CN105112514B - Gnas 基因突变检测试剂 - Google Patents

Gnas 基因突变检测试剂 Download PDF

Info

Publication number
CN105112514B
CN105112514B CN201510482091.1A CN201510482091A CN105112514B CN 105112514 B CN105112514 B CN 105112514B CN 201510482091 A CN201510482091 A CN 201510482091A CN 105112514 B CN105112514 B CN 105112514B
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
mutant
gnas
dna
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510482091.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105112514A (zh
Inventor
丁少峰
刘强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Kinnet Gene Biotechnology Co Ltd</en>
Original Assignee
Tianjin Kinnet Gene Biotechnology Co Ltd</en>
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Kinnet Gene Biotechnology Co Ltd</en> filed Critical Tianjin Kinnet Gene Biotechnology Co Ltd</en>
Priority to CN201510482091.1A priority Critical patent/CN105112514B/zh
Publication of CN105112514A publication Critical patent/CN105112514A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105112514B publication Critical patent/CN105112514B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了GNAS基因突变检测试剂盒包括光学孔板及反应孔中标记的PAP聚合酶、缓冲剂、特异性引物、dNTP和PPi；所述试剂盒可用于检测全血白细胞基因组DNA中体细胞GNAS基因201密码子3种基因突变，即R201H(CGT‑CAT)、R201L(CGT‑CTT)和R201C(CGT‑TGT)，从而辅助临床诊断体细胞GNAS基因突变所引起的MAS综合症。

Description

GNAS 基因突变检测试剂
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是GNAS基因突变检测试剂盒。
背景技术
McCune-Albright综合征(MAS)又称多骨纤维发育不良(polyostotic fibrousdysplasia)，是一种少见的由编码鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)α亚蛋白(Gsα)的GNAS1基因突变所致的单基因病，临床以性早熟、多发性骨纤维异常增殖症及皮肤斑片状色素沉着为最常见的症状，少数病人还合并其他内分泌功能的异常，病因是在胚胎形成过程中的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)α亚基(Gsα)基因的突变，导致刺激cAMP产生可激活许多内分泌激素的受体。
现阶段对该疾病的临床诊断主要与变形性骨炎和神经纤维瘤病(vonRecklinghausen病)鉴别：1.变形性骨炎，MAS骨病不典型时易与变形性骨炎相混淆，但变形性骨炎无性早熟，亦无色素沉着的Cafe-au-lait斑点，而血ALP明显升高，可资鉴别；2.神经纤维瘤病，累及骨骼，常合并有皮肤咖啡斑，不合并内分泌异常，可与MAS类似。神经纤维瘤病有皮下结节或软性色块改变及多发性神经纤维瘤，亦无性早熟。
可见，由于McCune-Albright综合征(MAS)临床表现的多样化及外周血基因组DNA不易发现异常是目前制约临床开展分子诊断MAS的关键难题。已知GANS1突变发生在胚胎形成早期，是合子后出现的体细胞突变，由于突变细胞呈镶嵌型分布，使得仅有部分细胞受累，甚至可在受累组织(内分泌腺体、皮肤、骨组织等)中混合有正常和突变异常细胞，因而临床表现呈多样性；此外，大多数患儿症状不典型或较轻微，可能与突变发生时间窗较晚，突变细胞少，病变范围小有关。此外，除在受累组织外、存在于外周血循环中的突变细胞数量极少、往往与病情轻重有关，因而自外周血采样进行分子病因诊断阳性率极低，故不少病例仍处于疑似或误诊、漏诊状态。
采用焦磷酸解激活聚合反应(pyrophosphorolysis activatedpolymerization，PAP)对GNAS1已知突变热点进行筛查是新一代核苷酸扩增技术转化临床应用的积极探索，近期报道的新一代极高选择性的核酸检测技术，即PAP，将DNA聚合酶的焦磷酸解活性与聚合活性结合在一个反应体系，被认为是目前等位基因识别特异性最高的技术。其原理是使用与突变型核酸完全匹配的引物，3’末端设计具有封闭作用的双脱氧核苷酸；在加入焦磷酸后去除末端的 封闭，引物与模板完全结合，得以扩增。如果模板与引物不完全互补，焦磷酸反应便不会发生，末端的封闭作用不能去除，反应则无法进行。有报道采用此技术来检测人体细胞的TP53基因突变，认为对于检测体细胞的稀少突变其敏感度高、特异性强而且速度快。Boon等(Boon EM，Schlecht HB，Martin P，et al.Y chromosome detection by realtime PCR and pyrophosphorolysis-activated polymerisation using free fetal DNAisolated from maternal plasma[J].Prenat Diagn，2007，27(10):932-937.)在2007年首先将PAP技术应用于无创产前诊断，对母血中胎儿Y染色体序列进行检测，其检测灵敏度为100％，特异性为98％。由于实时荧光PAP技术检测到的荧光信号即为来自突变型模板的扩增产物，所以此方法不仅可以检测到突变，还可以定量确认突变型基因的拷贝量。国内也已有研究者将PAP技术成功地应用于大肠癌的早期无创诊断。但尚无应用于MAS分子诊断的报道，本发明首次将PAP技术转化应用于MAS临床诊断，对于提升该病的确诊效率将具有积极意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供GNAS基因突变检测试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
GNAS基因突变检测试剂盒，是采用以焦磷酸化激活的聚合反应(Pyrophosphorolysis Activated Polymerization,PAP)为基础的核酸扩增技术来扩增体细胞GNAS基因，从而实现对扩增的片段3种基因突变R201H、R201L和R201C的检测并以辅以GNA基因保守序列基因组DNA总量检测作为内对照。
优选的，上述GNAS基因突变检测试剂盒，包括光学孔板及反应孔中标记的PAP聚合酶、缓冲剂、特异性引物、dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)和PPi(焦磷酸)和光学封板膜。
优选的，上述GNAS基因突变检测试剂盒，所述光学孔板为光学96孔板，每4孔一组，即A1-D1、A2-D2、……A12-D12；E1-H1、E2-H2、……E12-H12。
优选的，上述GNAS基因突变检测试剂盒，所述PAP聚合酶是含F667Y突变的Taq聚合酶、所述缓冲剂是指每1x缓冲剂含有50mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgCl2,pH 8.0；所述特异性引物包括突变体-1引物、突变体-2引物、突变体-3引物、总量DNA引物和野生型GNAS基因引物。
优选的，上述GNAS基因突变检测试剂盒，所述突变体-1为(CGT to CAT,R201H)，突变体-2为(CGT to CTT,R201L)，突变体-3为(CGT to TGT,R201C)。
优选的，上述GNAS基因突变检测试剂盒，所述突变体-1引物的序列为TGGTCTCAAAGATTCCAGAAGTCAGGACAddT(5’-3’)；所述突变体-2引物的序列为TGGTCTCAAAGATTCCAGAAGTCAGGACAddA(5’-3’)；所述突变体-3引物的序列为GGTCTCAAAGATTCCAGAAGTCAGGACACddA(5’-3’)。
优选的，上述GNAS基因突变检测试剂盒，所述总量DNA引物的序列为CTTGGTCTCAAAGATTCCAGAAGTCAGGAddC(5’-3’)。
优选的，上述GNAS基因突变检测试剂盒，所述野生型GNAS基因引物的序列为CACCAACTGTTTCGGTTGGCTTTGG/FAM-dT/G(5’-3’)。该野生型GNAS基因引物与上述四个引物(突变体-1引物、突变体-2引物、突变体-3引物、总量DNA引物)配对，FAM-dT是荧光染料FAM标记的脱氧胸苷(deoxythymidine)，荧光染料FAM链接到胸苷5的位置。
优选的，上述GNAS基因突变检测试剂盒，采用焦磷酸化激活聚合反应的核酸扩增技术，同时采用荧光标记的LUX引物发出实时荧光信号,PAPLUX引物是一种单一荧光标记连接到其靠近3’末端的寡核苷酸引物,可承载大量的人类基因组DNA模板的模板但是不造成荧光信号的饱和。
优选的，上述GNAS基因突变检测试剂盒，采用荧光标记的LUX引物发出实时荧光信号的焦磷酸化激活聚合反应,其LUX引物的3’末端是一种不能直接延伸但可焦磷酸化激活的核苷酸。
优选的，上述GNAS基因突变检测试剂盒，采用荧光标记的LUX引物发出实时荧光信号的焦磷酸化激活聚合反应,其LUX引物的3’末端是双脱氧核苷酸ddNMP。
上述GNAS基因突变检测试剂盒的检测使用方法，具体步骤包括：
(1)试剂盒准备：将试剂盒中96孔板及对照品取出恢复至室温,打开96孔板的外包装袋并启封96孔板的覆盖膜；
(2)加样：将已提取好的DNA样本/阳性对照品/野生型DNA对照品/无DNA阴性对照品即超纯水按照上图分别加入1组检测孔中。加样完毕后，用光学封板膜封闭96孔板，并持续震荡2分钟将DNA样本混匀；随后以3,000rpm离心2分钟去除气泡；每孔总反应体积为20μl。
(3)将离心后的96孔板放在实时荧光PCR检测仪上，按照以下温度及循环设定程序(所有步骤全部循环一遍)：
(4)信号收集与判读：实时监测PCR仪器信号通道设定为FAM收集荧光信号，采用扣除基线配合曲线法进行数据的分析，并测量扩增产物的Tm值。
上述GNAS基因突变检测试剂盒在诊断体细胞GNAS基因突变所引起的McCune-Albright综合症(MAS)方面的应用。
本发明的有益效果是：
GNAS基因突变检测试剂盒，可用于检测全血白细胞基因组DNA中体细胞GNAS基因201密码子3种基因突变，即R201H(CGT-CAT)、R201L(CGT-CTT)和R201C(CGT-TGT)，从而辅助临床诊断体细胞GNAS基因突变所引起的McCune-Albright综合症(MAS)。
Sybr Green I,一种非特异性DNA结合染料,是实时PAP检测最常用的荧光染料。当结合任何类型的双链DNA，无论是双链DNA模板或者产物,它都会发出明亮的荧光。在实时PAP反应中DNA模板量限制在30-40ng/25ul PAP反应，超越了这一点，检测到的荧光信号变得饱和而影响定量精度，因此使用大量的人类基因组DNA模板进行扩增就变成了一个特别严重的问题。因此，有进一步开发用于此目的的PAP技术发展的迫切需要。
本发明所述GNAS基因突变检测试剂盒中，为了提高在反应中DNA模板量，本发明结合了PAP扩增技术和LUX荧光技术。LUX(Light Upon eXtension)是一种单一荧光标记连接到其靠近3’末端的寡核苷酸引物。一旦在模板上延长成产物，LUX引物会发出更多的荧光。在PAP反应中使用FAM标记的引物[CACCAACTGTTTCGGTTGGCTTTGG/FAM-dT/G(5’-3’)]来发出荧光信号。除了常规PAP的性能外，本发明可以承受高达3.3ug人类基因组DNA/25ul PAP反应和进行准确的定量分析。和SybrGreen I染料相比本发明承受量增加100倍，并且如此大量的基因组DNA不造成荧光信号的饱和。另外，在GNAS基因与HIV基因中也设计了其他LUX引物实施PAP反应,并获得相似的结果。此外，在实时PAP反应中,LUX引物可以通过在3’末端标记阻断剂，如双脱氧核苷酸ddGMP，进一步提高其特异性。
附图说明
图1为GNAS基因突变检测试剂盒示意图。
具体实施方式
实施例1
如图1所示，结合本领域试剂盒常规获得方法得到本发明所述GNAS基因突变检测试剂盒，主要组成成份如下表1所述。
表1
不同批号试剂中各组成成份不能互换。
上述GNAS基因突变检测试剂盒的适用仪器为实时荧光PCR检测仪。
上述GNAS基因突变检测试剂盒的储存条件及有效期为：-20℃阴凉避光处保存，避免反复冻存；自检定合格之日起有效期为6个月。运输时应用4℃以下冷藏方法运输。
上述GNAS基因突变检测试剂盒的对照品使用前应恢复室温，并充分摇匀；检测样本禁止用肝素作为抗凝剂，样本如不能立即检测应存放在4℃冰箱，检测时恢复室温后再进行操作。
上述GNAS基因突变检测试剂盒对样本要求包括：
(1)常规方法由静脉采集5ml全血样本，使用EDTA(1.5g/L)作为抗凝剂(禁止用肝素作为抗凝剂)。抗凝样本可放置4℃保存3天。全血样本长期保存则需放置于-20℃到-80℃。
(2)取0.2ml全血并用已商品化的适当试剂盒提取基因组DNA，例如二氧化硅(SiO2)材料为基础的全血DNA提取试剂盒。
(3)用200μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl,0.1mM EDTA,pH 8.0)洗脱约可获得6μg基因组DNA。用分光光度计测定基因组DNA的浓度。提取后的DNA样品应置于4℃保存备用，长期保存应置于-20℃。
(4)优选延长蛋白酶K消化时间至2-4小时，以彻底清除各种蛋白质类抑制物。
(5)禁止在高温下长时间加热DNA样本，以减少物理性原因引起的自发性化学损伤(详见检验结果的解释章)，从而避免假阳性检测结果。
上述GNAS基因突变检测试剂盒的检测方法，具体步骤包括：
(1)试剂盒准备：将试剂盒中96孔板及对照品取出恢复至室温,打开96孔板的外包装袋并启封96孔板的覆盖膜。
(2)加样：将已提取好的DNA样本/阳性对照品/野生型DNA对照品/无DNA阴性对照品即超纯水按照上图分别加入1组检测孔(4孔/组)中，(建议每次检测设置阳性对照和阴性对照)。加样完毕后，用光学封板膜封闭96孔板，并持续震荡2分钟将DNA样本混匀。随后以3,000rpm离心2分钟去除气泡。每孔总反应体积为20μl。
(3)将离心后的96孔板放在实时荧光PCR检测仪上，按照以下表2的温度及循环设定程序。
表2温度循环核酸扩增反应程序
(4)信号收集与判读：实时监测PCR仪器信号通道设定为FAM收集荧光信号，采用扣除基线配合曲线法进行数据的分析，并测量扩增产物的Tm值。
上述GNAS基因突变检测试剂盒的检验结果和解释：
(1)每个反应加入165ng(50,000个拷贝)的基因组DNA时，根据以下表3判定检测结果。
表3
(2)如检测样本判定为阳性，即指病人基因组DNA中可能含有大于0.1％的突变体-1,大于0.01％的突变体-2,或大于0.025％的突变体-3。
(3)如检测样本判定为可疑阳性，即指病人基因组DNA中可能含有低至0.1％的突变体-1,0.01％的突变体-2,或0.025％的突变体-3，建议重复检测可疑阳性样品。
(4)检测时要确认目标基因扩增产物的Tm值应该是82-83℃。Tm值偶尔会出现在75-77℃左右，此情况是由于循环周期(Ct>37)有引物二聚体形成。
上述GNAS基因突变检测试剂盒的产品性能指标：
(1)阴性参比品符合率：检测阴性参考品均为阴性。
(2)阳性参比品符合率：检测阳性参考品均为阳性。
(3)灵敏度：最低可检测20个拷贝量的突变体。
(4)特异性：野生型GNAS基因和无DNA模板的对照均无假阳性反应出现。
(5)精密度：检测结果一致，对精密度标准品检测均符合要求。
(6)线性：突变体-1、突变体-2、突变体-3以及基因组DNA总量反应-4的检测中，扩增在拷贝数和Ct值之间高度线性量化，扩增效率95-105％,相关系数(R2)>0.98，接近-3.32坡度。
上述GNAS基因突变检测试剂盒在检测时，试剂盒对照品检测值应如下表4，否则检测无效，建议重新检测。
表4对照品的Ct值
(1)阳性对照经28±2个循环周期后检测应为阳性，否则实验视为无效。要确认目标基因扩增产物的Tm值应该是82-83℃。
(2)野生型GNAS基因阴性对照品在32个循环周期内应检测为阴性,应不显示Ct值,否则实验视为无效。
(3)没有模板的阴性对照在37个循环周期内应检测为阴性，应不显示Ct值，否则实验视为无效。阴性对照的Ct值可在37个循环周期后由于引物二聚体的形成出现，但引物二聚体的Tm值约75-77℃。
阈值确定：原则上使阈值线刚好超过正常阴性样本噪音线的最高点。一般以仪器默认值为准，当出现少数样本扩增曲线的噪音太大等特殊情况时可适当调整。
实施例2
1资料与方法
1.1研究对象2006年1月至2013年9月上海交通大学医学院附属瑞金医院儿内科就诊临床疑诊MAS患儿共36例(女35例和男1例)；平均发病年龄为(3.48±1.89)岁(1月龄至6.8岁)；父母均非近亲婚配。依据临床特征将36例疑诊MAS患儿分为典型组11例(非GnRH依赖型性早熟和骨纤维结构发育不良，伴或不伴皮肤牛奶咖啡斑)与非典型组25例(仅非GnRH依赖型性早熟者16例，伴皮肤牛奶咖啡斑者9例)；所有检查均获得患儿家长或监护人的知情同意。另有33例无血缘关系的健康成年男女作为对照组。
1.2研究方法
1.2.1基因组DNA抽提采用QIAGEN试剂盒(FlexiGene DNA Kit(250)，No:51206)，按照试剂盒的操作步骤抽提外周血基因组DNA；用Nanodrop 2000紫外分光光度仪(Thermo)测定各DNA样品的浓度和纯度。
1.2.2实时荧光PAP技术针对GNAS1的已知突变热点设计引物如表5所示， 即为本发明实施例1所述试剂盒中引物。实时荧光定量PAP反应体系：
模板DNA 660ng，缓冲液2.5μL，焦磷酸(PPi)2.5μL，dNTP 0.6μL，GNAS1 Luxprimer 1μL，聚合酶0.15μL，Mut-1、2、3blocked primers及Genomic DNA primers各0.5μL，ddH2O调整总体积至25μL。Real-time PCR反应条件：96℃2min；
96℃12s，60℃30s，64℃1min，共40个循环；
后于68～95℃递增程序每次增加0.5℃，5s。所得结果由BIO-RAD CFX96 real-time PCR仪信号通道设定为FAM收集荧光信号，采用扣除基线配合曲线法进行数据分析。保证扩增产物的Tm值在(82±2)℃。三个突变反应Ct值＜32判做GNAS1突变阳性，Ct值≥32的样品定为阴性。检测率估算公式：突变体/基因组DNA总载量拷贝的比率＝1/2(Ct突变体-Ct总载量)。
表5针对GNAS1已知突变热点设计的引物列表(PAP技术)
注：Mut：突变；-R：上游引物；Genomic DNA：模板DNA；Lux-L：下游标有荧光引物；
dT：双脱氧核苷酸末端；R：精氨酸；H：组氨酸；L：亮氨酸；C：半胱氨酸
1.2.3普通PCR技术采用Primer 3.0软件针对GNAS1的已知突变热点设计所用引物，上游和下游序列分别为5’-AACTGTGGGACGGTCACTTC-3’和
5’-TGCACGGGGTTCTTCTCTAT-3’，扩增片段长度为833bp。引物购于上海生工生物技术有限公司。
PCR反应体系：正反引物各0.12μL，模板DNA 25ng，dNTP 0.45μL，MgCl2 0.6μL，Tag酶0.08μL，缓冲液1μL，Q-solution 1μL，ddH2O调整总体积至10μL。采用Touch-down的PCR反应程序：95℃5min；94℃40s，63℃40s，每个循环下降0.5℃，72℃1min 10个循环；94℃40s，56℃40s，72℃1min，30个循环后72℃延伸10min。PCR产物送国家人类基因组南方研究中心测序分析。
1.3统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计数资料比较采用χ2检验方法，P＜0.05为差异有统计学意义，率的95％可信区间采用Wilson score interval方法进行分析。
2结果
2.1实时荧光PAP技术检测结果在36例患儿中发现9例(25％；女8例， 男1例)存在2种已知GNAS1错义突变(4例R201H、5例R201C)，但未发现R201L；平均突变阳性DNA的Ct为28.42±2.84，平均DNA总载量的Ct为19.68±1.44，突变DNA与DNA总载量的拷贝数比率，即检测率为(8.14±15.54)‰。其中在典型组突变发现率为63.64％(7/11)；非典型组为8.00％(2/25)，其中仅非GnRH依赖型性早熟者16例中1例突变阳性(男)；对照组均未发现已知突变(见表6)。在本发明中PAP技术的检测率最高可达万分之一，敏感性可达100.00％(95％可信区间64.57％～100.00％)、特异性为76.47％(95％可信区间52.74％～90.45％)。
2.2普通PCR技术利用普通PCR技术对所有样本目的片段同步进行扩增并直接测序均无阳性发现。普通PCR技术的检出率为0。与PAP技术比较，普通PCR技术检测率明显低于PAP技术，两者比较差异有统计学意义(P＜0.05)。详见表6。
表6三组实时荧光PAP技术与普通PCR检测突变
注：“+”示意检测阳性结果；“-”示意检测阴性结果
可见，本发明采用实时荧光PAP技术首次用于MAS分子病因诊断，该方法操作简便，且采样简单(外周血)，免去获取活检样品困扰；此外，检测率可高达万分之一，敏感性(100％)和特异性(76.47％)均显著高于普通PCR技术(P＜0.05)，此较国外其他技术应用研究报道敏感性、特异性更高，可见，PAP技术在检测GNAS1基因缺陷上远远超越普通PCR技术，并能明显提升MAS的临床分子诊断水平。
上述参照具体实施方式对该GNAS基因突变检测试剂盒进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.GNAS 基因突变检测试剂盒，其特征在于：是采用以焦磷酸化激活的聚合反应为基础的核酸扩增技术来扩增体细胞GNAS基因，从而实现对扩增的片段3种基因突变R201H、R201L和R201C的检测并以辅以GNA基因保守序列基因组DNA总量检测作为内对照；所述试剂盒包括光学孔板及反应孔中标记的PAP聚合酶、缓冲剂、特异性引物、dNTP和PPi和光学封板膜，所述光学孔板为光学96孔板，每4孔一组，所述PAP聚合酶是含F667Y 突变的Taq聚合酶、所述缓冲剂是指每1x缓冲剂含有50mM Tris-HCl、10mM (NH4)2SO4、2mM MgCl2, pH 8.0；所述特异性引物为突变体-1引物、 突变体-2引物、 突变体-3引物、总量DNA引物和野生型GNAS基因引物，所述突变体-1 R201H为CGT to CAT，突变体-2 R201L为CGT to CTT，突变体-3R201C为CGT to TGT，其中，
所述突变体-1引物的序列为5’-TGGTCTCAAAGATTCCAGAAGTCAGGACAddT-3’；
所述突变体-2引物的序列为5’-TGGTCTCAAAGATTCCAGAAGTCAGGACAddA-3’；
所述突变体-3引物的序列为5’-GGTCTCAAAGATTCCAGAAGTCAGGACACddA-3’；
所述总量DNA引物的序列为5’-CTTGGTCTCAAAGATTCCAGAAGTCAGGAddC-3’；
所述野生型GNAS基因引物的序列为5’-CACCAACTGTTTCGGTTGGCTTTGG/FAM-dT/G-3’。
2.根据权利要求1所述的GNAS 基因突变检测试剂盒，其特征在于：采用荧光标记的LUX引物发出实时荧光信号的焦磷酸化激活聚合反应, 其LUX 引物的3’末端是双脱氧核苷酸ddNMP。
CN201510482091.1A 2014-08-04 2015-08-03 Gnas 基因突变检测试剂 Active CN105112514B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510482091.1A CN105112514B (zh) 2014-08-04 2015-08-03 Gnas 基因突变检测试剂

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2014103800189 2014-08-04
CN201410380018 2014-08-04
CN201510482091.1A CN105112514B (zh) 2014-08-04 2015-08-03 Gnas 基因突变检测试剂

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105112514A CN105112514A (zh) 2015-12-02
CN105112514B true CN105112514B (zh) 2019-04-19

Family

ID=54660617

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510482091.1A Active CN105112514B (zh) 2014-08-04 2015-08-03 Gnas 基因突变检测试剂

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105112514B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108103159A (zh) * 2016-11-22 2018-06-01 天津华大医学检验所有限公司 一种高特异性的碱基突变多重pcr检测方法
CN108103157B (zh) * 2016-11-22 2024-06-11 天津华大医学检验所有限公司 一种高特异性的碱基突变pcr检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101381766A (zh) * 2008-06-11 2009-03-11 厦门大学 一种基因稀有突变的定量检测方法
CN103266103A (zh) * 2012-11-08 2013-08-28 丁少峰 用于扩增核糖核酸的方法及分析该方法中rna或dna模板的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101381766A (zh) * 2008-06-11 2009-03-11 厦门大学 一种基因稀有突变的定量检测方法
CN103266103A (zh) * 2012-11-08 2013-08-28 丁少峰 用于扩增核糖核酸的方法及分析该方法中rna或dna模板的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Novel GNAS1 Mutation, R201G, in McCune–Albright Syndrome;MARA RIMINUCCI et al;《Journal of Bone And Mineral Research》;19991231;第14卷(第11期);1987-1989
Abdullah Karadag,et al.A novel technique based on a PNA hybridization probe and FRET principle for quanti®cation of mutant genotype in ®brous dysplasia/McCune-Albright syndrome.《Nucleic Acids Research》.2004,第32卷(第7期),e63.
Diagnostic value of investigating GNAS mutations in fibro-osseous lesions: a retrospective study of 91 cases of fibrous dysplasia and 40 other fibro-osseous lesions;Flore Tabareau-Delalande,et al;《Modern Pathology》;20131231;1-11
焦磷酸解激活聚合反应在McCune-Albright综合征基因突变检测中的应用;秦雪艳等;《中国实用儿科杂志》;20140806;第29卷(第8期);596-599

Also Published As

Publication number Publication date
CN105112514A (zh) 2015-12-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107365852A (zh) 血清外泌体中肺癌相关microRNA分子标记的应用及其检测试剂盒
CN103773861B (zh) 华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光pcr检测试剂、试剂盒及其检测方法
KR101643748B1 (ko) 결핵 진단용 바이오마커 마이크로 rna
CN110093413A (zh) 检测β地中海贫血的引物组和试剂盒
CN107151711A (zh) 一种检测登革病毒和寨卡病毒的双重荧光定量rt‑pcr试剂盒
CN106521023B (zh) 一种检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒及方法
CN104745719A (zh) 用于ret融合基因检测的引物、探针及检测试剂盒
CN104830989A (zh) 一种用于ros1与多种基因发生融合突变的检测试剂盒
CN103695532B (zh) 广州管圆线虫病早期检测的分子标记物及引物
CN103805701A (zh) Hla-b*58:01等位基因检测方法及其试剂盒
CN104673891A (zh) 一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法及试剂盒
CN103820545B (zh) 用于检测人abcg2基因突变的探针、引物及试剂盒
CN105112514B (zh) Gnas 基因突变检测试剂
ITVT20110002A1 (it) Metodo di determinazione dell&#39;origine di fluidi o tracce biologiche e kit di reagenti per la loro identificazione in un campione.
CN104293932A (zh) 一种基于实时荧光pcr检测hla-b*5801等位基因的方法
CN107513577A (zh) 一种高效检测egfrt790m突变体的方法以及用于检测的探针和试剂盒
CN107475363A (zh) 一种非小细胞肺癌的生物标记物组合、该生物标记物组合的筛选及其应用
CN110229910A (zh) Myd88基因l265p突变检测试剂盒及检测方法
CN103451302A (zh) 聋病易感基因线粒体12SrDNA 1555A＞G、1494C＞T突变比例检测试剂盒
CN109439800A (zh) 检测hiv-1基因pr区和rt区基因突变的试剂盒及方法
CN108060231A (zh) 用于宫颈癌基因FAM19A4、miR-124-2甲基化检测的引物对、试剂盒及方法
CN107641649B (zh) 检测微卫星nr27位点稳定性的引物对、试剂盒及方法
CN104911277A (zh) 一种检测干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒及其检测方法
CN111321233A (zh) 一种检测日本吸血虫的荧光raa引物、探针及检测方法
CN107267614A (zh) 线粒体耳聋a7445g突变的荧光定量pcr检测试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20190320

Address after: 300400 Tianjin Beichen District Qingguang Village North Tianjin Medical and Medical Device Industrial Park No. 2 Tengda Road

Applicant after: Tianjin Jingnaite Gene Biotechnology Co., Ltd.

Address before: No. 1310 Highlands Street, California

Applicant before: Ding Shaofeng

Applicant before: Liu Qiang

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant