CN103820565B - 21染色体中基因检测方法、相关检测探针组合物及检测试剂盒、以及相关应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种21染色体中基因检测方法，包括步骤：提取检测对象的基因组DNA；采用两套PCR引物对和TaqmanMGB荧光探针组合分别对基因组DNA进行荧光定量PCR，其中PCR引物对分别是SEQIDNO:4与SEQIDNO:5以及SEQIDNO:7与SEQIDNO:8所示的核苷酸序列，TaqmanMGB荧光探针具有的核苷酸序列分别是SEQIDNO:6和SEQIDNO:9所示的核苷酸序列；根据荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线，分析基因组DNA中的21号染色体是否存在三体可能性。还涉及相关检测探针组合物及检测试剂盒、以及相关应用，本发明设计巧妙，采用闭管检测，可有效避免样本污染，且检测快速、准确、简便，从而可作为医师诊断和用药的参考依据，适于大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因定量检测技术领域，更具体地，涉及21染色体中基因检测技术领域，特别是指一种21染色体中基因检测方法、相关检测探针组合物及检测试剂盒、以及相关应用。
背景技术
21三体综合症(先天愚型，Down’ssyndrome，唐氏综合症)是一种常见的常染色体病，其主要原因是因为21号染色体三体化造成的严重遗传物质不平衡而导致智力严重低下(IQ50-70)，特别面容(国际脸)、身体多种畸形率高和肿瘤发病率高等等系列疾病特征。21三体综合症发病率在1/500左右，随孕妇年龄增大发病率明显增加。21三体综合症几乎没有自理生存能力，寿命与正常人类似，病人生命质量极差，也给家庭和社会造成沉重负担。21三体综合症目前尚无有效的治疗办法，预防患者出生是阻断该病遗传的最有效的手段，因此产前基因检测是避免再次生育患者的最佳选择。
21三体综合症可以参考染色体检测结果和其他附加医疗检测进行判断。对于产前诊断，羊水合绒毛组织都是适合的检测样本。但是由于染色体检测需要活细胞培养以及后续染色体显带分析，对样本要求高(2ml全血或10ml羊水)，检测时间长(2周)，难以广泛开展。染色体检测因为技术条件复杂，影响因素多，即便在条件良好的试验室也有较多的失败案例。随后开发的荧光原位杂交可以不使用活细胞，直接在固定细胞操作大大简化了检测流程，但是探针检测范围局限性无法取代染色体检测。而包括AFP检测和孕妇血浆二代测序检测远远无法达到染色体检测的准确度，仅仅作为发现高危人群的一种筛选方法。
本发明检测21染色体中基因的方法，其采用MGB探针定量闭管检测2个21染色体特异性单拷贝位点，可对少量样本(血滤纸，0.1ml羊水，口腔拭子)进行检测，仅仅在2-3小时内准确得出21号染色体的基因数量特点。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种21染色体中基因检测方法、相关检测探针组合物及检测试剂盒、以及相关应用，该检测方法设计巧妙，采用闭管检测，可有效避免样本污染，且检测快速、准确、简便，适于大规模推广应用。
为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种21染色体中基因的检测方法，其特点是，包括步骤：
a.提取检测对象的基因组DNA；
b.采用第一PCR引物对和第一TaqmanMGB荧光探针对所述步骤a得到的基因组DNA进行荧光定量PCR，其中所述第一PCR引物对是SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示的核苷酸序列，所述第一TaqmanMGB荧光探针的核苷酸序列是SEQIDNO:6所示的核苷酸序列；采用第二PCR引物对和第二TaqmanMGB荧光探针对所述步骤a得到的基因组DNA进行荧光定量PCR，其中所述第二PCR引物对是SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的核苷酸序列，所述第二TaqmanMGB荧光探针的核苷酸序列是SEQIDNO:9所示的核苷酸序列；
c.根据所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线，分析所述基因组DNA中的21染色体的两个位点来判断染色体基因数量是否正常。
较佳地，在进行荧光定量PCR时，还采用内参PCR引物对和内参TaqmanMGB荧光探针进行扩增，其中所述内参PCR引物对是SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所示的核苷酸序列，所述内参TaqmanMGB荧光探针的核苷酸序列是SEQIDNO:12所示的核苷酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种21染色体中基因检测探针组合物，其特点是，包括第一PCR引物对、第一TaqmanMGB荧光探针、第二PCR引物对和第二TaqmanMGB荧光探针，其中所述第一PCR引物对是SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示的核苷酸序列，所述第一TaqmanMGB荧光探针的核苷酸序列是SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，所述第二PCR引物对是SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的核苷酸序列，所述第二TaqmanMGB荧光探针的核苷酸序列是SEQIDNO:9所示的核苷酸序列。
较佳地，所述21染色体中基因检测探针组合物还包括内参PCR引物对和内参TaqmanMGB荧光探针，所述内参PCR引物对是SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所示的核苷酸序列，所述内参TaqmanMGB荧光探针的核苷酸序列是SEQIDNO:12所示的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供了上述的21染色体中基因检测探针组合物在检测21染色体中基因数量中的应用。
在本发明的第四方面，提供了一种21染色体中基因检测试剂盒，其特点是，包括第一引物容器、第一荧光探针容器、第二引物容器和第二荧光探针容器，所述第一引物容器内具有第一PCR引物对干燥粉末或溶液，其是SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示的核苷酸序列；所述第一荧光探针容器内具有第一TaqmanMGB荧光探针干燥粉末或溶液，其核苷酸序列是SEQIDNO:6所示的核苷酸序列；所述第二引物容器内具有第二PCR引物对干燥粉末或溶液，其是SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的核苷酸序列；所述第二荧光探针容器内具有第二TaqmanMGB荧光探针干燥粉末或溶液，其核苷酸序列是SEQIDNO:9所示的核苷酸序列。
较佳地，所述21染色体中基因检测试剂盒还包括内参引物容器和内参荧光探针容器，所述内参引物容器内具有内参PCR引物对干燥粉末或溶液，其是SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所示的核苷酸序列；所述内参荧光探针容器内具有内参TaqmanMGB荧光探针干燥粉末或溶液，其核苷酸序列是SEQIDNO:12所示的核苷酸序列。
在本发明的第五方面，提供了上述的21染色体中基因检测试剂盒在检测21染色体中基因数量中的应用。
本发明的创新点在于通过荧光定量PCR技术检测样本的基因组DNA中的21染色体的2个单拷贝基因来判断21染色体基因数量，设计巧妙，采用闭管检测，可有效避免样本污染，且检测快速、准确、简便，适于大规模推广应用。
附图说明
图1是人21号ADAMTS5正常检测结果，1为β-actin基因扩增曲线，2为21号染色体ADAMTS5特异性片段扩增曲线横坐标是以0-42的偶数标示的循环数，纵坐标是相应的荧光信号。
图2是人21号染色体ADAMTS521染色体异常型检测结果，3为β-actin基因扩增曲线，4为21号染色体ADAMTS5基因扩增曲线，横坐标是以0-42的偶数标示的循环数，纵坐标是相应的荧光信号。
图3是人21号染色体DSCRA正常检测结果，5为β-actin基因扩增曲线，6为21号染色体DSCRA特异性片段扩增曲线，横坐标是以0-42的偶数标示的循环数，纵坐标是相应的荧光信号。
图4是人21号染色体DSCRA21染色体异常型检测结果。7为β-actin基因扩增曲线，8为21号染色体DSCRA基因扩增曲线。横坐标是以0-42的偶数标示的循环数，纵坐标是相应的荧光信号，横坐标是以0-42的偶数标示的循环数，纵坐标是相应的荧光信号。
具体实施方式
为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。应理解，下列具体实施例仅仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制。
实施例1：DNA制备
1)测试用正常人基因组DNA制备
采取正常人血滤纸，Chlex100抽提制备，正常人基因组DNA浓度调节到10ng/μl。
2)正常基因型标准品制备
依据人21号染色体ADAMTS5(adisintegrinandmetallopeptidasewiththrombospondintype1motif5，一种含有1型血栓反应素结构域5的去整合素及金属蛋白酶)基因、DSCRA(Downsyndromecriticalregiongene3，唐氏综合症关键区域基因3)基因和内参基因β-actin序列，人工合成ADAMTS5(SEQIDNO:1)、DSCRA(SEQIDNO:2)和β-actin(SEQIDNO:3)。分别含上述片段的T载体按1：1：1混合，浓度调节为1ng/ul作为10倍正常基因型模板。
3)21染色体异常型基因型标准品制备
人工合成ADAMTS5(SEQIDNO:1)、DSCRA(SEQIDNO:2)和β-actin(SEQIDNO:3)。含上述片段的T载体按摩尔数3：3：2混合，浓度调节为1ng/ul作为21染色体异常型基因型模板。
实施例2：21号染色体特异性单拷贝基因扩增引物和MGB探针设计合成
根据人21号染色体ADAMTS5和DSCRA设计合成引物，ADAMTS5基因、DSCRA基因探针标记Fam，内参基因探针标记Vic。验证荧光定量PCR引物特异性扩增目标基因片段，TaqmanMGB位点特异性探针报告对应荧光信号。人工合成基因片段特异性扩增引物和位点特异性TaqmanMGB报告探针。基因片段特异性引物和位点特异性TaqmanMGB探针序列见表1和表2(SEQIDNO:4到SEQIDNO:12)。
表1SEQIDNO:4至SEQIDNO:9所示核苷酸序列及其修饰特征
表2SEQIDNO:10至SEQIDNO:12所示核苷酸序列及其修饰特征
实施例3：21染色体特异性单拷贝基因定量PCR检测
1)ADAMTS5基因验证
反应体系：引物探针混合物2.5μl，2倍MultiplexPCRMix(QIAGENN.V.，德国)12.5μl，标准模板2.5μl，5倍EasyBuffer5μl，ddH2O2.5μl。
定量PCR仪：ABI7500(LifeTechnologies公司，美国)。
反应条件：95℃5分钟；94℃30秒——60℃30秒——72℃45秒，40循环。
2)DSCRA基因验证
反应体系：引物探针混合物2.5μl，2倍MultiplexPCRMix(QIAGENN.V.，德国)12.5μl，标准模板2.5μl，5倍EasyBuffer5μl，ddH2O2.5μl。
定量PCR仪：ABI7500(LifeTechnologies公司，美国)。
反应条件：95℃5分钟；94℃30秒——60℃30秒——72℃45秒，40循环。
实施例4：结果读取
1)ADAMTS5基因验证结果读取：
请参见图1和图2，检测到Vic、Fam信号确定为扩增成功，样本Fam/Vic与正常对照Fam/Vic比值为0.90-1.10确定为21号染色体正常；样本Fam/Vic与正常对照Fam/Vic比值大于1.25以上确定为21号染色体有异常情况，吻合度要求100％。类似的，样本Fam/Vic与21染色体异常型对照Fam/Vic比值为0.70-0.80确定为21号染色体正常；样本Fam/Vic与21染色体异常型对照Fam/Vic比值大于0.9确定为21号染色体有异常情况，吻合度要求100％。
2)DSCRA基因验证结果读取：
请参见图3和图4，检测到Vic、Fam信号确定为扩增成功，样本Fam/Vic与正常对照Fam/Vic比值为0.90-1.10确定为21号染色体正常；样本Fam/Vic与正常对照Fam/Vic比值大于1.25以上确定为21号染色体有异常情况，吻合度要求100％。类似的，样本Fam/Vic与21染色体异常型对照Fam/Vic比值为0.70-0.80确定为21号染色体正常；样本Fam/Vic与21染色体异常型对照Fam/Vic比值大于0.9确定为21号染色体有异常情况，吻合度要求100％。
3)数据联合分析
本发明通过使用上述引物对和TaqmanMGB探针可以确定上述2个基因位点的基因型，两个位点和两个对照样本的结果应该综合分析，要求100％吻合，否则视为实验失败。检测结果可以分为2种染色体分型判断，21号染色体正常和21染色体有异常情况。
本发明提出的检测21号染色体特异性单拷贝基因位点检测引物，标的基因和内参基因TaqmanMGB探针分别用Fam和Vic标记，显然可以选用其它合适荧光标记。
本发明提出的21染色体的2个基因位点检测引物探针，分位点包装为2管，单引物探针浓度为0.1到0.5μM，设计为10倍浓度，使用时终浓度为1倍浓度。
本发明的21染色体的2个基因位点检测引物探针分别与模板及PCR扩增试剂混合，在定量PCR仪上扩增并收集Ct值，依据Ct值确定位点基因型。
本发明使用TaqmanMGB探针定量PCR确定21染色体条数。综合2个位点的基因型确定个体21号染色体条数。进一步可以确定个体是否为21染色体有异常情况。本发明提供的试剂可以在具有定量PCR的实验室完成，检测时间仅仅需要3到5个小时；检测仪器(如AB7500定量PCR仪)和方法(TaqmanMGB探针定量PCR)获得SFDA认证；可以在单个实验室全闭管完成，可避免高浓度模板污染；该发明可以稳定实施，具备在大规模推广的技术条件。
因此，本发明的21染色体中基因检测方法可以使用定量PCR仪和配套PCR试剂，通过扩增检测2个21染色体常见单拷贝基因位点，可在3到5个小时内得出检测结果。该发明提供的试剂检测21染色体中基因在具有定量PCR仪的单个实验室闭管完成，可有效避免高浓度样本污染。该发明提供的试剂可以方便地在生物技术公司生产以及在生物医学检测机构用于检测，具备产业化推广的条件。
综上所述，本发明的21染色体中基因检测方法设计巧妙，采用闭管检测，可有效避免样本污染，且检测快速、准确、简便，适于大规模推广应用。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。
Claims (4)
1.一种21染色体中基因检测探针组合物，其特征在于，包括第一PCR引物对、第一TaqmanMGB荧光探针、第二PCR引物对和第二TaqmanMGB荧光探针，其中所述第一PCR引物对是SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示的核苷酸序列，所述第一TaqmanMGB荧光探针的核苷酸序列是SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，所述第二PCR引物对是SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的核苷酸序列，所述第二TaqmanMGB荧光探针的核苷酸序列是SEQIDNO:9所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的21染色体中基因检测探针组合物，其特征在于，所述21染色体中基因检测探针组合物还包括内参PCR引物对和内参TaqmanMGB荧光探针，所述内参PCR引物对是SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所示的核苷酸序列，所述内参TaqmanMGB荧光探针的核苷酸序列是SEQIDNO:12所示的核苷酸序列。
3.一种21染色体中基因检测试剂盒，其特征在于，包括第一引物容器、第一荧光探针容器、第二引物容器和第二荧光探针容器，所述第一引物容器内具有第一PCR引物对干燥粉末或溶液，其是SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示的核苷酸序列；所述第一荧光探针容器内具有第一TaqmanMGB荧光探针干燥粉末或溶液，其核苷酸序列是SEQIDNO:6所示的核苷酸序列；所述第二引物容器内具有第二PCR引物对干燥粉末或溶液，其是SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的核苷酸序列；所述第二荧光探针容器内具有第二TaqmanMGB荧光探针干燥粉末或溶液，其核苷酸序列是SEQIDNO:9所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的21染色体中基因检测试剂盒，其特征在于，所述21染色体中基因检测试剂盒还包括内参引物容器和内参荧光探针容器，所述内参引物容器内具有内参PCR引物对干燥粉末或溶液，其是SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所示的核苷酸序列；所述内参荧光探针容器内具有内参TaqmanMGB荧光探针干燥粉末或溶液，其核苷酸序列是SEQIDNO:12所示的核苷酸序列。
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| CN101323877A (zh) * | 2007-06-15 | 2008-12-17 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 检测21号染色体和性染色体数目异常的试剂盒 |
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