KR101990958B1 - 면역학적 측정을 이용한 hiv 1형, 2형 및 o형 동시 진단용 키트 및 이를 이용한 동시 진단방법 - Google Patents

면역학적 측정을 이용한 hiv 1형, 2형 및 o형 동시 진단용 키트 및 이를 이용한 동시 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역학적 측정을 이용한 인간면역부전바이러스(Human Immunodeficiency Virus, HIV) 1형, 2형 및 O형 동시 진단용 키트 및 동시 진단방법에 관한 것으로서, 본 발명의 진단용 키트를 이용하면 체내에 존재하는 2종 이상의 아형을 포함하는 항-인간면역부전바이러스 항체를 동시 진단할 수 있는 효과가 있다.

Description

면역학적 측정을 이용한 HIV 1형, 2형 및 O형 동시 진단용 키트 및 이를 이용한 동시 진단방법{Simultaneous diagnosis kit for HIV type 1, 2 and O using immunochromatographic assay and simultaneous diagnosis method using the same}
본 발명은 면역학적 측정을 이용한 인간면역부전바이러스(Human Immunodeficiency Virus, HIV) 1형, 2형 및 O형 동시 진단용 키트 및 이를 이용한 동시 진단방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 체내에 존재하는 2종 이상의 아형을 포함하는 항-인간면역부전바이러스 항체를 동시 진단할 수 있는 진단용 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.
인간면역부전바이러스(Human Immunodeficiency Virus; HIV)란 후천성 면역결핍 증후군(Acquired Immunodeficiency Syndrome; AIDS)을 일으키는 원인 바이러스를 말한다. HIV에 감염되면 우리 몸에 있는 면역세포인 CD4 양성 T-림프구가 이 바이러스에 의해 감염되어 파괴되므로 면역력이 약화되고, 그 결과 각종 감염질환과 악성 종양이 발병하여 사망에 이르게 되는데, 인체의 면역력이 상당히 저하되어 (보통, 혈중 CD4 양성 T-림프구수가 200 cells/ml 이하) 각종 감염 질환이나 악성 종양이 나타나기 시작하는 상태를 AIDS라 한다.
HIV 항체 검사를 통해, 증상이 없는 상태에서도 HIV의 감염 여부에 대한 진단이 가능함에도 불구하고, 상당수의 환자들이 HIV 감염이 상당히 진행되어 면역 저하가 심해진 후(혈중 CD4 양성 T-림프구 수가 200 cells/ml 이하로 감소된 후)에 진단되고 있다.
진단이 늦어지면, 환자 본인이 감염 여부를 모르고 있는 상태에서 HIV 감염 전파를 차단하기 위한 여러 조치들에 대한 교육을 받을 기회가 없으므로 주변에 HIV 바이러스를 전파할 위험이 높아지며, 또한 감염이 확인되지 않은 환자에 대한 시술 및 치료에 의해 의료진이 감염에 노출되기도 한다.
기존의 항-인간면역부전바이러스 항체 진단용 키트는 금 나노입자를 사용한 면역크로마토그래피의 방법을 적용한 키트가 대부분이었다. 따라서 보다 민감도와 특이도가 우수한 진단법의 개발을 위해 새로운 나노입자를 적용한 면역크로마토그래피 진단법의 개발이 요구되었다.
관련 종래기술로서 한국등록특허 제10-0466382호(2005.01.05)에서는 HIV 1, 2, O형의 각각의 항원성이 높은 단백질이 하나의 단백질(Combo 단백질)로 발현되도록 발현벡터를 제조하여 다량의 HIV 콤보 항원을 정제함으로써 이를 이용한 진단키트 및 백신용 조성물을 개시한 바 있고, 한국등록특허 제10-1473243호(2014.12.10)에서는 금 결합체를 포함하는 결합패드를 구비한 키트를 사용하여 구강 점액으로부터 에이즈의 감염여부를 확인할 수 있는 에이즈 감염여부 진단방법을 개시하였다.
본 발명자들은 면역학적 측정을 이용한 인간면역부전바이러스(Human Immunodeficiency Virus, HIV) 1형, 2형 및 O형 동시 진단용 키트 및 동시 진단방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 항원에 표지물질을 결합시킨 중합체를 이용하여 체내에 존재하는 2종 이상의 아형을 포함하는 항-인간면역부전바이러스 항체를 동시 진단할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 면역학적 측정을 이용한 HIV 1형, 2형 및 O형 동시 진단용 키트를 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은, 면역학적 측정을 이용한 HIV 1형, 2형 및 O형 동시 진단방법을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 면역학적 측정을 이용한 HIV 1형, 2형 및 O형 동시 정량분석 방법을 제공함에 있다.
본 발명은 면역학적 측정을 이용한 인간면역부전바이러스(Human Immunodeficiency Virus, HIV) 1형, 2형 및 O형 동시 진단용 키트 및 동시 진단방법에 관한 것으로서, 인간면역부전바이러스(Human Immunodeficiency Virus, HIV)의 1형, 2형 및 O형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 항원에 특이적으로 결합하는 검출항체를 검출하는 진단용 키트를 포함한다. 이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 명세서상의 용어 "검출항체"는 상기 진단용 키트를 이용하여 진단하고자 하는 질환에 감염된 검체에서 생성되는 항체로서, 분석하고자 하는 대상에 해당하는 항체를 의미한다.
본 명세서상의 용어 "고정항원"은 상기 진단용 키트의 검출선에 고정되어 검출항체에 결합함으로써 상기 검출항체가 표지물질에 의해 검출선에 표시될 수 있게 하는 항원을 의미한다.
본 발명의 일 양태는 각각 독립적으로 표지물질이 결합된 인간면역부전바이러스(Human Immunodeficiency Virus, HIV)의 1형, 2형 및 O형 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 중합체를 포함하고,
각각 독립적으로 표지물질이 결합된 HIV 1형 중합체는 HIV 1형 항원에 결합하는 HIV의 1형 검출항체와 결합하고,
각각 독립적으로 표지물질이 결합된 HIV 2형 중합체는 HIV 2형 항원에 결합하는 HIV의 2형 검출항체와 결합하고,
각각 독립적으로 표지물질이 결합된 HIV O형 중합체는 HIV O형 항원에 결합하는 HIV의 O형 검출항체와 결합하는 것인,
면역학적 측정을 이용한 HIV 1형, 2형 및 O형 동시 진단용 키트이다.
상기 진단용 키트는 2종 이상의 검출항체에 각각 결합하는 2종 이상의 고정항원이 독립적으로 고정된 2개 이상의 검출선을 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 항원은, 예를 들어, 당단백질 41(glycoprotein 41; 이하 gp41) 및 당단백질 120(glycoprotein 120; 이하 gp120)의 특성을 나타내는 HIV 1형 재조합 항원, 당단백질 36(glycoprotein 36; 이하 gp36)의 특성을 나타내는 HIV 2형 재조합 항원 및 gp36, gp41 또는 gp120의 특성을 나타내는 HIV 1,2형 재조합 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 항원일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검출선은 진단용 키트에 구비된 검사패드에 위치한 것일 수 있다.
본 명세서상의 용어 "검출선"은 면역학적 측정을 이용한 진단용 키트에 있어서 분석결과를 확인하기 위해 분석물 또는 표지물질이 도달하도록 준비된 선을 의미한다. 예를 들어, 분석하고자 하는 검출항체에 결합하는 고정항원을 검사패드 상에 고정하여 검출선을 준비함으로써 분석물의 유무 또는 농도를 확인할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 진단용 키트를 이용한 분석 대상이 되는 분석물은 존재, 부재 또는 농도와 같은 결과 중 하나를 식별하기 위한 분석의 목적이 되는 특이적 활성을 갖는 생물학적 물질, 생물학적 시료 또는 시료 내의 특정 성분을 의미한다.
상기 분석물은 검체의 체액 내에 존재하는 것 또는 검체의 체액으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검체는 동물인 것일 수 있으며, 포유류, 설치류, 파충류 또는 조류일 수 있고, 예를 들어, 포유류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검사패드는 니트로셀룰로오즈 멤브레인(Nitrocellulose membrane)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 진단용 키트는 시료를 투입하기 위한 샘플패드(sample pad)를 검사패드의 상류측에 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 샘플패드는 유리섬유, 셀룰로오즈 및 폴리에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 예를 들어, 유리섬유일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 샘플패드는 진단용 키트의 플라스틱 하우징 말단부로 돌출되어 위치할 수 있으며, 이 경우 샘플패드의 오염을 방지하기 위해 샘플패드가 돌출된 말단부를 외부와 차단하는 뚜껑을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 진단용 키트의 말단부에 노출된 샘플패드의 일부를 시료와 접촉시키는 방법에 있어서, 검체의 체액을 수집함과 동시에 직접적으로 접촉시켜 이용하거나, 미리 수집된 검체의 체액을 보관하는 튜브 등에 넣어서 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표지물질은 셀룰로오즈 나노입자, 방사성 동위원소, 염료, 마그네틱비드, 금 나노입자, 세레니움, 실리카 비드, 실버 비드 및 덴드리머로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 예를 들어, 셀룰로오즈 나노입자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 셀룰로오즈 나노입자는 염료를 활용하여 염색함으로써 원하는 색상을 나타나게 할 수 있다. 염색할 수 있는 색상은 한정되지 않으나, 빨강, 파랑 또는 검정색으로 염색하는 경우 육안으로 식별하기에 용이하다.
상기 중합체는 샘플패드 또는 컨쥬게이션패드(conjugatiom pad)에 포함된 것일 수 있고, 샘플패드에 전처리되거나, 컨쥬게이션패드에 전처리하여 동결건조시킨 후 상기 샘플패드 및 검사패드의 사이에 위치시킬 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 진단용 키트는 검사의 유효성을 판단하기 위해 상기 항원에 결합하는 항체를 고정한 대조선을 검사패드 상에 추가적으로 포함할 수 있다.
대조선은 분석물의 유무 또는 농도에 관계없이 분석을 수행하면 나타나게 되므로, 분석 수행 시 대조선에 표시가 나타나면 상기 검출선을 통해 분석한 결과가 유효하다고 판단할 수 있는 근거가 될 수 있다. 반면 검출선에 표시가 나타났더라도 대조선에 표시가 나타나지 않으면 해당 결과를 신뢰할 수 없으므로 재분석을 필요로 한다.
상기 진단용 키트는 액체 시료를 모세관 현상에 의해 흡수할 수 있는 흡수패드(Absorption pad)를 검사패드의 하류측에 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 흡수패드는 셀룰로오즈일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 진단용 키트는 컨쥬게이션패드 및 검사패드 사이에 분리패드(Separation pad)를 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 시료를 분석하기 위해 상기 항원에 셀룰로오즈 나노입자를 결합시킨 중합체와 반응시킨 반응물이 검사패드에 전개되고, 검사패드에 고정항원으로 표시된 검출선에서 반응물이 결합을 이루게 되며, 이 때 검출선에서 고정항원이 특이적으로 결합하는 반응물 또는 분석물의 유무 또는 농도에 대한 분석결과를 표지물질로 확인할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 진단용 키트의 샘플패드에 시료를 접촉하여 검출선에서 결과를 도출하기까지는 1~10분, 2~8분 또는 3~6분, 예를 들어, 5분이 소요될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 진단용 키트를 이용함에 있어서, 진단용 키트를 수용 가능한 리더기를 사용하여 시료에 포함된 분석물을 정량 분석할 수 있다. 구체적으로, 검출선에 나타난 표지물질을 리더기에 구비된 카메라로 촬영한 후, 인식하는 부위의 색의 진하기를 측정함으로써 분석에 활용할 수 있다. 예를 들어, 검출선에서 결합을 이룬 중합체의 표지물질을 타겟으로 하여 리더기로 정량 분석할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 리더기에 진단용 키트를 삽입하여 정량 분석을 수행하기 위해 20초~120초 또는 30초~80초, 예를 들어, 50~70초가 소요될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 다음의 단계를 포함하는 면역학적 측정을 이용한 HIV 1형, 2형 및 O형 동시 진단방법이다:
각각 독립적으로 표지물질이 결합된 HIV의 1형, 2형 및 O형 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 중합체에 시료를 가하는 시료 반응 단계; 및
상기 1종 이상의 중합체 및 시료의 반응물이 HIV 1형 항원에 결합하는 HIV 1형 검출항체, HIV 2형 항원에 결합하는 HIV 2형 검출항체 또는 HIV O형 항원에 결합하는 HIV O형 검출항체를 포함하는지의 여부를 확인하는 검출 확인 단계.
상기 검출 확인 단계는 2종 이상의 검출항체에 각각 결합하는 2종 이상의 고정항원이 독립적으로 고정된 검출선에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 항원은, 예를 들어, gp41 및 gp120의 특성을 나타내는 HIV 1형 재조합 항원, gp36의 특성을 나타내는 HIV 2형 재조합 항원 및 gp36, gp41 또는 gp120의 특성을 나타내는 HIV 1,2형 재조합 항원일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검출선은 진단방법을 수행하기 위해 이용되는 진단용 키트에 구비된 검사패드에 위치한 것일 수 있다.
상기 동시 진단방법을 이용한 분석 대상이 되는 분석물은 존재, 부재 또는 농도와 같은 결과 중 하나를 식별하기 위한 분석의 목적이 되는 특이적 활성을 갖는 생물학적 물질, 생물학적 시료 또는 시료 내의 특정 성분을 의미한다.
상기 분석물은 검체의 체액 내에 존재하는 것 또는 검체의 체액으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검체는 동물인 것일 수 있으며, 포유류, 설치류, 파충류 또는 조류일 수 있고, 예를 들어, 포유류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검사패드는 니트로셀룰로오즈 멤브레인일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 진단용 키트는 시료를 투입하기 위한 샘플패드를 검사패드의 상류측에 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 샘플패드는 유리섬유, 셀룰로오즈 및 폴리에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 예를 들어, 유리섬유일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 샘플패드는 진단용 키트의 플라스틱 하우징 말단부로 돌출되어 위치할 수 있으며, 이 경우 샘플패드의 오염을 방지하기 위해 샘플패드가 돌출된 말단부를 외부와 차단하는 뚜껑을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 시료 반응 단계는, 진단용 키트의 말단부에 노출된 샘플패드의 일부를 시료와 접촉시키기 위하여, 검체의 체액을 수집함과 동시에 직접적으로 접촉시켜 수행하거나, 미리 수집된 검체의 체액을 보관하는 튜브 등에 넣어서 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표지물질은 셀룰로오즈 나노입자, 방사성 동위원소, 염료, 마그네틱비드, 금 나노입자, 세레니움, 실리카 비드, 실버 비드 및 덴드리머로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 예를 들어, 셀룰로오즈 나노입자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표지물질은 화학적 또는 물리적 방법으로 결합시킨 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 셀룰로오즈 나노입자는 염료를 활용하여 염색함으로써 원하는 색상을 나타나게 할 수 있다. 염색할 수 있는 색상은 한정되지 않으나, 빨강, 파랑 또는 검정색으로 염색하는 경우 육안으로 식별하기에 용이하다.
상기 중합체는 샘플패드 또는 컨쥬게이션패드에 포함된 것일 수 있고, 샘플패드에 전처리되거나, 컨쥬게이션패드에 전처리하여 동결건조시킨 후 상기 샘플패드 및 검사패드의 사이에 위치시킬 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검출 확인 단계는, 검사패드에 고정항원으로 표시된 검출선에서 반응물이 결합을 이루게 되면 육안으로 확인하여 수행될 수 있고, 이 때 검출선에서 고정항원이 특이적으로 결합하는 반응물 또는 분석물의 유무와 농도에 대한 분석결과를 표지물질로 확인할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검출 확인 단계는 1~10분, 2~8분 또는 3~6분, 예를 들어, 5분이 소요될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태는 다음의 단계를 포함하는 면역학적 측정을 이용한 HIV 1형, 2형 및 O형 동시 정량분석 방법이다:
각각 독립적으로 표지물질이 결합된 HIV의 1형, 2형 및 O형 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 중합체에 시료를 가하는 시료 반응 단계; 및
상기 1종 이상의 중합체 및 시료의 반응물에서 HIV 1형 항원에 결합하는 HIV 1형 검출항체, HIV 2형 항원에 결합하는 HIV 2형 검출항체 또는 HIV O형 항원에 결합하는 HIV O형 검출항체를 정량화하는 정량수치 산출 단계.
상기 정량수치 산출 단계는 2종 이상의 검출항체에 각각 결합하는 2종 이상의 고정항원이 독립적으로 고정된 검출선을 이미지 분석하여 수행되는 것일 수 있다.
상기 항원은, 예를 들어, gp41 및 gp120의 특성을 나타내는 HIV 1형 재조합 항원, gp36의 특성을 나타내는 HIV 2형 재조합 항원 및 gp36, gp41 또는 gp120의 특성을 나타내는 HIV 1,2형 재조합 항원일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검출선은 진단방법을 수행하기 위해 이용되는 진단용 키트에 구비된 검사패드에 위치한 것일 수 있다.
상기 정량분석 방법을 이용한 분석 대상이 되는 분석물은 존재, 부재 또는 농도와 같은 결과 중 하나를 식별하기 위한 분석의 목적이 되는 특이적 활성을 갖는 생물학적 물질, 생물학적 시료 또는 시료 내의 특정 성분을 의미한다.
상기 분석물은 검체의 체액 내에 존재하는 것 또는 검체의 체액으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검체는 동물인 것일 수 있으며, 포유류, 설치류, 파충류 또는 조류일 수 있고, 예를 들어, 포유류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 진단용 키트는 시료를 투입하기 위한 샘플패드를 검사패드의 상류측에 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 샘플패드는 유리섬유, 셀룰로오즈 및 폴리에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 예를 들어, 유리섬유일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 시료 반응 단계는, 진단용 키트의 말단부에 노출된 샘플패드의 일부를 시료와 접촉시키기 위하여, 검체의 체액을 수집함과 동시에 직접적으로 접촉시켜 수행하거나, 미리 수집된 검체의 체액을 보관하는 튜브 등에 넣어서 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표지물질은 셀룰로오즈 나노입자, 방사성 동위원소, 염료, 마그네틱비드, 금 나노입자, 세레니움, 실리카 비드, 실버 비드 및 덴드리머로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 예를 들어, 셀룰로오즈 나노입자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표지물질은 화학적 또는 물리적 방법으로 결합시킬 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 셀룰로오즈 나노입자는 염료를 활용하여 염색함으로써 원하는 색상을 나타나게 할 수 있다. 염색할 수 있는 색상은 한정되지 않으나, 빨강, 파랑 또는 검정색으로 염색하는 경우 육안으로 식별하기에 용이하다.
상기 중합체는 샘플패드 또는 컨쥬게이션패드(conjugatiom pad)에 포함된 것일 수 있고, 샘플패드에 전처리되거나, 컨쥬게이션패드에 전처리하여 동결건조시킨 후 상기 샘플패드 및 검사패드의 사이에 위치시킬 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검출 확인 단계는, 검사패드에 고정항원으로 표시된 검출선에서 반응물이 결합을 이루게 되면 육안으로 확인하여 수행될 수 있고, 이 때 검출선에서 고정항원이 특이적으로 결합하는 반응물 또는 분석물의 유무와 농도에 대한 분석결과를 표지물질로 확인할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검출 확인 단계는 1~10분, 2~8분 또는 3~6분, 예를 들어, 5분이 소요될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 진단용 키트를 이용함에 있어서, 진단용 키트를 수용 가능한 리더기를 사용하여 시료에 포함된 분석물을 정량 분석할 수 있다. 구체적으로, 검출선에 나타난 표지물질을 리더기에 구비된 카메라로 촬영한 후, 인식하는 부위의 색의 진하기를 측정함으로써 분석에 활용할 수 있다. 예를 들어, 검출선에서 결합을 이룬 중합체의 표지물질을 타겟으로 하여 리더기로 정량 분석할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 리더기에 진단용 키트를 삽입하여 정량 분석을 수행하기 위해 20초~120초 또는 30초~80초, 예를 들어, 50~70초가 소요될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 면역학적 측정을 이용한 인간면역부전바이러스(Human Immunodeficiency Virus, HIV) 1형, 2형 및 O형 동시 진단용 키트 및 이를 이용한 동시 진단방법에 관한 것으로서, 상기 진단용 키트를 이용하면 체내에 존재하는 2종 이상의 아형을 포함하는 항-HIV 항체를 동시 진단할 수 있으므로, 이를 효과적으로 HIV 감염의 진단에 이용할 수 있다.
도 1은 HIV 1형, 2형 및 O형 동시 진단용 키트의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 2는 셀룰로오즈 나노입자 또는 금 나노입자를 이용한 중합체를 이용하여 제조된 HIV 진단용 키트를 사용하여 진단한 결과를 비교하여 나타낸 결과이다.
도 3은 표지물질인 셀룰로오즈 나노입자를 다양한 색상의 염료로 염색한 중합체를 포함하는 진단용 키트를 사용하여 분석을 수행한 결과를 나타낸 결과이다.
도 4a는 HIV 진단용 키트의 플라스틱 하우징의 상부를 나타낸 모식도이다.
도 4b는 HIV 진단용 키트의 플라스틱 하우징의 하부를 나타낸 모식도이다.
도 4c는 HIV 진단용 키트의 플라스틱 하우징의 뚜껑을 나타낸 모식도이다.
도 4d는 HIV 진단용 키트의 플라스틱 하우징을 장착할 수 있는 플레이트를 나타낸 모식도이다.
도 5는 플라스틱 하우징으로 조립한 HIV 진단용 키트를 정량 리더기에 삽입하기 위해 플레이트의 홈에 장착한 모습을 나타낸 사진이다.
도 6a는 HIV 진단용 키트의 HIV 1형에 대한 정량화 알고리즘 표준화 정도를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 HIV 진단용 키트의 HIV 2형에 대한 정량화 알고리즘 표준화 정도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 HIV 진단용 키트의 정량화 알고리즘 과정을 수행하기 위해 촬영한 이미지를 수치화하도록 설계 개발된 프로그램의 출력 화면이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 항원 - 표지물질 중합체의 제조
인간면역부전바이러스(Human Immunodeficiency Virus, HIV)의 아형인 1형(gp41 및 gp120), 2형(gp36) 및 에 해당하는 재조합 항원과 셀룰로오즈 나노입자의 물리 화학적 결합을 이용한 중합체를 제조하였다.
본 발명의 진단용 키트 제작에 이용된 항원 관련 정보는 하기 표 1과 같다.
검출 타입 특성 분자량 발현시스템
HIV-1,2 gp36, 41, 120 44kDa E.coli
상기 재조합 항원과 셀룰로오즈 나노입자(Asahikasei, NanoACT(RE1OAPOBS))를 결합한 중합체와, 금 나노입자(SIGMA, Gold chloride(G4022-10G), trihydrate)를 결합한 중합체를 각각 제조하여 준비하였다. 금 나노입자의 경우, 원재료를 환원시켜 콜로이달 골드(Colloidal gold) 형태로 활용하였다.
구체적으로, 혼합 시 pH를 조절하기 위해 Tris-Cl 버퍼를 사용하여 pH를 7.5 ± 0.5로 맞추고, 셀룰로오즈 나노입자 또는 금 나노입자 1 mL 당(OD 1 기준, Spectrophotometer 측정) 재조합 항원 3 ug를 혼합하여 37℃에서 1시간 동안 결합시켰다. 그 다음 2% 카제인(Casein) 용액을 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 Tris-Cl(pH 10.0)으로 세척한 뒤 원심분리기를 이용하여 중합체를 회수하였다. 회수된 중합체는 컨쥬게이션 패드에 침윤하여 건조시켰다.
실시예 2: 진단용 키트의 제작
지지판에 대조선(control line) 및 검출선(Test & result line)이 생성된 백색의 니트로 셀룰로오즈 멤브레인 재질의 검사패드(Test pad)를 부착하였다.
검사패드에 검출선을 표시하기 위하여 표 2의 고정항원인 HIV-1과 2(Mybiosource)를 가는 선의 형태로 니트로셀룰로스 멤브레인 위에 분주하였다. 분주한 이후에 온도 25℃, 습도 35 내지 50%로 유지되는 제습장치 안에서 2시간 동안 분주된 고정항원을 고정화하였다. 이후, 검사패드에 대조선을 표시하기 위하여 염소 항 mouse IgG 항체(Sigma Aldrich)를 상기 검출선 표시 방법과 동일한 조건에서 분주하여 건조하였다.
검출 타입 특성 분자량 발현시스템
HIV-1 gp41, 120 34kDa E.coli
HIV-2 gp36 31kDa E.coli
검사패드의 하류측으로는 셀룰로오즈 소재의 흡수패드(Absorption pad)를 부착하고, 상류측으로는 공극이 조밀한 셀룰로오즈(Millipore) 소재의 분리패드(Separation pad), 실시예 1에서 전처리된 폴리에틸렌(Millipore) 소재의 컨쥬게이션패드(conjugatiom pad) 및 유리섬유(Millipore) 소재의 샘플패드(sample pad)를 부착하였다.
실시예 3: HIV 감염 여부의 육안 분석
항체의 농도를 달리한 시료를 이용하여 항원과 결합하는 표지물질이 셀룰로오즈 나노입자일 때와 금나노입자일 때 검사패드에서 검출선이 나타나는 정도를 비교 확인하였다.
구체적으로, 실시예 2에 따른 방법으로 제조하되 고정 재조합 항원 HIV-1(gp41, 120)과 HIV-2(gp36)을 각각 1 mg/mL의 농도로 분주하여 검출선을 표시한 검사패드에 HIV 인덱스(INDEX) 값이 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 10, 25, 50, 100 포함된 시료를 전개시켰다. HIV 인덱스 값은 측정장비(Simens ADVIA Centaur XP HIV1/0/2) 제조사의 지침에 따라 설정하였다.
도 2에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 HIV 진단용 키트는 항원에 셀룰로오즈 나노입자를 결합한 중합체를 이용하였을 때 HIV 인덱스 값 0.5, 금 나노입자를 결합시킨 중합체를 이용하였을 때 HIV 인덱스 값 2.5까지 검출 가능한 것으로 나타났다. 따라서 진단용 키트의 구성으로 이용함에 있어서 표지물질로 셀룰로오즈 나노입자를 사용하는 것이 민감도가 현저히 높음을 확인할 수 있다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 진단용 키트에 이용되는 셀룰로오즈 나노입자는 다양한 색상의 염료를 이용하여 염색할 수 있으며, 상대적으로 빨강, 검정 또는 파랑으로 염색하는 경우 육안식별이 용이하였다.
실시예 4: 진단용 키트를 이용한 HIV 항체의 정량 분석
실시예 2에 따라 제조된 각각의 패드와 멤브레인을 연결하여 제작된 진단용 키트를 도 4와 같은 플라스틱 하우징에 넣고 조립하였다.
플라스틱 하우징은 도 5와 같은 플레이트에 구비된 홈에 장착될 수 있으며, 플레이트는 정량 분석 리더기의 부속품으로서 기기 내부에 본 발명의 진단용 키트를 삽입하는 데 활용된다.
리더기는 내부에 삽입된 키트를 이미지 또는 영상으로 촬영한 후 특정 범위의 색이 나타내는 진하기를 분석하여 정량적으로 측정하는 기능을 수행한다.
도 6 및 7과 같이 HIV 1형과 2형의 정량적 모니터링 알고리즘을 구축함으로써, 리더기를 이용한 정량 분석에 활용하여 육안 식별보다 정확하게 음/양성을 판단 할 수 있으며 양성의 경우 신속하게 정량 수치를 산출해낼 수 있다.

Claims (6)

  1. 각각 독립적으로 표지물질이 결합된 인간면역부전바이러스(Human Immunodeficiency Virus, HIV)의 1형, 2형 및 O형 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 중합체를 포함하고,
    각각 독립적으로 표지물질이 결합된 HIV 1형 중합체는 HIV 1형 항원에 결합하는 HIV의 1형 검출항체와 결합하고,
    각각 독립적으로 표지물질이 결합된 HIV 2형 중합체는 HIV 2형 항원에 결합하는 HIV의 2형 검출항체와 결합하고,
    각각 독립적으로 표지물질이 결합된 HIV O형 중합체는 HIV O형 항원에 결합하는 HIV의 O형 검출항체와 결합하고,
    상기 표지물질은 빨강, 검정 또는 파랑으로 염색한 셀룰로오즈 나노입자인 것인,
    면역학적 측정을 이용한 HIV 1형, 2형 및 O형 동시 진단용 키트.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 진단용 키트는 2종 이상의 검출항체에 각각 결합하는 2종 이상의 고정항원이 독립적으로 고정된 2개 이상의 검출선을 추가적으로 포함하는 것인, 면역학적 측정을 이용한 HIV 1형, 2형 및 O형 동시 진단용 키트.
  3. 다음의 단계를 포함하는 면역학적 측정을 이용한 HIV 1형, 2형 및 O형 동시 진단을 위한 정보 제공 방법:
    각각 독립적으로 표지물질이 결합된 인간면역부전바이러스(Human Immunodeficiency Virus, HIV)의 1형, 2형 및 O형 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 중합체에 시료를 가하는 시료 반응 단계에 있어서, 상기 표지물질은 빨강, 검정 또는 파랑으로 염색한 셀룰로오즈 나노입자인 것인 단계; 및
    상기 1종 이상의 중합체 및 시료의 반응물이 HIV 1형 항원에 결합하는 HIV 1형 검출항체, HIV 2형 항원에 결합하는 HIV 2형 검출항체 또는 HIV O형 항원에 결합하는 HIV O형 검출항체를 포함하는지의 여부를 확인하는 검출 확인 단계.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 검출 확인 단계는 2종 이상의 검출항체에 각각 결합하는 2종 이상의 고정항원이 독립적으로 고정된 검출선에서 수행되는 것인, 면역학적 측정을 이용한 HIV 1형, 2형 및 O형 동시 진단을 위한 정보 제공 방법.
  5. 다음의 단계를 포함하는 면역학적 측정을 이용한 HIV 1형, 2형 및 O형 동시 정량분석 방법:
    각각 독립적으로 표지물질이 결합된 인간면역부전바이러스(Human Immunodeficiency Virus, HIV)의 1형, 2형 및 O형 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 중합체에 시료를 가하는 시료 반응 단계; 및
    상기 1종 이상의 중합체 및 시료의 반응물에서 HIV 1형 항원에 결합하는 HIV 1형 검출항체, HIV 2형 항원에 결합하는 HIV 2형 검출항체 또는 HIV O형 항원에 결합하는 HIV O형 검출항체를 정량화하는 정량수치 산출 단계에 있어서, 상기 정량수치 산출 단계는 2종 이상의 검출항체에 각각 결합하는 2종 이상의 고정항원이 독립적으로 고정된 검출선을 이미지 분석하고, 색이 나타내는 진하기로부터 정량화가 수행되는 것인, 단계.
  6. 삭제
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