리하였다. 이후 남아있는 세척 용액을 완전히 제거하기 위해서 컬럼을 새로운 튜브에 장착한 상태로 13000 RPM에서 1분간 원심분리하였다. 컬럼을 1.5 mL 원심분리 튜브에 장착하고 DNA 용출용 버퍼인 AE 버퍼 100 uL를 컬럼에 첨가한 후 상온에서 3분간 반응시키고 8000 RPM에서 1분간 원심분리하여 최종적으로 DNA 샘플을 수득하였다.
상기 DNA 샘플을 사용하여 실시예 2와 동일하게 디지털 PCR을 수행하였다. 반응이 완료된 PCR plate를 QX200 droplet reader에 장착하여 각 유전자에 대한 복제수를 계산하고, 대조군 유전자에 대한 표적 유전자를 정상화한 값을 QuantaSoft 소프트웨어(Bio-rad)를 사용하여 산출하였다. 정규화된 잠복 대상포진바이러스의 로드(load)는 105 PBMC 당 VZV로 표현하였다. 그 결과는 도 3과 같다.
대상포진바이러스를 대상으로 하는 새로운 백신의 개발이 활발히 연구되고 있으며, 최근에는 Shingrix라는 백신이 미국에서 승인을 받은 바 있다. 그럼에도 아직까지 대상포진바이러스 예측 또는 진단을 위한 방법이 확립되어 있지 않아 일괄적으로 50세 이상 모든 성인에게 백신 접종을 권고하고 있는 실정이다. 따라서 본 발명에서는 객관적이고 정확한 대상포진바이러스 예측 또는 진단 방법을 제안함으로써 불필요한 백신의 접종을 줄이고 오진의 가능성을 낮출수 있다.
실제 대상포진 백신 접종 기준이 되는 50~69세(60세 전후)를 대상으로 하여 혈액에서 잠복 대상포진바이러스를 검출한 결과, 도 3에서와 같이, 50~69세에서 중간값이 28.2 copies/105 PBMC인 것으로 확인되었고, 이를 통해 기준값(cut-off value)을 설정하였다. 상기 결과를 통해 본원발명은 피부병변이 없고 잠복해있더라도 성인의 PBMC를 통해 극미량의 대상포진바이러스를 효과적으로 검출할 수 있어 향후 대상포진바이러스 발생의 위험을 예측할 수 있는 생물학적 지표로 사용이 가능하다.
즉, 본 발명에서 제안하는 디지털 PCR을 통해, 병변이 나타나지 않은 정상인으로부터 잠복해있는 극미량의 대상포진바이러스를 효과적으로 검출할 수 있고, 이를 통해 대상포진을 예측 및 진단할 수 있음을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> THE ASAN FOUNDATION
University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation
<120> method for predicting or diagnosing Varicella zoster virus
<130> HPC8417
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF62-Forward
<400> 1
gcccggttga gcaattgtac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF62-Reverse
<400> 2
gcgggtatca tcggtctcaa 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF62-Probe
<400> 3
ctttcggaca gcgttcccgc taag 24
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RPP30-Forward
<400> 4
gatttggacc tgcgagcg 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RPP30-Reverse
<400> 5
gcggctgtct ccacaagt 18
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RPP30-Probe
<400> 6
ctgacctgaa ggctct 16
Claims (7)
1) 피검자로부터 체외로 분리된 샘플을 취득하는 단계;
2) 상기 체외로 분리된 샘플로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
3) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 디지털 PCR용 프라이머 세트와 서열번호 3 및 6으로 표시되는 프로브 세트를 포함하는 반응액으로부터 복수의 드롭렛을 생성하는 단계;
4) 상기 생성된 드롭렛에서 다중 PCR을 통해 표적 핵산 서열을 증폭하는 단계; 및
5) 상기 증폭된 표적핵산을 갖는 드롭렛의 수를 계수하여 표적핵산의 유무 또는 표적핵산의 양을 분석하는 단계를 포함하는 대상포진 예측 또는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
2) 상기 체외로 분리된 샘플로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
3) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 디지털 PCR용 프라이머 세트와 서열번호 3 및 6으로 표시되는 프로브 세트를 포함하는 반응액으로부터 복수의 드롭렛을 생성하는 단계;
4) 상기 생성된 드롭렛에서 다중 PCR을 통해 표적 핵산 서열을 증폭하는 단계; 및
5) 상기 증폭된 표적핵산을 갖는 드롭렛의 수를 계수하여 표적핵산의 유무 또는 표적핵산의 양을 분석하는 단계를 포함하는 대상포진 예측 또는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 체외로 분리된 샘플은 피검자의 전혈 또는 말초혈액단핵구인 것을 특징으로 하는 대상포진 예측 또는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
상기 체외로 분리된 샘플은 피검자의 전혈 또는 말초혈액단핵구인 것을 특징으로 하는 대상포진 예측 또는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 프로브 세트는 형광모이어티가 부착되고, 상기 형광모이어티는 CY3, CY5, CY5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665m Calfluor Orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670, HEX, VIC, BHQ, BHQ1, MGB, ZEN, NFQ 및 비오틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
상기 프로브 세트는 형광모이어티가 부착되고, 상기 형광모이어티는 CY3, CY5, CY5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665m Calfluor Orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670, HEX, VIC, BHQ, BHQ1, MGB, ZEN, NFQ 및 비오틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 5) 단계에서 표적핵산의 양은 아래 식을 통해 정량분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
[식 1]
Latent VZV load/105 PBMCs = VZV copy number/cell number × 105
이때, cell number는 RPP30 카피수/2이다.
상기 5) 단계에서 표적핵산의 양은 아래 식을 통해 정량분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
[식 1]
Latent VZV load/105 PBMCs = VZV copy number/cell number × 105
이때, cell number는 RPP30 카피수/2이다.
1) 피검자로부터 체외로 분리된 샘플을 취득하는 단계;
2) 상기 체외로 분리된 샘플로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
3) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 디지털 PCR용 프라이머 세트와 서열번호 3 및 6으로 표시되는 프로브 세트를 포함하는 반응액으로부터 복수의 드롭렛을 생성하는 단계;
4) 상기 생성된 드롭렛에서 다중 PCR을 통해 표적 핵산 서열을 증폭하는 단계; 및
5) 상기 증폭된 표적 핵산을 갖는 드롭렛의 수를 계수하여 표적 핵산의 양을 결정하는 단계를 포함하는, 잠복중인 대상포진바이러스의 검출 방법.
2) 상기 체외로 분리된 샘플로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
3) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 디지털 PCR용 프라이머 세트와 서열번호 3 및 6으로 표시되는 프로브 세트를 포함하는 반응액으로부터 복수의 드롭렛을 생성하는 단계;
4) 상기 생성된 드롭렛에서 다중 PCR을 통해 표적 핵산 서열을 증폭하는 단계; 및
5) 상기 증폭된 표적 핵산을 갖는 드롭렛의 수를 계수하여 표적 핵산의 양을 결정하는 단계를 포함하는, 잠복중인 대상포진바이러스의 검출 방법.
서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트;, 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 세트;, 서열번호 3 및 6으로 표시되는 프로브 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 대상포진바이러스 예측 또는 진단 키트.
제6항에 있어서,
상기 키트는 말초혈액단핵구에서 분리된 DNA를 주형으로 하는 것을 특징으로 하는 키트.
상기 키트는 말초혈액단핵구에서 분리된 DNA를 주형으로 하는 것을 특징으로 하는 키트.
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|---|---|---|---|
| KR1020190110187A KR20210028968A (ko) | 2019-09-05 | 2019-09-05 | 대상포진 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 |
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|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113502354A (zh) * | 2021-07-14 | 2021-10-15 | 中国医学科学院输血研究所 | 一种用于移植患者感染的病原体检测引物和探针组、试剂盒及应用 |
| CN114164302A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-03-11 | 武汉百泰基因工程有限公司 | 一种vzv病毒数字pcr检测试剂盒及其使用方法 |
| CN115624008A (zh) * | 2022-07-08 | 2023-01-20 | 珠海科艺普检测科技有限公司 | 一种基于生物信息技术的大口黑鲈鱼的鱼苗智能检测方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101990958B1 (ko) | 2016-08-31 | 2019-06-21 | 휴마시스 주식회사 | 면역학적 측정을 이용한 hiv 1형, 2형 및 o형 동시 진단용 키트 및 이를 이용한 동시 진단방법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113502354A (zh) * | 2021-07-14 | 2021-10-15 | 中国医学科学院输血研究所 | 一种用于移植患者感染的病原体检测引物和探针组、试剂盒及应用 |
| CN114164302A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-03-11 | 武汉百泰基因工程有限公司 | 一种vzv病毒数字pcr检测试剂盒及其使用方法 |
| CN115624008A (zh) * | 2022-07-08 | 2023-01-20 | 珠海科艺普检测科技有限公司 | 一种基于生物信息技术的大口黑鲈鱼的鱼苗智能检测方法 |
| CN115624008B (zh) * | 2022-07-08 | 2023-09-05 | 珠海科艺普检测科技有限公司 | 一种基于生物信息技术的大口黑鲈鱼的鱼苗智能检测方法 |
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