CN104087671A - 一种用于检测人21号染色体数目的试剂盒 - Google Patents

一种用于检测人21号染色体数目的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测人21号染色体数目的试剂盒，包括扩增检测试剂，该扩增检测试剂包括：同时扩增21号染色体特异重复序列与11号染色体特异重复序列的引物对；特异性检测上述21号染色体特异重复序列的荧光探针；特异性检测上述11号染色体特异重复序列的荧光探针。本发明所述试剂盒采用一对引物同时扩增不同染色体间的一对相似序列，避免了不同引物扩增不同序列产生的相互干扰或其它干扰，保证了扩增效率的一致性，选择在具有碱基差异的DNA序列部位设计荧光探针，以便能通过重复片段的实时荧光PCR的△CT值分别精确检测两个序列的扩增量，进一步提高了检测结果的准确性和可靠性，降低了引起假阴性或假阳性结果的机率。

Description

一种用于检测人21号染色体数目的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于检测人21号染色体数目的试剂盒，属于分子生物学领域。
背景技术
唐氏综合征(Down’s syndrome)也称为21-三体综合征,是人类最常见的染色体数目异常引起的非整倍体疾病,新生儿发生率为1/600～1/800。患儿主要表现为严重的先天性智力障碍和各种器官先天性畸形,多数患者生活无法自理。目前,该病尚无有效的治疗方法,因此,进行产前诊断防止患儿的出生是预防该类疾病发生的主要方法。长期以来,羊水细胞培养、染色体核型分析成为产前诊断的经典方法(Caspersson T,Zech L,Johansson C,et al.Identification of human chromosomes by DNA-binding fluorescentagents[J].Chromosoma,1970,30(2):215-227.),但是，该方法存在费时(一般要两周以上)、容易培养失败以及不能检测较小的染色体结构畸变等缺点。荧光原位杂交(FISH)技术应用于产前快速诊断，无需进行细胞培养，24小时内就可得出检验结果成为可能(Ho SSY,Chua C,Gole L,et al.Same-day prenatal diagnosis of common chromosomal aneuploidies usingmicrofluidics-fluorescence in situ hybridization[J].PrenatalDiagnosis,2012,32(4):321-328.等)；但是由于该技术操作繁琐并且要求具有良好的技术专业性，使得该技术不能大量的进行临床标本的应用。因此，应该需要建立更加快速而有效的产前诊断方法来弥补以上方法的一些缺陷和不足。
随着分子生物学的发展,目前已出现了几种快速分子诊断非整倍体的方法。QF-PCR方法是目前应用最广的一种方法，该方法能实现非整倍体的准确检测(Atef SH,Hafez S,Helmy S,et al.QF-PCR as a Rapid Techniquefor Routine Prenatal Diagnosis of Fetal Aneuploidies[J].PediatricResearch,2011,70:412-412.)，该技术的主要缺点是诊断需要依靠多态性位点，而多态性位点可能在某一人群能较好的进行诊断，而因为种族的差异可能会出现在其它人群中出现无法进行诊断的情况(Mann K,Donaghue C,Fox SP,et al.Strategies for the rapid prenatal diagnosis ofchromosome aneuploidy[J].Eur J Hum Genet,2004,12:907-915.)；并且，其在PCR扩增后还需要毛细管电泳分析其片段片度，因此，仪器及试剂的费用也限制了该方法的广泛应用。多重连接探针扩增(MLPA)技术最开始应用于基因拷贝数的变化，后来应用于非整倍体疾病的诊断(Slater HR,Bruno DL,Ren H,et al.Rapid,high throughput prenatal detection ofaneuploidy using a novel quantitative method(MLPA)[J].Journal ofmedical genetics,2003,40(12):907-912.)，由于该技术需要杂交过夜、连接以及产物的后续毛细管电泳分析等步骤，实验相对繁琐且后续分析昂贵费用影响了该技术的广泛应用(Willis AS,Veyver I,Eng CM.Multiplexligation‐dependent probe amplification(MLPA)and prenataldiagnosis[J].Prenat Diagn,2012；32:315-320.)。
实时荧光定量PCR方法诊断非整倍体不需要PCR后处理或电泳检测,简便、快速,整个操作及结果的判定可在4小时内完成；而且数据的读取完全由仪器进行,排除了主观因素的影响,另外几十个标本可以一次完成,为开展大规模的产前筛查提供了技术保障。目前的研究主要是采用21号染色体的DSCR3基因片段与12号染色体的GAPDH基因片段进行相对定量(ZimmermannB,Holzgreve W,Wenzel F,et al.Novel real-time quantitative PCR testfor trisomy21[J].Clinical chemistry,2002,48(2):362-363.等)，或者采用其他不同染色体间的特异序列进行相对定量研究(Zimmermann B G,Dudarewicz L.Real-time quantitative PCR for the detection of fetalaneuploidies[M].Prenatal Diagnosis.Humana Press,2008:95-109；眭建忠,张慧敏,孙筱放.多重实时定量PCR快速诊断唐氏及爱德华综合征[J].中华医学遗传学杂志,2010(4):449-452.)。但是，由于采用两对引物分别扩增不同的片段，很微小的退火温度的变化或DNA质量的差异都会引起假阴性或假阳性的结果，从而导致结果的不准确性(Helmy SM,IsmailS,Bassiouni R,et al.Sensitivity of DCSR3/GAPDH ratio usingquantitative real-time PCR in the rapid prenatal diagnosis for downsyndrome[J].Fetal Diagn Ther,2009,25(2):220-223.)。
公开号为CN100338227A、CN102086469A的发明专利，均公开了通过对不同染色体的特异序列设计不同引物和探针的方法检测21号染色体的数目，但这类方法存在如前所述的可能会由于退火温度的变化或DNA质量的差异，从而引起假阴性或假阳性的结果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于检测人21号染色体数目的试剂盒。该试剂盒采用一对引物同时对不同染色体间的一对相似序列进行扩增，避免了不同引物扩增不同序列产生的相互干扰或其它干扰，保证了扩增效率的一致性，提高了检测结果的准确性和可靠性，降低了引起假阴性或假阳性结果的机率。
本发明所述的用于检测人21号染色体数目的试剂盒，包括扩增检测试剂，所述的扩增检测试剂包括一对可以同时扩增21号染色体和11号染色体上的特异重复序列的引物、2条可以分别检测21号染色体和11号染色体特异序列扩增量的不同荧光标记的探针，所述的扩增引物和荧光探针具体为：
(1)同时扩增21号染色体特异重复序列chr21-2与11号染色体特异重复序列chr11-1的引物对，其碱基序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
(2)特异性检测21号染色体特异重复序列chr21-2的Taqman探针chr21-2-Probe，其碱基序列如SEQ ID NO：3所示；
(3)特异性检测11号染色体特异重复序列chr11-1的Taqman探针chr11-1-Probe，其碱基序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明所述的试剂盒通过在特异重复序列(两个相似序列)的两端完全相同的DNA序列部位设计一对共同的扩增引物，避免了不同引物扩增不同序列产生的相互干扰或其它干扰，从而保证了扩增效率的一致性；选择在具有碱基差异的DNA序列部位设计Taqman探针，以便能通过重复片段的实时荧光PCR的△CT值分别精确检测两个序列的扩增量，并通过21号染色体上的特异重复序列和11号染色体上的特异重复序列的相对定量△CT21-11值的分布区间判定检测标本是否为正常标本或21-三体核型标本，检测结果更为准确、可靠性。
上述技术方案中，所述21号染色体特异重复序列chr21-2与11号染色体特异重复序列chr11-1为两个相似序列，其中，21号染色体特异重复序列chr21-2的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，11号染色体特异重复序列chr11-1的碱基序列如SEQ ID NO：6所示。所述用于特异性检测21号染色体特异重复序列chr21-2的Taqman探针chr21-2-Probe5’端标记ROX，3’端标记BHQ1；用于特异性检测11号染色体特异重复序列chr11-1的Taqman探针chr11-1-Probe的5’端标记HEX，3’端标记BHQ1。所述的Taqman探针chr21-2-Probe和Taqman探针chr11-1-Probe可以分别检测21号染色体上的特异重复序列chr21-2和11号染色体上的特异重复序列chr11-1，再通过Taqman探针chr21-2-Probe和Taqman探针chr11-1-Probe的相对定量指标△CT21-11值判断21号染色体的数目。当△CT21-11＝CtROX-CtHEX＝-0.98～-0.70时，表示所检测标本为21号染色体正常标本；当△CT21-11＝CtROX-CtHEX＝-1.71～-1.39时，表示所检测标本为21-三体核型标本。
本发明所述的荧光探针中，HEX指六氯-6-甲基荧光素，ROX指羧基-X-罗丹明，BHQ1是指荧光淬灭基团。
本发明所述的试剂盒还包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分，如阳性对照模板、阴性对照模板、缓冲液、酶液、dNTP、Mg2+等。
与现有技术相比，本发明所述试剂盒采用一对引物同时对不同染色体间的一对相似序列进行扩增，避免了不同引物扩增不同序列产生的相互干扰或其它干扰，保证了扩增效率的一致性，选择在具有碱基差异的DNA序列部位设计Taqman探针，以便能通过重复片段的实时荧光PCR的△CT值分别精确检测两个序列的扩增量，进一步提高了检测结果的准确性和可靠性，降低了引起假阴性或假阳性结果的机率；同时，本发明所述试剂盒还具有灵敏度高、特异性强和快速简便等优点。
附图说明
图1为21号染色体上的特异重复序列和11号染色体上的特异重复序列在染色体上的位置，其中，(a)为21号染色体上的特异重复序列chr21-2在21号染色体上的位置，(b)为11号染色体上的特异重复序列chr11-1在11号染色体上的位置；
图2为图1中21号染色体上的特异重复序列和11号染色体上的特异重复序列，以及根据序列设计的公共引物和各自的Taqman探针，其中，图中的21-Taqman probe即为Taqman探针chr21-2-Probe，图中的11-Taqmanprobe即为Taqman探针chr11-1-Probe。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1：采用本发明所述试剂盒对正常标本和待测21-三体标本进行检测
1、试剂盒的组成：
1.1目标序列的选择以及引物和探针的设计
检测位点：选择21号染色体上的特异重复序列chr21-2与11号染色体上特异重复序列chr11-1(chr21-2和chr11-1为两个相似序列)为相对实时荧光定量PCR扩增和检测序列，如图1所示，其中：
21号染色体上的特异重复序列chr21-2的碱基序列为：5’-gtgccattgacacaggaggacccatgcctgagaaagacttttatctgagttactgagattaagatgttttgaagctcccaagcagagggatgctggatctgctgtggaaatctggctgagcagctgcagggacagctgggggtaaag-3’(SEQ ID NO：5)；
11号染色体上特异重复序列chr11-1的碱基序列为：5’-gtgccattgacacaggaggacctacgcctcagaaagacttttatctgagttaccaaggttgagatgttttgaaagatgctagatctgggaatctggctgagcagctgctgggacagctgggggtaaag-3’(SEQ ID NO：6)。
在21号染色体的特异重复序列chr21-2与11号染色体的特异重复序列chr11-1的两侧完全相同的碱基序列位点处设计一对公用引物，如图2所示，该引物对可同时扩增21号染色体特异重复序列chr21-2与11号染色体特异重复序列chr11-1，该引物对中：
上游引物(以下用chr21-11-F代替)为：5’-gtgccattgacacaggaggac-3’(SEQ ID NO：1)；
下游引物(以下用chr21-11-R代替)为：5’-ctttacccccagctgtccc-3’(SEQID NO：2)。
在21号染色体的特异重复序列chr21-2与11号染色体的特异重复序列chr11-1的中间具有碱基差异的序列位点处设计用于特异性检测21号染色体特异重复序列chr21-2的Taqman探针chr21-2-Probe以及特异性检测11号染色体特异重复序列chr11-1的Taqman探针chr11-1-Probe，如图2所示，其中：
Taqman探针chr21-2-Probe的碱基序列为：5’-ROX-agccagatttccacagcagatcca-BHQ1-3’(SEQ ID NO：3)；
Taqman探针chr11-1-Probe的碱基序列为：5’-HEX-tgctcagccagattcccagatcta-BHQ1-3’(SEQ ID NO：4)。
1.2其它组成成分：
Hotstar-Taq酶，缓冲液，dATP、dTTP、dCTP和dGTP以及Mg2+均购自北京康为世纪生物科技有限公司。
2、PCR反应体系的配制：
按下述表1配制PCR反应体系：
表1：(mM表示mmol/L，μM表示μmol/L)
PCR反应体系为50uL。
3、样本的来源及处理
样本来源于经传统的染色体核型分析方法确定核型的DNA样本，DNA样本采用实验室常规DNA提取方法进行提取，以双蒸水稀释至20ng/μL，并于-20℃保存备用。
4、PCR扩增程序：
PCR反应所用仪器为CFX96实时荧光定量PCR仪。PCR反应程序为：95℃预变性10min；95℃15sec，60℃1min，40个循环，于60℃退火步骤末采集荧光信号。
将正常标本和待测21-三体标本，根据上述反应体系和反应程序，于荧光定量PCR仪上进行扩增检测，分别记录△CTROX值和△CTHEX值。
5、结果检测与分析：
正常标本的21号染色体与11号染色体的△CT21-11＝CtROX-CtHEX＝-0.98，而21-三体标本的21号染色体与11号染色体的△CT21-11＝CtROX-CtHEX＝-1.58；通过比较21号染色体与11号染色体正常标本与21-三体标本的△CT值：-0.98与-1.58，结果显示21号染色体比11号染色体要多一个拷贝(理论上，△CT相差为0.5时，其拷贝相差1个拷贝)，可见，与染色体核型分析的结果相符，测试的21-三体标本为3条21号染色体。
实验结果显示，本发明所述试剂盒可检测出待测21-三体标本为21-三体，与传统的染色体核型分析判断的结果一致，因此，本发明所述试剂盒能用于临床标本的检测。
实施例2：用实施例1所述试剂盒、方法、步骤等对临床标本进行检测
采用试剂盒对35例正常标本和26例21-三体标本进行测试，所有样本均来源自经传统的染色体核型分析方法确定核型的DNA样本。
通过21号染色体与11号染色体的相对定量△CT21-11值(△CT21-11＝CtROX-CtHEX)的不同分布区间，即可判断出该标本是正常标本或是21-三体标本，实时荧光定量检测△CT值及其范围如下：
正常标本的21号染色体与11号染色体的△CT21-11值范围为-0.98～-0.70；21-三体标本的21号染色体与11号染色体的△CT21-11值范围为-1.71～-1.39，正常标本和21-三体标本两者之间的△CT值无交叉重叠，通过△CT值在区间范围的分布来判断待测标本是正常标本或21-三体患者标本。
检测的临床正常核型标本(染色体核型结果表示为46,NN，46表示正常的染色体数目；NN表示正常的性染色体)和21-三体核型标本(染色体核型结果表示为47,NN,+21，47表示染色体的数目，NN表示正常的性染色体；+21表示多了一条21号染色体)的21号染色体与11号染色体的相对定量△CT21-11值的具体结果见表2。
表2:正常核型DNA与21-三体核型标本DNA的多重实时荧光定量的ΔCT值结果及分析
实验结果表明，本发明所述试剂盒能有效、准确的检测出21号染色体的数目，检测结果与传统的染色体核型分析方法一致，准确率为100％，结果可读性好，分析、检测过程简单、高效。

Claims (5)

1.一种用于检测人21号染色体数目的试剂盒，包括扩增检测试剂，其特征在于：所述的扩增检测试剂包括：
(1)同时扩增21号染色体特异重复序列chr21-2与11号染色体特异重复序列chr11-1的引物对，其碱基序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
(2)特异性检测21号染色体特异重复序列chr21-2的Taqman探针chr21-2-Probe，其碱基序列如SEQ ID NO：3所示；
(3)特异性检测11号染色体特异重复序列chr11-1的Taqman探针chr11-1-Probe，其碱基序列如SEQ ID NO：4所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述21号染色体特异重复序列chr21-2与11号染色体特异重复序列chr11-1为两个相似序列，其中，21号染色体特异重复序列chr21-2的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，11号染色体特异重复序列chr11-1的碱基序列如SEQ ID NO：6所示。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述Taqman探针chr21-2-Probe的5’端标记ROX，3’端标记BHQ1。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述Taqman探针chr11-1-Probe的5’端标记HEX，3’端标记BHQ1。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：以Taqman探针chr21-2-Probe和Taqman探针chr11-1-Probe的相对定量指标△CT21-11值判断21号染色体的数目，所述△CT21-11＝CtROX-CtHEX，当△CT21-11＝-0.98～-0.70时，表示所检测标本为21号染色体正常标本；当△CT21-11＝-1.71～-1.39时，表示所检测标本为21-三体核型标本。
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