CN104293932A - 一种基于实时荧光pcr检测hla-b*5801等位基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是在使用TaqMan探针检测法的基础上，设计了高特异性扩增HLA-B*5801等位基因的引物探针组合：Fp:5’-AGGGGCCGGAGTATTGGGATG-3’，Rp:5’-TTGGCCTCAACTGAAAATGAAAC-3’，MGB probe:5’-HEX/VIC-TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC–MGB-3’；同时使用内参基因ACTB的引物及探针，将目的基因与内参基因加入一管中进行双通道荧光定量PCR反应，通过扩增曲线分析结果。本发明具有简便、灵活快速、特异性高、高通量、无污染、分辨率高等特点，适用于人体外周血、唾液中全基因组DNA样本的HLA-B*5801等位基因的检测。

Description

一种基于实时荧光PCR检测HLA-B*5801等位基因的方法

技术领域

本发明属于药物基因组学和基因检测领域，具体涉及一种检测HLA‐B*5801等位基因的方法。

背景技术

HLA是指人类白细胞抗原，由人类第6号染色体短臂一群密切连锁的复等位基因编码，由360万个碱基对组成，是当前已知的人类染色体中基因密度最高，也是多态性最为丰富的区域。主要包括HLA‐A、HLA‐B、HLA‐C、HLA‐DR、HLA‐DQ及HLA‐DP。世界卫生组织HLA因子命名委员会命名的相关HLA等位基因已达到5000多个；HLA基因的多态性决定了个体间表达的HLA蛋白分子不同，也决定了不同个体处理和呈递同一种抗原的能力不同，这是免疫应答诱导和调节的最基本点，从而使不同个体对同一种抗原的免疫应答可表现出个体差异。这种个体差异或产生保护性免疫，或形成免疫耐受,或出现自身免疫倾向，或表现为HLA相关疾病。如：HLA‐B*5801、HLA‐B*1502等位基因均与药物的过敏反应相关。因此，鉴于HLA系统的高度多态性和复杂性，决定了HLA等位基因的检测方法不同于普通多态性位点的检测。其中已有大量研究证明别嘌呤醇相关的严重超敏反应与白细胞抗原HLA‐B*5801密切相关，在服用别嘌呤醇后出现严重不良反应的患者中100％存在，而在未出现不良反应的患者(耐受人群)和正常对照组中，其携带率仅为15％和20％；，中国汉族、泰国人中HLA‐B*5801阳性者比白人高(6‐8％vs 2％)，发生超敏反应的风险更大。

别嘌醇(Allopurinol)为次黄嘌呤的异构体，是黄嘌呤氧化酶(XO)的抑制剂，可阻止次黄嘌呤和黄嘌呤代谢为尿酸，从而减少尿酸的生成，是目前唯一能抑制尿酸合成的药物，在高尿酸血症等症的治疗领域发挥着重要作用。临床主要用于：①原发性和继发性高尿酸血症，尤其是尿酸生成过多而引起的高尿酸血症；②反复发作或慢性痛风者；③痛风石；④尿酸性肾结石和(或)尿酸性肾病；⑤有肾功能不全的高尿酸血症。剂型为片剂。然而，随着药品的大量应用，其不良反应也日益凸显，是最易引起严重药疹的药物之一。别嘌醇的不良反应主要表现为皮肤、黏膜损害，最常见的是剥脱性皮炎，比较严重的有Stevens‐Johnson综合征、中毒性表皮坏死松解症、系统性疾病(嗜酸性粒细胞增多症、脉管炎、以及主要器官的疾病)。有文献报道别嘌呤醇皮肤变态反应致死率达20‐40％。

临床上已经建议在使用别嘌呤醇前，应该进行HLA‐B*5801等位基因的检测，以判断是否属于高危人群，从而有效降低由别嘌呤醇引起的严重不良反应。同时，美国风湿病协会发布指南建议对具有高风险的别嘌呤醇过敏综合征的亚群体进行HLA‐B*5801检测。因此，研究一种快速、特异性高的PCR法对HLA‐B*5801等位基因进行检测是非常必要的。

传统检测HLA等位基因分型检测的常用方法主要包括PCR‐SSOP(Sequence SpecificOligonucleotide Probes)和PCR‐SSP(Sequence‐specific primers)，是基于核酸序列识别的方法，这些方法大多成本低、重复性好，然而需要多次的PCR后处理，即操作复杂，又容易发生污染而产生假性结果。PCR‐SBT(Sequence‐based Typing)技术很大程度上弥补了PCR‐凝胶电泳技术的不足之处，可以精确地检测出样本是否携带HLA‐B*5801等位基因，此方法灵敏度高、特异性强，然而PCR‐SBT技术成本昂贵、耗时长、操作繁琐。

基于实时定量TaqMan‐MGB探针及ARMS技术已成功应用于基因分型的检测，并显示了其突出的优势。首先，TaqMan‐MGB探针相对于普通的TaqMan探针而言，MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non‐Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度，同时探针上还连接有MGB(Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大大提高。此外，在模板DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的探针更容易设计，并且特异性更高，若一个碱基不配对，则MGB探针都不能与目的基因序列结合。其次，ARMS方法即扩增阻滞突变系统，这种技术的基本原理是在引物的3’端倒数第二位引入一个与模板序列不匹配的碱基，若引物最末端的碱基也与模板序列不互补，则不能延伸；若引物最末端的碱基与模板链互补，则在末端只有一个碱基不互补的情况下，引物可以进行延伸，这样就可以大大增加引物扩增的特异性。在进行样本检测时，只需将一个携带有HLA‐B*5801的样本作为对照(阳性质控品)，则可以很清楚地判断待测样本是否携带有HLA‐B*5801等位基因。

然而，相对于HLA等位基因的检测，该技术至今很少应用于HLA‐B*5801等位基因的检测；其根本原因是多个HLA‐B等位基因与HLA‐B*5801具有很高的序列同源性(90％以上)，因而设计一套适宜于荧光PCR反应高特异性扩增HLA‐B*5801等位基因的引物探针组合十分困难。

发明内容

本申请研发出一套适宜于荧光PCR反应高特异性扩增HLA‐B*5801等位基因的引物探针组合；在现有的实时荧光PCR检测HLA分型的技术基础上，提供了一种更加简便、快速、高通量、特异性高的可以定性检测HLA‐B*5801等位基因分型的方法。该检测方法更易于在临床的推广和应用，从而更加有利于HLA‐B*5801基因型指导下的别嘌呤醇安全用药。

本发明提供的定性HLA‐B*5801基因的TaqMan‐MGB探针检测方法，首先通过与HLA‐B中3000个其它等位基因序列的对比，进行HLA‐B*5801特异性位点和引物设计区域的确定，它们主要位于HLA‐B等位基因第2和第3外显子，然后根据特异性位点附近的区域，结合等位基因阻滞突变系统(ARMS)的方法，设计TaqMan‐MGB探针检测的特异性引物以及探针，值得注意的是探针和引物设计的位置能够排除其它HLA‐B等位基因的结合、识别，尤其是HLA‐B*570101等位基因。采用特异性更高的TaqMan‐MGB探针法在荧光定量PCR仪上扩增DNA片段，通过扩增曲线分析结果，来判断未知样本是否携带HLA‐B*5801等位基因。

为实现以上发明目的，本发明的技术方案如下。

本发明提出的用于荧光PCR反应高特异性扩增HLA-B*5801等位基因的引物探针组合，包括：

上游引物Fp：5’‐AGGGGCCGGAGTATTGGGATG‐3’；

下游引物Rp:5’‐TTGGCCTCAACTGAAAATGAAAC‐3’；

MGB探针：5’‐HEX/VIC‐TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC–MGB‐3’；

其中，HEX为6‐carboxy‐hexachlorofluorescein。

基于实时荧光PCR检测HLA-B*5801等位基因的方法，主要包括以下环节：

(1)针对HLA‐B*5801等位基因设计特异性引物和探针，即权利要求1所述的引物探针组合；并设计内参基因的引物和探针；

(2)获得抽提的待测样本基因组DNA；

(3)在同一个反应体系中，将待测样本基因组DNA与所述引物探针组合以及内参基因的引物和探针按照确定比例混合；

(4)通过Applied Biosystem 7500或者LightCycler System480进行实时定量荧光PCR检测，其中分别利用FAM通道和VIC通道进行双通道荧光采集；

(6)分析判断待测样本是否携带HLA‐B*5801等位基因。

基于上述方案，本发明还进一步作如下优化设计：

环节(1)中设计内参基因β‐actin引物和探针为：

上游引物Actin‐F:5’‐CAGCAGATGTGGATCAGCAAG‐3’；下游引物Actin‐R:5’‐GCATTTGCGGTGGACGAT‐3’；探针probe:5’‐FAM‐AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC–BHQ2‐3’；其中，FAM为6‐carboxyfluorescein；BHQ2为Minor Groove Binder。

使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行PCR扩增，所述反应体系以20μL计，则包括：10μL Premix Ex Taq(2×)、HLA‐B*5801特异性上游引物Fp 250nM‐500nM、下游引物Rp250nM‐500nM、MGB探针100nM‐250nM、以及ACTB特异性上游引物Actin‐F 100nM‐250nM、下游引物Actin‐R 100nM‐250nM、探针probe 50nM‐250nM，然后加入待测样本基因组DNA10ng‐50ng，补充PCR等级的水至终体积20μL；

扩增程序为：95℃预变性30s；95℃ 5s～10sec，64℃ 34s～40sec，共计35～40个循环。

本发明的优点主要有：

1、节省耗材和时间、简单易行、高通量

基于本实验设计及PCR反应特点，使得该发明可以很大程度上节省实验时间和耗材，检测过程只需要50min‐1h，操作也简单易行，整个实验可以在2小时内全部完成。采用本发明方法与HLA等位基因分型“金标准”PCR‐SBT测序进行方法学对比，50例样本结果完全吻合；与PCR‐SSP进行方法学对比，104例样本结果完全吻合。同时，使用本发明方法，可一次同时高通量进行96例或者384例样本的检测。

2、结果可靠、灵敏度高

本发明中，只需10ng‐20ng基因组DNA便可进行准确的HLA‐B*5801基因分型检测，相比与传统的PCR‐SSP技术，大大提高了检测的灵敏度。其中，最低检测样本量可达到0.15ng。

3、检测方法灵活、无污染

本发明方法较传统的HLA等位基因分型方法，未涉及多重扩增、重复开盖等二次污染的可能。本发明可直接根据探针的荧光曲线判断扩增产物，不涉及任何对人体有毒害作用的化学试剂，操作简便、耗时短、安全、无污染。

4、成本低、经济适用

由于本发明具有高通量的特点，因此使得本发明中每个反应管的成本低；同时，所设计的MGB探针序列更短，成本更低；此外，此技术适用于检测人类全血、组织等全基因组DNA样本，较经济适用。

附图说明

图1为利用内参基因(ACTB)的引物与探针对人基因组DNA实时扩增结果。若出现扩增曲线，则说明该样本无质量问题。曲线1为纯合阳性样本(2条DNA链均携带HLA‐B*5801等位基因)，Ct＝26.517；曲线2为杂合阳性样本(1条DNA链携带HLA‐B*5801等位基因)，Ct＝26.086；曲线3为阴性样本(2条DNA链均不携带HLA‐B*5801等位基因)，Ct＝26.751；NTC扩增曲线表明此实验无污染。

图2为利用目的基因(Target1)的引物与MGB探针对人基因组DNA实时荧光定量扩增结果曲线1为纯合阳性样本(2条DNA链均携带HLA‐B*5801等位基因)，Ct＝28.683；曲线2为杂合阳性样本(1条DNA链携带HLA‐B*5801等位基因)，Ct＝27.867；曲线3为阴性样本(2条DNA链均不携带HLA‐B*5801等位基因)，Ct＝35.610(>35.0)；NTC扩增曲线表明此实验及引物和探针无污染。

图3为利用FAM通道和VIC通道进行双通道荧光采集的实时定量扩增结果。

图4为SBT测序结果示意图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明进一步详细说明。

具体实施例 TaqMan‐MGB探针法检测HLA‐B*5801等位基因

1、DNA样本的提取及稀释

按常规方法获得用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的真空采血管采集静脉血后，使用QIAamp DNA Mini Blood Kit(德国Qiagen公司)试剂盒提取DNA；将已提取的DNA使用NanoDrop 2000进行浓度测定(A_260/280＝1.95～2.15)。用上述方法，分别测得104例布依族DNA样本浓度，然后使用PCR等级的H2O将样本稀释至10ng/μL。

2、设计引物和探针

在多态性位点集中的区域，利用ARMS方法设计HLA‐B*5801的特异性引物，上游引物F：5’‐GGGCCGGAGTATTGGGATG‐3’，下游引物R：5’‐TTGGCCTCAACTGAAAATGAAAC‐3’，以及配套的荧光探针probe:5’‐HEX/VIC‐TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC–MGB‐3’；另外在β‐actin基因上设计内参引物，上游引物Actin‐F:5’‐CAGCAGATGTGGATCAGCAAG‐3’，下游引物Actin‐R:5’‐GCATTTGCGGTGGACGAT‐3’，以及配套的荧光探针probe:5’‐FAM‐AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC–BHQ2‐3’。

其中，FAM为6‐carboxyfluorescein；HEX为6‐carboxy‐hexachlorofluorescein；MGB为MinorGroove Binder；BHQ2为Black Hole Quencher‐2；

委托上海某公司合成。

3、样本检测

在荧光定量PCR仪上，将目的基因和内参基因(ACTB)的引物、探针同时加入一个管中，分别利用FAM通道和VIC通道进行双通道荧光采集；使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行扩增，反应体系(20μL)包括：10μL Premix Ex Taq(2×)，HLA‐B*5801特异性上游引物Fp 250nM‐500nM，下游引物Rp 250nM‐500nM，HLA‐B*5801特异性MGB探针100nM‐250nM，以及ACTB基因特异性上游引物50nM‐100nM，下游引物50nM‐100nM，探针50nM‐100nM,然后加入被测样本基因组DNA约10ng‐50ng，补充PCR等级的水至终体积20μL；用于检测HLA‐B*5801基因型的扩增程序：95℃预变性30s；95℃ 5s～10sec，62℃34s～40sec，共计35～40个循环。

4、结果分析

内参基因作为质控，必须出现荧光扩增曲线；在内参基因观察到扩增曲线的前提下，特异性探针必须同时扩增到曲线，则判断待测样本携带HLA‐B*5801等位基因。本发明中，有荧光扩增曲线达到阈值以上，则代表该目的片段的特异性引物及探针与DNA模板结合，并且引物能够顺利延伸，引物覆盖区域碱基序列与模板序列一致，且探针覆盖范围内碱基也与模板序列一致。

验证实验：50例样本进行SBT测序与HLA‐B*5801基因检测方法比较

从104例布依族样本中随机选取50例样本，将其进行SBT金标准测序，测序结果用峰图和Excel表格进行展示，以便对本发明实验结果进行复核。将SBT测序结果与本发明的检测方法结果进行比对(见表1)，发现两者之间的阴、阳性符合率均为100％。

表1

本发明在前期还准备了已知为HLA‐B*5801等位基因纯合型和杂合型的血样标准品，作为检测体系的阳性对照。此外，标准品的存在，使完成HLA‐B*5801等位基因检测方法建立的同时，进一步提高了待检样本HLA‐B*5801等位基因纯合型或杂合型判断的准确度。我们利用全基因组扩增技术将标准品样本进行了富集，以便多次使用。

Claims (4)

1.用于荧光PCR反应高特异性扩增HLA-B*5801等位基因的引物探针组合，包括：

上游引物Fp：5’‐AGGGGCCGGAGTATTGGGATG‐3’；

下游引物Rp:5’‐TTGGCCTCAACTGAAAATGAAAC‐3’；

MGB探针：5’‐HEX/VIC‐TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC–MGB‐3’；

其中，HEX为6‐carboxy‐hexachlorofluorescein。

2.一种基于实时荧光PCR检测HLA-B*5801等位基因的方法，用于非疾病诊断目的，主要包括以下环节：

(1)针对HLA‐B*5801等位基因设计特异性引物和探针，即权利要求1所述的引物探针组合；并设计内参基因的引物和探针；

(2)获得抽提的待测样本基因组DNA；

(3)在同一个反应体系中，将待测样本基因组DNA与所述引物探针组合以及内参基因的引物和探针按照确定比例混合；

(4)通过Applied Biosystem 7500或者LightCycler System480进行实时定量荧光PCR检测，其中分别利用FAM通道和VIC通道进行双通道荧光采集；

(6)分析判断待测样本是否携带HLA‐B*5801等位基因。

3.根据权利要求2所述的基于实时荧光PCR检测HLA-B*5801等位基因的方法，其特征在于，环节(1)中设计内参基因β‐actin引物和探针为：

上游引物Actin‐F:5’‐CAGCAGATGTGGATCAGCAAG‐3’；

下游引物Actin‐R:5’‐GCATTTGCGGTGGACGAT‐3’；

探针probe:5’‐FAM‐AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC–BHQ2‐3’；

其中，FAM为6‐carboxyfluorescein；BHQ2为Minor Groove Binder。

4.根据权利要求3所述的基于实时荧光PCR检测HLA-B*5801等位基因的方法，其特征在于：使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行PCR扩增，所述反应体系以20μL计，则包括：10μL Premix Ex Taq(2×)、HLA‐B*5801特异性上游引物Fp 250nM‐500nM、下游引物Rp 250nM‐500nM、MGB探针100nM‐250nM、以及ACTB特异性上游引物Actin‐F100nM‐250nM、下游引物Actin‐R 100nM‐250nM、探针probe 50nM‐250nM，然后加入待测样本基因组DNA10ng‐50ng，补充PCR等级的水至终体积20μL；

扩增程序为：95℃预变性30s；95℃ 5s～10sec，64℃ 34s～40sec，共计35～40个循环。