CN105624293A - 检测hla-b*5801等位基因的多色荧光pcr试剂盒及方法 - Google Patents

检测hla-b*5801等位基因的多色荧光pcr试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒及方法，其特征在于，包括：检测基因HLA-B*5801的两个正向引物、两个反向引物及三个检测探针的检测引物探针组合，包括检测内参基因的一个正向引物、一个反向引物及一个内控探针的内控引物探针。基于本发明的引物设计及PCR反应特点，使得本发明可以很大程度上节省时间和耗材，检测过程只需要1小时～1.5小时，操作简单易行，整个实验可在2.5小时内完成。

Description

检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及一种检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，本发明还涉及检测HLA-B*5801等位基因的方法，属于基因诊断领域。
背景技术
人类白细胞抗原(Humanleukocyteantigens，HLA)是人类主要组织相容性复合体的表达产物，在免疫系统中主要负责细胞间的相互识别和诱导免疫反应，调节免疫应答。HLA分为三类：Ⅰ类分子为HLA-A、-B、-C系列抗原，广泛表达于各组织有核细胞表面；Ⅱ类分子为HLA-D/DR、-DP、DQ系列抗原，主要表达于B细胞和抗原提呈细胞，I类和II类抗原都与器官移植有关，其中Ⅱ类抗原更为重要；Ⅲ类分子为补体成分。HLA是迄今已知基因中等位基因多态性最高的基因复合体，目前已经证实包含超过2700多种等位基因。HLA是人类最复杂的遗传多态性系统，其多态性存在明显的族群特征。近年来发现一些药物的严重不良反应与人类白细胞抗原基因多态性有关，如HLA-B*5801等位基因与别嘌醇所致Stevens-Johnson综合征/中毒性表皮坏死松解症(Stevens-Johnsonsyndrome/toxicepidermalnecrolysis，SJS/TEN)相关。
别嘌醇(Allopurinol)是一种能抑制尿酸合成的药物，在高尿酸血症等症的治疗领域发挥着重要作用。临床主要用于：原发性和继发性高尿酸血症，尤其是尿酸生成过多而引起的高尿酸血症；反复发作后慢性痛风者；痛风石；尿酸性肾结石和(或)尿酸性肾病；有肾功能不全的高尿酸血症。然而该药易引起严重的皮肤反应，别嘌醇药疹因潜伏期长、病情重、易复发和病死率高而受到重视。药疹是最常见的别嘌醇药物过敏反应，大多数的药疹表现比较轻微，可以通过停药相应治疗好转。近5％的别嘌醇服用患者出现严重皮肤及其附件损害，主要表现为重症药疹，如：剥脱性皮炎、重症多形红斑型药疹、中毒性表皮坏死松解症。这些严重的皮肤药物不良反应若不加以积极的干预和治疗，死亡率很高，可达26％。
HLA-B*5801是HLA-B的一个基因亚型，已有大量研究证明别嘌醇相关的严重超敏反应与白细胞抗原HLA-B*5801密切相关，在服用别嘌醇后出现严重不良反应的患者中100％存在，而在未出现不良反应的患者中其携带率仅为10％；中国汉族人中HLA-B*5801阳性者比白人高(12％vs2％)，发生超敏反应的风险更大。临床上已经建议在使用别嘌醇前，应该进行HLA-B*5801等位基因的检测，以判断是否属于高危人群，从而有效降低由别嘌醇引起的严重不良反应。美国风湿病学会已经正式发布了痛风治疗指南，黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌醇和非布司他是首选的降尿酸的药物。但是对于特定的人群，如所有中国汉族人、泰国裔、韩国裔同时有3级以上CKD(慢性肾衰)，由于人类白细胞抗原(HLA-B*5801)阳性率高，发生别嘌醇相关的严重过敏性药疹危险性增高，在使用别嘌醇前，应该进行HLA-B*5801快速PCR检测。并且台湾卫生署也建议在使用别嘌呤醇前，应该进行HLA-B*5801基因检测，结果阳性患者应禁止使用该药物。因此，研究一种快速、特异性高的PCR方法对HLA-B*5801等位基因进行检测是非常必要的。
目前用于HLA-B*5801基因型鉴定的方法包括PCR-SBT法、PCR-SSP法、PCR-SSOP法。具体如下：PCR-SBT法，即基于测序分析的聚合酶链反应，主要包括PCR扩增和PCR产物纯化、测序反应、测序和结果分析四个主要步骤。主要不足是灵敏度不高，可能出现假阴性结果；对试剂和仪器有特殊要求，不易普及；操作复杂，成本相对较高，速度慢、通量低。PCR-SSP法，其原理是根据已知HLA基因片段设计特异性引物直接进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳电泳分析，缺点是操作复杂且容易污染。PCR-SSOP法，即序列特异性寡核苷酸探针，首先对HLA的多态区域进行扩增，在扩增过程中对产物进行标记，然后针对扩增产物设计系列寡核苷酸探针固定，最后将产物与探针杂交、放射自显影。该技术灵敏度高，特异性较强，结果直观，但是由于其所使用的载体多为膜或滴定板，对于复杂的HLA等位基因来说，不具有集成化的优点，而且洗脱比较繁琐，耗时较长，难以标准化和自动化。
针对于传统的HLA分型方法，实时定量PCR法是在普通PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，利用信号积累检测整个PCR反应的进程，它是将荧光值得积累与PCR产物扩增的过程相结合，最后通过标准曲线或测量指数扩增期的荧光值来进行定量或者定性的方法，基于实时定量TaqMan探针及ARMS技术已成功应用于基因分型的检测，其优点主要有灵敏度高、特异性强、操作简便、耗时短、通量相对较高、无污染等特点。而多色荧光PCR方法可以实现在同一PCR反应过程中对多个靶标序列的检测，从而进一步提高检测的通量。因此，将多色荧光PCR结果ARMS法应用于HLA等位基因的分型检测是PCR分子诊断技术领域的一项创新。
但是，由于HLA基因家族的序列多态性，相对于HLA等位基因的检测，该技术至今很少应用于HLA-B*5801等位基因的检测，其根本原因是多个HLA-B等位基因与HLA-B*5801具有极高的序列同源性(90％以上)，因而设计一套适用于多色荧光PCR反应高特异性扩增HLA-B*5801等位基因的引物探针组合十分困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒及方法，以解决上述问题。
本发明采用了如下技术方案：
本发明提供一种检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，其特征在于，包括：
检测基因HLA-B*5801的两个正向引物、两个反向引物及三个检测探针的检测引物探针组合，包括检测内参基因的一个正向引物、一个反向引物及一个内控探针的内控引物探针。
进一步，本发明的检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，还可以具有这样的特征：其中，检测基因HLA-B*5801的第一正向引物F1为：HLA-B*5801F1：5’-GGCGGGTCTCAGCCCCTCCTCG-3’，第一反向引物R1为：HLA-B*5801R1：5’-CCCACTGCCCCTGGTACCCGCGC-3’。
进一步，本发明的检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，还可以具有这样的特征：其中，检测引物探针包括：第一检测探针：5’-FAM-ACACGGAACATGAAGGCCTCCGC-BHQ2-3’。
进一步，本发明的检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，还可以具有这样的特征：检测引物探针包括：第二检测探针：5’-JOE-TCGGGCCCCAGGTCGCAGCCATA-BHQ2-3’。
进一步，本发明的检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，还可以具有这样的特征：
检测引物探针包括：第三检测探针：5’-CY5-CTTCCAGAAGTGGGCAGCTGTGGT-BHQ2-3’。
进一步，本发明的检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，还可以具有这样的特征：其中，检测基因HLA-B*5801的第二正向引物F2为：5’-TTCTGACTCTTCCCATCAGACC-3’，
第二反向引物R2为：5’-CCCTCCTTACCCCATCTCAGG-3’。
进一步，本发明的检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，还可以具有这样的特征：其中，检测内参基因的正向引物为：5’-CATTCTAAACTGTACCCTGTTACT-3’；
检测内参基因的反向引物为：5’-GCCACACTGAGTGAGCTGCACTG-3’；
检测内参基因的检测探针为：5’-ROX-CCTTCCTATGACATGAACTTAACC-BHQ2-3’。
本发明还提供一种检测HLA-B*5801等位基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
第一步：准备待检测DNA
第二步：PCR反应体系配制
在荧光PCR专用管内按照下列配方配制PCR反应体系：
PCR反应液，25μl；基因组DNA，约100ng；ddH2O，加至50μl；
第三步：上机检测
按照下列步骤设置温度循环及信号采集程序：
温度为95℃，时间为3分钟；再次依照以下程序运行40个循环，变性：温度为95℃，时间为15秒，退火：温度为60℃，时间为20秒，延伸：温度为72℃，时间为30秒。
第四步：分析结果
在第三步中的PCR反应体系及温度循环条件下，在内控信号形成正常对数扩增“S”型曲线的前提下，观察反应体系内特异性检测荧光信号是否都形成对数扩增“S”型曲线，若都形成“S”型曲线则该待检DNA样本为HLA-B*5801等位基因的阳性。
进一步，本发明的多色荧光PCR检测HLA-B*5801等位基因的方法，还可以具有这样的特征：其中，PCR反应液包含PCR反应的缓冲液、镁离子、dNTP、核酸聚合酶，以及如权利要求2-7中的正向引物、反向引物和探针。
进一步，本发明的多色荧光PCR检测HLA-B*5801等位基因的方法，还可以具有这样的特征：第一步中，待检测DNA浓度应不小于50ng/μl；OD260nm/OD280nm在1.7～2.0之间。
发明的有益效果
(1)节省耗材和时间、简单易行、高通量
基于本发明的引物设计及PCR反应特点，使得本发明可以很大程度上节省时间和耗材，检测过程只需要1小时～1.5小时，操作简单易行，整个实验可在2.5小时内完成。
(2)结果可靠、灵敏度高
采用本发明方法与HLA等位基因分型“金标准”PCR-SBT测序以及PCR-SSP进行方法学对比，所有样本结果完全吻合。本发明方法在引入多色荧光方法提高准确度与灵敏度外，同时，使用本发明方法可一次同时高通量进行96例或者384例样本的检测，因此，更适用于临床分子诊断。
(3)成本低、无污染
由于本发明具有高通量的特点，因此使得本发明中每个反应管的成本低；同时，此技术未涉及重复开盖等二次污染的可能，本发明可直接根据探针的荧光曲线判断扩增产物，不涉及任何对人体有毒害作用的化学试剂，安全、无污染。
附图说明
图1为HLA-B*5801等位基因携带者样本试剂盒检测结果图；
图2为HLA-B*5801等位基因携带者HLA-B基因2、3号外显子测序图前半段；
图3为HLA-B*5801等位基因携带者HLA-B基因2、3号外显子测序图的后半段。
具体实施方式
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
1.引物探针的设计：
根据美国国立生物技术信息中心NCBI的核酸序列数据库GeneBank公开的HLA-B基因的参考序列(NG_023187)以及英国IMG/HLA数据库公开的HLA-B*5801(HLA00386)的信息，分别设计HLA-B*5801等位基因特异性检测引物探针组合。引物探针组合的序列具体如下：
第一正向引物：HLA-B*5801F1：5’-GGCGGGTCTCAGCCCCTCCTCG-3’，
第一反向引物：HLA-B*5801R1：5’-CCCACTGCCCCTGGTACCCGCGC-3’，
第一检测探针：probe1：5’-FAM-ACACGGAACATGAAGGCCTCCGC-BHQ2-3’，
第二检测探针：probe2：5’-JOE-TCGGGCCCCAGGTCGCAGCCATA-BHQ2-3’，
第二正向引物：HLA-B*5801F2：5’-TTCTGACTCTTCCCATCAGACC-3’，
第二反向引物：HLA-B*5801R2：5’-CCCTCCTTACCCCATCTCAGG-3’，
第三检测探针：probe3：5’-CY5-CTTCCAGAAGTGGGCAGCTGTGGT-BHQ2-3’，
为了监测DNA模板及反应体系的有效性，在检测体系内加入内控引物与探针，本发明选取人类保守基因Globin的一段序列，设计内控引物探针，具体序列如下所示：
内控正向引物：HLA-B*5801F3：5’-CATTCTAAACTGTACCCTGTTACT-3’，
内控反向引物：HLA-B*5801R3：5’-GCCACACTGAGTGAGCTGCACTG-3’，
内控检测探针：probe4：5’-ROX-CCTTCCTATGACATGAACTTAACC-BHQ2-3’，
2.引物的制备
将设计好的引物及探针序列交给合成公司合成，一般采用仪器自动化学合成，需提供合成检验合格报告。
3.多色荧光PCR检测HLA-B*5801等位基因试剂盒的准备
制备HLA-B*5801等位基因检测反应液，其中PCR反应液包含了PCR反应必须的缓冲液、镁离子、dNTP、核酸聚合酶等物质外，还包含了检测引物探针组合和内控引物探针。上述特异性检测的PCR反应液组份信息如下：
缓冲液，10X；镁离子，15mM；dNTP(A/T/C/G)，各20mM；HLA-B*5801F1，200nM；HLA-B*5801R1，200nM；HLA-B*5801F2，200nM；HLA-B*5801R2，200nM；probe1，2μM；probe2，2μM；probe3，2μM；HLA-B*5801F3，200nM；HLA-B*5801R3，200nM；probe4，2μM；核酸聚合酶5U。
4.多色荧光PCR检测HLA-B*5801等位基因的方法
第一步：准备待检测DNA
抽取待检测这的血液样本，保存于抗凝采集管中；从血液样本中获取DNA，推荐使用商品化的试剂盒提取；测定DNA的浓度和纯度，要求浓度不小于50ng/μl；OD260nm/OD280nm在1.7～2.0之间。
第二步：PCR反应体系配制
在荧光PCR专用管内按照下列配方配制PCR反应体系：
PCR反应液，25μl；基因组DNA，约100ng；ddH2O，加至50μl；
上述PCR反应液采用第3部分中制备的试剂盒中的HLA-B*5801等位基因检测反应液，也可以按照第3部分提供的配方制备含有HLA-B*5801等位基因特异性引物探针组合并含有内控引物探针的PCR反应液。
第三步：上机检测
按照下列步骤设置温度循环及信号采集程序：
温度为95℃，时间为3分钟；再次依照以下程序运行40个循环，变性：温度为95℃，时间为15秒，退火：温度为60℃，时间为20秒，延伸：温度为72℃，时间为30秒。在每个循环的延伸阶段设置荧光信号采集，针对FAM、JOE、CY5和ROX荧光信号进行采集。
第四步：分析结果
在上述PCR反应体系及温度循环条件下，在内控信号形成正常对数扩增“S”型曲线的前提下，观察反应体系内特异性检测荧光信号是否都形成对数扩增“S”型曲线，若都形成“S”型曲线则该待检DNA样本为HLA-B*5801等位基因的阳性。例如：某待检样本在反应体系内控荧光信号(ROX通道)形成对数扩增“S”型曲线的条件下，特异性检测荧光信号(FAM、JOE和CY5通道)都形成“S”型曲线，则提示该样本为HLA-B*5801等位基因阳性。
附图1为某样本HLA-B*5801等位基因多色荧光PCR试剂盒检测图，检测图反应体系内控荧光信号合格，HLA-B*5801特异性检测信号均合格，则判断该样本为HLA-B*5801等位基因阳性。
图2和图3为图1样本HLA-B基因测序图，测序结果经比对显示为该演变HLA-B*5801等位基因阳性。试剂盒检测结果与测序结果一致。

Claims (10)

1.一种检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，其特征在于，包括：
检测基因HLA-B*5801的两个正向引物、两个反向引物及三个检测探针的检测引物探针组合，包括检测内参基因的一个正向引物、一个反向引物及一个内控探针的内控引物探针。
2.如权利要求1所述的检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，其特征在于：
其中，检测基因HLA-B*5801的第一正向引物F1为：HLA-B*5801F1：5’-GGCGGGTCTCAGCCCCTCCTCG-3’，
第一反向引物R1为：HLA-B*5801R1：5’-CCCACTGCCCCTGGTACCCGCGC-3’。
3.如权利要求1所述的检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，其特征在于：
其中，检测引物探针包括：第一检测探针：5’-FAM-ACACGGAACATGAAGGCCTCCGC-BHQ2-3’。
4.如权利要求1所述的检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，其特征在于：
检测引物探针包括：第二检测探针：5’-JOE-TCGGGCCCCAGGTCGCAGCCATA-BHQ2-3’。
5.如权利要求1所述的检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，其特征在于：
检测引物探针包括：第三检测探针：5’-CY5-CTTCCAGAAGTGGGCAGCTGTGGT-BHQ2-3’。
6.如权利要求1所述的检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，其特征在于：
其中，检测基因HLA-B*5801的第二正向引物F2为：5’-TTCTGACTCTTCCCATCAGACC-3’，
第二反向引物R2为：5’-CCCTCCTTACCCCATCTCAGG-3’。
7.如权利要求1所述的检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，其特征在于：
其中，检测内参基因的正向引物为：5’-CATTCTAAACTGTACCCTGTTACT-3’；
检测内参基因的反向引物为：5’-GCCACACTGAGTGAGCTGCACTG-3’；
检测内参基因的检测探针为：5’-ROX-CCTTCCTATGACATGAACTTAACC-BHQ2-3’。
8.一种检测HLA-B*5801等位基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
第一步：准备待检测DNA
第二步：PCR反应体系配制
在荧光PCR专用管内按照下列配方配制PCR反应体系：
PCR反应液，25μl；基因组DNA，约100ng；ddH2O，加至50μl；
第三步：上机检测
按照下列步骤设置温度循环及信号采集程序：
温度为95℃，时间为3分钟；再次依照以下程序运行40个循环，变性：温度为95℃，时间为15秒，退火：温度为60℃，时间为20秒，延伸：温度为72℃，时间为30秒。
第四步：分析结果
在第三步中所述的PCR反应体系及温度循环条件下，在内控信号形成正常对数扩增“S”型曲线的前提下，观察反应体系内特异性检测荧光信号是否都形成对数扩增“S”型曲线，若都形成“S”型曲线则该待检DNA样本为HLA-B*5801等位基因的阳性。
9.如权利要求8所述的多色荧光PCR检测HLA-B*5801等位基因的方法，其特征在于：
其中，所述PCR反应液包含PCR反应的缓冲液、镁离子、dNTP、核酸聚合酶，以及如权利要求2-7中所述的正向引物、反向引物和探针。
10.如权利要求8所述的多色荧光PCR检测HLA-B*5801等位基因的方法，其特征在于：
第一步中，待检测DNA浓度应不小于50ng/μl；OD260nm/OD280nm在1.7～2.0之间。
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