CN103805701A - Hla-b*58:01等位基因检测方法及其试剂盒 - Google Patents

Hla-b*58:01等位基因检测方法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种HLA-B*58:01等位基因检测方法，包括：提供待测样品、核酸扩增体系和荧光检测体系的混合物；通过扩增反应循环扩增靶多核苷酸；使荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸序列间接结合；测定荧光发生基团所产生的荧光量，从而确定靶多核苷酸的存在及其相对量。本发明还公开了一种测定上述等位基因的试剂盒，包括分别装有反应液1、反应液2、反应液3、EZ Taq酶混合液、标准液1、标准液2的多个密封离心管，分隔并集中包装这些离心管的试剂盒。本试剂盒及检测方法操作简便，耗时短，特异性强，灵敏度高。可广泛应用于人HLA-B*58:01等位基因的检测和临床上规避HLA-B*58:01等位基因型患者因使用别嘌呤醇引起的严重皮肤不良反应。

Description

HLA-B*58:01等位基因检测方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及一种HLA-B*58:01等位基因的检测方法，以及用于该方法的试剂盒，尤其涉及采用实时定量荧光聚合酶链反应技术对HLA-B*58:01等位基因的检测，并将检测结果应用于临床上指导别嘌呤药物使用的方法与试剂盒。
背景技术
药物不良反应（adverse drug reactions,简称ADR）,按照WHO国际药物监测合作中心的规定，系指正常剂量的药物用于预防、诊断、治疗疾病或调节生理机能时出现的有害的和与用药目的无关的反应。药物不良反应，是病患者治疗过程中的巨大隐患。据统计，每年全世界死于不合理用药的人群总数量达1900万人。在美国每年有220万人在服用处方药后会产生副作用。其中死亡的病例超过了10万，每年用于治疗药物副作用的支出就达40亿美元。在我国，因药物不良反应住院的病人每年约250万人，直接死亡20万人。用药安全已经成为医学界的热点问题。
HLA(human leukocyte antigen)，即人类白细胞抗原是人体重要的免疫遗传体系，也是目前所知人体最复杂的多态系统。HLA作为抗原刺激机体产生相应抗体的性质或分子结构，这是器官移植产生排异反应的主要原因，也是血清学和细胞学配型的基础。在骨髓干细胞移植中最主要的排斥反应是移植物对宿主疾病(Graft Versus Host Disease,GVHD)，这主要是由于移植物中的免疫活性细胞(T细胞)识别并对移植物受体中的HLA和次要组织相容性产生反应的结果。因此在建立骨髓库以及移植手术前必须进行分型。
近年的研究发现HLA的部分等位基因与某些药物引起的不良反应密切关联。如美国白种人群中的卡马西平-药物超敏综合征（CBZ-HSS）关联性研究结果表明：HLA-B*0801、HLA-DR3和HLA-DQ2等位基因与CBZ-HSS具有相关性；HLA-B*58:01等位基因与别嘌呤醇引发的严重皮炎副反应（Stevens-John综合征及中毒性表皮坏死症）呈现很强的相关性。尤其在汉族人中，几乎所有副反应的患者都是HLA-B58:01的携带者。HLA等位基因的分型检测可识别特定的HLA多态基因型。通过已知的多态基因型与药物疗效及毒性的关系，指导相关疾病的给药，对规避药物不良反应，倡导安全用药有着重要的影响与意义。
目前，HLA等位基因分型检测的常用方法主要是基于核酸序列识别的方法，主要有PCR-SSOP(Sequence Specific Oligonucleotide Probes)法、PCR-SSP(Sequence-specific primers)法和PCR-SBT(Sequence-Based Typing)法。其中，PCR-SBT测序方法更是现世界卫生组织（WHO）推荐的HLA分型方法的“金标准”。此类方法具有灵敏度高，特异性强，样本需求量少等优点。但是，拥有众多优点的同时，此类方法也存在着操作繁琐，耗时长，成本高昂等缺点。尤其，操作繁琐，耗时长等缺点已经逐渐不能满足现代医学检测需要，不适应现代医学检验所要求的“快速、简便”的理念。实时荧光定量PCR（FQ-PCR）是近年在普通PCR基础上发展起来的核酸检测方法，它将荧光值的积累与PCR产物的扩增过程相结合，通过测量指数扩增期的荧光值来计算待测样本中核酸的原始量。相较于传统的HLA等位基因分型检测方法，FQ-PCR除了具有灵敏度高、特异性强等特点外，还具有着操作简便、耗时短、可定量等传统方法无可比拟的优点将FQ-PCR应用于HLA等位基因的分型检测是PCR技术领域的一项创新。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种HLA-B*58:01等位基因检测方法及其试剂盒，以克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明的一个目的是提供一种HLA-B*58:01等位基因检测方法，该方法包括如下步骤：
（1）提供包括待测样品、核酸扩增体系和荧光检测体系的混合物；
（2）通过扩增反应循环扩增待测样品中的靶多核苷酸；
（3）使所述荧光检测体系中的荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸序列间接结合；
（4）测定荧光发生基团所产生的荧光量，从而确定靶多核苷酸的存在及其相对量。
所述核酸扩增体系由如下组分组成：耐热DNA聚合酶、2’-脱氧核苷三磷酸、能够与靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物a和能够与靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物a，能够与靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物b和能够与靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物b；
所述荧光检测体系是能够与靶多核苷酸结合并且两端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的两条寡核苷酸探针。
作为一种优选的技术方案，本发明所述核酸扩增体系和荧光检测体系共3组，其中：
核酸扩增体系Ⅰ中用于靶多核苷酸扩增的正向引物a和反向引物a分别为引物1和引物2，用于靶多核苷酸扩增的正向引物b和反向引物b分别为引物7和引物8，并且荧光检测体系I中所使用的寡核苷酸探针为探针1和探针4；
核酸扩增体系Ⅱ中用于靶多核苷酸扩增的正向引物a和反向引物a分别为引物3和引物4，用于靶多核苷酸扩增的正向引物b和反向引物b分别为引物7和引物8，并且荧光检测体系II中所使用的寡核苷酸探针为探针2和探针4；
核酸扩增体系Ⅲ中用于靶多核苷酸扩增的正向引物a和反向引物a分别为引物5和引物6，用于靶多核苷酸扩增的正向引物b和反向引物b分别为引物7和引物8，并且荧光检测体系III中所使用的寡核苷酸探针为探针3和探针4；
其中，各引物和探针具体组成如下：
引物1：5’-CCACGAGTTTCACTTCTTCTC-3’，
引物2：5’GCGACACTGATTGGCTTCT-3’，
引物3：5’-CTGGAGAACGGGAAGGAG-3’，
引物4：5’-CAAGGGAGGGCGACATT-3’，
引物5：5’-CTCCAGCCAGCGACAGTGC-3’，
引物6：5’CGCGAAACATCCCAATCAA-3’，
引物7：5’-TTCAGGGTGAGTCTATGGGA-3’，
引物8：5’-CGATCCTGAGACTTCCACAC-3’；
探针1：5’-CCCAACCTATGTCGGGTCCTTCTTC-3’，
探针2：5’-AAGGAGACGCTGCAGCGCGC-3’，
探针3：5’-ATCCCCATTACCCAGGCCTTTCC-3’，
探针4：5’-TGATGCAATCATTCGTCTGTTTCCC-3’。
其中，引物1-6来源于人HLA-B位点的基因序列，引物1位于102-123位，含21个碱基，引物2位于202-221位，含19个碱基，扩增片段长度为120bp；引物3位于1244-1262位，含18个碱基，引物4位于1371-1386位，含17个碱基，扩增片段长度为143bp；引物5位于2924-2943位，含19个碱基，引物6位于3065-3083位，含18个碱基，扩增片段长度为160bp；引物7、8来自源人β-globin基因组序列的HBB基因（62137-63742），引物7位于62627-62647位，含19个碱基，引物8位于62756-62775位，含18个碱基，扩增片段长度为149bp。探针1－3分别来源于HLA-B位点基因序列的122-146位、1256-1276位和3038-3061位；探针4来源于人β-globin基因序列反向序列的62731-62755位。
可使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物，用分子筛和快速液相层析法(FPLC)纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5’端标记作为荧光发生基团（报告基团）的FAM或HEX，并在其3’端标记借助活性连接臂偶联的作为荧光淬灭基团的TAMRA或BHQ。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针，然后使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶（20％）电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针的纯度。
所述扩增反应循环是重复35-45次的聚合酶链反应循环。
所述待测样品是指需要检测其中是否含有HLA-B*58:01基因型的临床血液样本。
所述靶多核苷酸来自人血液全基因组DNA。
作为本发明的一个优选实施方案，步骤（4）中，先确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环数；然后将上述测定的阈循环数与标准溶液中的靶多核苷酸的阈循环数相比较，以确定样品中靶多核苷酸的相对量，从而判断样品包含靶多核苷酸基因的纯合型与杂合型。
使用磁珠法或DNA柱回收法（可购买市售DNA提取试剂盒）从得自受试者的血液样本中提取基因组DNA，然后将提取合格的DNA产物用于后续的PCR扩增。
在含有引物1、2和引物7、8，探针1、4，DNA模板（PCR扩增靶序列），dNTPs（10mM），耐热DNA聚合酶，Mg2+，PCR缓冲液和水的反应体系中（体系Ⅰ）；含有引物3、4和引物7、8，探针2、4，DNA模板（PCR扩增靶序列），dNTPs（10mM），耐热DNA聚合酶，Mg2+，PCR缓冲液和水的反应体系中（体系Ⅱ）；含有引物5、6和引物7、8，探针3、4，DNA模板（PCR扩增靶序列），dNTPs（10mM），耐热DNA聚合酶，Mg2+，PCR缓冲液和水的反应体系中（体系Ⅲ）；使用ABI7500、Roche Light Cycler480、Mx3000P等其它结构类似的自动荧光检测热循环仪上对如上得到的DNA序列进行PCR扩增。所使用的反应条件是：96℃预变性3分钟，95℃30秒→65℃45秒，共进行35个循环；最后25℃下至少30秒。
1.无效结果判定：与存在于体系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中的寡核苷酸荧光探针4相关的扩增曲线不呈现“S”型或Ct值空白又或Ct值＞30的样本，报告为无效；
2.阳性结果判定：满足与体系Ⅰ和体系Ⅱ中的寡核苷酸探针1、探针2和探针4相关的扩增曲线呈现“S”型且同体系中探针1、探针2和探针4的CT值＜30，同时体系Ⅲ中的寡核苷酸探针3的CT值空白且体系中Ⅲ探针4的CT值＜30的样本，报告为阳性；
3.阴性结果判定：属于无效结果判定和阳性结果判定以外的情况则报告为阴性；
可利用已知为HLA-B*58:01纯合型和杂合型等位基因的样本与待检样本同批次进行PCR扩增反应，在获得相应的CT值后，利用双△Ct法，将标准品（HLA-B*58:01纯合型和杂合型样本）扩增体系Ⅱ中与探针2、探针4相关的扩增曲线的CT值，与待检样本（根据扩增试验结果已确定为HLA-B*58:01等位基因型）扩增体系Ⅱ中探针2、探针4相关的扩增曲线的CT值进行比较分析，从而判断出待检样本（根据扩增试验结果已确定为HLA-B*58:01等位基因型）HLA-B*58:01等位基因的纯合型或杂合型。也就是说，为了基于上述的扩增反应结果推断出待检样本HLA-B*58:01等位基因的纯合型或杂合型。
本发明的另一个目的是提供一种用于上述HLA-B*58:01等位基因检测的试剂盒，该试剂盒包括：（1）分别装有反应液1、反应液2、反应液3、EZ Taq酶混合液、标准液1、标准液2的多个密封离心管，（2）分隔并集中包装这些离心管的试剂盒；其中：
反应液1由如下组分组成：由PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物1和引物2，寡核苷酸探针为探针1；用于靶多核苷酸扩增的引物7和引物8，寡核苷酸探针为探针4；
反应液2由如下组分组成：PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物3和引物4，寡核苷酸探针为探针2；用于靶多核苷酸扩增的引物7和引物8，寡核苷酸探针为探针4；
反应液3由如下组分组成：PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物5和引物6，寡核苷酸探针为探针3；用于靶多核苷酸扩增的引物7和引物8，寡核苷酸探针为探针4；
EZ Taq混合液：主要成份为热启动Taq酶；
标准液1：纯合型HLA-B*58:01基因组DNA；
标准液2：杂合型HLA-B*58:01基因组DNA。
与基于扩增反应完成后进行单一终点检测的传统PCR方法不同，实时荧光定量聚合酶链反应方法可以在扩增反应进行的过程中随时监测扩增产物的产生，从而极大的提高了定量检测的准确性和精密度。实时荧光定量PCR（Taqman探针法）在PCR的扩增中，同时加入了引物和在5’末端和3’末端分别标记有荧光发生基团和荧光淬灭基团的特异性寡核苷酸探针。如果探针没有与靶序列互补结合，探针序列保持完整，荧光发生基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，故没有荧光信号的产生，而当探针与靶序列能够互补结合时，在PCR扩增进行的过程中，DNA聚合酶在引导DNA序列复制的同时其5’-3’端外切酶活性将切断荧光探针，导致荧光发生基团与荧光淬灭基团的分离，从而荧光检测系统可以接收并记录荧光信号。每扩增一条DNA链即有一个荧光信号的产生，荧光信号的积累与PCR产物的形成完全同步，故可以实时地监测整个PCR反应过程，并可借助标准曲线或表达量恒定的内对照产物对未知的靶多核苷酸进行绝对或相对的定量分析。
如上所述，为了检测出临床血液样本中HLA(human leukocyte antigen)的基因型为HLA-B*58:01等位基因型，特别是能够准确区分HLA-B*15:16，HLA-B*35**，HLA-B*57:01，HLA-58*31，HLA-B*57:06，HLA-B*58:02-35/37-43/45/46等与HLA-B*58:01等位基因有着较高相似度DNA序列的其他等位基因型，设计并制备实现这些目的的寡核苷酸引物和探针是一个非常重要的技术环节。为此，我们在使用适当的核酸分析软件（如DNA Star）对HLA-B*的核苷酸序列进行分析，进一步使用适当的引物设计软件（如Primerprimer5.0）选择并设计具有特定核苷酸序列的寡核苷酸引物；选择并设计具有特定核苷酸序列的寡核苷酸探针。
如上所述，为了检测出临床血液样本中HLA(human leukocyte antigen)的基因型为HLA-B*58:01等位基因型，特别是能够准确区分HLA-B*15:16，HLA-B*35**，HLA-B*57:01，HLA-58*31，HLA-B*57:06，HLA-B*58:02-35/37-43/45/46等与HLA-B*58:01等位基因有着较高相似度DNA序列的其他等位基因型，本发明将HLA-B*58:01等位基因型的DNA序列与其它与之有着高度同源性的等位基因型的DNA序列进行了同源性比较和分析，特别设计适用本发明检测试剂盒的寡核苷酸引物和探针。使用这些引物和探针完成的HLA-B*58:01等位基因实时定量检测，极大的简化了HLA-B*58:01等位基因检测的操作步骤，缩短了检测时间，提高了检测灵敏度，降低了模板使用量。实验证明，本发明对HLA-B*58:01等位基因型检测的准确度在99.9％以上。
值得特别说明的是，我们使用了已知为HLA-B*58:01等位基因纯合型和杂合型的血样标准品，作为检测体系中的阳性对照。此外，标准品的存在，使完成HLA-B*58:01等位基因型检测的同时，进一步提高了待检样本HLA-B*58:01等位基因纯合型或杂合型判断的准确度。
本发明即将Taqman PCR技术应用于HLA-B*58:01等位基因的检测，使TaqmanPCR的技术优点（灵敏度高、特异性强、着操作简便、耗时短、可定量）在HLA-B*58:01等位基因检测中得到完美继承的同时对HLA-B*58:01等位基因的纯合型和杂合型进行了鉴定。本发明涉及的试剂盒可广泛应用于人HLA-B*58:01等位基因的检测，指导临床上别嘌呤醇药物的使用，规避HLA-B*58:01基因型患者在使用别嘌呤醇药物后可能引起的严重皮肤不良反应（SCARs）。
具体实施方式
下面给出本发明较佳实施例，以详细说明本发明的技术方案。
实施例1：
HLA-B*58:01等位基因检测试剂盒（SSP-PCR荧光探针法）及其使用。
（1）制备包括下列组成成份的试剂盒：反应液1（650μl/管）1管、反应液2（650μl/管）1管、反应液3（650μl/管）1管、EZ Taq酶混合液（150μl/管）1管、标准液1（30μl/管）、标准液2（30μl/管）。
（2）样本采集、运送和保存：用一次性真空采血器，无菌操作，取待检个体血液样本，做好标示后将获取的血液样本置于低温冰箱（-70℃或-20℃）中冷冻保存。如集中检验，标本需在0℃以下环境中运送并于24小时内送达实验室。
（3）检验步骤和结果分析：
将待检测血样取300μl，用柱回收法(删除)同批次提取血液样本(删除)和标准品1、标准品2中的DNA，用分光光度计或类似的仪器确认提取的DNA的质量（OD260/280在1.8-2.0之间），将提取的每份待检样本DNA和标准品DNA分别置于3个PCR反应管或PCR板的3个孔中，每孔2μl。然后，在加入同一DNA样本的3个孔中各加入一种PCR反应液（反应液1、反应液2、反应液3）15μl，再在每个孔中加入3μl的酶混合液。混匀离心后，将PCR反应体系置于自动荧光检测热循环仪上，选择FAM通道（Reporter:FAM,Quencher:none）收集特异扩增信号；选择HEX或VIC通道（Reporter:HEX/VIC,Quencher:none）检测内标；参比荧光（Passive Reference）设置为none；设置Sample Volume为20。按照仪器操作说明做好相应设置后开始试验。本试剂盒的所使用的反应条件是：96℃预变性3分钟，95℃30秒→65℃45秒，共进行35个循环；最后25℃下至少30秒。
反应结束后保存检测数据文件，点选仪器的数据分析选项后可查看各个PCR反应体系的结果，如PCR扩增曲线，待检样本和标准样本的CT值等，具体PCR扩增反应条件、标准品和样品的检测结果见表1～表3。
表1PCR扩增反应条件
Figure BDA0000462804240000091
表2阳性标准品和阴性标准品中HLA-B58*:01等位基因目标序列和内对照序列扩增结果
Figure BDA0000462804240000092
阳性标准品在扩增体系Ⅰ、Ⅱ中有HLA-B*58:01等位基因目标序列的扩增，在扩增体系Ⅲ中没有HLA-B*58:01等位基因目标序列的扩增；阴性标准品在扩增体系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中没有HLA-B*58:01等位基因目标序列的扩增。阳性标准品和阴性标准品在扩增体系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中均检测到内对照目标基因序列的扩增。所有有扩增的HLA-B*58:01等位基因目标序列和内对照目标基因序列的CT值（荧光阈值）＜30。根据判定规则，阳性标准品和阴性标准品的检测结果符合预期，扩增结果有效。“/”表示没有Ct值，体系中没有目标或内标基因的扩增。
表3阳性样本、阴性样本和无效样本中HLA-B58*:01等位基因目标序列和内对照序列扩增结果
Figure BDA0000462804240000101
阳性样本1、2在扩增体系Ⅰ、Ⅱ中有HLA-B*58:01等位基因目标序列的扩增，在扩增体系Ⅲ中没有HLA-B*58:01等位基因目标序列的扩增。阴性样本1在扩增体系Ⅰ中有HLA-B*58:01等位基因目标序列的扩增，但在扩增体系Ⅱ中没有HLA-B*58:01等位基因目标序列的扩增；阴性样本2在扩增体系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中没有HLA-B*58:01等位基因目标序列的扩增。阳性样本和阴性样本在扩增体系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中均检测到内对照目标基因序列的扩增。所有有扩增的HLA-B*58:01等位基因目标序列和内对照目标基因序列的CT值（荧光阈值）＜30。根据判定规则，阳性标准品和阴性标准品的检测结果符合预期，扩增结果有效。无效样本1在在扩增体系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中没有HLA-B*58:01等位基因目标序列和内对照目标基因序列的扩增。无效样本2在扩增体系Ⅰ、Ⅱ中有HLA-B*58:01等位基因目标序列的扩增，在扩增体系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中均检测到内对照目标基因序列的扩增。无效样本3在扩增体系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中HLA-B*58:01等位基因目标序列没有扩增，内对照目标基因序有扩增。根据判定规则，同一体系中所有有扩增的HLA-B*58:01等位基因目标序列和内对照目标基因序列的CT值（荧光阈值）同时≥30，或没有HLA-B*58:01等位基因目标序列的扩增但扩增体系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ内对照目标基因序列的CT值（荧光阈值）同时≥30，或在扩增体系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中完全没有检测到HLA-B*58:01等位基因目标序列和内对照目标基因序列的扩增，则判定扩增反应无效，该检测样本为无效样本，需重复试验或者重新提取样本DNA后再进行检测。“/”表示没有Ct值，体系中没有目标或内标基因的扩增。
实施例2：使用本发明的试剂盒检测30例临床血液样本的结果与分析
采用单盲实验法，从来自重庆市血液中心的500例血液样本中选择30例用本发明的试剂盒进行试验，以TBG公司的HLAssure ABCDRDQ SBT测序试剂盒，采用PCR-SBT金标准方法试剂盒对实验结果进行复核。试验数据显示：本试剂盒检测的30例临床血液样本的PCR扩增均为有效扩增。除1号样本扩增体系Ⅰ和6号样本扩增体系Ⅲ外，其它样本内对照基因的目标序列均有扩增；除10号样本的扩增体系Ⅰ（Ct34.13）和17号样本的扩增体系Ⅰ（Ct34.93）、Ⅲ（Ct34.54）外，其它样本内对照基因的目标序列的CT值均小于30。其中，8例样本在扩增体系Ⅰ和扩增体系Ⅱ中有HLA-B*58:01等位基因目标序列和内对照基因目标序列的扩增，在扩增体系Ⅲ中有内对照目标基因序列的扩增，且HLA-B*58:01等位基因目标序列和对照基因目标序列CT值均小于30；18例在扩增体系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中均有内对照基因目标序列的扩增，且CT值小于30（1号样本扩增体系Ⅰ和6号样本扩增体系Ⅲ无内对照目标序列的扩增，10号样本的扩增体系Ⅰ（Ct34.13）和17号样本的扩增体系Ⅰ（Ct34.93）、Ⅲ（Ct34.54）的Ct值大于30）。试验数据表明30例临床血液样本中检出HLA-B*58:01等位基因型8例，其中杂合型7例，纯合型1例，其余22例为非HLA-B*58:01等位基因型。采用TBG公司的HLAssure ABCDRDQ SBT测序试剂盒对30例临床血液样本进行复核，PCR结果与复核结果一致的判定为真阴（阳）性，PCR结果与复核结果不一致的判定为假阴（阳）性。样本复核结果为：30例临床血液样本中，22例为非HLA-B*58:01等位基因型，8例为HLA-B*58:01等位基因型，其中杂合型7例，纯合型1例。本次试验结果表明：本发明的试剂盒与TBG公司的HLAssure ABCDRDQSBT测序试剂盒检测结果的阴、阳性符合率均为100％。具体检测数据见表4。
表430例临床血液样本的扩增结果
Figure BDA0000462804240000121
30例临床血液样本的PCR扩增均为有效扩增。其中，编号2、3、9、11、12、18、23、28样本在扩增体系Ⅰ和扩增体系Ⅱ中有HLA-B*58:01等位基因目标序列和内对照基因目标序列的扩增，在扩增体系Ⅲ中有内对照目标基因序列的扩增，同体系中HLA-B*58:01等位基因目标序列的CT与对照基因目标序列CT均值小于30，判定检测结果为HLA-B*58:01等位基因阳性；编号12样本的CT值明显小于其余7个HLA-B*58:01等位基因阳性样本，判定为HLA-B*58:01等位基因阳性纯合子。应用PCR-SBT方法对30例临床血液样本的HLA-B*基因型进行复检，结果表明阳性与阴性符合率均为100％，本试剂盒检验结果准确。Positive Control与Negative Control结果符合预期表明本次试验结果有效。

Claims (5)

1.一种HLA-B*58:01等位基因检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提供包括待测样品、核酸扩增体系和荧光检测体系的混合物；
（2）通过扩增反应循环扩增待测样品中的靶多核苷酸；
（3）使所述荧光检测体系中的荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸序列间接结合；
（4）测定荧光发生基团所产生的荧光量，从而确定靶多核苷酸的存在及其相对量；
所述核酸扩增体系由如下组分组成：耐热DNA聚合酶、2’-脱氧核苷三磷酸、能够与靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物a和能够与靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物a，能够与靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物b和能够与靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物b；所述荧光检测体系是能够与靶多核苷酸结合并且两端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的两条寡核苷酸探针。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸扩增体系和荧光检测体系共3组，其中：
核酸扩增体系Ⅰ中用于靶多核苷酸扩增的正向引物a和反向引物a分别为引物1和引物2，用于靶多核苷酸扩增的正向引物b和反向引物b分别为引物7和引物8，并且荧光检测体系I中所使用的寡核苷酸探针为探针1和探针4；
核酸扩增体系Ⅱ中用于靶多核苷酸扩增的正向引物a和反向引物a分别为引物3和引物4，用于靶多核苷酸扩增的正向引物b和反向引物b分别为引物7和引物8，并且荧光检测体系II中所使用的寡核苷酸探针为探针2和探针4；
核酸扩增体系Ⅲ中用于靶多核苷酸扩增的正向引物a和反向引物a分别为引物5和引物6，用于靶多核苷酸扩增的正向引物b和反向引物b分别为引物7和引物8，并且荧光检测体系III中所使用的寡核苷酸探针为探针3和探针4；
各引物和探针具体组成如下：
引物1：5’-CCACGAGTTTCACTTCTTCTC-3’，
引物2：5’GCGACACTGATTGGCTTCT-3’，
引物3：5’-CTGGAGAACGGGAAGGAG-3’，
引物4：5’-CAAGGGAGGGCGACATT-3’，
引物5：5’-CTCCAGCCAGCGACAGTGC-3’，
引物6：5’CGCGAAACATCCCAATCAA-3’，
引物7：5’-TTCAGGGTGAGTCTATGGGA-3’，
引物8：5’-CGATCCTGAGACTTCCACAC-3’；
探针1：5’-CCCAACCTATGTCGGGTCCTTCTTC-3’，
探针2：5’-AAGGAGACGCTGCAGCGCGC-3’，
探针3：5’-ATCCCCATTACCCAGGCCTTTCC-3’，
探针4：5’-TGATGCAATCATTCGTCTGTTTCCC-3’。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增反应循环是重复35-45次的聚合酶链反应循环。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，先确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环数；然后将上述测定的阈循环数与标准溶液中的靶多核苷酸的阈循环数相比较，以确定样品中靶多核苷酸的相对量，从而判断样品包含靶多核苷酸基因的纯合型与杂合型。
5.一种用于HLA-B*58:01等位基因检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：（1）分别装有反应液1、反应液2、反应液3、EZ Taq混合液、标准液1、标准液2的多个密封离心管，（2）分隔并集中包装这些离心管的试剂盒；其中：
反应液1由如下组分组成：由PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物1和引物2，寡核苷酸探针为探针1；用于靶多核苷酸扩增的引物7和引物8，寡核苷酸探针为探针4；
反应液2由如下组分组成：PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物3和引物4，寡核苷酸探针为探针2；用于靶多核苷酸扩增的引物7和引物8，寡核苷酸探针为探针4；
反应液3由如下组分组成：PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物5和引物6，寡核苷酸探针为探针3；用于靶多核苷酸扩增的引物7和引物8，寡核苷酸探针为探针4；
EZ Taq混合液：主要成份为热启动Taq酶；
标准液1：纯合型HLA-B*58:01基因组DNA；
标准液2：杂合型HLA-B*58:01基因组DNA；
各引物和探针具体组成如下：
引物1：5’-CCACGAGTTTCACTTCTTCTC-3’，
引物2：5’GCGACACTGATTGGCTTCT-3’，
引物3：5’-CTGGAGAACGGGAAGGAG-3’，
引物4：5’-CAAGGGAGGGCGACATT-3’，
引物5：5’-CTCCAGCCAGCGACAGTGC-3’，
引物6：5’CGCGAAACATCCCAATCAA-3’，
引物7：5’-TTCAGGGTGAGTCTATGGGA-3’，
引物8：5’-CGATCCTGAGACTTCCACAC-3’；
探针1：5’-CCCAACCTATGTCGGGTCCTTCTTC-3’，
探针2：5’-AAGGAGACGCTGCAGCGCGC-3’，
探针3：5’-ATCCCCATTACCCAGGCCTTTCC-3’，
探针4：5’-TGATGCAATCATTCGTCTGTTTCCC-3’。
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