CN101555528B - 一种染色体22q11.2区微缺失、微重复的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程领域，公开了一种染色体22q11.2区微缺失、微重复的测定方法。该方法的步骤包括：抽提基因组DNA；进行多重荧光定量PCR复合扩增，复合扩增体系中包括了5个STR标记：D22S873，22D_5_1，22D_4_5，2D_4_4，22D_4_3和一个内参G6PDH；取PCR扩增产物变性使双链产物转化为可为毛细管电泳分析的单链，采用毛细管电泳对上述变性产物进行产物长度和产物量分析；采用量比值分析的方法和/或采用峰的位置及数量分析的方法判断是否为正常、微缺失或微重复。该方法可提高检测的可靠性，缩短检测时间，降低检测成本，便于临床大规模使用。

Description

一种染色体22q11.2区微缺失、微重复的测定方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种染色体22q11.2区微缺失、微重复的测定方法。

背景技术：

22q11微缺失人群发生率为约1/4000，是最常见的基因组异常综合征，临床表现以先天性心脏缺陷(CHD)为最常见，其他临床表现有：面部畸形、免疫缺陷、高钙血症、骨骼异常、泌尿系畸形、轻度学习障碍等。而CHD以主动脉弓中断、法乐氏四联征、室间隔缺损、永存动脉干等最为常见。对CHD进行22q11微缺失分析不仅可对CHD的分子机理进行探讨，对临床诊断、遗传咨询和产前诊断都有帮助。

虽然国外对22q11微缺失和先心病关系的探索已历十余年，取得了一些进展，如已将缺失片段定位于染色体22q11区段的1.5-3Mb区间，对其间的一些基因进行了定位，制备了一些区域探针和筛选了一些STRP标记用于遗传学诊断，不幸的是对部分染色体拷贝数变化比较困难，包括微缺失、微重复等。

对于染色体微缺失、微重复的检测，目前主要采用三种技术(1)染色体荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)。这是利用克隆获得目标染色体位点DNA序列制备探针，在荧光标记的条件下，与患者体细胞染色体杂交，确定目标染色体位点是否存在检测片段的缺失。FISH技术具有分子杂交的特异性和敏感性，结果直观，染色体微缺失分析中，一直为多数实验室所采用。但FISH检测成本较高，操作繁杂，难以同时分析多个染色体区带。FISH技术受到探针杂交片段的限制，分析染色体位点内的微小缺失容易出现漏诊。(2)短串联重复序列多态性(short tandemrepeat polymorphsm，STRP)分析。这一技术利用人类基因组中广泛存在的微卫星DNA多态性，在目标染色体区带内选择多条微卫星DNA靶序列。结合患者及其亲本基因组DNA的分析，确定目标染色体位点是否存在靶序列的杂合型缺失。STRP分析方法简便，可以确定缺失染色体的亲本起源。但判定结果通常依赖于杂合条带，同时需结合双亲基因型综合分析。另一方面，FISH技术和STRP对于分析片段难以定量，因此对于目标染色体区带的DNA微复制也难以检出。(3)多重连接探针扩增技术(MultiplexLigation-dependent Probe Amplicication，MLPA)，由荷兰的Dr.Schouten所带领的研发团队于2002年发表，这是利用针对染色体不同区域的上下游对同一条DNA单链设计的多对带冗余共同序列的探针，用连接酶连接这些上下游探针以采集这些探针结合区域的DNA模板的数量信息，其探针数量为模板数量。这些多个在不同结合区域所生成的探针可由同一对引物扩增，其定量较为准确，且于单一反应管内最多可同时检测40个不同的核苷酸序列的拷贝数变化。但作为一种半定量的方法，其假阳性率不可避免。并且其检测成本较高，难以大规模推广。

以上各种检验染色体拷贝数变化的方法共同的缺点是结果的不确定性。FISH技术受到探针杂交片段的限制，分析染色体位点内的微小缺失容易出现漏诊，STRP分析的判定结果通常依赖于杂合条带，且受到分析靶序列杂合度和双亲样本分析结果的影响，其阳性率不能完全满意，而MLPA作为一种半定量的方法，其假阳性率不可避免。这些方法的不确定性已成为制约大规模推广临床诊断的重要障碍，因此，开发一种新的、能大规模精确而又经济的确定染色体拷贝数变化的方法并制定相关的技术标准就变得非常重要。

发明内容：

本发明的目的是提供一种染色体22q11.2区微缺失、微重复的测定方法。

本发明的目的是通过下列技术措施实现的：

一种染色体22q11.2区微缺失、微重复的测定方法，该方法包括下列步骤：

a.抽提基因组DNA；

b.多重荧光定量PCR复合扩增：复合扩增体系中包括了5个STR标记：D22S873，22D_5_1，22D_4_5，22D_4_4，22D_4_3和一个内参G6PDH；进行PCR扩增；

c.取PCR扩增产物变性使双链产物转化为可为毛细管电泳分析的单链，采用毛细管电泳对上述变性产物进行产物长度和产物量分析；

d.结果分析：

1)根据下列公式计算量比值：

量比值0.7～1.3，为正常二倍体个体；

量比值小于0.7，为存在微缺失的个体；

量比值大于1.3，为存在微重复的个体；

和/或

2)根据峰的位置和数量进行判断，微缺失为在相应位置缺少峰；微重复有三种情形：相应位置出现峰高等于或接近1∶1∶1的三个峰、出现峰高等于或接近2∶1的二个峰、出现峰高等于或接近1∶2的二个峰；

其中：

D22S873的上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2；

22D_5_1的上游引物序列为SEQ ID NO.3，下游引物序列为SEQ ID NO.4；

22D_4_5的上游引物序列为SEQ ID NO.5，下游引物序列为SEQ ID NO.6；

22D_4_4的上游引物序列为SEQ ID NO.7，下游引物序列为SEQ ID NO.8；

22D_4_3的上游引物序列为SEQ ID NO.9，下游引物序列为SEQ ID NO.10；

G6PDH的上游引物序列为SEQ ID NO.11，下游引物序列为SEQ ID NO.12。

所述的测定方法，该方法中PCR复合扩增体系为：

25μl体系包括：35-80ng基因组DNA

               2.5μl10×STR buffer(promega)

               0.1μM D22S873 引物

               0.2μM 22D_5_1 引物

               0.4μM 22D_4_5 引物

               1.1μM 22D_4_4 引物

               0.21μM 22D_4_3 引物

               0.085μM G6PDH 引物

               1U Tag酶(promega)。

本发明的有益效果：

对22q11.2，我们建立了一种竞争性多重荧光定量短串联重复PCR检测技术(CFMSA)。通过短串联重复PCR标记物，CFMSA可以在同一试管中同时检测该染色体的多态性和基因数量，也因此增加了敏感性。在110个正常对照的实验中证实了高度多态性和基因数量的可靠性。476个符合美国心脏学会诊断标准的先天性心脏病患者中，正确鉴别出22q11.2区的17个微缺失和1个微重复。CFMSA有望取代目前对22q11.2区常规的大范围筛查技术，成为廉价而有效的筛查22q11.2区微缺失和微重复的新方法。

1、突破了传统微缺失和微重复的筛查工具只能提供定量信息和多态性信息中的其中一种的限制，CFMSA同时提供这两个互为印证的信息，极大的提高了传统筛查工具的可靠性，将筛查结果的无效率从20％左右降低为0.02％以下，降低了1000倍。

2、CFMSA不需要传统的细胞培养，探针杂交技术，将整套流程的时间从数个工作日降低为数个小时，并极大降低了工作量，每个FISH样品所需要的人工为3个，该工具仅为0.01个。

3、整个技术流程的大部分可以自动化操作，利于大规模临床使用。且费用低廉，成本从1千多元降低为数十元。国内产前诊断由于成本高，规模小长期处于亏损状态，该工具有望改变这一情况。

附图说明

图1是实施例1样本扩增产物用ABI3130基因分析仪进行毛细管电泳分析图。

图2是实施例2样本扩增产物用ABI3130基因分析仪进行毛细管电泳分析图。

图中标*为先心病人样本。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

注：本发明实施例涉及的生物工程技术未作详细说明的均采用本领域技术人员公知的方法。用于产前诊断的基因组DNA可采用胎儿羊水进行抽提基因组DNA。

实施例1

操作步骤：

1、抽提基因组DNA：树脂型TM基因组DNA提取试剂盒(上海赛百盛技术公司)；先天性心脏病患者及正常人血液；按照试剂盒要求分别抽提基因组DNA。

2、多重荧光定量PCR复合扩增

复合扩增体系中包括了5个STR标记：D22S873，22D_5_1，22D_4_5，22D_4_4，22D_4_3和一个内参G6PDH；

引物序列见下表(在每个STR位点的前向引物F上加FAM荧光标记)

PCR扩增：

25μl体系包括： 35-80ng基因组DNA

                2.5μl 10×STR buffer(缓冲液)(promega)

                0.1μM D22S873 引物

                0.2μM 22D_5_1 引物

                0.4μM 22D_4_5 引物

                1.1μM 22D_4_4 引物

                0.21μM 22D_4_3 引物

                0.085μM G6PDH 引物

                1U Tag酶(promega)；

PCR反应条件：95℃ 2min，

             60℃ 30min

3、取2μlPCR产物，与7.8μlHiDi甲酰胺(ABI公司)，0.2μl Rox500标准分子量标记(ABI公司)相混合，95℃变性5分钟，使PCR扩增产物由双链产物转化为可为毛细管电泳分析的单链。

4、用ABI3130基因分析仪对上述变性产物进行毛细管电泳分析，得出STR位点及其内参的峰面积(见表1)及图1：

5、结果分析：

1)根据量比值进行分析

表1

	D22S873(峰面积)	22D_5_1(峰面积)	22D_4_5(峰面积)	22_4_4(峰面积)	22D_4_3(峰面积)	G6PDH(峰面积)
							先心病人	18419	17156	16808	15507	37654	92059
正常人	27852	20354	18870	18110	45668	68631

结果：此先心病人存在22q11.2微缺失。

2)根据图1中峰的位置和数量进行判断：

说明：由于染色体的DNA来自父母，在正常情况下，每对引物PCR扩增片断的变性产物进行毛细管电泳分析显示为相应位置出现峰高相同或接近的两个峰(峰高比例可在0.7～1.3∶1之间)，即两个未重叠峰；如果这两个峰重叠，则该位置出现峰高约为未重叠峰峰高2倍的单个重叠峰(重叠峰与未重叠峰的峰高比例可在1.6～2.4∶1之间)。

图1中：

引物D22S873对应位置的峰：正常对照为峰高约为先心病人峰高2倍的一个峰，表明形成重叠，而先心病人只有一个未重叠的峰，缺少另一个峰高相近的峰；

引物22D_5_1、引物22D_4_5、引物22D_4_4、引物22D_4_3对应位置的峰：正常人分别在相应位置出现两个未重叠的峰，而先心病人在相应位置只有一个未重叠的峰。

结论：此先心病人存在22q11.2微缺失。

可以单独采用量比值的方法或者采用峰的位置和数量的方法判断是否存在微缺失，最好是两种方法结合采用，以进一步提高分析的准确性。

实施例2：

操作步骤：

1、抽提基因组DNA：树脂型TM基因组DNA提取试剂盒(上海赛百盛技术公司)；另一先天性心脏病患者及正常人血液；按照试剂盒要求分别抽提基因组DNA。

2、多重荧光定量PCR复合扩增

复合扩增体系中包括了5个STR标记：D22S873，22D_5_1，22D_4_5，22D_4_4，22D_4_3和一个内参G6PDH；

引物序列见下表(在每个STR位点的前向引物F上加FAM荧光标记)

PCR扩增：

25μl体系包括：35-80ng基因组DNA

               2.5μl 10×STR buffer(promega)

               0.1μM D22S873 引物

               0.2μM 22D_5_1 引物

               0.4μM 22D_4_5 引物

               1.1μM 22D_4_4 引物

               0.21μM 22D_4_3 引物

               0.085μM G6PDH 引物

               1U Tag酶(promega)；

PCR反应条件：95℃ 2min，

             60℃ 30min

3、取2μlPCR产物，与7.8μlHiDi甲酰胺(ABI公司)，0.2μl Rox500标准分子量标记(ABI公司)相混合，95℃变性5分钟，使PCR扩增产物由双链产物转化为可为毛细管电泳分析的单链。

4、用ABI3130基因分析仪对上述变性产物进行毛细管电泳分析，得出STR位点及其内参的峰面积(见表2)及图2：

5、结果分析：

1)根据量比值进行分析

表2

	D22S873(峰面积)	22D_5_1(峰面积)	22D_4_5(峰面积)	22_4_4(峰面积)	22D_4_3(峰面积)	G6PDH(峰面积)
							先心病人	49348	50186	30342	45278	124836	85514
正常人	27852	20354	18870	18110	45668	68631

结果：此先心病人存在22q11.2微重复。

2)根据图2中峰的位置和数量进行判断：

引物D22S873对应位置的峰：正常对照为峰高约为先心病人未重叠峰的峰高2倍的一个峰，表明形成重叠，而先心病人有3个峰高相近的未重叠峰，多出一个峰；

引物22D_5_1、引物22D_4_5、引物22D_4_4对应位置的峰：正常人分别在相应位置出现2个未重叠的峰，而先心病人在相应位置出现2个峰，但其中一个峰的峰高约为另一个峰的峰高2倍，表明此峰是重叠峰，即多出一个峰。

引物22D_4_3对应位置的峰：正常人在相应位置出现两个未重叠的峰，而先心病人在相应位置出现3个未重叠峰，多出一个峰。

结论：此先心病人存在22q11.2微重复。

可以单独采用量比值的方法或者采用峰的位置和数量的方法判断是否存在微重复，最好是两种方法结合采用，以进一步提高分析的准确性。

序列表

<110>南京市妇幼保健院

<120>一种染色体22q11.2区微缺失、微重复的测定方法

<160>12

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>STR标记D22S873上游引物

<400>1

agtctgtgtg acagagtgac agc 23

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>STR标记D22S873下游引物

<400>2

gctcctctga gcacgtttct 20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>STR标记22D_5_1上游引物

<400>3

gagcagcttt tgtgggtttt 20

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>STR标记22D_5_1下游引物

<400>4

gactctgaaa ggtagaggtg aagg 24

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>STR标记22D_4_5上游引物

<400>5

tgaaatttgt atgtgagctg attg 24

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>STR标记22D_4_5下游引物

<400>6

gagcgacact gtgagacacc t 21

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>STR标记22D_4_4上游引物

<400>7

ggcttggact gagtgtctga g 21

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>STR标记22D_4_4下游引物

<400>8

gtgagaccct atttcaaaaa cgaa 24

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>STR标记22D_4_3上游引物

<400>9

tcctgctcca ttccaggtc 19

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>STR标记22D_4_3下游引物

<400>10

gatgatttat ctgccctgt cacc 24

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>G6PDH上游引物

<400>11

cagccctctg tccgat tact ac 22

<210>12

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>G6PDH上游引物

<400>12

gccagct tag agatcagctc ct 22

Claims (1)

1.一种检测染色体22q11.2区微缺失、微重复的引物组合，其特征在于该引物组合由下列引物组成：

D22S873的上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2；

22D_5_1的上游引物序列为SEQ ID NO.3，下游引物序列为SEQ ID NO.4；

22D_4_5的上游引物序列为SEQ ID NO.5，下游引物序列为SEQ ID NO.6；

22D_4_4的上游引物序列为SEQ ID NO.7，下游引物序列为SEQ ID NO.8；

22D_4_3的上游引物序列为SEQ ID NO.9，下游引物序列为SEQ ID NO.10；

G6PDH的上游引物序列为SEQ ID NO.11，下游引物序列为SEQ ID NO.12。